WO2021162228A1 - Hiv-1 약제 내성 분석을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents

Hiv-1 약제 내성 분석을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 분석 방법 Download PDF

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WO2021162228A1
WO2021162228A1 PCT/KR2020/018471 KR2020018471W WO2021162228A1 WO 2021162228 A1 WO2021162228 A1 WO 2021162228A1 KR 2020018471 W KR2020018471 W KR 2020018471W WO 2021162228 A1 WO2021162228 A1 WO 2021162228A1
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hiv
primer set
seq
nos
drug resistance
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PCT/KR2020/018471
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이경률
김영진
김윤태
문주영
고기한
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주식회사 에스씨엘헬스케어
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)

Definitions

  • the present disclosure relates to a primer set for analyzing whether a subject to be analyzed has resistance to an HIV-1 drug, a kit comprising the same, and an analysis method using the same, and more particularly, to the identification of a POL gene of HIV-1 RNA It relates to a primer set for determining whether a region has resistance to an HIV-1 drug by analyzing the nucleotide sequence, a kit including the same, and an analysis method using the same.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • HIV-1 mutations resistant to anti-HIV-1 therapeutic agents have emerged. 1 There is a problem that the treatment is no longer effective. Accordingly, in order to prescribe a suitable treatment for each HIV-1 infected person, that is, a suitable therapeutic agent, a so-called HIV-1 drug resistance test is required today, which confirms the position of the mutation in the HIV-1 gene possessed by the infected person. have.
  • HIV-1 drug resistance diagnostic kits include Abbott's "ViroSeq HIV-1 Genotyping System” and Trugene's "HIV genotyping kit”, but the kits are expensive and difficult to supply. has a Accordingly, there is a demand for the development of a new kit having the same or higher performance than the conventional kits and having a lower unit price.
  • HIV-1 drug resistance diagnosis can be performed through nucleotide sequence analysis of the POL gene of HIV-1 RNA, and part of the Protease (PR) region, part of the Reverse Transcriptase (RT) region, or Integrase ( IN), it is observed whether there is a mutation in the nucleotide sequence by targeting a part of the region.
  • PR Protease
  • RT Reverse Transcriptase
  • IN Integrase
  • Patent Document 1 KR10-1605524 B1
  • Patent Document 2 US6852491 B1
  • Patent Document 3 US6232455 B1
  • a first aspect of the present disclosure is to provide a primer set for RT-PCR for a novel HIV-1 drug resistance assay that can solve the above problems and satisfy the above needs.
  • a second aspect of the present disclosure is to provide a kit for HIV-1 drug resistance assay comprising the primer set of the first aspect.
  • a third aspect of the present disclosure is to provide a method for analyzing HIV-1 drug resistance in a sample collected from an HIV-1 infected person using the primer set of the first aspect and/or the kit of the second aspect.
  • a primer set for RT-PCR for HIV-1 drug resistance analysis for achieving the first aspect of the present disclosure includes a forward primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6, and a reverse primer set forth in SEQ ID NO: 7. .
  • the primer set simultaneously targets at least a portion of the Protease (PR) region, at least a portion of the Reverse Transcriptase (RT) region, and at least a portion of the Integrase (IN) region in the HIV-1 POL gene. do it with
  • the forward primer is any one of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • a kit for the analysis of HIV-1 drug resistance to achieve the second aspect of the present disclosure includes the primer set for RT-PCR; and a primer set for sequencing for analyzing the nucleotide sequence of the HIV-1 POL gene.
  • the primer set for sequencing is a forward primer set selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 19, and combinations thereof, and SEQ ID NOs: 20 to 29, and selected from the group consisting of combinations thereof and a reverse primer set.
  • the forward primer set comprises any one of SEQ ID NOs: 8 to 10; any one of SEQ ID NOs: 11 to 14; any one of SEQ ID NOs: 15 or 16; SEQ ID NO: 17; and any one of SEQ ID NOs: 18 or 19.
  • the reverse primer set comprises SEQ ID NO: 20; any one of SEQ ID NOs: 21 or 22; SEQ ID NO:23; any one of SEQ ID NOs: 24 or 25; and any one of SEQ ID NOs: 26-29.
  • the forward primer set comprises SEQ ID NOs: 8, 11, 15, 17, and 18, and the reverse primer set comprises SEQ ID NOs: 20, 21, 23, 24, and 26 .
  • a method for analyzing HIV-1 drug resistance of a sample comprises the steps of (a) obtaining from a subject at least one sample comprising HIV-1 RNA; (b) amplifying the target gene of the sample using a primer set for RT-PCR, wherein the primer set for RT-PCR is a forward primer selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6, and SEQ ID NO: 7 including the reverse primers shown; and (c) sequencing the amplified target gene using a sequencing primer set.
  • the HIV-1 RNA included in the at least one sample includes a POL gene.
  • the method further includes (d) determining the resistance of the sample to the HIV-1 drug by analyzing the nucleotide sequence sequenced through the step (c).
  • the step (d) comprises the steps of arranging the sequenced base sequence; and inputting the aligned nucleotide sequence into an HIV-1 drug resistance gene nucleotide sequence database and analyzing it.
  • the primer set, kit, and analysis method according to the present disclosure can achieve a level of reliability similar to that of a currently commercialized kit, and at the same time, it is possible to propose a significantly reduced cost to a consumer compared to a commercially available kit. For example, when using currently commercially available kits, a cost of about $140 or more is required per test, whereas when using the kit of the present disclosure, a cost of about $30 or less is expected to be required per test, which is reduced The cost is expected to be very significant.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing some structures comprising the POL gene of HIV-1;
  • FIG. 3 shows an electrophoresis result of a PCR product amplified according to an embodiment of the present disclosure
  • 5A to 5C show sequencing results sequenced according to an embodiment of the present disclosure
  • 6A to 6C show sequencing results sequenced according to an embodiment of the present disclosure.
  • target DNA refers to a nucleic acid that is targeted by DNA amplification.
  • target DNA or target RNA serves as a template for amplification in a PCR reaction or RT-PCR reaction.
  • polynucleotide refers to double-stranded DNA or cDNA, or single-stranded DNA or RNA, and unless otherwise specified, includes nucleotide analogs.
  • primer refers to a single-stranded oligonucleotide capable of serving as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions in a suitable buffer at a suitable temperature.
  • oligonucleotide may, in some cases, be used interchangeably with “primer” or “polynucleotide”.
  • forward primer and “reverse primer” refer to primers that bind to the 3' and 5' ends of a specific region of a template amplified by polymerase chain reaction, respectively.
  • the sequence of the primer does not need to have a completely complementary sequence to a partial sequence of the template, and it is sufficient if it hybridizes with the template and has sufficient complementarity within a range capable of performing an intrinsic function of the primer.
  • the primer set according to one embodiment of the present disclosure may be a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence of the template, and the primer set according to another embodiment is not a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence of the template, and the present disclosure It may be a substantially complementary sequence within a range that does not interfere with amplification of the target gene of interest.
  • the term “substantially complementary” means that two nucleic acid strands that are sufficiently complementary in sequence anneal and form a stable duplex.
  • the complementarity need not be perfect; For example, there may be several mismatches of base pairs between two nucleic acids. However, if the number of mismatches is so high that hybridization does not occur even under minimal stringent hybridization conditions, the sequence is not substantially complementary.
  • two sequences are interpreted as “substantially complementary” in the present disclosure, it is meant that the sequences are sufficiently complementary to hybridize to each other under selected reaction conditions, such as stringent hybridization conditions.
