KR20050017826A

KR20050017826A - 마이코플라즈마의 탐지 및 동정

Info

Publication number: KR20050017826A
Application number: KR1020030055253A
Authority: KR
Inventors: 국윤호; 고관수
Original assignee: 국윤호
Priority date: 2003-08-11
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2005-02-23
Also published as: KR100502765B1

Abstract

본 발명은 분자생물학적 방법 가운데 가장 간편하고 기본적인 PCR을 통하여 마이코플라즈마 속 균종을 탐지 및 동정하고자 하는 것으로, 서열 28 내지 31의 어느 하나로 표시되는 마이코플라즈마 속 균종의 동정을 위한 PCR용 프라이머; 서열 32 내지 37의 어느 하나로 표시되는 마이코플라즈마 속 균종의 탐지를 위한 그룹 특이 PCR용 프라이머; 그리고 이들 프라이머 쌍을 포함하는 마이코플라즈마 속(屬, genus) 'Pneumoniae 그룹' 또는 'Hominis 그룹' 균종의 탐지 및 동정을 위한 진단용 키트를 이용하여, 마이코플라즈마 그룹 특이 seminested rpoB PCR을 수행함으로써 환자나 동물의 임상 검체 또는 오염된 세포 배양액에 마이코플라즈마가 존재하는가 여부를 알 수 있고, 존재할 경우 그것이 마이코플라즈마의 두 그룹인 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'의 어디에 속하는 것인지 개괄적인 동정이 PCR만으로도 가능할 뿐 아니라, 염기서열 확인용 두 종류의 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 표준균주들의 염기서열과 비교하여 상동성을 측정하거나 작성된 계통수에 대입하여 비교함으로서 균종 동정을 완결할 수 있다.

Description

마이코플라즈마의 탐지 및 동정{DETECTION AND IDENTIFICATION OF MYCOPLASMA SPECIES}

본 발명은 분자생물학적 방법 가운데 가장 간편하고 기본적인 PCR을 통하여 마이코플라즈마를 탐지 및 동정하는 기술에 관련된다.

마이코플라즈마(Mycoplasma)와 우레아플라즈마(Ureaplasma) 속에 속한 균종들은 세포벽이 없는 세균들이다. 이들은 비교적 작은 유전체를 갖고 있으며 특별한 영양 공급을 필요로 하기 때문에 배양 방법이 까다롭다(Waites, K.B. and Taylor-Robinson, D. (1999) Mycoplasma and Ureaplasma. p. 582-794. In Murray, P. R. (ed.), Manual of clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D. C.). 이 균종들은 사람, 동물, 곤충, 식물 등 다양한 숙주에 기생하며 자연계에 널리 분포한다(Razin, S., Yogev, D. and Naot, Y. (1998) Molecular biology and pathogenicity of Mycoplasmas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 1094-1156)). 현재까지 마이코플라즈마 속의 13 종과 우레아플라즈마 속의 2 종이 사람으로부터 분리되는 것으로 알려져 있다(Waites, K. B., et al., 1999; Yoshida, T., Maeda, S.-I., Deguchi, T. and Ishiko, H. (2002) Phylogeny-based rapid identification of mycoplasmas and ureaplasmas from urethritis patients. J. Clin. Microbiol. 40, 105-110).

M. pneumoniae, M. hominis, M. genitalium, M. fermentans 및 M. penetrans의 다섯 마이코플라즈마 속 균종과 두 우레아플라즈마 속 균종이 사람의 질병을 일으킨다고 알려져 있는데 (Waites, K. B., et al. 1999), 이들은 주로 호흡기나 비뇨기 계통의 점막에 존재하다 분리되는 병원성 미생물이다. 이밖에 많은 균종들이 동물에도 병을 일으켜 수의학 분야에서도 주목하고 있는 미생물이다(Pettersson, B., Uhlen, M., Johansson, K.-E. (1996) Phylogeny of some mycoplasmas from ruminants based on 16S rRNA sequences and definition of a new cluster within the hominis group. Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 1093-1098.)

마이코플라즈마 속 균종은 흔히 연구실험실에서 사용하는 배양세포를 감염시키며 심각한 문제를 일으킨다. 실험실에서 사용하는 배양세포의 10∼87%가 마이코플라즈마에 감염되어 있다는 보고도 있으며(Razin, S., et al., 1998), 흔히 M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, M. fermentans, M. pirum 및 Acholeplasma laidlawii 등이 이 같은 배양세포 감염을 일으킨다(Razin, S., et al., 1998).

마이코플라즈마를 탐지하거나 동정하기 위하여 여러 가지 방법들이 시도되어 왔는데, 여기에는 배양법, 형광색소 DNA(fluorochrome DNA) 염색법, 면역학적 방법(enzyme-linked immunosorbent assay 및 immunofluorescence), 생화학적인 방법, 그리고 DNA 프로브(probe) 분석 등이 포함된다. 이들 방법은 각각 마이코플라즈마를 탐지하는데 있어 나름의 장점을 가지고 있지만, 비용, 시간, 신뢰도, 특이성(specificity), 그리고 감도(sensitivity) 등과 관련된 단점들이 있기 때문에, 최근에는 이를 극복하기 위하여 PCR 방법이 이용되고 있다.

분자생물학적 방법으로 균종을 감별하기 위해서는 표적 유전자로 어떤 것을 사용하는가에 따라 그 효용성이 좌우된다. 16S rRNA 유전자(16S rDNA)는 세균의 분류 또는 감별 동정에 흔히 사용되고 있으며 마이코플라즈마 속과 우레아플라즈마 속 균종들의 계통학적 연구에도 사용된 적이 있으나(Yoshida, T., et al., 2002; Pettersson, B., et al., 1996; Weisburg, W.G., Tully, J.G., Rose, D.L., Petzel, J.P., Oyaizu, H., Yang, D., Mandelco, L., Sechrest, J., Lawrence, T.G., Van Etten, J., Maniloff, J. and Woese, C.R. (1989) A phylogenetic analysis of the mycoplasmas: basis for their classification. J. Bacteriol. 171, 6455-6467; Pettersson, B., Tully, J.G., Bolske, G. and Johansson, K.-E. (2000) Updated phylogenetic description of the Mycoplasma hominis cluster (Weisburg et al. 1989) based on 16S rDNA sequences. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 290-301.), 연구자마다 서로 연관된 균종간의 관계가 일치하지 않는 등 불합리한 점이 노출된 바 있다(Yoshida, T., et al., 2002; Weisburg, W.G., et al., 1989; Pettersson, B., et al., 2000). 특히 16S rDNA 서열 사용이 불합리한 가장 큰 이유는 마이코플라즈마 균종들이 2 개 이상의 16S rRNA 오페론을 갖고 있다는 점(Pettersson, B., et al., 1996)과, 종내 변이(intraspecific variation)가 매우 높다는 점에 있다(Pettersson, B., Bolske, G., Thiaucourt, F., Uhlen, M. and Johansson, K.-E. (1998) Molecular evolution of Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae strains, based on polymorphisms in the 16S rRNA genes. J. Bacteriol. 180, 2350-2358; Konigsson, M.H., Bolske, G., Johansson, K.-E. (2002) Intraspecific variation in the 16S rRNA gene sequences of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis strains. Vet. Microbiol. 85, 209-220). 이에 따라, 16S rDNA 대신 단백질을 코딩하는 유전자를 사용할 것을 권장하기도 했으나(Palys, T., Nakamura, K. and Cohan, F.M. (1997) Discovery and classification of ecological diversity in the bacterial world: the role of DNA sequence data. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 1145-1156), 아직 마이코플라즈마와 우레아플라즈마 균종 분류나 계통학적 연구에 사용된 것은 없었다.

이를 구체적으로 살펴보면, 마이코플라즈마의 계통학적 관계는 대개 16S rDNA 염기서열에 근거하여 설명되어 있으며(Pettersson, B., et al., 1996; Weisburg, W.G., et al., 1989; Woese, C.R., Kandler, O. and Wheelis, M.L. (1990) Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archae, Bacteria, and Eukarya. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4576-4579; Rawadi, G., Dujeancourt-Henry, A., Lemercier, B., and Roulland-Dussoix, D. (1998) Phylogenetic position of rare human mycoplasmas, Mycoplasma faucium, M. buccale, M. primatum and M. spermatophilum, based on 16S rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 305-309), 16S rDNA 염기서열에 따라 마이코플라즈마를 몇 개의 그룹이나 클러스터로 나누고 있는데(Yoshida, T., et al., 2002; Pettersson, B., et al., 1996; Weisburg, W.G., et al., 1989; Pettersson, B., et al., 2000), 이런 분류가 생화학적 성상과 어느 정도 일치하였다 (Pettersson, B., et al., 2000). 그러나 한 유전자 염기서열만으로 계통학적 결론을 내리기는 어렵기 때문에 몇 가지 유전자를 분석하여 비교하는 것이 바람직하다(Palys, T., et al., 1997; Roux, V., Rydkina, E., Eremeeva, M., and Raoult, D. (1997) Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the richettsiae. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 252-261). 특히 마이코플라즈마처럼 rrn 오페론이 여럿 있는 경우 (Pettersson, B., et al., 1996)와, 종내 염기서열 변이가 심한 경우(Pettersson, B., et al., 1998; Konigsson, M.H., et al., 2002), 16S rDNA 염기서열 하나에만 의존해서는 오류를 범할 수 있다. 또한 사람이나 동물, 또는 배양세포를 감염시킨 마이코플라즈마를 탐지하거나 동정할 목적으로 이런 유전자를 증폭하거나 염기서열을 이용할 경우 위양성이나 위음성이 예견되는 것은 당연하고 할 것이다.

