KR20090081039A

KR20090081039A - 생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마를 검출하기 위한ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마이코플라즈마검출용 키트

Info

Publication number: KR20090081039A
Application number: KR1020080006881A
Authority: KR
Inventors: 송석길; 이동욱; 성혜란
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 주식회사 엔케이바이오
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2009-07-28
Also published as: WO2009093856A3; KR100974861B1; WO2009093856A2

Abstract

본 발명은 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머 세트, 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트 및 이를 이용한 마이코플라즈마 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 마이코플라즈마를 검출하기 위한 서열목록 제1서열 내지 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머를 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면, 폐나 생식기 등 인체 감염증을 유발하는 마이코플라즈마 뿐만 아니라 세포배양이나 생물의약품의 제조, 보관, 투여, 체외조작 및 배양에서 빈번하게 오염되는 마이코플라즈마를 직접 배양 방법에 의하지 않고 신속하고 정확하게 고민감도로 검출할 수 있다.

마이코플라즈마, 핵산증폭반응, 프라이머

Description

생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마를 검출하기 위한 ＰＣＲ 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트{PCR Primer Set for Identification of Mycoplasma from Biological Medical Preparation and Detection Kit for Mycoplasma Comprising the Same}

본 발명은 마이코플라즈마 검출용 PCR 프라이머 세트, 이를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 키트 및 이를 이용한 마이코플라즈마 검출 방법에 관한 것이다.

마이코플라즈마(Mycoplasma)는 분류학적으로 Mollicutes class 에 속하는 원핵세균(prokaryotes)이며, 인간 또는 동물의 호흡기나 생식기 등의 각종 장기에 상주하며 심각한 질병을 일으키고, 현재까지 수백여 종(species)이 알려져 있다.

마이코플라즈마는 세포벽이 없어 페니실린이나 스트렙토마이신과 같은 세포벽합성을 저해하는 항생물질에 내성이 있고 크기가 0.15-0.8 ㎛ 정도로 여과멸균에 의하여 제거되지 않으며, 형태학적으로도 다형적(pleomorphic) 특성이 있어 광학현미경을 이용한 관찰이 어려운 미생물이다. 또한 체외 배양세포의 30-50％에서 마이 코플라즈마의 감염이 존재하며 세포의 대사, 성장 및 생존율에 변화를 유도하여 궁극적으로 다양한 생화학적, 유전학적 특성변이는 물론 감염 바이러스의 복제에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

과학기술의 발전에 따라 개발이 증가하고 있는 세포치료제, 유전자치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제 등 첨단생물의약품의 제조, 보관 및 투여과정에서 오염되는 마이코플라즈마를 신속, 정확하게 검출할 수 있는 효율적인 진단법이 필요하다.

마이코플라즈마의 검출을 위해 통상적으로 사용되고 있는 직접배양법은 세포나 조직 배양시 기질이나 생체재료에 오염이 쉽게 되며 그 성장속도가 느린 마이코플라즈마의 증식을 확인하기 위해서는 2주이상의 긴 시간이 걸리고, 까다로운 영양요구성 때문에 종(species)에 따라 서로 다른 배양기법을 필요로 한다. 또한, 마이코플라즈마에 오염이 되었어도 세포의 형태변이나 배양용 배지의 색깔 변이를 유도하지 않고, 감염시 아무런 증상이 나타나지 않을 수 있으므로 직접배양법으로 마이코플라즈마의 증식을 확인하는 것은 극히 어렵다.