  • stringent hybridization conditions such as stringent hybridization conditions.
  • substantially complementary strands may be, for example, completely complementary or contain one to many mismatches, e.g., as long as they sufficiently permit differences between paired and unpaired sequences.
  • a "substantially complementary" sequence can mean a sequence having at least 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50%, or any % of base pair complementarity between these numbers in the double-stranded region. .
  • Oligonucleotides used in the present disclosure may be synthesized and prepared by appropriate methods (such as chemical synthesis) according to methods known in the art. In addition, oligonucleotides are commercially available.
  • the present disclosure provides primer sets for HIV-1 drug resistance assays.
  • the primer set is a primer set for RT-PCR for the purpose of amplifying a target gene having drug resistance or a primer set for sequencing for sequencing the amplified target gene.
  • the primer set for RT-PCR of the present disclosure can amplify a target gene having HIV-1 drug resistance.
  • the target gene is a POL gene of HIV-1.
  • the POL gene consists of a Protease (PR) region, a Reverse Transcriptase (RT) region, and an Integrase (IN) region.
  • the primer set for RT-PCR simultaneously binds at least a portion of the Protease (PR) region, at least a portion of the Reverse Transcriptase (RT) region, and at least a portion of the Integrase (IN) region of the HIV-1 POL gene.
  • the primer set for RT-PCR may simultaneously target all of the PR region, all of the RT region, and at least a portion of the IN region of the HIV-1 POL gene.
  • the primer set may target codons 1 to 99 of PR, codons 1 to 560 of RT, and codons 1 to 285 of IN as target regions.
  • the primer set of the present disclosure does not require the use of multiple primer sets in diagnosing HIV-1 drug resistance, and has advantages over existing primer sets in terms of time and cost for diagnosis.
  • the primer set of the present disclosure includes a forward primer and a reverse primer, and the forward primer may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the reverse primer may be shown as SEQ ID NO: 7.
  • the primer set for RT-PCR may preferably consist of the following sets.
  • nucleotide sequence of the amplified target gene may be analyzed using the primer set for DNA sequencing of the present disclosure.
  • a primer set for sequencing enables nucleotide sequence analysis of a target gene amplified by the RT-PCR primer set of the present disclosure.
  • the sequencing primer set may include a forward primer set including a plurality of forward primers and a direction primer set including a plurality of reverse primers.
  • the primer set for sequencing may include a forward primer set including five forward primers and a reverse primer set including five reverse primers.
  • each of the five forward primers and the five reverse primers may partially overlap a target region with at least one other primer. This makes it possible to prevent omission of sequencing.
  • FIG. 2 shows a sequencing strategy for sequencing a target gene amplified in the present disclosure.
  • a plurality of forward primers (F2 to F6) and a plurality of reverse primers (R2 to R6) can be used for sequencing without omission of all ranges of the PR region, RT region, and IN region.
  • each arrow corresponds to a nucleotide sequence range that can be amplified by the corresponding primer.
  • F5 forward primers
  • R2 to R6 reverse primers
  • the amplified region overlaps.
  • good sequencing results can be derived through the remaining primers even if either the forward or reverse primers do not react during actual analysis. It has an advantage in terms of mutual complementarity.
  • the amplification by the 10 primers may be independently performed.
  • Table 3 below shows specific examples of primers included in the primer set for sequencing of the present disclosure.
  • the forward primer set included in the sequencing primer set of the present disclosure may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 19 and combinations thereof.
  • the reverse primer set included in the sequencing primer set may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20 to 29, and combinations thereof.
  • the forward primer set comprises any one of SEQ ID NOs: 8 to 10; any one of SEQ ID NOs: 11 to 14; any one of SEQ ID NOs: 15 or 16; SEQ ID NO: 17; and any one of SEQ ID NOs: 18 or 19. More preferably from the viewpoint of sequencing reliability, the forward primer set may include SEQ ID NOs: 8, 11, 15, 17, and 18.
  • the reverse primer set comprises SEQ ID NO: 20; any one of SEQ ID NOs: 21 or 22; SEQ ID NO:23; any one of SEQ ID NOs: 24 or 25; and any one of SEQ ID NOs: 26 to 29. More preferably from the viewpoint of sequencing reliability, the reverse primer set may include SEQ ID NOs: 20, 21, 23, 24, and 26.
  • kits for HIV-1 drug resistance assays may include a primer set for RT-PCR and a primer set for sequencing.
  • the primer set for RT-PCR may be the above-described primer set for RT-PCR of the present disclosure.
  • the sequencing primer set for analyzing the nucleotide sequence of the HIV-1 POL gene may also be the sequencing primer set of the present disclosure.
  • the kit includes an RT mix comprising a reverse transcriptase, dNTP, and a buffer solution; PCR mix containing DNA polymerase, dNTP, and buffer solution; nuclease-free water; Or it may further include a combination thereof.
  • the RT mix may be used to reverse transcribe RNA into DNA prior to amplification of a target gene, and the PCR mix may be used to amplify DNA generated through reverse transcription.
  • the kit may further include a fluorescent dye, ddNTPs, a sequencing buffer solution, a purification reagent, or a combination thereof.
  • the PCR product may be purified before and after attaching a fluorescent dye to the target gene using a purification reagent.
  • the purification reagent is, for example, SAP (shrimp alkaline phosphatase); EXO I (Exonuclease I); EtOH; sodium acetate; EDTA or the like.
  • SAP shrimp alkaline phosphatase
  • EXO I Exonuclease I
  • EtOH sodium acetate
  • EDTA or the like.
  • a PCR product labeled with a fluorescent dye after purification through the purification reagent may be analyzed for a specific nucleotide sequence using a sequencer in a subsequent step.
  • the present disclosure provides a novel method for analyzing HIV-1 drug resistance in a sample obtained from an HIV-1 infected person.
  • the primer sets and/or kits of the present disclosure described above may be used.
  • the method comprises obtaining from the subject at least one sample comprising HIV-1 RNA.
  • the HIV-1 RNA may include a POL gene.
  • the sample may be obtained by a known method from a bodily fluid already collected from a subject.
  • the bodily fluid may be blood, and among them, may be plasma separated from blood.
  • the assay method of the present disclosure includes amplifying a gene targeted for HIV-1 drug resistance diagnosis in the sample.
  • the amplifying step may be performed through RT-PCR, and thus the above-described RT-PCR primer set of the present disclosure may also be used in the amplifying step.
  • a sample containing HIV-1 RNA is reverse transcribed into cDNA by a reverse transcriptase, wherein the reverse transcriptase may be a known reverse transcriptase and is not particularly limited.
  • the reverse transcription step is performed at a temperature of about 40 to 70° C., preferably about 45 to 60° C., and about 5 to 20 minutes, preferably about 5 to 15 minutes, most preferably can be performed for about 10 minutes.
  • the present disclosure may include a reverse transcription inactivation step and an initial denaturation step before entering the amplification of the cDNA generated after the reverse transcription step.
  • the reverse transcription inactivation step inactivates the reverse transcriptase used in the reverse transcription step to prevent unnecessary reactions from occurring in the subsequent step, and the initial denaturation step means denaturing the generated cDNA so that it can be amplified in a later step. do.
  • the reverse transcription inactivation step and the initial denaturation step may be performed simultaneously, for example, in a temperature range of about 95 to 100° C., for a time of about 1 minute 30 seconds to 2 minutes 30 seconds.
  • the amplifying step includes: i) a denaturation step of separating double-stranded DNA into single-stranded DNA; ii) annealing (annealing) combining the single-stranded denatured DNA with a primer; iii) extending the bound primer.