본 발명에서는 분자생물학적 방법 가운데 가장 간편하고 기본적인 PCR을 통하여 마이코플라즈마를 탐지-동정하는 방법을 개발하고자 하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 서열 1 내지 23의 어느 하나로 표시되는, 마이코플라즈마(Mycoplasma) 속 균종의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편, 서열 24 및 25의 어느 하나로 표시되는, 우레아플라즈마(Ureaplasma) 속 균종의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편 및 서열 26으로 표시되는, Acholeplasma laidlawii의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편을 제공한다.

또한, 본 발명에 따라, 서열 28 내지 31의 어느 하나로 표시되는 마이코플라즈마 속 균종의 동정을 위한 PCR용 프라이머, 및 서열 32 내지 37의 어느 하나로 표시되는 마이코플라즈마 속 균종의 탐지를 위한 PCR용 프라이머가 제공된다.

마찬가지로, 본 발명에서는 서열 28 내지 31로 표시되는 프라이머를 포함하는, 마이코플라즈마 속 균종의 동정을 위한 진단용 키트; 서열 32 및 33으로 표시되는 프라이머를 포함하는, 마이코플라즈마 속 'Pneumoniae 그룹' 균종의 탐지를 위한 진단용 키트, 및 서열 34, 35 및 37 또는 서열 34, 36 및 37로 표시되는 프라이머를 포함하는, 마이코플라즈마 속 'Hominis 그룹' 균종의 탐지를 위한 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서는 사람 또는 동물 감염증을 일으키거나 실험실에서 배양 세포를 오염시켜 문제가 되는 마이코플라즈마의 탐지 및 균종 동정에 사용할 수 있는 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(이하 rpoB로 약칭) 증폭용 특이 PCR을 개발하였으며 마이코플라즈마 26 균종의 rpoB 염기서열(282∼387 bp)을 새로이 확인 및 결정하였다(서열 1∼27). 이 염기서열 결정용 PCR에 사용한 프라이머는 'Pneumoniae 그룹' 용으로 MPF1(5'-GAY ATT GAT CAC TTA GGT AA-3': 서열 28)와 MPR1(5'-CTT CNG GTG TTT CAA TNG G-3': 서열 29)를, 그리고 'Hominis 그룹'용으로 MPF2(5'-AGA TGA TGA YCC NGA TTC A-3': 서열 30)와 MPR2(5'-ACA AAT TCT TCC ATA RTG AGT-3': 서열 31)로, 이들 프라이머 쌍을 이용하여 rpoB DNA를 증폭시킨 후 염기서열을 결정하였다.

표적 부위 rpoB DNA는 마이코플라즈마 균종 별로 크기나 염기서열 변화가 심하지만 아미노산과 염기서열로 계통학적 분석을 한 결과 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'으로 잘 나뉘어졌다. 이로서 rpoB 염기서열이 균종 감별에 필요한 충분한 변별력을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서는 26 균종 rpoB DNA의 염기서열에 근거하여 마이코플라즈마 각 그룹에 속한 균종을 특이적으로 탐지하기 위한 2 종류(3 세트)의 PCR 방법을 고안하였다. 여기에서 사용하는 PCR용 프라이머는, (1) 'Pneumoniae 그룹'과 우레아플라즈마 용으로 MP-GPF(5'-GAA AAR TTR GCA ATT GCW GAT GG -3': 서열 32)와 MP-GPR(5'-CGR ATA TCY AAG TTA GGG TCT TC-3': 서열 33)로 구성된 한 세트, 그리고 (2) 'Hominis 그룹' 용으로는 seminested PCR 방법으로 또 다른 프라이머인 MP-GHF1(5'-GAR YTA TTA CAA AAY CAA TT-3': 서열 34)와 MP-GHF2(5'-GAA AGA ATG KSA GCT AAA GA-3': 서열 35), 그리고 MP-GHR(5'-CSA RTG GAT TAM WTT GRT CCA T-3': 서열 37)로 구성된 한 세트, 또는 MP-GHF1과 MP-GHR은 그대로 사용하고 MP-GHF2 대신 MP-GHF3(5'-GAA AAA AMY ACW MRT GAA AGA AT-3': 서열 36)를 이용하는 한 세트이다.

이들 마이코플라즈마 균종의 탐지 및 동정을 위한 프라이머 쌍에 대하여 좀더 설명하자면, 먼저 MPF1과 MPR1 쌍은 마이코플라즈마 속 'Pneumoniae 그룹' 균종의 114∼136 개 아미노산을 코딩하는 DNA(약 320 bp 전후)를 얻기 위해 사용된 것으로, 증폭된 염기서열을 표준 균주들의 염기서열과 비교하여 상동성을 측정하거나 계통수에 대입하여 비교함으로써 마이코플라즈마 속 'Pneumoniae 그룹' 균종 동정이 가능하다. 이처럼, 마이코플라즈마 속 'Pneumoniae 그룹'의 염기서열을 확인한 후 그 염기서열 안쪽에서 'Pneumoniae 그룹'이 공통적으로 증폭되는 것, 즉 'Pneumoniae 그룹' 균종 특이적이라 할 수 있는 것을 찾아 만든 것이 MP-GPF와 MP-GPR 프라이머 쌍이다. 이들 MP-GPF와 MP-GPR 프라이머 쌍은 염기서열 결정에 사용할 수도 있지만, 단순히 PCR로 마이코플라즈마 속 'Pneumoniae 그룹' 균종의 존재 여부를 탐지하기 위해 사용된다.

또한, 'Pneumoniae 그룹'에 사용한 MPF1과 MPR1 쌍과 마찬가지로, MPF2와 MPR2 쌍의 경우도 마이코플라즈마 속 'Hominis 그룹' 균종의 염기서열을 결정하기 위해 약 104∼105 개 아미노산을 코딩하는 DNA(약 320 bp 전후)를 얻기 위한 프라이머 쌍이다. 이와 같이 염기서열을 확인한 후 'Hominis' 그룹 균종이 공통적으로 증폭되는, 'Hominis' 그룹 균종 특이적이라 할 수 있는 MP-GHF1, MP-GHF2와 MP-GHR 또는 MP-GHF1, MP-GHF3와 MP-GHR 프라이머 쌍을 제작하였다. 여기에서, MP-GHF1과 MP-GHF2, 그리고 MP-GHR 등 3 가지 프라이머를 사용하는 것은 한 튜브 안에서 서로 다른 2 종류 PCR을 시행(seminested PCR)하기 위한 것으로, 특이성을 갖추고 생산량을 늘이기 위한 것이다. 즉 MP-GHF1과 MP-GHR 쌍에 의해 조금 큰 DNA가 증폭되고(1차 산물), 그 증폭된 1차 산물을 주형으로 MP-GHF2(또는 MP-GHF3)와 MP-GHR 쌍에 의해 다시 PCR로 증폭되어 2차 산물이 생성된다.

본 발명에서 표적으로 삼은 rpoB 유전자는 RNA 폴리머라제의 β-서브유닛을 인코딩하는 것으로, 본 발명자에 의해 마이코박테리움(Mycobacterium), 보렐리아 (Borrelia), 레지오넬라(Legionella)와 같은 다른 세균의 동정이나 계통학적 분류를 위해 사용된 바 있다(Mollet, C., Drancourt, M., and Raoult, D. (1997) rpoB sequence analysis as a novel basis for bacterial identification. Mol. Microbiol. 26,1005-1011; Kim, B.-J., Lee, S.-H., Lyu, M.-A., Kim, S.-J., Bai, G.-H., Kim, S.-S., Chae, G.-T., Kim, E.-C., Cha, C.-Y. and Kook, Y.-H. (1999) Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene (rpoB). J. Clin. Microbiol. 37, 1714-1720; Lee, S.-H., Kim, B.-J., Kim, J.-H., Park, K.-H., Kim, S.-J., and Kook, Y.-H. (2000) Differentiation of Borrelia burgdorferi sensu lato on the basis of RNA polymerase gene (rpoB) sequences. J. Clin. Microbiol. 38, 2557-2562; Ko, K.S., Lee, H.K., Park, M.-Y., Lee, K.-H., Yun, Y.-J., Woo, S.-Y., Miyamoto, H. and Kook, Y.-H. (2002) Application of RNA polymerase β-subunit gene (rpoB) sequences for the molecular differentiation of Legionella species. J. Clinical Microbiol. 40, 2653-2658).