이에 최근 도입되는 마이코플라즈마 검출방법 중에서 가장 선호되는 방법은 유전물질인 핵산을 증폭하는 중합효소연쇄반응 (PCR; polymerase chain reaction)이다. PCR은 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열의 양 말단에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 프라이머 세트로 이용하여 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 기법이다. 이러한 PCR을 이용한 유전자 증폭방법을 이용하면 인체에 감염되어 있는 마이코플라 즈마 또는 세포 혹은 조직의 체외 조작과 배양 과정중에서 고빈도로 오염되는 마이코플라즈마를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 중합효소연쇄반응 (PCR; polymerase chain reaction)을 이용하여 마이코플라즈마 (Mycoplasma), 특히 세포치료제, 유전자치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제 등의 생물의약품의 제조, 보관 및 투여과정에서 오염될 수 있는 마이코플라즈마를 고감도로 검출할 수 있는 방법에 대해 심도 있는 연구를 행하였다. 그 결과 마이코플라즈마에 특이적인 PCR 용 프라이머를 개발하였고, 이를 사용한 PCR 방법을 이용하면 마이크로플라즈마를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 마이크로플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 프라이머 세트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 중합효소연쇄반응을 이용한 마이크로플라즈마 검출 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 마이크로플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다: (a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) (i) 상기 추출된 시료 DNA, (ⅱ) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머, 및 (ⅲ) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 1차 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)액을 제조하는 단계; 및 (c) 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.

본 발명자들은 중합효소연쇄반응을 이용하여 마이코플라즈마(Mycoplasma), 특히 세포치료제, 유전자치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제 등의 생물의약품의 제조, 보관 및 투여과정에서 오염될 수 있는 마이코플라즈마를 고감도로 검출할 수 있는 방법에 대해 심도 있는 연구를 행하였다. 그 결과 마이코플라즈마에 특이적인 PCR용 프라이머를 개발하였고, 이를 사용한 PCR 방법을 이용하면 마이크로플라즈마를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명의 방법을 단계별로 나누어 설명한다.

(a) 시료( sample )로부터 DNA 를 추출하는 단계

본 발명의 검출방법은 마이코플라즈마(Mycoplasma)가 오염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 본 발명의 시료는 예를 들어 배양된 세포(cultured cell), 단백질, 또는 핵산, 또는 이를 포함하는 생물학적 의약제, 동물 또는 인간의 뇌(brain), 눈(eye), 심장(heart), 장(intestine), 신장(kidney), 간(liver), 허파(lung), 근육(muscle), 비장(spleen), 또는 정소(testis)로부터 얻은 조직(tissue), 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 뇨액(urine), 타액(saliva), 땀(sweat), 정액(semen) 또는 점액(mucus) 등의 체액(body fluid)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 의해 검출 가능한 마이코플라즈마는 체외 세포배양 시에 빈번하게 마이코플라즈마 감염을 일으키는 마아코플라즈마 아스리티디스(M. arthritidis), 마이코플라즈마 보비스(M. bovis), 마이코플라즈마 퍼멘타스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 뉴로리티쿰(M. neurolyticum), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 피룸(M. pirum), 마이코플라즈마 풀모니스(M. pulmonis), 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium), 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii) 및 인 체 감염 시 폐렴을 일으키는 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumonia), 비임균성 요도염과 같은 비뇨생식기계 질환을 유발하는 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)와 같은 다양한 마이코플라즈마를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 DNA 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

(b) 1차 중합효소연쇄반응액을 제조하는 단계

중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 타깃 핵산에 인접해 있는 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 명세서에서 용어 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.

본 발명의 1차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 마이코플라즈마 DNA에 특이적 인 PCR용 프라이머 세트는 (ⅰ) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열의 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향(forward) 프라이머와, (ⅱ) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향(reverse) 프라이머로 이루어진다.

본 발명의 중합효소연쇄반응용 프라이머는 마이코플라즈마 게놈서열중에서 종(species) 보존적인 16S rDNA와 23S rDNA 사이의 ITS (internal transcribed spacer) 영역을 표적으로 하였기 때문에 다양한 종(species)의 마이코플라즈마를 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 1차 중합효소연쇄반응액은 상기 단계 (a)에서 시료로부터 추출한 DNA를 PCR의 주형 DNA로서 포함한다.