  • the target region to be amplified of the present disclosure includes at least a portion of the PR region, at least a portion of the RT region, and at least a portion of the IN region at the same time. may require different conditions in the amplification step.
  • the denaturation step may be performed for 5 to 20 seconds within a temperature range of 90 to 100 °C.
  • the denaturing step may be performed for 7 seconds to 15 seconds within a temperature range of 95 to 100° C.
  • the modification step is performed for 8 seconds to 12 seconds within a temperature range of 97 to 99° C. can be performed.
  • the annealing step may be performed for 5 to 20 seconds within a temperature range of 50 to 80 °C.
  • the annealing step may be performed for 7 seconds to 15 seconds within a temperature range of 55 to 75° C., more preferably, the annealing step is performed for 8 seconds to 12 seconds within a temperature range of 55 to 72° C. can be performed.
  • the stretching step may be performed for 90 seconds or more within a temperature range of 60 to 80 °C.
  • the stretching step may be performed for 100 seconds to 140 seconds within a temperature range of 65 to 75 ° C.
  • the stretching step is 110 seconds to 130 seconds within a temperature range of 70 to 74 ° C. can be performed.
  • the stretching step may be performed at a temperature of about 72° C. for about 120 seconds.
  • the denaturation step, the annealing step, and the elongation step may be sequentially performed, and the denaturation step, the annealing step, and the elongation step are performed once each as 1 cycle, and the cycle is 30 to 50 cycles, preferably 32 to 45 cycles, more preferably 35 to 45 cycles.
  • the target gene to be amplified through RT-PCR is a gene including PR, RT, and IN regions having a long sequence length of about 3 kb, so the temperature and time conditions of each step are very important, and among them, the reverse transcription step and conditions of the annealing step are the most important. If it is out of the above temperature range, it may be difficult to reach the amplification of the target gene having a length of 3 kb.
  • the analysis method of the present disclosure includes sequencing the target gene amplified through the amplification step using a sequencing primer set.
  • the sequencing primer set of the present disclosure described above may be used in the sequencing step.
  • the sequencing step includes: a cycle sequencing step of amplifying a sequencing target gene using a sequencing primer set and a fluorescent dye, and labeling the sequencing target gene with the fluorescent dye; and a final sequencing step of analyzing the specific nucleotide sequence of the fluorescent dye-labeled gene using a sequencer or the like.
  • the cycle sequencing step may also include i) a denaturation step; ii) annealing; and iii) stretching.
  • the denaturation step may be performed for 5 to 20 seconds within a temperature range of 90 to 100 °C.
  • the denaturing step may be performed for 7 seconds to 15 seconds within a temperature range of 95 to 100° C.
  • the modification step is performed for 8 seconds to 12 seconds within a temperature range of 95 to 97° C. can be performed.
  • the annealing step may be performed for 1 to 15 seconds within a temperature range of 40 to 60 °C.
  • the annealing step may be performed for 3 seconds to 10 seconds within a temperature range of 45 to 55°C, and more preferably, the annealing step is performed for 4 seconds to 6 seconds within a temperature range of 47 to 52°C. can be performed.
  • the stretching step may be performed for 3 minutes to 10 minutes within a temperature range of 50 to 70 °C.
  • the stretching step may be performed for 3 minutes to 6 minutes within a temperature range of 55 to 65° C., more preferably, the stretching step is performed for 3 minutes to 4 minutes within a temperature range of 58 to 62° C. It can be carried out for 30 seconds.
  • the denaturation step, the annealing step, and the elongation step included in the cycle sequencing step may be sequentially performed, and performing the denaturation step, the annealing step, and the elongation step each once is 1 cycle.
  • the cycle may be carried out for 25 to 40 cycles, preferably 25 to 35 cycles, and more preferably 25 to 30 cycles.
  • the analysis method may further include purifying the amplification product of the target gene obtained in the amplification step before the cycle sequencing step after the amplification step.
  • the purification step it is possible to remove the remaining primers for RT-PCR through a purification reagent, where, for example, SAP and/or EXO may be used as the purification reagent.
  • the purified amplification product may be diluted using sterile distilled water before being introduced into the cycle sequencing step.
  • the analysis method may further include, after the cycle sequencing step, a step of purifying a gene labeled with a fluorescent dye using a purification reagent.
  • the purification reagent for example, EtOH and/or sodium acetate, EDTA, etc. may be used.
  • the analysis method of the present disclosure may analyze a specific nucleotide sequence of a gene labeled with a fluorescent dye through a final sequencing step.
  • the final sequencing step may be performed using a commercially available sequencer device.
  • the analysis method of the present disclosure may further include, after the sequencing step, determining the resistance of the sample to the HIV-1 drug based on the nucleotide sequence analyzed through the sequencing step.
  • the step of determining the resistance of the sample to the HIV-1 drug using the nucleotide sequence analyzed through the sequencing step includes: arranging the nucleotide sequence sequenced by each of these primers into one nucleotide sequence; and inputting the aligned nucleotide sequence into an HIV-1 drug resistance gene nucleotide sequence database and analyzing it.
  • the database is not particularly limited as long as it is possible to analyze whether resistance to the drug for HIV-1 targeted by the present disclosure is possible, for example, “https://hivdb.stanford.edu/” and the like are available.
  • HIV-1 RNA (Samples 1 to 14) isolated from a sample (plasma) collected from an HIV-1 infected person was prepared in advance and stored frozen in a cooling device. After complete thawing in ice or laptop cooler, an RT-PCR mixture containing the HIV-1 RNA was prepared. The composition of the RT-PCR mixture is shown in Table 4 below.
  • RT-PCR was performed according to the RT-PCR reaction conditions as shown in Table 6 below using each RT-PCR primer set of Examples 1 to 4 in the RT-PCR mixture containing each of Samples 1 to 14.
  • a Veriti 96-well Thermal Cycler was used as the PCR instrument.
  • each PCR product of Examples 1 to 4 was electrophoresed using BIO-RAD's Gel Doc XR+ Gel Documentation System, and the results are shown in FIG. 3 .
  • FIG. 3 as a result of electrophoresis, it was confirmed that a PCR product of about 3200 bp was obtained through amplification using the primer sets of Examples 1 to 4 for all of Samples 1 to 14.
  • a mixture was prepared by using the amplification product obtained by the above-mentioned "1.
  • Amplification of the HIV-1 target gene to have the composition shown in the following table.
  • the mixture was purified using a Thermal Cycler under the conditions shown in Table 8 below.
  • the purified amplification product was diluted with distilled water so that the band intensity was 20-50 ng prior to sequencing.
  • nucleotide sequence obtained through the nucleotide sequence analysis result into a database provided by “https://hivdb.stanford.edu/”, the mutation site of the sample and resistance to the HIV-1 drug can be checked.
  • the sequencing and drug resistance analysis results for the amplification products obtained by amplifying samples 1, 9, and 12 using the primer set (1) of Example 1 are sequentially shown in FIGS. 4 to 6 .
  • FIGS. 4A to 6A it can be confirmed that sequencing was performed without missing a portion for a region of about 3200 bp.
  • FIGS. 4B to 6B it can be seen that all three targeted PR, RT, and IN regions were amplified through a single primer set and were smoothly sequenced through the sequencing primer set.
  • FIGS. 4C to 6C using the primer set for RT-PCR and the primer set for sequencing of the present disclosure instead of the conventionally commercialized diagnostic kit, the diagnosis of HIV-1 drug resistance of the sample is performed. You can check that it is possible.