이 유전자는 특정 부위의 변이가 리팜핀에 대한 내성 여부와 관련이 있으며, 이 부위를 포함하는 부분이 유전자 변이가 적고 균종간에 잘 보존된 부위로서 균종 감별을 가능하게 하는 부위이다. 따라서 마이코플라즈마 속(屬, genus)에서도 다른 속의 균종들과 마찬가지로 이 부위에 그들만의 독특한 염기서열을 갖고 있을 것으로 보고, 26 마이코플라즈마 균종으로부터 rpoB DNA의 염기서열을 결정하였고, 결정한 염기서열에 기초하여 마이코플라즈마 속 균종들만의 rpoB DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 개발하여 마이코플라즈마 특이 PCR을 가능하도록 하였다.

본 발명에 따르면, 마이코플라즈마 감염이 의심되는 임상 검체나 실험실내 배양 세포로부터 '마이코플라즈마 그룹 특이 PCR'을 통해 탐지가 가능하고, 이렇게 탐지된 균종의 경우, 그 염기서열을 결정함으로써 표준균주들에 대한 염기서열 상동성을 측정하거나 계통수에 대입-비교하여 동정에 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

(1) 사용 균주

마이코플라즈마 속의 23 종, 우레아플라즈마 속의 2 종, 그리고 Acholeplasma laidlawii 등 모두 26 종의 표준 균주(26 주)를 사용하였다. 다음 표 1은 본 실시예에 사용한 균종들과 확인된 rpoB 염기서열의 GenBank accession number를 나타낸 것이다.

Species Strain number Accession number

M. anatis ATCC 25524 AY191418 M. arthritidis ATCC 19611 AY191419 M. bovis ATCC 25523 AY191420 M. buccale ATCC 23636 AY191421 M. fermentans ATCC 19989 AY191422 M. gallinarum ATCC 15319 AY191423 M. gallisepticum ATCC 19610 AY191424 M. genitalium ATCC 33530 AY191425 M. hominis ATCC 23114 AY191426 M. hyopneumoniae ATCC 25617 AY191427 M. hyorhinis ATCC 23839 AY191428 M. iowae ATCC 33552 AY191429 M. lipophilum ATCC 27104 AY191430 M. orale ATCC 23714 AY191431 M. penetrans KMC-1^a AY191432 M. pirum ATCC 25960 AY191433 M. pneumoniae ATCC 15531 AY191434 M. primatum ATCC 25948 AY191435 M. pullorum ATCC 33553 AY191436 M. pulmonis ATCC 19612 AY191437 M. salivarium ATCC 23064 AY191438 M. spermatophilum ATCC 49695 AY191439 M. synoviae ATCC 27399 AY191440 U. parvum ATCC 27813 ^a AY191441 U. urealyticum ATCC 27814 ^a AY191442 Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 AY191443 Spiroplasma citri R8A2HP U25815^b

^a ATCC 27813, U. urealyticum serovar 1; ATCC 27814, U. urealyticum serovar 2.

^b rpoB sequence는 GenBank로부터 인용.

(2) DNA 준비

DNA는 비드 비터(bead beater)-페놀 추출 방법을 사용하여 준비하였다.

구체적으로, 세균 부유액 200 ㎕를 2.0 ㎖ 스크류-마개달린 마이크로원심분리관에 넣고, 200 ㎕의 페놀-클로로포름-이소프로필 알콜(50:49:1)과 200 ㎕ (packed volume)의 글라스 비드를 넣어 미니-비드 비터로 5,000 rpm에서 30 초간 진탕한 다음, 14,000 rpm으로 10 분간 원침하였다. 상층액은 다른 튜브에 옮겨 2∼3 배 용적의 무수알콜로 DNA를 침전시킨 다음, 60 ㎕의 증류수에 녹여 PCR용 주형 DNA로 사용하였다.

(3) PCR

우선 염기서열을 결정하기 위한 DNA를 얻기 위해, 마이코플라즈마와 우레아플라즈마 균속에 속한 균종들로부터 우선 'Pneumoniae 그룹' 용으로 MPF1(5'-GAY ATT GAT CAC TTA GGT AA-3': 서열 28)와 MPR1(5'-CTT CNG GTG TTT CAA TNG G-3': 서열 29)를, 그리고 'Hominis 그룹'용으로 MPF2(5'-AGA TGA TGA YCC NGA TTC A-3': 서열 30)와 MPR2 (5'-ACA AAT TCT TCC ATA RTG AGT-3': 서열 31)를 이용하여 rpoB DNA를 증폭시킨 후 염기서열을 결정하였다.

구체적으로, 주형 DNA는 각각 50 ng씩을 20 pmol의 각 프라이머와 함께, 1 유닛의 Taq DNA 폴리머라제, 각 dNTP 250 μM, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 그리고 겔 로딩 염료(gel loading dye)가 포함되어 있는 PCR 혼합물 튜브(AccuPower PCR PreMix; Bioneer, 대한민국)에 넣은 다음, 최종 부피가 20 ㎕로 되도록 증류수를 넣었다. 혼합물은 95 ℃에서 30 초, 42 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1 분간의 조건으로, 30 사이클을 수행하고 72 ℃에서 5 분간 최종 연장(extension)을 시행하였다(Model 9700 Thermocycler; Perkin-Elmer Cetus, USA). 증폭된 PCR 산물은 1.5 % 아가로스 겔 상에서 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드로로 염색하여 확인하고 염기서열 결정을 위해 QIAEX II gel extraction kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 정제하였다.

(4) rpoB의 염기서열 결정

정제한 PCR 산물의 염기서열은 각 균종별로 PCR에 이용하였던 전방향-역방향 프라이머 쌍으로 자동 염기서열 분석기(Applied Biosystems automated sequencer, model 377; BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom)를 사용하여 결정하였다. 시퀀싱 반응은 30 ng의 정제된 PCR 산물과, 각 프라이머 2.5 pmol, 그리고 4 ㎕의 BigDye Terminator RR mix(Perkin-Elmer Applied Biosystems; part no. 4303153)를 섞은 다음 증류수를 넣어 부피를 10 ㎕로 한 다음, 5%(vol/vol)가 되도록 디메틸설폭시드를 넣어 PCR을 시행하였다(30 사이클: 95 ℃ 15 초, 50 ℃ 5 초, 60 ℃ 4 분). 정확을 기하기 위해 양쪽 방향으로 모두 염기서열을 결정하였다.

(5) 염기서열 분석 및 계통학적 분석

염기서열은 컴퓨터 프로그램인 DNASTAR(Madison, WI)로 분석하였으며, 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여(MegAlign program in DNASTAR, Madison, WI) 멀티플 얼라인먼트(Multiple alignments)를 시행하였다. 아미노산과 염기서열을 사용한 계통수는 PAUP 프로그램에 있는(Swofford, D.L. (1999) PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony (* and other methods), version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.) NJ(Neighbor-joining) 방법으로 구성하였으며, 페어방향 거리(pairwise distance)는 최대 가능치 옵션(maximum likelihood option)을 사용하여 계산하였다. 외부그룹으로 사용한 2 균주 중, Acholeplasma laidlawii의 rpoB 염기서열은 직접 결정하여 사용하였으나, Spiroplasma citri의 rpoB 염기서열은 GenBank에서 꺼내 사용하였다(Accession no. U25815)(위 표 1 참조). Branch supporting value들은 1000 회 반복 시행하였다.

rpoB의 염기서열을 이용한 계통도와 비교하기 위하여 사용한 26 종 마이코플라즈마의 16S rRNA 유전자 염기서열을 GenBank에서 꺼내 계통도를 작성하였다. ILD(Incongruence length difference) 테스트(PAUP 프로그램의 부분 상동성 테스트(partition homogeneity test)(Farris, J.S., Kallersjo, M., Kluge, A.G., Bult, C. (1995) Testing significance of incongruence. Cladistics 10, 315-319; Cunningham, C.W. (1997) Can three incongruence tests predict when data should be combined? Mol. Biol. Evol. 14, 733-740)는 rpoB 분석 결과와 16S rRNA 유전자(rDNA) 분석 결과가 서로 일치하는가 보기 위해 PAUP 프로그램을 이용하여 시행하였다.