또한, 본 발명의 1차 중합효소연쇄반응액은 DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 중합효소연쇄반응액에는 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 포함한다. 상기 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 시료 준비 과정이나 PCR 과정에서 PCR 방해 요인들에 의해 PCR이 정상적으로 행해지지 않은 경우를 점검하기 위해 포함한다. 즉, 본 발명의 방법에서 중합효소연쇄반응이 정상적으로 일어났다면 상기 내부 컨트롤용 프라이머가 표적으 로 하는 특정 유전자 부위가 증폭될 것이고, 중합효소연쇄반응이 정상적으로 일어나지 않았다면 내부 컨트롤용 프라이머가 표적으로 하는 유전자의 증폭도 발생하지 않을 것이므로, 정상적인 중합효소연쇄반응 여부는 내부 컨트롤용 프라이머 표적 유전자 부위의 증폭여부를 확인하면 검사할 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, hGAPDH) 유전자 일부를 증폭시키는 프라이머 세트이다. 상기 hGAPDH 유전자는 인체에 중복적(redundant)으로 존재하는 유전자로서 본 발명의 PCR 반응이 정상적으로 행해졌는지를 판별하는데 매우 유용하게 사용된다.

본 발명의 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향프라이머를 포함한다.

(c) 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계

본 발명에서 중합효소연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 "사이클" 표적 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서의 상기 중합효소연쇄반응은 (i) 90-98℃에서 25-35초간의 변성(denaturation) 과정 및 (ⅱ) 60-70℃에서 90-150초간의 어닐링(annealing) 및 신장(elongation) 과정으로 이루어지는 1 사이클을 20-40회 반복 수행하는 단계를 포함한다.

(d) 2차 중합효소연쇄반응액을 제조하는 단계

본 발명의 방법은 상기 단계 (c) 이후에 1차 중합효소연쇄반응 생성물에 대한 2차 중합효소연쇄반응 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 "2차 중합효소연쇄반응"은 "네스티드 PCR (Nested PCR)"과 동일한 의미이며, 본 명세서에서는 이 두가지 용어를 혼용한다.

본 발명의 방법에서 1차 중합효소연쇄반응 생성물을 DNA 주형(template)으로 사용하여 2차 중합효소연쇄반응을 행함으로써 1차 중합효소연쇄반응만을 행한 경우에 비해 마이코플라즈마 검출 민감도를 현저히 향상시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액은 (i) 상기 1차 중합효소연쇄반응 생성물, (ⅱ) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머 및 (ⅲ) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함한다.

본 발명의 2차 중합효소연쇄반응에 포함되는 프라이머는 1차 중합효소연쇄반응에 사용되는 프라이머와 마찬가지로, 마이코플라즈마 게놈서열중에서 종(species) 보존적인 16S rDNA와 23S rDNA 사이의 ITS (internal transcribed spacer) 영역을 표적으로 한다. 또한, 1차 중합효소연쇄반응에서 증폭된 DNA 생성물을 주형으로 사용하여 PCR 반응을 행하므로, 1차 증폭된 DNA 생성물에 결합할 수 있는 서열을 갖는다.

본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액에는 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 2차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 내부 컨트롤용 프라이머는 상기 1차 중합효소연쇄반응액에 포함된 것과 동일한 것으로서, (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향프라이머를 포함한다.

본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액에는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액, 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다.

본 발명의 2차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 상기 성분들은 1차 중합효소연쇄반응액에 포함되는 성분들과 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이들에 대한 내용은 중복하여 설명하지 않는다.

(e) 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계

본 발명의 방법은 1차 중합효소반응후에 이어서 2차 중합효소연쇄반응을 행할 수 있다. 2차 중합효소연쇄반응 및 이의 반응 조건은 1차 중합효소연쇄반응과 동일하므로, 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이에 대한 중복 설명은 생략한 다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열, 제4서열, 제5서열, 제6서열, 제7서열, 제8서열 또는 제9서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제10서열, 제11서열, 제12서열 또는 제13서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 내부 컨트롤(internal control)용 PCR 프라이머를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 키트(Kit)를 제공한다: (a) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 PCR 키트는 다음의 프라이머 세트를 더욱 포함한다: (a) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 PCR 키트는 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 더욱 포함한다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 PCR 키트는 다음의 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 더욱 포함한다: (a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머, 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 PCR 키트는 (c) dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (d) DNA 중합효소; 및 (e) 완충(buffer)용액을 더욱 포함한다.