  • the use of the primer set, kit, and analysis method of the present disclosure has significantly superior advantages in terms of time, cost, and performance, particularly in terms of time and cost, compared to conventionally commercialized diagnostic kits. It is expected that it will be possible to provide

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Abstract

본 개시는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 RT-PCR용 프라이머 세트로서, 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 7로 제시된 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 RT-PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 HIV-1 약제 내성의 분석 방법을 제공한다.

Description

HIV-1 약제 내성 분석을 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용한 분석 방법
본 개시는 분석 대상이 HIV-1 약제에 대한 내성을 갖는지 여부를 분석하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용하는 분석 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HIV-1 RNA의 POL 유전자의 특정 영역의 염기서열을 분석하여 HIV-1 약제에 대한 내성을 갖는지 여부를 판단하기 위한 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 및 이를 이용하는 분석 방법에 관한 것이다.
인간면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)는, 발병하게 되면 AIDS로 진행하는, 인간의 면역 체계를 파괴하는 레트로바이러스이다. HIV에 감염된 모든 사람을 HIV 감염인이라 칭하며, 신규 HIV 감염인은 전 세계를 기준으로 연간 2,000,000 여명 수준인 것으로 보고되고 있다.
국내에서 보고되는 신규 HIV 감염인은 한 해 약 1,000 여명으로 알려져 있다. 구체적으로, 2017년 한 해 1,191명이 신규 HIV 감염인으로 신고되었으며, 이 중 내국인은 1,009명, 외국인은 182명으로 나타났다. 성별로는 남성이 1,089명, 여성이 102명으로 10.7 : 1의 성비를 갖는 것으로 보고되었다.
HIV-1 감염인에 대한 치료법이 개발되어 온 이래, 항HIV-1 치료제에 내성을 갖는 HIV-1 돌연변이가 등장하였으며, 이러한 HIV-1 돌연변이를 보유하고 있는 HIV-1 감염인에 대하여는 기존의 항HIV-1 치료제가 더 이상 유효하지 않은 문제점이 발생한다. 이에, 각 HIV-1 감염인들에 대한 적합한 치료, 즉 적합한 치료제의 처방을 위하여 감염인이 보유하는 HIV-1의 유전자 중 어느 위치에 돌연변이가 존재하는지를 확인하는 이른바 HIV-1 약제 내성 시험이 오늘날 요구되고 있다.
현재 상용화되고 있는 HIV-1 약제 내성 진단 키트 상품에는 Abbott사의 "ViroSeq HIV-1 Genotyping System" 및 Trugene사의 "HIV genotyping kit" 등이 존재하나, 상기 키트들은 단가가 높을 뿐만 아니라, 키트 수급이 어렵다는 문제점을 갖고 있다. 이에, 종래 키트들과 동등 또는 그 이상의 성능을 가지면서 단가가 더 저렴한 새로운 키트의 개발 수요가 존재한다.
한편, HIV-1 약제 내성 진단은 HIV-1 RNA의 POL 유전자의 염기 서열 분석을 통해 수행될 수 있으며, POL 유전자 내 Protease(PR) 영역 중 일부, Reverse Transcriptase(RT) 영역 중 일부, 또는 Integrase(IN) 영역 중 일부를 타겟으로 염기서열의 변이 여부를 관찰한다.
상기 HIV-1 치료에 관한 연구가 계속됨에 따라, 최근 종래 알려진 POL 유전자 내 HIV-1 약제 내성의 타겟 영역 외의 범위에서도 항HIV-1 약제에 대한 내성을 갖는 돌연변이가 나타날 수 있음이 밝혀진바, 현재 상용화되고 있는 상기 키트들이 타겟으로 하지 않는 영역까지 진단할 수 있는 새로운 키트의 필요성이 존재한다.
또 한편, 상기 PR 영역, RT 영역, IN 영역 각각을 개별적으로 분석하는 것에 대하여 상기 PR-RT-IN 영역을 동시에 타겟으로 하여 원스텝으로 분석하는 것이 시간, 노력, 비용의 관점에서 바람직하나, 이러한 원스텝 방식은 현재 알려진바 없고, 상기 Abbott 사의 키트의 경우에도 PR-RT를 원스텝으로 분석하는 것에 그칠 뿐이었다. 이에, PR-RT-IN 영역을 동시에 타겟으로 하여 원스텝으로 분석할 수 있는 새로운 프라이머 세트의 개발에도 여전히 니즈가 존재한다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) KR10-1605524 B1
(특허문헌 2) US6852491 B1
(특허문헌 3) US6232455 B1
따라서, 본 개시의 제1 관점은 상기와 같은 문제점을 해소하고, 상기와 같은 필요성을 충족시킬 수 있는 신규의 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 RT-PCR용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.
또한, 본 개시의 제2 관점은 제1 관점의 프라이머 세트를 포함하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트를 제공하는데 있다.
또한, 본 개시의 제3 관점은 제1 관점의 프라이머 세트 및/또는 제2 관점의 키트를 이용한 HIV-1 감염인으로부터 채취된 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 방법을 제공하는데 있다.
본 개시의 제1 관점을 달성하기 위한 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 RT-PCR용 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 7로 제시된 역방향 프라이머를 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 HIV-1 POL 유전자 중 Protease(PR) 영역의 적어도 일부, Reverse Transcriptase(RT) 영역의 적어도 일부, 및 Integrase(IN) 영역의 적어도 일부를 동시에 타겟으로 한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나이다.
본 개시의 제2 관점을 달성하기 위한 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트는 상기 RT-PCR용 프라이머 세트; 및 HIV-1 POL 유전자의 염기서열을 분석하기 위한 시퀀싱용 프라이머 세트를 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 시퀀싱용 프라이머 세트는 서열번호 8 내지 19, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 세트 및 서열번호 20 내지 29, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 역방향 프라이머 세트를 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 정방향 프라이머 세트는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나; 서열번호 11 내지 14 중 어느 하나; 서열번호 15 또는 16 중 어느 하나; 서열번호 17; 및 서열번호 18 또는 19 중 어느 하나를 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 역방향 프라이머 세트는 서열번호 20; 서열번호 21 또는 22 중 어느 하나; 서열번호 23; 서열번호 24 또는 25 중 어느 하나; 및 서열번호 26 내지 29 중 어느 하나를 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 정방향 프라이머 세트는 서열번호 8, 11, 15, 17, 및 18을 포함하고, 상기 역방향 프라이머 세트는 서열번호 20, 21, 23, 24, 및 26을 포함한다.
본 개시의 제3 관점을 달성하기 위한 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 방법은 (a) 대상자로부터 HIV-1 RNA를 포함하는 적어도 하나의 샘플을 얻는 단계; (b) 상기 샘플의 타겟 유전자를 RT-PCR용 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계, 여기서 상기 RT-PCR용 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 7로 제시된 역방향 프라이머를 포함하며; 및 (c) 상기 증폭된 타겟 유전자를 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용하여 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 적어도 하나의 샘플에 포함되는 HIV-1 RNA는 POL 유전자를 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 방법은 (d) 상기 (c) 단계를 통해 시퀀싱된 염기 서열을 분석하여 샘플의 HIV-1 약제에 대한 내성을 판단하는 단계를 더욱 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 (d) 단계는 시퀀싱된 염기 서열을 배열하는 단계; 및 상기 배열된 염기서열을 HIV-1 약제 내성 유전자 염기 서열 데이터베이스에 입력하여 분석하는 단계를 포함한다.