(6) 마이코플라즈마 그룹 특이 PCR

확인한 rpoB DNA의 염기서열에 기초하여 'Pneumoniae 그룹' 과 'Homonis 그룹'에 속하는 거의 모든 균종들을 증폭할 수 있는 프라이머를 고안하여 특이적인 PCR을 수행할 수 있었다. 'Pneumoniae 그룹'과 우레아플라즈마 용으로는 MP-GPF (5'-GAA AAR TTR GCA ATT GCW GAT GG -3': 서열 32)와 MP-GPR(5'-CGR ATA TCY AAG TTA GGG TCT TC-3': 서열 33)로 구성된 한 세트, 그리고 'Hominis 그룹' 용으로는 seminested PCR 방법으로, MP-GHF1(5'-GAR YTA TTA CAA AAY CAA TT-3': 서열 34)와 MP-GHF2(5'-GAA AGA ATG KSA GCT AAA GA-3': 서열 35), 그리고 MP-GHR(5'-CSA RTG GAT TAM WTT GRT CCA T-3': 서열 37)을 사용하는 한 세트와, 바깥 프라이머인 MP-GHF1와 MP-GHR는 그대로 사용하되 안쪽 프라이머는 MP-GHF2 대신 MP-GHF3(5'-GAA AAA AMY ACW MRT GAA AGA AT-3': 서열 36)를 이용하는 다른 한 세트 등, 모두 세 가지 세트를 고안하였다. PCR 조건은 앞서 사용한 조건을 그대로 이용하였다.

실시예 1: 마이코플라즈마 속 및 우레아플라즈마 속 균종의 염기서열 및 계통학적 관계 분석

전체 유전체의 염기서열의 결정되어 있는 종들(M. pneumoniae, M. genitalium, M. pulmonis, M. gallisepticum, M. penetrans 및 U. urealyticum)의 rpoB DNA의 염기서열을 근거로 프라이머를 제작한 후, PCR로 마이코플라즈마 26 균종들의 rpoB DNA를 증폭하여 염기서열들을 결정할 수 있었다(서열 1 내지 27의 각 균종의 rpoB 염기서열 참고). 앞서 전체 염기서열이 알려진 균종의 경우, 본 발명의 프라이머를 이용한 PCR로 확인된 염기서열인 서열 7(M. genitalium), 8(M. gallisepticum), 15(M. penetrans), 17(M. pneumoniae), 20(M. pulmonis) 및 25( U. urealyticum)과 비교할 때 동일하였다.

염기서열 분석 결과 심한 변화가 관찰되었으므로, 염기서열만으로는 정상적인 정렬이 불가능하였다. 따라서, 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여 계통 분석에 사용하였다. 그 결과 갭(gap)을 포함하여 모두 136 개의 아미노산을 확인하였으며, 특징적으로 3 곳의 삽입-상실(insertion-deletion; ID-1, -2, -3) 부위가 있음을 확인하였다.

도 1은 rpoB 염기서열로부터 추론한 아미노산 서열들의 정렬을 나타낸 것으로, Consensus sequence와 동일한 아미노산은 점으로, 3 곳의 삽입-상실 부위(ID-1, -2, -3)는 회색음영으로 표시하였다. 실선 상자와 별표는 각각 리팜핀 내성 관련 부위와, 리팜핀 내성에 흔히 관련된 아미노산을 나타낸다. 여기에서 보면, 'Pneumoniae 그룹' 8 균종의 ID-1에서는 7 개의 아미노산이 빠졌으며, 'Hominis 그룹'에서는 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis를 제외한 15 종과 A. laidlawii 및 S. citri가 특징적으로 ID-2에서 1 개 아미노산의 갭이 있었다. ID-3는 무려 31 개의 아미노산이 빠진 부위로서 우레아플라즈마 속의 2 균종들과는 달리 'Hominis 그룹'의 모든 균종과 A. laidlawii, S. citri에서 확인할 수 있다. 'Pneumoniae 그룹' 균종들에서도 역시 결손이 발견되나 일정한 양상을 관찰할 수는 없었다. 심한 삽입 또는 결손에도 불구하고 리팜핀-내성과 직접 관련 있는 것으로 알려진 부위의 아미노산들은(별표) 모든 균종에서 잘 보존되어 있었다. 특히 Mollicutes 균종들의 리팜핀 내성과 관련있는 것으로 보고된(Gaurivaud, P., Laigret, F. and Bove, J.-M. (1996) Insusceptibility of members of the class Mollucutes to rifampin: studies of the Spiroplasma citri RNA polymerase β-subunit gene. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 858-862) N₅₂₆ (화살표)는 3 종을 제외한 거의 모든 마이코플라즈마에서 볼 수 있었다.

rpoB 아미노산과 해당 염기서열에 근거하여 마이코플라즈마 속과 우레아플라즈마 속에 속하는 25 종들의 계통학적 관계를 계통수로 구성하였다. 도 2는 rpoB의 아미노산서열(A)과 염기서열(B)로 구성한 rpoB 계통도로, 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'이 잘 구분되어 나타나 있다. 계통도들은 PAUP(Swofford, D.L., 1999)의 NJ 방법으로 작성하였으며, Acholeplasma laidlawii와 Spiroplasma citri를 외부그룹으로 하였으나 도면에는 표시하지 않았다. 부트스트랩 값(Bootstrap value)은 1000회 반복하여 계산하고 50% 이상인 것만 해당 분지에 표시하였으며, 그룹과 클러스터 표시는 타 연구자가 사용한 분류를 그대로 적용하였다(Yoshida, T., et al., 2002; Weisburg, W.G., et al., 1989). 눈금 막대는 100 염기(nucleotide)당 5 치환(substitution)을 나타낸다.

도 2에서 보면 두 계통수에서 모두 마이코플라즈마 균종들이 두 개의 그룹, 즉 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'으로 나뉘어지는 것을 볼 수 있는데, 이는 이전의 다른 사람들의 연구 결과(Pettersson, B., et al, 1996; Pettersson, B., et al., 2000)와도 일치하는 것이다. 16S rDNA 일부 염기서열 분석 결과에 따라 나뉘어졌던(Yoshida, T., et al, 2002) 클러스터 B와 클러스터 C에 속한 균들도 약간의 차이가 있을 뿐, 'Hominis 그룹'으로 rpoB 계통수에서도 잘 구분되고 있다. 'Pneumoniae 그룹'의 M. penetrans와 M. iowae는 아미노산 계통수에서 우레아플라즈마 속 두 균종과 서브그룹을 형성하였지만(A), 염기서열로 구성한 계통수에서는 그렇지 않았다(B). 그 외에 M. bovis나 M. anatis의 위치도 두 계통수 간에 약간의 차이가 있다.

도 3은 GenBank에서 인용한 16S rDNA 염기서열로 구성한 계통도로, 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'의 클러스터를 표시한 것이다. 도 2와 같은 방법으로 작성되었으며, 눈금 막대는 100 염기당 1 치환을 나타낸다. rpoB 분석 결과와 비교하기 위해 구성한 16S rDNA 계통수를 보면 Pettersson 등(Pettersson, B., et al., 2000)이 구분한 5 개의 클러스터들은 rpoB 결과와 완전히 일치하지는 않는 것을 볼 수 있다. Yoshida 등(Yoshida, T., et al., 2002)이 보고한 '클러스터 C'에 해당하는 'M. hominis 클러스터'의 5 균종들은 rpoB 계통수에서도 한 그룹을 형성하며, 16S rDNA 계통수는 rpoB 염기서열로 구성한 계통수와 동일하였다. 'M. neurolyticum 클러스터'의 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis 외의 다른 클러스터들은 16S rDNA와 rpoB 계통수가 일치하지 않았다. 일치하지 않은 대표적인 예는 M. pulmonis, M. gallinarum 및 M. lipophilum였다. 또한 M. lipophilum, M. primatum 및 M. bovis 같은 균종은 rpoB의 뉴클레오티드 서열로부터 유추한 계통수 상의 어떤 cluster에도 포함되지 않았다(도 2 및 3 참조).

한편, rpoB와 16S rDNA 계통수 간의 일치 정도를 측정하기 위해 ILD (incongruence length difference) 테스트t(Farris, J.S., et al., 1995)를 시행한 결과, 두 데이터 세트 사이에는 계통수 작성시의 오류가 아닌 유의한 불일치가 존재하며(p<0.001), M. gallinarum, M. synoviae, M. primatum, M. lipophilum, M. bovis 및 M. pulmonis 등 6 종이 이와 같은 결과를 초래한다는 것을 알 수 있었다.