본 발명의 PCR용 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응 방법에 의하면 다양한 종(species)의 마이코플라즈마를 신속하고 정확하며 고민감도로 검출할 수 있다. 본 발명에 의하면 체외 배양에 있어 빈번히 오염되는 마이코플라즈마 뿐만 아니라 감염증을 유발하는 것으로 알려져 있는 마이코플라즈마까지 검출이 가능하고, 특히 세포치료제, 유전자 치료제, 줄기세포치료제, 단백질제제, 주사제, 백신 등의 제조단계에서 필수적으로 요구하는 마이코플라스마 부정 시험을 대체할 수 있는 검출 방법으로 이용이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 마이코플라즈마 검출용 프라이머의 설계

본 실시예에서는 인체의 호흡기에 감염되어 폐렴을 일으키는 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumonia), 남성에게 비임균성 요도염을 유발하는 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium)과 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum) 및 여성의 자궁경부나 난관, 난소 등 여성 생식기 질병과 연관이 있는 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)와 1종의 아코레플라즈마(Acholeplasma (A. laidlawii))를 포함한 다수의 마이코플라즈마 종(species)을 동시에 특이적으로 검출할 수 있도록 프라이머 세트를 설계하였다.

마이코플라즈마와 같은 원핵생물(prokaryote)의 rDNA 염기서열이 매우 잘 보존되어 있다. 이에 반하여, 이러한 rDNA 오페론(operon)의 간격(spacer) 영역의 염기서열 (ex. 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역) 및 그 길이는 종(species)마다 차이가 있다. 이 간격(spacer) 영역 중 어떤 부분은 마이코플라즈마 사이에도 종(species)에 따라 변이가 있으며, 또 다른 부분은 매우 보존적(conserved)이다. 따라서, 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역을 PCR 반응의 표적으로 선택하였다(도 2 참조).

1994년 Julie D. Thompson 등에 의해 개발된 다중 서열 정렬 프로그램인 Clustal W (http://www.ccbb.re.kr/clustalW.php)를 이용하여 14종의 마이코플라즈마의 16S rDNA 유전자 염기서열 일부와 23S rDNA 유전자 염기서열 일부 그리고 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역의 염기서열의 유사성을 비교 분석하였다. 이 결과로부터 14종 마이코플라즈마에 공통적인 염기서열 부분을 선택하였다(도 3, 4 참조).

이 때 14종 마이코플라즈마의 염기서열이 공통적인 부분이지만 일부 염기가 100％ 일치하지 않은 경우, 다종의 마이코플라즈마와 결합될 수 있도록 일치되지 않는 일부 염기를 혼합염기(mixed base)로 대체하여 설계하였다(표 1 참조).

[표 1] 혼합 염기(mixed base) 구성

혼합염기	뉴클레오타이드
Y	C 또는 T
W	A 또는 T
R	A 또는 G

상기와 같이 선택된 염기서열에 상보적인 염기서열을 가진 각 프라이머는 아래 표 2에 나타내었다.

[표 2] 마이코플라즈마 검출용 프라이머 세트

프라이머 세트	명칭	서열번호	염기서열 (5'→3')	길이(mer)
MP-F	OK 1089	1	ACACCA TGGGAG YTGGTA AT	20
MP-F	OK 1094	2	AAAGTG GGCAAT ACCCAA CGC	21
MP-R	OK 1110	3	GAGTTA GTTCCG TCCTTC ATCGCC T	25
	OK 1111	4	CTTCAT CGCCTA TTAGTG CCAAGG C	25
	OK 1112	5	CTTCAT CGCCTT TTAGTG CCAAGG C	25
	OK 1090	6	CTTCWT CGACTT YCAGAC CCAAGG CAT	27
MN-F	OK 1104	7	AAGGTA YCCCTA CGAGAA CGTGGG G	25
MN-R	OK 1114	8	GACCCA AGGCAT CCACCA WAWACY CTT	27
MN-R	OK 1119	9	CGCCTT TTRGTG CCAAGG CATCCA C	25

서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 구성되는 MP-F 프라이머 및 서열목록 제7서열의 염기서열로 구성되는 MN-F 프라이머는 마이코플라즈마 유전자 중 16S rDNA 유전자를 암호화 하는 염기서열에 결합한다(도 2, 도 3 참조).