본 개시에 따른 프라이머 세트, 키트, 및 분석 방법은 현재 상용화되고 있는 키트 등과 유사한 수준의 신뢰도를 달성가능하며, 동시에 상용화되고 있는 키트 등에 비해 현저히 저감된 비용을 수요자에게 제안하는 것이 가능하다. 예컨대, 현재 상용화되고 있는 키트들을 이용하는 경우, 약 $140 이상의 비용이 1회의 테스트당 요구되는 반면, 본 개시의 키트를 이용하는 경우, 약 $30 이하의 비용이 1회의 테스트당 요구될 것으로 예상되는바 저감되는 비용은 매우 현저할 것으로 생각된다.
또한, 본 개시에 따른 키트 등을 이용하는 경우, 종래 키트들로 분석하지 못하는 POL 유전자 내 특정 영역에서 발생하는 돌연변이에 대하여도 분석이 가능하다.
또한, POL 유전자 중 PR 영역의 적어도 일부, RT 영역의 적어도 일부, 및 IN 영역의 적어도 일부를 하나의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR로 원스텝으로 증폭하는 것이 가능함에 따라 소요되는 시간, 비용, 노력의 관점에서 종래 키트들에 비하여 경쟁력이 존재한다.
도 1은 HIV-1의 POL 유전자를 포함하는 일부 구조를 나타내는 개략도이며;
도 2는 본 개시에서 증폭시킨 타겟 유전자를 시퀀싱하기 위한 시퀀싱 전략을 도시하는 것이며;
도 3은 본 개시의 실시예에 따라 증폭된 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸 것이며;
도 4a 내지 도 4c는 본 개시의 실시예에 따라 시퀀싱된 시퀀싱 결과를 나타낸 것이며;
도 5a 내지 도 5c는 본 개시의 실시예에 따라 시퀀싱된 시퀀싱 결과를 나타낸 것이며;
도 6a 내지 도 6c는 본 개시의 실시예에 따라 시퀀싱된 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
본 개시의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이나, 본 개시가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
본 개시에서 달리 정의되어 있지 않다면, 본 개시에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
본 개시에서 사용되는 용어 "타겟 DNA", "타겟 RNA", "타겟 유전자", 또는 "타겟 영역"은 DNA 증폭에 의해 표적이 되는 핵산을 의미한다. 타겟 DNA 또는 타겟 RNA는 PCR 반응, 또는 RT-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 제공된다.
본 개시에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 이중 가닥 DNA 또는 cDNA, 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA이며, 달리 기재되어 있지 않는 한, 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 개시에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 개시에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 일부 경우에서, "프라이머" 또는 "폴리뉴클레오티드"와 혼용될 수 있다. 용어 "정방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 개시의 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열일 수 있고, 다른 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열이 아니고, 본 개시가 목적으로 하는 타겟 유전자의 증폭을 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다.
본 개시에서 사용되는 용어, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열 내에서 충분히 상보적인 2개의 핵산 가닥이 어닐링되고 안정적인 듀플렉스를 형성하는 것을 의미한다. 상기 상보성은 완전할 필요는 없다; 예를 들어, 2개의 핵산 사이에 염기 쌍의 미스매치(mismatch)가 몇 개 정도 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 숫자가 너무 많아서 최소한의 엄격한 혼성화 조건에서 조차 혼성화가 일어나지 않는 경우에는, 상기 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 본 개시에서 2개의 서열이 "실질적으로 상보적인" 것으로 해석되면, 상기 서열은 엄격한 혼성화 조건과 같이 선택된 반응 조건 하에서 서로가 혼성화될 수 있도록 충분히 상보적인 것을 의미한다. 특이성을 달성할 수 있는 충분한 핵산의 상보성과 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 2개의 실질적으로 상보적인 가닥은, 예를 들어, 완전하게 상보적이거나 또는 예를 들어, 쌍을 이루는 서열 및 쌍을 이루지 않는 서열 사이의 차이점을 충분히 허용하는 한 1 내지 다수의 미스매치를 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인" 서열은 이중 가닥 구역에서 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50% 이상, 또는 상기 숫자 사이의 어떠한 %의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 의미할 수 있다.
본 개시에서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(화학적 합성과 같은)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 구입할 수 있다.
프라이머 세트
본 개시는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 약제 내성을 갖는 타겟 유전자의 증폭을 목적으로 하는 RT-PCR용 프라이머 세트 또는 상기 증폭된 타겟 유전자를 시퀀싱하기 위한 시퀀싱용 프라이머 세트이다.
본 개시의 RT-PCR용 프라이머 세트는 HIV-1 약제 내성을 갖는 타겟 유전자를 증폭시킬 수 있다. 본 개시에서 상기 타겟 유전자는 HIV-1의 POL 유전자이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 POL 유전자는 Protease(PR) 영역, Reverse Transcriptase(RT) 영역, 및 Integrase(IN) 영역으로 구성된다.
이에, 본 개시에서, 상기 RT-PCR용 프라이머 세트는 HIV-1 POL 유전자 중 Protease(PR) 영역의 적어도 일부, Reverse Transcriptase(RT) 영역의 적어도 일부, 및 Integrase(IN) 영역의 적어도 일부를 동시에 타겟으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 RT-PCR용 프라이머 세트는 HIV-1 POL 유전자 중 PR 영역의 전부, RT 영역의 전부, 및 IN 영역의 적어도 일부를 동시에 타겟으로 할 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PR의 코돈 1 내지 99, RT의 코돈 1 내지 560, 및 IN의 코돈 1 내지 285를 타겟 영역으로 할 수 있다. 현재 상용화되어 있는 RT 영역을 타겟으로 하는 HIV-1 약제 내성 진단용 프라이머 세트의 경우, 1 내지 348번 사이의 코돈에 대하여만 진단이 가능한 한계점이 존재하나, 본 개시의 프라이머 세트의 경우 348번을 초과하는 RT 영역의 진단 또한 가능하다는 점에서 유리한 이점을 갖는다.
또한, 종래 기술에서는 PR, RT, IN 각각을 개별적으로 타겟으로 하는 프라이머 세트 또는 PR-RT만을 동시에 타겟으로 하는 프라이머 세트가 존재하였을 뿐, 아직까지 PR-RT-IN을 동시에 타겟으로 하면서 RT-PCR용 프라이머로서 우수한 성능을 가진 프라이머 세트에 대하여는 밝혀진바 없었으나, 본 개시의 프라이머 세트는 이를 달성하였다. 이에 본 개시의 프라이머 세트는 HIV-1 약제 내성 진단에 있어서, 다수의 프라이머 세트의 사용을 요구하지 않아, 진단에 소요되는 시간, 비용 측면에서 기존의 프라이머 세트들 보다 유리한 이점을 갖는다.
이러한 본 개시의 프라이머 세트는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하며, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 7로 제시될 수 있다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000001
상기 RT-PCR용 프라이머 세트는 바람직하게는 다음과 같은 세트로 구성될 수 있다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000002
상기 표 1에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 타겟 유전자를 RT-PCR을 통해 증폭하는 것이 가능하다. 또한, 상기 증폭된 타겟 유전자의 염기 서열은 본 개시의 DNA 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용하여 분석될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따른 시퀀싱용 프라이머 세트는 본 개시의 RT-PCR용 프라이머 세트에 의해 증폭된 타겟 유전자의 염기 서열 분석을 가능하게 한다. 상기 시퀀싱용 프라이머 세트는 복수의 정방향 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 세트와 복수의 역방향 프라이머를 포함하는 방향 프라이머 세트로 구성될 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 시퀀싱용 프라이머 세트는 5개의 정방향 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 세트와 5개의 역방향 프라이머를 포함하는 역방향 프라이머 세트로 구성될 수 있다. 여기서 상기 5개의 정방향 프라이머 및 5개의 역방향 프라이머들은 각각이 적어도 1개 이상의 다른 프라이머와 타겟 영역이 부분적으로 중복될 수 있다. 이를 통해 시퀀싱의 누락을 방지하는 것이 가능하다.