이상과 같은 결과들은 rpoB 염기서열과 아미노산 서열이 마이코플라즈마 균종들 간의 관계를 잘 반영하는 것을 의미하며, 이는 마이코플라즈마 균종 또는 마이코플라즈마가 있을 것으로 의심되는 미지의 검체로부터 rpoB PCR-시퀀싱으로 확인한 염기서열을 표준균주들의 염기서열과 비교함으로서 균종을 탐지/동정할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 다음에는 그 예를 기술할 것이다.

실시예 2: 야생형 분리 균주의 염기서열 상동성 측정에 의한 균종 동정

국내 환자와 가축에서 분리되어 기존의 방법으로 동정된 M. pneumoniae 55 주와 M. hyorhinis 19 균주들의 rpoB 염기서열을 결정하여 각 표준균주의 염기서열과 비교 분석하였다.

그 결과, M. pneumoniae 55 주 사이에는 100%의 상동성을, 그리고 M. hyorhinis 19 주 사이에서는 99.1 % 이상의 상동성을 보여 rpoB 염기서열이 상당히 잘 보존되어 있는 것을 알 수 있었다.

한편, 마이코플라즈마가 감염된 것으로 의심되는 두 개의 세포 배양액도 DNA를 추출하여 rpoB PCR을 시행한 결과 증폭산물이 나타나 마이코플라즈마가 있음을 확인하였으며, 두 마이코플라즈마는 염기서열을 확인한 결과 M. hyorhinis 염기서열에 각각 99.7%와 100%의 상동성을 보여, M. hyorhinis로 동정하였다.

도 4는 야생형 분리 균주의 rpoB PCR 증폭 산물의 염기서열을 M. hyorhinis와 비교한 결과 및 'Hominis 그룹'의 rpoB 아미노산서열(A)과 염기서열(B)로 구성한 rpoB 계통도이다. 즉, rpoB PCR을 시행하여 증폭산물의 염기서열을 결정하고 표준균주 염기서열들과 비교하여 상동성이 99% 이상이면 해당 균종으로 동정할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3: 마이코플라즈마 특이 rpoB PCR

장비와 시간 그리고 소모품들을 고려하면 환자 검체나 분리균으로 PCR-시퀀싱을 매번 수행할 수 있는 검사실은 드물며 효용성이 감소한다고 볼 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서는 일반 검사실에서 PCR만으로 간단히 마이코플라즈마를 탐지할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 확인된 rpoB 염기서열로부터 병원성 균종 및 배양 세포주(cell line) 감염 균종들을 검출하기 위한 프라이머를 그룹별로 고안하였다(서열 32 내지 37).

먼저, 'Pneumoniae 그룹' 특이 프라이머로 고안된 MP-GPF와 MP-GPR을 이용하여 PCR을 시행한 결과, 'Pneumoniae 그룹'의 여섯 균종(M. pneumoniae, M. genitalium, M. pirum, M. penetrans, M. iowae 및 M. gallisepticum)과 우레아플라즈마 두 균종(U. parvum 및 U. urealyticum)으로부터 rpoB DNA를 성공적으로 증폭시킬 수 있었다.

그리고, 'Hominis 그룹' 용으로는 seminested PCR에 사용할 MP-GHF1와 MP-GHF2, 그리고 MP-GHR, 또는 MP-GHF2 대신 MP-GHF3를 이용하는 두 종류의 세트를 고안하여 사용한 결과, 'Hominis 그룹'의 18 균종으로부터 증폭 산물을 얻을 수 있었다.

다음 표 2는 마이코플라즈마 특이 rpoB PCR로 증폭되는 산물의 크기(bp)를 나타낸 것이다.

Group/Species 프라이머 MP-GPF MP-GHF1 MP-GHF1 MP-GPR MP-GHF2 MP-GHF3 MP-GHR MP-GHR

Pneumoniae group M. gallisepticum 281 M. genitalium 272 M. iowae 251 M. penetrans 257 M. pirum 278 M. pneumoniae 272 U. parvum 315 U. urealyticum 315 Hominis group M. anatis 137 152 M. arthritidis 137 152 M. bovis 137 152 M. buccale 137 152 M.fermentans 137 152 M. gallinarum 137 152 M. hominis 137 152 M. hyopneumoniae 140 155 M. hyorhinis 140 155 M. lipophilum 137 152 M. orale 137 152 M. primatum 137 152 M. pullorum 137 152 M. pulmonis 137 152 M. salivarium 137 152 M. spermatophilum 137 152 M. synoviae 137 152 M. faucium 137 152

도 5는 'Pneumoniae 그룹' 특이 프라이머로 고안된 MP-GPF와 MP-GPR을 이용하여 PCR 시행한 결과를 나타낸 것으로, 여기에서 M은 표지 DNA(100 bp 래더); 1은 M. pneumoniae(272 bp); 2는 M. genitalium(272 bp); 3은 M. pirum(278 bp); 4는 M. penetrans(257 bp); 5는 M. iowae(251 bp); 6은 M. gallisepticum(281 bp); 7은 M. parvum(315 bp); 8은 U. urealyticum(315 bp); 그리고 9는 음성 대조군이다. 도 5에서 보듯이, 'Pneumoniae 그룹' 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 모든 'Pneumoniae 그룹'의 균종에서 증폭산물이 있음을 알 수 있다.

도 6은 'Hominis 그룹' 특이 프라이머로 고안된 MP-GHF1와 MP-GHF2, 그리고 MP-GHR을 이용하여 PCR 시행한 결과를 나타낸 것으로, 여기에서 M은 표지 DNA(100 bp 래더); 1은 M. hominis; 2는 M. buccale; 3은 M. arthritidis; 4는 M. orale; 5는 M. salivarium; 6은 M. fermentans; 7은 M. spermatophilum; 8은 M. primatum ; 9는 M. bovis; 10은 M. pullorum; 11은 M. anatis; 12는 M. gallinarum; 13은 M. synoviae; 14는 M. lipophilum; 15는 M. pulmonis; 16은 M. hyorhinis; 17은 M. hyopneumoniae; 18은 M. faucium; 그리고 19는 음성 대조군이다. 여기에서 보듯이, 'Hominis 그룹' 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 모든 'Hominis 그룹'의 균종에서 증폭산물이 있음을 알 수 있다. 또한, 도 6에서 4, 5 및 13은 100∼200 bp 부근에 두 개의 밴드를 보이는데, 이는 MP-GHF1과 MP-GHR 쌍에 의한 1차 산물이 위에 나타난 것이다. 그러나 특이적인 것은 아래 것으로, 그 크기는 표 2에서 보듯이 약간씩 차이가 있다.

도 7은 'Hominis 그룹' 특이 프라이머로 고안된 MP-GHF2 대신 MP-GHF3을 이용하여 PCR 시행한 결과를 나타낸 것으로, 여기에서 M과 1 내지 19는 도 6에서와 같은 균종과 음성대조를 나타낸다. 도 6에서와 마찬가지로, 여기에서도 'Hominis 그룹' 특이 프라이머를 사용한 PCR 결과 모든 'Hominis 그룹'의 균종에서 증폭산물이 있음을 알 수 있다.

특히, 도 6 및 7에서 보면, 계통분석을 위한 PCR에서 증폭산물을 얻을 수 없어 염기서열 확인이 불가능했던 M. faucium으로부터도 두 종류의 프라이머 세트를 이용한 결과, 증폭 산물을 얻을 수 있었다(도 6 및 7의 18번).

한편, 마이코플라즈마 감염이 의심되는 세포 배양액 2 개 검체에 마이코플라즈마 특이 rpoB PCR을 시행한 결과, 두 검체 모두에서 증폭산물이 나타난 것이 관찰되어, 이들 세포는 마이코플라즈마에 감염된 것을 쉽게 알 수 있었다. 이 증폭 산물의 염기서열을 결정하여 비교한 결과, 이 균들은 M. hyorhinis임을 알 수 있었다.

도 8은 마이코플라즈마 감염이 의심되는 세포 배양액과 임상분리 검체에 대하여 마이코플라즈마 'Pneumoniae 그룹' 및 'Hominis 그룹' 특이 rpoB PCR을 시행한 결과를 나타낸 것으로, 여기에서 M은 표지 DNA(100 bp 래더); a는 음성 대조군; b 내지 j는 임상분리 검체(272 bp); 1 및 2는 세포배양액 상등액(155 bp); 그리고 3 및 4는 M. hyorhinis이다. 여기에서 보면, 임상분리 검체(b∼j)들은 'Pneumoniae 그룹' 특이 PCR에서만 증폭산물이 있어 'Pneumoniae 그룹' 균종임을 알 수 있으며, 염기서열 분석 결과 모두 M. pneumoniae로 확인되었다. 또한, 세포 배양액은 'Hominis 그룹' 특이 PCR에서 증폭산물이 생겼으며, 이들 역시 염기서열 분석 결과 도 4에서와 같이 M. hyorhinis로 동정할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 마이코플라즈마 균종의 분자생물학적 분석에서 16S rDNA 염기서열을 이용한 방법이 갖는 난점을 해결할 수 있도록, rpoB DNA를 증폭하는 PCR-시퀀싱으로 마이코플라즈마 균종을 탐지하고 염기서열을 결정-비교하여 균종을 동정하는 방법과, 두 그룹, 즉 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'을 탐지할 수 있는 특이 seminested PCR 방법을 개발하였다.