또한, 서열목록 제3서열 내지 제6서열의 염기서열로 구성되는 MP-R 프라이머 및 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 구성되는 MN-R 프라이머는 23S rDNA 유전자를 암호화하는 염기서열에 결합한다(도 2 및 도 4 참조).

본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 행하면 14 종 마이코플라즈마의 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역이 특이적으로 증폭된다.

실시예 2 : hGAPDH 유전자 증폭용 프라이머의 설계

마이코플라즈마 검출을 위해 행하는 PCR 반응이 정상적으로 수행되어졌는지 여부를 판정하기 위해, 인체에 중복적(redundant)으로 존재하는 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 (human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, hGAPDH) 유전자를 내부 컨트롤(Internal control) 프라이머의 표적으로 설정하였다.

NCBI 사이트의 GenBank 데이터베이스를 검색하여 얻은 hGAPDH 유전자의 염기서열(GenBank accession number M17851)을 분석하고, 내부 컨트롤(internal control)로 사용하여도 마이코플라즈마 유래 산물과 혼동되지 않도록 마이코플라즈마 검출용 프라이머 세트에 의해 증폭되는 마이코플라즈마의 PCR 산물 크기를 고려하여 특이적으로 hGAPDH 유전자를 증폭 할 수 있도록 hGAPDH 유전자 염기서열의 540bp 내지 780bp 영역을 표적으로 하는 프라이머 세트를 고안하였다.

위와 같은 조건을 충족하는 hGAPDH 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트는 아래 표 3에 나타내었다.

[표 3] hGAPDH 유전자 증폭용 프라이머 세트

프라이머 세트	명칭	서열번호	염기서열(5'→3')	길이(mer)	PCR 산물(bp)
IC-P	OK 1124	10	CTCATG ACCACA GTCCAT GCCATC	24	210
IC-P	OK 1125	11	CACCAC TGACAC GTTGGC AGTGG	23	210
IC-N	OK 1126	12	ACTGCC ACCCAG AAGACT GTGGAT	24	163
IC-N	OK 1127	13	GGACAC GGAAGG CCATGC CAGT	22	163

IC-P 프라이머 세트는 1차 PCR(Primary PCR) 반응에 사용하고 IC-N 프라미어 세트는 2차 PCR (Nested PCR)반응시에 사용하였다. 도 5에 서열목록 제10서열, 제11서열, 제12서열 및 제13서열의 프라이머가 결합되는 서열부위를 나타내었다.

실시예 3 : 마이코플라즈마 DNA 추출

마이코플라즈마 검출을 위해 시험하고자 하는 세포배양액 또는 시료를 250g에서 3 분간 원심분리하여 상층액을 취한 후, 새 마이크로 튜브에 넣고 95℃에서 5 분간 가열하고, 살짝 원심분리하여 1차 PCR (Primary PCR) 반응에 주형으로 사용하였다. 추출한 DNA는 사용 전까지는 -20℃ 에서 보관하였다.

실시예 4 : 1차 PCR (Primary PCR) 수행

1차 PCR(Primary PCR) 반응은 총 반응물의 양을 25㎕로 수행하였으며, PCR 반응 샘플간의 오차를 줄이기 위하여 주형으로 사용할 DNA 추출물을 제외한 나머지 반응물을 모두 섞어 마스터 혼합물 (master mix)을 만들어서 PCR 반응을 수행하였다.

본 발명의 PCR 반응에는, 다종(species)의 마이코플라즈마 검출을 최적화할 수 있도록 프라이머 다이머(dimer)의 형성을 최소화시킨, 멀티플렉스(multiplex) PCR 반응에 적합한 h-Taq 중합효소(polymerase)를 사용한 2X premix (Solgent, SG6400)를 사용하였다.