도 2는 본 개시에서 증폭시킨 타겟 유전자를 시퀀싱하기 위한 시퀀싱 전략을 도시하는 것이다. 도 2를 참고하면, PR 영역, RT 영역, IN 영역의 모든 범위에 대한 누락 없는 시퀀싱을 위하여 복수의 정방향 프라이머(F2 내지 F6) 및 복수의 역방향 프라이머(R2 내지 R6)이 사용될 수 있음을 나타내고 있으며, 여기서 각 화살표는 해당 프라이머에 의해 증폭될 수 있는 염기서열 범위에 해당한다. 예시적으로 F5에 의해 증폭된 영역의 경우 R3, F6, 및 R2 각각에 의해
증폭된 영역과 적어도 일부가 중첩됨을 알 수 있다. 이를 통해 전술한 바와 같은 시퀀싱 중 발생할 수 있는 타겟 영역의 분석 누락을 방지하는 것이 가능하다. 특히, F2와 R6; F3과 R5; F4와 R4; F5와 R3; F6과 R2와 같이 타겟 영역이 대부분 중복되는 프라이머를 정방향 및 역방향으로 2쌍씩 채택함으로써, 실제 분석 시에 정방향 혹은 역방향 프라이머 중 어느 하나의 미반응이 발생한 경우에도 나머지 프라이머를 통해 양호한 시퀀싱 결과 도출이 가능하다는 점에서 상호 보완성의 관점에서 이점을 갖는다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 10개의 프라이머에 의한 증폭은 각각 독립적으로 수행될 수 있다.
하기 표 3은 본 개시의 시퀀싱용 프라이머 세트에 포함되는 프라이머의 구체예이다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000003
상기 표 3을 참조할 때, 본 개시의 시퀀싱용 프라이머 세트에 포함되는 정방향 프라이머 세트는 서열번호 8 내지 19 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 시퀀싱용 프라이머 세트에 포함되는 역방향 프라이머 세트는 서열번호 20 내지 29, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 정방향 프라이머 세트는 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나; 서열번호 11 내지 14 중 어느 하나; 서열번호 15 또는 16 중 어느 하나; 서열번호 17; 및 서열번호 18 또는 19 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 시퀀싱의 신뢰성의 관점에서 보다 바람직하게는, 상기 정방향 프라이머 세트는 서열번호 8, 11, 15, 17, 및 18을 포함할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 역방향 프라이머 세트는 서열번호 20; 서열번호 21 또는 22 중 어느 하나; 서열번호 23; 서열번호 24 또는 25 중 어느 하나; 및 서열번호 26 내지 29 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 시퀀싱의 신뢰성의 관점에서 보다 바람직하게는, 상기 역방향 프라이머 세트는 서열번호 20, 21, 23, 24, 및 26을 포함할 수 있다.
키트
본 개시는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 RT-PCR용 프라이머 세트 및 시퀀싱용 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 상기 RT-PCR용 프라이머 세트는 전술한 본 개시의 RT-PCR용 프라이머 세트일 수 있다. HIV-1 POL 유전자의 염기서열을 분석하기 위한 상기 시퀀싱용 프라이머 세트 또한, 전술한 본 개시의 시퀀싱용 프라이머 세트일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 역전사효소, dNTP, 및 버퍼 용액을 포함하는 RT 믹스; DNA 중합 효소, dNTP, 및 버퍼 용액을 포함하는 PCR 믹스; 뉴클리아제 프리 워터(nuclease-free water); 또는 이들의 조합을 더욱 포함할 수 있다. 상기 RT 믹스는 타겟 유전자의 증폭에 앞서 RNA를 DNA로 역전사하는데 이용되며, 상기 PCR 믹스는 역전사를 통해 생성된 DNA를 증폭하는데 사용될 수 있다.
본 개시의 다른 구체예에 따르면, 상기 키트는 형광 염료, ddNTP, 시퀀싱 버퍼 용액, 정제 시약, 또는 이들의 조합을 더욱 포함할 수 있다. 정제 시약을 사용하여 상기 타겟 유전자에 형광 염료를 붙이기 전후로 PCR 산물의 정제를 실시할 수 있다. 본 개시에 있어서, 상기 정제 시약은 예컨대 SAP(shrimp alkaline phosphatase); EXO I (Exonuclease I); EtOH; 소듐 아세테이트; EDTA 등일 수 있다. 상기 정제 시약을 통해 정제된 후의 형광 염료로 표지된 PCR 산물은 이후 단계에서 시퀀서를 이용하여 구체적인 염기 서열이 분석될 수 있다.
분석 방법
본 개시는 HIV-1 감염인으로부터 얻어지는 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 신규의 방법을 제공한다. 상기 방법에는 전술한 본 개시의 프라이머 세트 및/또는 키트가 사용될 수 있을 것이다.
상기 방법은 대상자로부터 HIV-1 RNA를 포함하는 적어도 하나의 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 상기 HIV-1 RNA는 POL 유전자를 포함할 수 있다. 상기 샘플은 대상자로부터 이미 채취된 체액으로부터 공지의 방법을 통하여 얻어질 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 체액은 혈액일 수 있으며, 그 중에서도 혈액에서 분리된 혈장(plasma)일 수 있다.
또한, 본 개시의 분석 방법은 상기 샘플 내에서 HIV-1 약제 내성 진단을 위해 타겟으로 하는 유전자를 증폭하는 단계를 포함한다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 증폭하는 단계는 RT-PCR을 통하여 수행될 수 있으며, 이에 전술한 본 개시의 RT-PCR용 프라이머 세트가 또한 상기 증폭 단계에 이용될 수 있다.
RT-PCR 내에서 HIV-1 RNA를 포함하는 샘플은 역전사 효소에 의하여 cDNA로 역전사되며, 여기서 상기 역전사 효소는 공지의 역전사 효소가 사용가능하며 특별히 제한되지 않는다. 본 개시에 따른 일 구체예에 있어서, 역전사 단계는 약 40 내지 70℃, 바람직하게는 약 45 내지 60℃의 온도에서, 또 약 5 내지 20분, 바람직하게는 약 5 내지 15분, 가장 바람직하게는 약 10분간 수행될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 역전사 단계 이후 생성된 cDNA의 증폭에 들어가기 앞서 역전사 불활성화 단계 및 초기 변성 단계를 포함할 수 있다. 상기 역전사 불활성화 단계는 역전사 단계에서 사용된 역전사효소를 불활성화시켜 후속 단계에서 불필요한 반응이 발생하는 것을 억제하고, 상기 초기 변성 단계는 상기 생성된 cDNA가 이후 단계에서 증폭될 수 있도록 변성하는 것을 의미한다. 상기 역전사 불활성화 단계 및 초기 변성 단계는 동시에 수행될 수 있으며, 예컨대 약 95 내지 100℃의 온도 범위에서, 약 1분 30초 내지 2분 30초 사이의 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 증폭하는 단계는 i) 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 분리시키는 변성(denaturation) 단계; ii) 단일 가닥으로 변성된 DNA를 프라이머와 결합시키는 어닐링(annealing) 단계; iii) 상기 결합된 프라이머를 신장시키는 신장(extension) 단계를 포함한다.