마이코플라즈마 rpoB 염기서열 분석 결과, 균종들 간에 PCR 산물 크기가 조금씩 다를 정도로 상당한 염기서열 변화가 관찰되었다. rpoB 염기서열을 다른 세균 속, 즉 마이코박테리움 등의 계통분석과 동정에 사용하기는 하였는데(Kim, B.-J., et al., 1999; Lee, S.-H., et al., 2000; Ko, K.S., et al., 2002), 동일한 속 내의 균종 사이에서는 염기서열을 정렬하여 비교할 때 갭이 없었으나, 마이코플라즈마의 경우는 이들과 달랐다. 삽입-상실에 따른 염기서열의 변화는 마이코플라즈마 특정 균종에 대한 PCR용 프라이머를 고안하여 해당 균의 탐지-동정이 가능할 수 있다. 그러나 병원성 균종이나 배양 세포를 감염시킬 수 있는 원인 균이 여럿이므로 본 발명에서 고안한 바와 같은, 마이코플라즈마를 그룹별로 구분하여 증폭할 수 있는 seminested PCR용 프라이머와 PCR 방법이 더욱 효용성이 있을 것으로 사료된다.

각 균종의 표준 균주들 사이에서는 염기서열의 심한 변화가 관찰된 반면 한 균종에 속하는 야생형 균주들 사이에서는 염기서열의 변화가 그리 크지 않았다. 국내에서 분리된 M. pneumoniae 55 주와 M. hyorhinis 19 주의 각 rpoB 염기서열을 분석한 결과로도 알 수 있듯이, 한 종 내에서는 99% 이상의 상동성을 유지하는 것이다. 이는 rpoB 염기서열 또는 아미노산 서열이 마이코플라즈마 균종 동정에 좋은 변별력을 갖고 있다는 것을 의미한다.

ILD 테스트 결과에서도 보듯이 rpoB와 16S rDNA 계통수 사이에는 일치하지 않는 점이 관찰되기도 했다. 이는 균종 분류나 동정에 사용하는 분자 표지로서 16S rDNA 염기서열 외의 다른 유전자의 것도 필요함을 시사하는 것이며 결론적으로 rpoB는 다중(multicopy)으로 존재하는 결점이 있는 마이코플라즈마의 16S rDNA 대신 계통분석, 분류 및 동정에 사용할 수 있는 좋은 분자 표지라는 사실이다. 마이코플라즈마에서는 특징적으로 아미노산과 염기서열로 구성한 계통수가 차이를 보였는데 이는 아마도 해당 코돈의 셋째 염기에서 균종간의 변화가 있지만 그것은 아미노산의 변화를 동반하지 않는 돌연변이에 의해 초래된 것으로 보인다. 이런 경우 염기서열보다는 아미노산 서열로 계통학적 관계를 보는 것이 합당할 것이다. 다른 균속에서 이런 현상이 없었던 것은, 비단 한 종 내의 균주들뿐 아니라 더 나아가 해당 속 내의 균종들 간에 염기서열 상동성이 매우 높았던 것 때문일 것이다. 그러나 마이코플라즈마에서는 이들과 달리 아미노산 서열이 아주 좋은 분자 표적이 되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따르면, 2 종류 프라이머로 마이코플라즈마 그룹 특이 seminested rpoB PCR을 수행함으로써 환자나 동물의 임상 검체 또는 오염된 세포 배양액에 마이코플라즈마가 존재하는가 여부를 알 수 있고, 존재할 경우 그것이 마이코플라즈마의 두 그룹인 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹' 중 어디에 속하는 것인지 개괄적인 동정이 PCR만으로도 가능하다. 그리고 더 나아가 장비 구비 등으로 염기서열 결정이 가능할 경우, 염기서열 확인용 두 종류의 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 표준균주들의 염기서열과 비교하여 상동성을 측정하거나 작성된 계통수에 대입하여 비교함으로서 균종 동정을 완결할 수 있다.

도 1은 rpoB 염기서열로부터 추론한 아미노산 서열들의 정렬을 나타낸 것.

도 2는 rpoB의 아미노산서열(A)과 염기서열(B)로 구성한 rpoB 계통도로, 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'을 구분하여 나타낸 것.

도 3은 GenBank에서 인용한 16S rDNA 염기서열로 구성한 계통도로, 'Pneumoniae 그룹'과 'Hominis 그룹'의 클러스터를 표시한 것.

도 4는 야생형 분리 균주의 rpoB PCR 증폭 산물의 염기서열을 M. hyorhinis와 비교한 결과 및 'Hominis 그룹'의 rpoB 아미노산서열(A)과 염기서열(B)로 구성한 rpoB 계통도.

도 5는 'Pneumoniae 그룹' 특이 프라이머로 고안된 MP-GPF와 MP-GPR을 이용하여 PCR 시행한 결과를 나타낸 것.

도 6은 'Hominis 그룹' 특이 프라이머로 고안된 MP-GHF1와 MP-GHF2, 그리고 MP-GHR을 이용하여 PCR 시행한 결과를 나타낸 것.

도 7은 'Hominis 그룹' 특이 프라이머로 고안된 MP-GHF2 대신 MP-GHF3을 이용하여 PCR 시행한 결과를 나타낸 것.

도 8은 마이코플라즈마 감염이 의심되는 세포 배양액과 임상분리 검체에 대하여 마이코플라즈마 'Pneumoniae 그룹' 및 'Hominis 그룹' 특이 rpoB PCR을 시행한 결과를 나타낸 것.