PCR 반응 결과의 분석 및 판별이 용이하도록, 매 PCR 반응 시마다 분석하고자 하는 시료 외에 음성대조군으로서 증류수를 주형으로 하여 분석시료와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.

1차 PCR(Primary PCR) 반응을 위한 마스터 혼합물을 제조하였다. 1시료 당 필요한 각 반응물의 양(25㎕ PCR 반응물 기준)은 다음과 같다.

성분	양
MP-F 프라이머(서열목록 제1서열, 제2서열)	1㎕
MP-R 프라이머(서열목록 제3서열 내지 제6서열)	1㎕
IC-P 프라이머(서열목록 제10서열 및 제11서열)	1㎕
2X multiplex PCR premix (dNTP mix, h-Taq DNA polymerase, h-Taq buffer, loading dye) (Solgent, SG6400)	12.5㎕
증류수	7.5㎕

위의 5가지 반응물 각각에 대하여 [(시료개수 + 2) X (1 시료 당 필요한 반응물의 양)]으로 계산하고 하나의 튜브에서 혼합하여 마스터 혼합물을 완성했다.

각각의 0.2 ㎖ PCR 튜브 바닥에 음성대조군인 증류수, 양성대조군(positive control) 용액 및 준비한 시료의 DNA 추출물 각각을 2 ㎕씩 넣고, 각 튜브에 완성한 상기의 마스터 혼합물 23 ㎕씩을 첨가하여 혼합하였다.

상기와 같이 준비된 1차 PCR (primary PCR) 반응 혼합물은 Applied Byosystems, GeneAmp PCR system 9700 기기를 사용하여 95℃, 15분 → [95℃, 30초 → 65℃, 2분] 35회 반복 → 72℃, 5분 반응시켜 1차 PCR을 수행하였다.

실시예 5 : 2차 PCR (Nested PCR) 수행

2차 PCR (Nested PCR) 반응은 총 반응물의 양을 25 ㎕로 수행하였으며, 1차 PCR (Primary PCR) 반응과 마찬가지로 주형으로 사용할 1차 PCR 반응산물을 제외한 나머지 반응물을 모두 섞어 마스터 혼합물(master mix)을 만들어서 PCR 반응을 수행하였다.

2차 PCR (Nested PCR) 반응을 위한 마스터 혼합물을 다음과 같이 제조하였다. 1시료 당 필요한 각 반응물의 양(25㎕ PCR 반응물 기준)은 다음과 같았다.

성분	양
MN-F 프라이머(서열목록 제7서열)	1㎕
MN-R 프라이머(서열목록 제8서열 및 제9서열)	1㎕
IC-N 프라이머 세트(서열목록 제12서열 및 제13서열)	1㎕
2X multiplex PCR premix (dNTP mix, h-Taq DNA polymerase, h-Taq buffer, loading dye) (Solgent, SG6400)	12.5㎕
증류수	9㎕

위의 5가지 반응물 각각에 대하여 [(시료개수) X (1 시료 당 필요한 반응물 의 양)]으로 계산하고 하나의 튜브에서 혼합하여 마스터 혼합물을 완성했다. 각각의 0.2 ㎖ PCR 튜브 바닥에 1차 PCR 반응산물을 0.5 ㎕씩 넣고, 각 튜브에 완성한 상기의 마스터 혼합물 24.5 ㎕씩을 첨가하여 혼합한다.

상기와 같이 준비된 2차 PCR (Nested PCR) 반응 혼합물은 Applied Biosystems, GeneAmp PCR system 9700 기기를 사용하여 95℃, 15분 → [95℃, 30초 → 68℃, 2분] 35회 반복 → 72℃, 5분 반응시켜 2차 PCR (Nested PCR)을 수행하였다.