본 개시의 증폭이 되는 타겟 영역은 PR 영역의 적어도 일부, RT 영역의 적어도 일부, 및 IN 영역의 적어도 일부를 동시에 포함하는바, PR 영역, RT 영역, 또는 IN 영역 각각만을 타겟으로 하던 종래 기술과는 증폭 단계에서의 상이한 조건이 요구될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 변성 단계는 90 내지 100℃의 온도 범위 내에서 5 내지 20초간 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 변성 단계는 95 내지 100℃의 온도 범위 내에서 7초 내지 15초간 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 변성 단계는 97 내지 99℃의 온도 범위 내에서 8초 내지 12초간 수행될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 어닐링 단계는 50 내지 80℃의 온도 범위 내에서 5 내지 20초간 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 어닐링 단계는 55 내지 75℃의 온도 범위 내에서 7초 내지 15초간 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 어닐링 단계는 55 내지 72℃의 온도 범위 내에서 8초 내지 12초간 수행될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 신장 단계는 60 내지 80℃의 온도 범위 내에서 90초 이상 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 신장 단계는 65 내지 75℃의 온도 범위 내에서 100초 내지 140초간 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 신장 단계는 70 내지 74℃의 온도 범위 내에서 110초 내지 130초간 수행될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 신장 단계는 약 72℃의 온도에서 약 120초간 수행될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 변성 단계, 어닐링 단계, 및 신장 단계는 순차적으로 진행될 수 있으며, 변성 단계, 어닐링 단계, 및 신장 단계를 각 1회씩 실시하는 것을 1 사이클로 하여 상기 사이클은 30 내지 50 사이클, 바람직하게는 32 내지 45 사이클, 보다 바람직하게는 35 내지 45 사이클 실시될 수 있다.
본 개시에서 RT-PCR을 통해 증폭하고자 하는 타겟 유전자는 약 3kb의 긴 서열 길이를 갖는 PR, RT, IN 영역을 포함하는 유전자이기에, 각 단계의 온도 및 시간 조건은 매우 중요하며, 그 중에서도 역전사 단계 및 어닐링 단계의 조건이 가장 중요하다. 상기 온도 범위를 벗어나는 경우 3kb 길이를 갖는 타겟 유전자의 증폭에 도달하기 어려운 문제가 발생할 수 있다.
또한, 본 개시의 분석 방법은 상기 증폭 단계를 통해 증폭된 타겟 유전자를 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용하여 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 이에 전술한 본 개시의 시퀀싱용 프라이머 세트가 상기 시퀀싱 단계에 이용될 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 시퀀싱 단계는 시퀀싱용 프라이머 세트 및 형광 염료를 이용하여 시퀀싱 타겟 유전자를 증폭하고, 이에 형광 염료를 표지하는 사이클 시퀀싱 단계; 및 상기 형광 염료가 표지된 유전자를 시퀀서 등의 장치를 이용하여 구체적인 염기 서열을 분석하는 최종 시퀀싱 단계를 포함할 수 있다.
상기 사이클 시퀀싱 단계는 또한, i) 변성 단계; ii) 어닐링 단계; 및 iii) 신장 단계를 포함할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 변성 단계는 90 내지 100℃의 온도 범위 내에서 5 내지 20초간 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 변성 단계는 95 내지 100℃의 온도 범위 내에서 7초 내지 15초간 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 변성 단계는 95 내지 97℃의 온도 범위 내에서 8초 내지 12초간 수행될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 어닐링 단계는 40 내지 60℃의 온도 범위 내에서 1 내지 15초간 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 어닐링 단계는 45 내지 55℃의 온도 범위 내에서 3초 내지 10초간 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 어닐링 단계는 47 내지 52℃의 온도 범위 내에서 4초 내지 6초간 수행될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 신장 단계는 50 내지 70℃의 온도 범위 내에서 3분 내지 10분간 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 신장 단계는 55 내지 65℃의 온도 범위 내에서 3분 내지 6분간 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 신장 단계는 58 내지 62℃의 온도 범위 내에서 3분 내지 4분 30초간 수행될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 사이클 시퀀싱 단계가 포함하는 변성 단계, 어닐링 단계, 및 신장 단계는 순차적으로 진행될 수 있으며, 변성 단계, 어닐링 단계, 및 신장 단계를 각 1회씩 실시하는 것을 1 사이클로 하여 상기 사이클은 25 내지 40 사이클, 바람직하게는 25 내지 35 사이클, 보다 바람직하게는 25 내지 30 사이클 실시될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 분석 방법은 증폭 단계 이후, 사이클 시퀀싱 단계에 앞서 증폭 단계에서 얻어진 타겟 유전자의 증폭 산물을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정제 단계에서는 정제 시약을 통해 잔존하는 RT-PCR용 프라이머를 제거하는 것이 가능하며, 여기서 상기 정제 시약으로는 예컨대 SAP 및/또는 EXO 등이 사용될 수 있다. 또한 필요한 경우, 상기 정제된 증폭 산물은 멸균 증류수를 이용하여 사이클 시퀀싱 단계에 도입되기 이전에 희석될 수 있다. 마찬가지로, 상기 분석 방법은 사이클 시퀀싱 단계 이후, 형광 염료가 표지된 유전자를 정제 시약을 이용하여 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 여기서 상기 정제 시약으로는 예컨대, EtOH 및/또는 소듐 아세테이트, EDTA 등이 사용될 수 있다.
상기 사이클 시퀀싱 단계 이후, 본 개시의 상기 분석 방법은 최종 시퀀싱 단계를 통해 형광 염료가 표지된 유전자의 구체적인 염기 서열을 분석할 수 있다. 상기 최종 시퀀싱 단계는 상용화되어 있는 시퀀서 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
한편, 본 개시의 상기 분석 방법은 시퀀싱 단계 이후에, 상기 시퀀싱 단계를 통해 분석된 염기 서열에 기초하여, 샘플의 HIV-1 약제에 대한 내성을 판단하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 개시의 시퀀싱용 프라이머 세트를 사용하는 경우, 5개의 정방향 프라이머를 포함하는 정방향 프라이머 세트 및 5개의 역방향 프라이머를 포함하는 역방향 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이에, 상기 시퀀싱 단계를 통해 분석된 염기 서열을 이용하여 샘플의 HIV-1 약제에 대한 내성을 판단하는 단계는 이들 프라이머 각각에 의해 시퀀싱된 염기 서열을 하나의 염기 서열로 배열하는 단계; 및 상기 배열된 염기 서열을 HIV-1 약제 내성 유전자 염기 서열 데이터 베이스에 입력하여 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 데이터베이스는 본 개시가 목적으로 하는 HIV-1 용 약제에 대한 내성 여부의 분석이 가능하다면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 “https://hivdb.stanford.edu/”등이 이용 가능하다.
이하, 본 개시의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 개시를 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 개시가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. HIV-1 타겟 유전자의 증폭
HIV-1 감염인으로부터 채취된 시료(혈장)로부터 분리된 HIV-1 RNA (샘플 1 내지 14)를 사전에 준비하여 냉각 장치 내에서 동결 보관하였다. Ice 또는 laptop cooler에서 완전히 해동한 이후, 상기 HIV-1 RNA를 포함하는 RT-PCR 혼합물을 제조하였다. 상기 RT-PCR 혼합물의 조성은 하기 표 4와 같다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000004
상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 종류는 다음 표 5에 나타난 바와 같다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000005
샘플 1 내지 14를 각각 포함하는 RT-PCR 혼합물에 실시예 1 내지 4의 각 RT-PCR 프라이머 세트를 사용하여 하기 표 6에 나타난 바와 같은 RT-PCR 반응 조건에 따라 RT-PCR을 수행하였다. PCR 기기로는 Veriti 96-well Thermal Cycler가 사용되었다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000006
이후, 실시예 1 내지 4 각각의 PCR 산물을 BIO-RAD사의 Gel Doc XR+ Gel Documentation System을 이용하여 전기영동하고, 그 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3을 참조하면, 전기영동 결과, 샘플 1 내지 14 모두에 대해서 실시예 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용한 증폭을 통해 약 3200bp의 PCR 산물이 수득됨을 확인할 수 있었다.