<110> KOOK, Yoon-Hoh <120> DETECTION AND IDENTIFICATION OF MYCOPLASMA SPECIES <130> 1-320 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Mycoplasma anatis <400> 1 agaattgttg ctgttggaga attattagct aaccaattaa atgtggcttt atcaaaactt 60 gaaaagacca ctcgtgaaag aatgggagct aaagaacctg aaaaagtaac ggctaaaaat 120 gttacaaaca acaaattaat aacaaatcaa atgaagacat tctttaactc atctaaactc 180 tcacaattta tggaccaaat caatccatta gcagaagtat ctaacaaacg tcgtgttact 240 tctcttggac ctggtggact taatcgtgat acagctcagt ttgaggttcg tgacgttcat 300 300 <210> 2 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma arthritidis <400> 2 ttagttaata aaagaattgt tacaattggc gaacttctac aaaaccaatt ccgtgttgga 60 ttaattaaat tagaaaaaaa cactaaagaa cgaatctcag ctaaagatat tgacaaaatt 120 acaccgaaaa atgtaactaa caaccggcca attttcaatc aattcaaatc attcttcaac 180 acctcgaaac tttcacagtt catggatcaa tgtaatccgc ttgccgaaat ttctaataaa 240 agaagaatta cttcgctagg accacggggc cttaatagag acaccgctca atttgaggtg 300 cgggacgttc ac 312 <210> 3 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma bovis <400> 3 atgattaata aaagaatagt ttcagttggc gaattgatgc aaaatcaatt gaatgttgga 60 ctttcaaaat tggaaaaaac cactagagaa agaatgtcag ctaaagagcc tgaaaagatt 120 actcctaaaa atattacaaa taacaaactg gtttcaaacc aaatgaaaac attcttcaat 180 agctcaaaat tgtctcaatt tatggatcaa attaatgctt tggctgaaat ttcaaacgaa 240 agacgtatta cttctttagg ccctggtggt cttaatcgtg atactgcaca attcgaagtt 300 cgtgacgtgc ac 312 <210> 4 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma buccale <400> 4 cttattaata aaagaattgt tacaattggt gaattacttc aaaaccaatt tagaataggt 60 cttatcaaat tagaaaaaaa tacaaaagaa agaatttctg ctaaagatat tgacaaaata 120 acacctagaa atgtaacaaa taacaaacct atttttaatc aatttaaatc atttttcaac 180 acttctaaat tatcacaatt catggatcaa tgtaatccac ttgctgaaat ttcaaataaa 240 agaagaatta cttcactagg accaagaggt cttaatagag atactgctca atttgaagtt 300 cgtgatgttc ac 312 <210> 5 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma fermentans <400> 5 ttaacaaaca aacgtattgt tgcagttggt gaattattac aaagccaatt aaatgtcggt 60 ttagtaaaac ttgaaaaaac tacacgtgaa agaatgggcg ctaaagaacc tgacaaagta 120 acacctaaaa atgttacaaa caataaactc atttcaacac aaatgaaaac attctttaac 180 tcatcaaaac tttcacaatt tatggatcaa attaatccac ttgctgaaat ttcaaatgaa 240 cgtcgtatca cttctctagg acctggtggt cttaaccgtg atacagctca attcgaagtt 300 cgtgacgttc at 312 <210> 6 <211> 282 <212> DNA <213> Mycoplasma gallinarum <400> 6 gagcttttag aagggcaatt atctgtagct ttaactaaac ttgaaaaaat tacccgtgaa 60 agaatgggag ctaaagaacc agataaagtt acagctaaaa acgtaacaaa caacaaattg 120 gttacaaacc aaatgaaaac attctttaac acttcaaaac tttcacaatt catggatcaa 180 attaacccgc ttgctgaagt ttctaacaaa cgtagagtta catcacttgg acctgggggt 240 cttaaccgtg atactgcgca gtttgaagtt cgtgacgttc ac 282 <210> 7 <211> 357 <212> DNA <213> Mycoplasma gallisepticum <400> 7 ctaattaacg aactattaaa atctaaagtt caaaccggaa tgatgcggat tgaaaaatac 60 atcaaagata agttacaaac tgcagatggt aataataagt tagctgatca agatgctgaa 120 aacgatcctg attcagatct tggtactaag agtagtaatg atctaactgt gaaatcagtt 180 attaatccaa aaccattcca aatcgtgatt aaagatttct ttaacacgca ccaattaacc 240 caattcttag accaacaaaa cccattatct gaattaacta ataagagaag aatttcagca 300 atgggtcctg gggggatctc acgggaagac cctaacttag atattcgtga cgttcac 357 <210> 8 <211> 348 <212> DNA <213> Mycoplasma genitalium <400> 8 ttaattaatg aattaattac tgctaaatta gaaagcggct tcactagaat ggagcgcttt 60 ttaaaagaaa agttaactat tgctgatgga gttaaccgtg gccagcaaat taatgaagag 120 ggtcaggtta ttgaacaagg tgaaaaaaag gaattaacta ttaaatcttt aatcaactca 180 aaaccaattc aaattgtgat taaagacttc ttcaataccc accaattaac ccaattttta 240 gaccaccaaa accctttatc agaattgagt aataaaagaa ggatttcagc aatgggacct 300 gggggaatat caagagagga ccctaattta gatatccgtg atgtgctt 348 <210> 9 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma hominis <400> 9 ttagttaata aaagaattgt aacaataggc gaattattac aaaatcaatt tagaataggg 60 ctattaaaat tagaaaaaaa tacaagagaa agaatctcag caaaagatat tgataagatt 120 actgctaaga acgttacaaa taataaacca atatttaatc aatttaaatc gttctttaac 180 acatcaaaac tttctcaatt tatggatcaa tgtaatcctc ttgctgaaat atcaaacaag 240 agaagaataa cctccctagg accaagaggg ttgaaccgtg atactgcaca atttgaagtt 300 cgtgacgttc ac 312 <210> 10 <211> 315 <212> DNA <213> Mycoplasma hyopneumoniae <400> 10 ctagttaata aacggatagt tagtgttggc gaacttttac aaaatcaatt tttgattgca 60 cttacaaaaa ttgaaaagaa ttctaaggaa aaaatttcaa caaaatcgga tctttcgcag 120 ttaacagtaa aatcaattat taataataag ccaatttata atcaatttaa aaattttttc 180 aactcttcaa aactttcgca atttatggac caaattaacc cgcttggcga aatggcaagt 240 aaaagaaaag ttacctcact tggccctggc ggtctaaatc gtgatactgc tcaatttgaa 300 gtccgggatg ttcat 315 <210> 11 <211> 315 <212> DNA <213> Mycoplasma hyorhinis <400> 11 ttagtaaaca aacgtgttgt taatgtaggt gagttattac aaaatcaatt tttaattgct 60 ttatccaagc tagaaaaaaa cacaaaagaa agaatttctt ctagaggaga tagcgaaaaa 120 attaacatta aaaacatcac aaataataaa cctatttata atcaattcaa aaacttcttt 180 aattcttcaa aactttcaca atttatggat caaataaatc ctttaggtga aatggcaaac 240 aaaagaagag taacctcttt aggacctgga ggtcttaata gagaaactgc acaattcgaa 300 gttcgtgacg tccat 315 <210> 12 <211> 327 <212> DNA <213> Mycoplasma iowae <400> 12 cttattcatg aattattgaa agcaagaagc caagctggtt tagcaagaat tgaaaaattt 60 attaatgata aattagcaat tgctgatggt gctaataaag ttcaagaaga aaatgaagag 120 gcaagaaaag ctgttacagt taaatcaata atcaatacaa aaccttttca aatgactttt 180 aaagaattct ttaattctca ccagttaaca caatttttag accaacaaaa tcctcttgct 240 gaattaacaa ataaaagaag aatttctgca atgggtcctg gtggtatttc aagagaagac 300 cctaaccttg atatccgtga tgttcat 327 <210> 13 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma lipophilum <400> 13 ttggttaata aacgtattgt ttcagttggg gaattattac aaaaccaatt tgttttagga 60 gttaataaat tagaaaaaac cacccgtgaa agaatgggag ctaaagaacc tgataagatt 120 agtcctaaaa atgttattaa caataaaatg atttctaacc aaatgaaaac tttctttaat 180 tcatctaaat tatcacaatt tatggatcaa attaatccac tagctgaaat ttcaaatgaa 240 agaagaatca cttctctagg acctggtggt ttaaatcgtg atactgctca attcgaagtt 300 cgggacgttc at 312 <210> 14 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma orale <400> 14 ttaattaata agagaattgt tacaattggc gaacttttac aaaaccaatt taaaattgga 60 cttattaaat tagaaaaaaa tactaaagaa agaatagtta ctaaagaaat agaaaaaatt 120 acacctaaaa atgtaaccaa taataaacct atttttaatc aaatgaagtc tttctttaac 180 acttcaaaat tatcacaatt tatggatcaa tgtaatccac ttgcagaaat ttctaacaag 240 agaagaatta cttcacttgg acctagaggt ttaaatcgtg atactgcgca atttgaagtt 300 cgtgatgtgc ac 312 <210> 15 <211> 333 <212> DNA <213> Mycoplasma penetrans <400> 15 ctaattgatg aattattaaa aacaagagca caagctggtc ttgtaagaat tgaaaaattc 60 attaatgata aattggcaat tgccgatggg gcaaacaaat cacaagaaca aagtgaagaa 120 caagaaccta aaaagtcatt aactgttaaa tcaattatta acacaaaacc attccaaatt 180 agttttaaag agtttttcaa ctctcaccaa ttaactcaat tcttagatca acaaaatcct 240 ttagctgagc ttacaaataa gagaagaatt tcagcaatgg gtcctggtgg gatttcaaga 300 gaagacccta acctagatat ccgtgacgtt cac 333 <210> 16 <211> 354 <212> DNA <213> Mycoplasma pirum <400> 16 ttaattaatg aacttttata tagcagaatt caaactggta tggctagaat ggaacgctat 60 attagagaaa aattagcaat tgctgatggt actaacaaaa atgttgaagt taatgaagaa 120 acaggagaat ttgttgaaac tgataagcaa aaaactcgtt taacaattaa atctgttgtt 180 aattctaaac cattccaatt agttattcgt gatttcttta atactcatca attaactcaa 240 tttctagatc aacaaaatcc tttgtctgaa ttaacaaata aacgtagaat ttcagcaatg 300 ggacctgggg gtatttcaag agaagaccct aacttggata ttcgtgatgt tcac 354 <210> 17 <211> 348 <212> DNA <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 17 ttaattaacg agttaattag ttcccgtttg gaaagtggaa tcacccgcat ggagcgcttc 60 ttaaaggaaa agctcacgat tgctgatgga gtgaaccgtg gtcaacaaat taacgaagag 120 ggtcaagtaa ttgaacaagc ggaaaagaag gaattgacca ttaaatcctt aattaattcc 180 aaacctattc aaattgtcat tcgtgacttc ttcaacactc accagttgac ccagttctta 240 gatcaccaaa atccactttc agaattaagt aataagcgcc ggatttccgc catgggtcca 300 gggggtatct cccgcgaaga cccgaacttg gatatccggg atgtgcac 348 <210> 18 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma primatum <400> 18 atgactaaca aaagaattgt ttctgttggt gaattaatgc aaaaccaatt aaatgtaggt 60 ctttcaaaac ttgaaaaaac cacacgtgaa agaatgtcgg ctaaagaacc tgaaaaagtt 120 actccaaaaa atattacaaa taacaaacta atttccaatc aaatgaagac tttctttaat 180 tcttcaaaac tttcacaatt tatggatcaa attaacccac ttgctgaaat ttctaatgaa 240 agacgtatta catcacttgg gcctggtggt cttaaccgtg atactgcgca atttgaagtt 300 cgggatgttc ac 312 <210> 19 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma pullorum <400> 19 cttattaaca agagaattgt ttcagttggt gagttacttc aaaatcaatt aaacgttgct 60 ttaaccaaat tagaaaaaac tactcgcgaa agaatggggg cgaaagaacc tgaaaaaatc 120 acagcgaaaa acgtaactaa taacaaatta attaccaacc aaatgaaaac cttattcaac 180 tcttcaaaac tttcacaatt tatggaccaa atcaatccac ttgcagaagt ttcaaataaa 240 cgtcgtgtga cttctttagg acctggtggt cttaaccgtg atactgcaca attcgaagtt 300 cgtgacgttc ac 312 <210> 20 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma pulmonis <400> 20 cttattaata aaagaatagt tagtgttgga gaattgttat taaaccaatt aaatattggt 60 cttttaaaaa tggaaaaaaa tactagagaa aaaatgtctt ctaaagaaat ctctagaatc 120 actccaaaaa acattaccaa taacaaaatg attcaaaacc aaattaaaac cttctttaac 180 tcatcaaagc tttctcagtt tatggatcaa acaaatcctc tttcagaaat ttctacaaag 240 agaaaaatta cttctctagg gcctggtggt cttaatagag atacagctca atttgaagtt 300 cgtgacgttc at 312 <210> 21 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma salivarium <400> 21 ttaattaaca aaagaattgt gacaattggt gaacttttac aatatcaatt tagagttgga 60 cttattaaac tagaaaaaaa tactaaagaa agaattgcaa ctaaagatct agaaaaaatt 120 acacctaaaa atgtaactaa caacaaacct atctttaacc aatttaaatc attctttaat 180 acttcaaaac tttcacaatt tatggatcaa tgtaatccat tagctgaaat ttcaaacaaa 240 cgtagaatca catcattagg acctagaggt cttaaccgtg atactgcaca atttgaagtt 300 cgggatgttc ac 312 <210> 22 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma spermatophilum <400> 22 atgactaaca aacgtattgt tgctgtaggt gaattattgc aaaatcaatt aaacgtaggt 60 ttatcaaaac ttgaaaaaac tacacgtgaa agaatgggag ctaaagaacc tgacaaagtg 120 acacctaaaa atgttacaaa caacaaactc atttctaacc aaatgaaaac attctttaac 180 tcatcaaaac tttcacaatt tatggaccaa attaacccat tagcagaaat tgctaataaa 240 cgtcgtatta cttctctagg ccctggtgga cttaaccgtg atactgcaca attcgaagtt 300 cgtgacgttc at 312 <210> 23 <211> 312 <212> DNA <213> Mycoplasma synoviae <400> 23 cttatgaata agagaatcgt atcagtagga gagcttcttg aaggtgaatt aagaattgct 60 ttattaaaat tagaaaaagc aactcgtgaa agaatgggtg ctaaagagcc agataaaatt 120 accgcgaaaa atgttacaaa taataagctt ataactaacc aaatgaagac atttttcaac 180 acttcaaaac tagctcaatt catggatcaa attaatcctt tagctgaaat ttcaaataaa 240 cgtagagtta catccctagg gcctggtgga ctaaatcgtg acactgcaca atttgaagtt 300 cgtgacgtgc at 312 <210> 24 <211> 387 <212> DNA <213> Ureaplasma parvum <400> 24 ttgattcatg aattattacg agcaagaatt gctacaagta tggctcgtat tgagaagttt 60 attaatgaaa agttggctat ttctgatggt tcaagcaata acattacaaa tgttaatgat 120 aaaggtattg atactgaact tgatcgtgaa attgaagaaa gcgatatgag tgatgaggaa 180 aagaaaaaag caattagtgt taaatcaatt attaatacaa aacaattcca aagtttagtt 240 aaagattttt ttaattcaca tcaattaatt caatttattg accaacaaaa tccattagca 300 gaattaacta ataaacgtcg tatttcagcg atgggtccag gaggaattag tcgtgaagat 360 cctaatttag atattcgtga tgttcat 387 <210> 25 <211> 387 <212> DNA <213> Ureaplasma urealyticum <400> 25 ttaattcacg aattactacg tgcacgtatt gctacaagta tggctcgtat tgaaaaattc 60 attaacgaaa aattagctat ttcagatggt tcaagcaata acattactaa tgttaatgat 120 aaaggaattg acacagaact tgatcgtgaa gttgaagaaa gcgatatgag tgatgaagaa 180 aagaaaaaag caattagtgt taaatcaatt attaatacaa agcaattcca aagtcttgtt 240 aaagacttct ttaattcaca ccaattaatt caatttattg atcaacaaaa ccctttagca 300 gagttaacta ataaacgtcg tatttcagcg atgggacctg ggggaattag tcgtgaagac 360 cctaacttag atattcgtga cgttcac 387 <210> 26 <211> 312 <212> DNA <213> Acholeplasma laidlawii <400> 26 ttaggtaata gacgtctaag attaattgga gagctattaa aaaaccaatt tagaattggt 60 ttagcaagag ctgaaaagaa catcaaagat aagatgtcaa caacaaactt taatgatgca 120 acacctgcaa acgttattaa catgacgcca cttgtaggtg ctattaaaac attctttggt 180 tcgtcacaat tatcacaatt catggaccaa attaacccac tagcagagtt aactcaaaaa 240 cgtagagtat ctgccttagg tcccggtggt attgcaagag atagagctgg ggttgaagta 300 cgtgacgtgc at 312 <210> 27 <211> 312 <212> DNA <213> Spiroplasma citri <400> 27 ttaggaaatc gtcgtgtccg aacaattggg gaattattac aaaatcaatt tcgaattgga 60 ttactaagaa ttgaaaaaaa tgttaaagaa aaaatgtcaa cttcaaattt atttaaaatg 120 aaaccttcaa atattattaa taataaaccc ttatcagcga ttattgggga atttttcaat 180 ttatcacagt tatcacaatt tatggatcaa acaaatcctt tagctgaatt aacaaataaa 240 cgtcgattaa cagccctagg gccagggggg ctatcaagag aacgtgctgg attagaagtc 300 cgagatgttc ac 312 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for amplifying rpoB DNA of Pneumoniae group <400> 28 gayattgatc acttaggtaa 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for amplifying rpoB DNA of Pneumoniae group <400> 29 cttcnggtgt ttcaatngg 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for amplifying rpoB DNA of Hominis group <400> 30 agatgatgay ccngattca 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for amplifying rpoB DNA of Hominis group <400> 31 acaaattctt ccatartgag t 21 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycoplasma specific rpoB PCR primer for Pneumoniae group <400> 32 gaaaarttrg caattgcwga tgg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycoplasma specific rpoB PCR primer for Pneumoniae group <400> 33 cgratatcya agttagggtc ttc 23 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycoplasma specific rpoB PCR primer for Hominis group <400> 34 garytattac aaaaycaatt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycoplasma specific rpoB PCR primer for Hominis group <400> 35 gaaagaatgk sagctaaaga 20 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycoplasma specific rpoB PCR primer for Hominis group <400> 36 gaaaaaamya cwmrtgaaag aat 23 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mycoplasma specific rpoB PCR primer for Hominis group <400> 37 csartggatt amwttgrtcc at 22