실시예 6 : PCR 산물 전기영동 확인

2차 PCR (Nested PCR) 반응을 종료한 각 반응액 10 ㎕을 2.5％ NuSieve:Seckem 아가로스 겔 상에 로딩하여 150V 전압으로 전기영동 하였다. 전기영동한 아가로스 겔을 EtBr로 염색한 후, UV 광선투사기(trans-illuminator)로 조사하여 PCR 산물의 밴드 유무와 그 크기를 확인하였다(표 4 참조).

[표 4] 1차 및 2차 PCR 반응 산물의 크기

14 종의 마이코플라즈마는 약 263bp 내지 469bp 사이에서 밴드가 확인되었다. 단, 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii)의 경우는 469bp 또는 259bp의 두 밴드가 확인될 수 있다(표 4, 도 6 참조).

실시예 7 : 마이코플라즈마 검출의 적합성 판정

반응에 사용한 시료가 인체에서 유래한 세포 또는 그 배양액이고 마이코플라즈마의 검출을 위한 2차 PCR(nested PCR) 반응이 성공적으로 수행되었다면 음성대조군인 증류수를 제외한 모든 반응물에서 163bp 밴드가 나타날 것이다.

본 발명의 마이코플라즈마 검출방법을 수행한 결과 도 6에서와 같이 163bp의 내부 컨트롤(internal control) 밴드와 약 250bp 내지 470bp 크기의 밴드가 동시에 확인되었고, 이 결과는 시료중에 마이코플라즈마가 오염된 것을 나타내는 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 마이코플라즈마(Mycoplasma) 특이적 프라이머 세트를 이용한 1차 PCR(Primary PCR)과 2차 PCR(Nested PCR) 두 단계의 핵산증폭법을 사용하여 마이코플라즈마의 오염여부를 진단하는 방법에 대한 개략도이다.

도 2는 본 발명의 마이코플라즈마 검출용 프라이머 세트의 표적 영역인 16S rDNA 유전자와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역 및 서열목록 제 1 서열 내지 제 9 서열의 프라이머(MP-F, MP-R, MN-F, MN-R)가 결합되는 위치를 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명의 마이코플라즈마 핵산증폭을 위한 전방향(forward) 프라이머를 설계하기 위하여 다중 서열정렬 프로그램인 Clustal W (http:// www.ccbb.re.kr/clustalW.php)를 이용하여 마이코플라즈마 14종의 16S rDNA 유전자 염기서열 일부와 23S rDNA 유전자 염기서열 일부 그리고 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역의 염기서열의 유사성을 비교 분석한 도면이다.

도 4는 본 발명의 마이코플라즈마 핵산증폭을 위한 역방향(reverse)프라이머를 설계하기 위하여 마이코플라즈마 14종의 16S rDNA와 23S rDNA 유전자 사이의 ITS 영역과 23S rDNA 유전자 염기서열 일부를 다중 서열정렬 프로그램인 Clustal W (http://www.ccbb.re.kr/clustalW.php)를 이용하여 염기서열의 유사성을 분석한 도면이다.

도 5는 내부 컨트롤(internal control)의 표적유전자로 선정한 인간 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(hGAPDH) 유전자의 염기서열 일부 및 PCR 반응의 적합성여부를 판단하기 위해 제작한 서열목록 제10서열 내지 제13서열의 프라이머가 결합하는 위치를 나타낸 도면이다.

도 6은 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 2차 PCR(nested PCR) 반응으로 14종의 마이코플라즈마에 대한 검출시험을 한 결과를 보여주는 도면이다. 도면에서 증류수(1)-음성대조군, 면역세포 배양액(2)-음성, 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii)(3), 마아코플라즈마 아스리티디스(M. arthritidis)(4), 마이코플라즈마 보비스(M. bovis)(5), 마이코플라즈마 퍼멘타스(M. fermentans)(6), 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium)(7), 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)(8), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis)(9), 마이코플라즈마 뉴로리티쿰(M. neurolyticum)(10), 마이코플라즈마 오레일(M. orale)(11), M. pirum(12), M. pneumoniae(13), M. pulmonis(14), M. salivarium(15), U. urealyticum(16)이다.

