CN109996875B - 使用dtbp浓缩微生物或提取核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用DTBP的用于浓缩微生物和提取核酸的方法。已经开发了能够使用DTBP浓缩微生物的技术，并且还已经开发了能够从浓缩的微生物中直接提取核酸的方法。由于浓缩微生物和提取核酸的技术可以在一个管或芯片中实现，因此期望显著减少来自外部的污染、成本、时间、复杂性等。

Description

使用DTBP浓缩微生物或提取核酸的方法
技术领域
本发明涉及使用3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate)浓缩微生物或提取核酸的方法。
背景技术
核酸是用于检查疾病状态的重要分析工具。脱氧核糖核酸(DNA)生物标志物(如单核苷酸多态性(SNP)、突变或DNA甲基化)帮助研究人员找到癌症的原因，并为在疾病初期阶段诊断和观察疾病状态以及预后和监测疾病状态提供重要机会提供重要线索。
由于与其它成分(如蛋白质)相比，核酸(如DNA)以非常低的生理浓度存在(例如，每微升全血中，相对于数十微克蛋白质存在数十纳克DNA)，从临床样品中有效提取和预浓缩DNA对于后续过程(如扩增和检测过程)非常重要。
在现有的检测微生物的方法中，使用1ml-2ml患者样品溶液中的一部分(而不是全部)提取核酸，并使用所提取的核酸进行检测。在存在大量微生物的情况下没有大问题。然而，在存在少量微生物的情况下，可能无法准确地检测微生物，因此在调控其它传染病方面可能存在问题。因此，需要研究出一种浓缩方法，通过该浓缩方法来尽可能多地使用1ml-2ml样品中的所有微生物。
此外，由于最近在包括生物技术、诊断学、药理学以及代谢组学在内的各种领域中对高度纯化的核酸的需求已经增加，已经尝试更快速地从各种生物样品分离具有更高纯度的核酸。
然而，迄今为止，在分离核酸的方法中进展最大的部分是关于从包含在细胞裂解液中的各种物质(如基因组DNA、质粒DNA、信使RNA、蛋白质以及细胞碎片)中特异性吸附核酸的载体的技术。几乎所有开发分离核酸的方法的研究都集中在吸附核酸的物质的研究和开发上。
因此，为了更快速地分离具有更高纯度的核酸，迫切需要开发能够从细胞碎片、变性蛋白质聚集体以及细胞裂解物中的其它各种物质中仅分离所需核酸的技术。
发明内容
[技术问题]
本发明旨在提供一种用于浓缩微生物的组合物以及使用所述组合物的用于浓缩微生物的方法和试剂盒，所述组合物包含3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(下文中称为“DTBP”)作为活性成分；一种用于提取核酸的组合物以及使用所述组合物的用于提取核酸的方法和试剂盒，所述组合物包含DTBP作为活性成分；以及，一种用于浓缩微生物和提取核酸的组合物以及使用所述组合物的用于浓缩微生物并同时从所浓缩的微生物中提取核酸的方法和试剂盒，所述组合物包含DTBP作为活性成分。
[技术方案]
为了解决上述问题，本发明提供了用于浓缩微生物的组合物，所述组合物包含3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)作为活性成分。
此外，本发明提供了用于浓缩微生物的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。
此外，本发明提供了浓缩微生物的方法，所述方法包括使包含微生物的样品和DTBP彼此接触。
此外，本发明提供了用于提取核酸的组合物，所述组合物包含DTBP作为活性成分。
此外，本发明提供了用于提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。
此外，本发明提供了提取核酸的方法，所述方法包括：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性(步骤1)；将核酸样品和DTBP注射到经改性的所述对象物上，并形成所述核酸和所述DTBP的复合物(步骤2)；以及通过用洗脱缓冲液处理所述对象物(在所述对象物上形成所述复合物)来提取所述核酸(步骤3)。
此外，本发明提供了用于浓缩微生物和提取核酸的组合物，所述组合物包含DTBP作为活性成分。
此外，本发明提供了用于浓缩微生物和提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。
此外，本发明提供了浓缩微生物并同时从所浓缩的微生物中提取核酸的方法，所述方法包括：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性(步骤1)；通过使包含微生物的样品和DTBP在经改性的所述对象物上彼此接触来浓缩所述微生物(步骤2)；从经浓缩的所述微生物中分离核酸(步骤3)；形成经分离的所述核酸和所述DTBP的复合物(步骤4)；以及通过用洗脱缓冲液处理所述对象物(在所述对象物上形成所述复合物)来提取所述核酸(步骤5)。