Claims

서열 1 내지 6, 9 내지 14, 16, 18, 19 및 21 내지 23의 어느 하나로 표시되는, 마이코플라즈마(Mycoplasma) 속 균종의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편.
서열 24로 표시되는, Ureaplasma parnum의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편.
서열 26으로 표시되는, Acholeplasma laidlawii의 RNA 폴리머라제 β-서브유닛(RNA polymerase β-subunit) 유전자(rpoB) 단편.
서열 28 내지 31의 어느 하나로 표시되는, 마이코플라즈마 속 균종의 동정을 위한 PCR용 프라이머.
서열 32 내지 37의 어느 하나로 표시되는, 마이코플라즈마 속 균종의 탐지를 위한 PCR용 프라이머.
서열 28 내지 31로 표시되는 프라이머를 포함하는, 마이코플라즈마 속 균종의 동정을 위한 진단용 키트.
서열 32 및 33으로 표시되는 프라이머를 포함하는, 마이코플라즈마 속 'Pneumoniae 그룹' 균종의 탐지를 위한 진단용 키트.
서열 34, 35 및 37 또는 서열 34, 36 및 37로 표시되는 프라이머를 포함하는, 마이코플라즈마 속 'Hominis 그룹' 균종의 탐지를 위한 진단용 키트.