이에 상기 프라이머 세트를 통해 HIV-1의 POL 유전자 중 PR-RT-IN 영역을 모두 포함하는 약 3kb 크기의 타겟 유전자를 증폭하는 것이 가능함을 알 수 있다.
2. 증폭 산물의 정제
전술한 "1. HIV-1 타겟 유전자의 증폭"에 의하여 얻어진 증폭 산물을 다음 표와 같은 조성으로 하여 혼합물을 제조하였다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000007
상기 혼합물은 다음 표 8과 같은 조건 하에서 Thermal Cycler를 이용하여 정제되었다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000008
이후 정제된 증폭 산물은 시퀀싱에 앞서 밴드 강도가 20~50ng 이 되도록 증류수를 이용하여 희석되었다.
3. 증폭된 HIV-1 타겟 유전자의 염기서열 분석
상기 희석된 증폭 산물 1㎕를 정방향 프라이머 F2-1, F3-1, F4-1, F5-1, 및 F6-1 및 역방향 프라이머 R2-1, R3-1, R4-1, R5-1, 및 R6-1를 각각 포함하는 HIV-1 sequencing mixture 각 9㎕와 혼합한 후 thermal cycler를 이용하여 사이클 시퀀싱을 수행하였다. 상기 HIV-1 sequencing mixture의 조성은 하기 표 9에 나타냈다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000009
상기 사이클 시퀀싱은 하기 표 9의 조건 하에서 수행되었다.
Figure PCTKR2020018471-appb-img-000010
이후 얻어진 사이클 시퀀싱 PCR 산물 10㎕에 3M 소듐 아세테이트 1㎕, 125mM EDTA 1㎕ 및 100% 에탄올 25㎕를 첨가하였다. 2000xg, 4℃에서 30분간 원심분리 후 상층액을 버리고, 70% 에탄올 100㎕를 넣은 후 다시 2000xg, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 남아있는 에탄올을 완벽히 제거하기 위해 plate 또는 tube를 뒤집어서 150xg, 4℃에서 30초간 원심분리 후 상온에서 시료를 건조시켰다. 시료에 Hi-Di formamide를 10㎕ 첨가하여 잘 섞어준 후 95℃에서 2분간 반응 후 ice에서 식혀주었다. 시료를 염기서열 분석기에 넣고 최종 시퀀싱을 수행하였다. 상기 염기서열 분석기로는 ABI 3130xL Genetic analyzer 또는 ABI 3500xL Dx Genetic Analyzer가 사용되었다.
상기 염기서열 분석 결과를 통해 얻어지는 염기 서열을 “https://hivdb.stanford.edu/”에서 제공하는 데이터베이스에 입력하여 샘플의 변이 부위와 HIV-1 약제에 대한 내성 여부를 확인할 수 있다.
예시적으로 실시예 1의 프라이머 set (1)을 이용하여 샘플 1, 9, 및 12를 증폭한 증폭 산물에 대한 시퀀싱 및 약제 내성 분석 결과는 순서대로 도 4 내지 도 6과 같다. 도 4a 내지 도 6a를 참조하면, 약 3200bp의 영역에 대하여 누락되는 부분 없이 시퀀싱이 수행되었음을 확인할 수 있다. 또한, 도 4b 내지 도 6b를 참조하면, 목적으로 한 PR, RT, IN 세 영역 모두 단일 프라이머 세트를 통하여 증폭이 가능하였고, 상기 시퀀싱 프라이머 세트를 통해 원활히 시퀀싱되었음을 알 수 있다. 또한, 도 4c 내지 도 6c에서 나타난바와 같이, 종래 상용화되고 있는 진단 키트를 대신하여 본 개시의 RT-PCR용 프라이머 세트 및 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용하여 해당 샘플의 HIV-1 약제 내성에 대한 진단이 가능함을 확인할 수 있다.
상기와 같은 결과에 기초하여, 본 개시의 프라이머 세트, 키트, 및 분석 방법의 이용은 종래 상용화되고 있는 진단 키트에 비해 시간, 비용, 성능의 관점에서, 특히 시간 및 비용의 관점에서 현저히 우수한 이점을 제공하는 것이 가능할 것으로 예상된다.
본 개시의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 개시의 영역에 속하는 것이며, 본 개시의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (12)

  1. HIV-1 약제 내성 분석을 위한 RT-PCR용 프라이머 세트로서,
    서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머, 및
    서열번호 7로 제시된 역방향 프라이머를 포함하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 RT-PCR용 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 HIV-1 POL 유전자 중 Protease(PR) 영역의 전부, Reverse Transcriptase(RT) 영역의 전부, 및 Integrase(IN) 영역의 적어도 일부를 동시에 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는 RT-PCR용 프라이머 세트.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 정방향 프라이머는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 RT-PCR용 프라이머 세트.
  4. HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트로서,
    청구항 1 내지 3 중 어느 하나의 RT-PCR용 프라이머 세트; 및
    HIV-1 POL 유전자의 염기서열을 분석하기 위한 시퀀싱용 프라이머 세트를 포함하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 시퀀싱용 프라이머 세트는 서열번호 8 내지 19, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 세트 및 서열번호 20 내지 29, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 역방향 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 정방향 프라이머 세트는
    서열번호 8 내지 10 중 어느 하나;
    서열번호 11 내지 14 중 어느 하나;
    서열번호 15 또는 16 중 어느 하나;
    서열번호 17; 및
    서열번호 18 또는 19 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 역방향 프라이머 세트는
    서열번호 20;
    서열번호 21 또는 22 중 어느 하나;
    서열번호 23;
    서열번호 24 또는 25 중 어느 하나; 및
    서열번호 26 내지 29 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 정방향 프라이머 세트는 서열번호 8, 11, 15, 17, 및 18을 포함하고, 상기 역방향 프라이머 세트는 서열번호 20, 21, 23, 24, 및 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV-1 약제 내성 분석을 위한 키트.
  9. 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 방법으로서,
    (a) 대상자로부터 미리 채취된 체액으로부터 HIV-1 RNA를 포함하는 적어도 하나의 샘플을 얻는 단계;
    (b) 상기 샘플의 타겟 유전자를 RT-PCR용 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계, 여기서 상기 RT-PCR용 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머, 및 서열번호 7로 제시된 역방향 프라이머를 포함하며; 및
    (c) 상기 증폭된 타겟 유전자를 시퀀싱용 프라이머 세트를 이용하여 시퀀싱하는 단계를 포함하는 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 적어도 하나의 샘플에 포함되는 HIV-1 RNA는 POL 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 방법.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 방법은 (d) 상기 (c) 단계를 통해 시퀀싱된 염기 서열을 분석하여 샘플의 HIV-1 약제에 대한 내성을 판단하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 (d) 단계는 시퀀싱된 염기 서열을 배열하는 단계; 및
    상기 배열된 염기서열을 HIV-1 약제 내성 유전자 염기 서열 데이터베이스에 입력하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 샘플의 HIV-1 약제 내성을 분석하는 방법.
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