[有益效果]
本发明涉及使用DTBP浓缩微生物或提取核酸的方法。本发明人开发了能够使用DTBP浓缩微生物的技术，并且开发了从浓缩的微生物中直接提取核酸的方法。用于浓缩微生物的技术和用于提取核酸的技术可以在一个管或芯片中实现，从而可以期望显著减少来自外部的污染、成本、时间以及复杂性。
附图说明
图1是说明根据本发明的3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)/薄膜样品分析的示意图。
图2是说明薄膜装置的构造的分解图。
图3是示出根据DTBP浓度变化的DNA提取效率的图。
图4是说明从结直肠癌细胞系(HCT116细胞系，以下称为“HCT116”)提取的DNA的终点PCR(见图4A)和实时PCR(见图4B)的一组图。
图5是说明从乳腺癌细胞系(MCF细胞系，以下称为“MCF”)提取的DNA的终点PCR(见图5A)和实时PCR(见图5B)的一组图。
图6是说明从绵羊布鲁氏菌(Brucella Ovis)提取的DNA的PCR结果的图，其中M是DNA标记；Q是使用现有Qiagen方法提取的DNA样品；DTBP是使用根据本发明的DTBP方法提取的DNA样品；以及N是阴性对照。
图7是说明提取RNA的方法(见图7A)以及同时提取RNA和cDNA的方法(见图7B)的一组图，其中，在图7A中，对同一样品进行四次实验，L是DNA标记以及N是阴性对照；在图7B中，对同一样品进行两次实验，L是DNA标记。
图8是示出使用DTBP浓缩病原体(大肠杆菌(Escherichia coli))的分析结果的图。
图9是示出使用DTBP在一个芯片中浓缩病原体(大肠杆菌)并同时提取和分析核酸的结果的图。
图10说明使用DTBP浓缩和分析病原体(RNA病毒(PIV3))的结果，其中P是阳性对照；N是阴性对照；L是50bp DNA梯；样品1至样品4是使用现有Qiagen方法提取的DNA样品；样品1-1至样品4-1是使用DTBP方法浓缩和提取的DNA样品。样品1通过现有方法被诊断为阴性，而使用DTBP浓缩的样品1-1被确认为阳性。通过现有方法提取的样品2和样品3以及使用DTBP浓缩的样品全部确实为阴性；并且在样品4的情况下，使用DTBP浓缩的样品4-1被确认为确实会增加之前为阳性的样品的条带强度。
具体实施方式
本发明提供用于浓缩微生物的组合物，所述组合物包含3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)作为活性成分。
理想地，所述微生物可包括所有带负电的微生物，如细菌、病毒以及细胞。
此外，本发明提供用于浓缩微生物的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。所述试剂盒可进一步包含有效浓缩微生物所需的用于pH调节等的缓冲液等。
此外，本发明提供浓缩微生物的方法，所述方法包括：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性(步骤1)；以及使包含微生物的样品和DTBP在经改性的所述对象物上彼此接触(步骤2)。
在本发明中，所述对象物可具有用硅烷化合物改性的表面。理想地，所述硅烷化合物可以是由式1表示的化合物，但是本发明不限于此。
[式1]
在式1中，R1至R3可以彼此相同或彼此不同，并且可以是选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基中的任何一种；R4可以是选自氨基(C1-C10)烷基、3-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基以及3-[2-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基氨基](C1-C4)烷基中的任何一种。
更理想地，硅烷化合物可以是选自(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(1-氨基甲基)三乙氧基硅烷、(2-氨基乙基)三乙氧基硅烷、(4-氨基丁基)三乙氧基硅烷、(5-氨基戊基)三乙氧基硅烷、(6-氨基己基)三乙氧基硅烷、3-氨基丙基(二乙氧基)甲基硅烷(APDMS)、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷(AEAPTMS)以及3-[(三甲氧基甲硅烷基)丙基]二亚乙基三胺(TMPTA)中的至少一种，但是本发明不限于此。更理想地，本发明的实施方式中所描述的APTES或APDMS最适合作为硅烷化合物。