<110> Chungbuk National University NKBIO Co., Ltd <120> PCR Primer Set for Identification of Mycoplasma from Biological Medical Preparation and Detection Kit for Mycoplasma Comprising the Same <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 1 acaccatggg agytggtaat 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 2 aaagtgggca atacccaacg c 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 3 gagttagttc cgtccttcat cgcct 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 4 cttcatcgcc tattagtgcc aaggc 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 5 cttcatcgcc ttttagtgcc aaggc 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 6 cttcwtcgac ttycagaccc aaggcat 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 7 aaggtayccc tacgagaacg tgggg 25 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 8 gacccaaggc atccaccawa wacyctt 27 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 9 cgccttttrg tgccaaggca tccac 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 10 ctcatgacca cagtccatgc catc 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 11 caccactgac acgttggcag tgg 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 12 actgccaccc agaagactgt ggat 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Mycoplasma sp. <400> 13 ggacacggaa ggccatgcca gt 22

Claims

다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 검출 방법:

(a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계;

(b) (i) 상기 추출된 시료 DNA, (ⅱ) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머(forward primer), 및 (ⅲ) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머(reverse primer)를 포함하는 1차 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)액을 제조하는 단계; 및

(c) 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c) 이후에 다음의 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법:

(d) (i) 상기 1차 중합효소연쇄반응 생성물, (ⅱ) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머, 및 (ⅲ) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머를 포함하는 2차 중합효소연쇄반응액을 제조하는 단계; 및

(e) 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (b) 또는 단계 (d)의 중합효소연쇄반응액에 다음의 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트가 더욱 포함되는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법:

(a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머 및 (b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (c) 또는 단계 (e)의 중합효소연쇄반응은 (i) 90-98 ℃에서 25-35 초간의 변성 (denaturation) 과정 및 (ⅱ) 60-70 ℃에서 90-150 초간의 어닐링 (annealing) 및 신장 (elongation) 과정을 20-40회 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 마이코플라즈마는 마아코플라즈마 아스리티디스(M. arthritidis), 마이코플라즈마 보비스(M. bovis), 마이코플라즈마 퍼멘타스(M. fermentans), 마이코플라즈마 히오르히니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 뉴로리티쿰(M. neurolyticum), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 피룸(M. pirum), 마이코플라즈마 풀모니스(M. pulmonis), 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium), 아코레플라즈마 라이드로우이(Acholeplasma laidlawii), 마이코플라즈마 뉴모니아(M. pneumonia), 마이코플라즈마 제니탈리움(M. genitalium), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 또는 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출방법.
서열목록 제1서열, 제2서열, 제3서열, 제4서열, 제5서열, 제6서열, 제7서열, 제8서열 또는 제9서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머.
서열목록 제10서열, 제11서열, 제12서열 또는 제13서열의 염기서열로 표시되는 마이코플라즈마를 검출하기 위한 중합효소연쇄반응의 내부 컨트롤(internal control)용 중합효소연쇄반응 프라이머.
다음의 프라이머 세트를 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응(PCR) 키트(Kit).

(a) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머; 및

(b) 서열목록 제3서열, 제4서열, 제5서열 및 제6서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
제 8 항에 있어서, 다음의 프라이머 세트를 더욱 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트:

(a) 서열목록 제7서열의 염기서열로 이루어지는 전방향 프라이머; 및

(b) 서열목록 제8서열 및 제9서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 내부 컨트롤(internal control)용 프라이머 세트를 더욱 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트.
제 10 항에 있어서, 상기 내부 컨트롤용 프라이머 세트는 다음의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트.

(a) 서열목록 제10서열 및 제12서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 전방향 프라이머, 및

(b) 서열목록 제11서열 및 제13서열의 염기서열로 이루어지는 프라이머 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 역방향 프라이머.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, (c) dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (d) DNA 중합효소; 및 (e) 완충(buffer)용액을 더욱 포함하는 마이코플라즈마 검출용 중합효소연쇄반응 키트.