理想地，所述包含微生物的样品可以是怀疑已经被微生物感染的对象物的粪便、尿液、泪液、唾液、皮肤外部分泌物、呼吸道外部分泌物、肠道外部分泌物、消化道外部分泌物、血浆、血清、血液、脊髓液、淋巴液、体液或组织的样品，但是本发明不限于此。
此外，本发明提供用于提取核酸的组合物，所述组合物包含DTBP作为活性成分。理想地，所述核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，但是本发明不限于此。
此外，本发明提供了用于提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。所述试剂盒可进一步包含用于将样品内的细胞溶解以从所述细胞中释放核酸的裂解缓冲液、蛋白酶等。所述试剂盒可进一步包含有效提取核酸所需的用于pH调节等的缓冲液等。
此外，本发明提供提取核酸的方法，所述方法包括：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性(步骤1)；将核酸样品和DTBP注射到经改性的所述对象物上以形成所述核酸和所述DTBP的复合物(步骤2)；以及通过用洗脱缓冲液处理所述对象物(在所述对象物上形成所述复合物)来提取所述核酸(步骤3)。
理想地，所述对象物可具有用硅烷化合物改性的表面。更理想地，所述硅烷化合物可以是由式1表示的化合物，但是本发明不限于此。
[式1]
在式1中，R1至R3可以彼此相同或彼此不同，并且可以是选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基中的任何一种；R4可以是选自氨基(C1-C10)烷基、3-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基以及3-[2-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基氨基](C1-C4)烷基中的任何一种。
更理想地，本发明的实施方式中所描述的APTES或APDMS最适合作为硅烷化合物。
此外，本发明提供浓缩微生物和提取核酸的组合物，所述组合物包含DTBP作为活性成分。
理想地，所述微生物可包括所有带负电的微生物，如细菌、病毒以及细胞。
理想地，所述核酸可以是DNA或RNA，但是本发明不限于此。
此外，本发明提供用于浓缩微生物和提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包含所述组合物。所述试剂盒可进一步包含有效浓缩微生物和提取核酸所需的用于pH调节等的缓冲液等。所述试剂盒可进一步包含用于将样品内的细胞溶解以从所述细胞中释放核酸的裂解缓冲液、蛋白酶等。
此外，本发明提供浓缩微生物并同时从所浓缩的微生物中提取核酸的方法，所述方法包括：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性(步骤1)；通过使包含微生物的样品和DTBP在经改性的所述对象物上彼此接触来浓缩所述微生物(步骤2)；从经浓缩的所述微生物中分离核酸(步骤3)；形成经分离的所述核酸和所述DTBP的复合物(步骤4)；以及通过用洗脱缓冲液处理所述对象物(在所述对象物上形成所述复合物)来提取所述核酸(步骤5)。
理想地，所述对象物可具有用硅烷化合物改性的表面。更理想地，所述硅烷化合物可以是由式1表示的化合物，但是本发明不限于此。
[式1]
在式1中，R1至R3可以彼此相同或彼此不同，并且可以是选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基中的任何一种；R4可以是选自氨基(C1-C10)烷基、3-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基以及3-[2-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基氨基](C1-C4)烷基中的任何一种。
更理想地，本发明的实施方式中所描述的APTES或APDMS最适合作为硅烷化合物。
理想地，所述包含微生物的样品可以是怀疑已经被微生物感染的对象物的粪便、尿液、泪液、唾液、皮肤外部分泌物、呼吸道外部分泌物、肠道外部分泌物、消化道外部分泌物、血浆、血清、血液、脊髓液、淋巴液、体液或组织的样品，但是本发明不限于此。
在本发明中，“对象物”可以是薄膜装置、磁珠、环形谐振器以及纳米颗粒中的任何一种，但是本发明不限于此。更理想地，所述对象物可以是薄膜装置，所述薄膜装置包含：上部薄膜，本发明实施方式中所描述的入口孔和出口孔经由所述上部薄膜形成并穿过所述上部薄膜；下部薄膜，所述下部薄膜设置为与所述上部薄膜间隔开；微通道室，所述微通道室设置在所述上部薄膜和所述下部薄膜之间，所述微通道室具有在其中图案化的微通道，使得其入口端和出口端分别对应于所述上部薄膜的入口孔和出口孔并与其连通，并且所述微通道室具有在邻近所述入口端处形成的注入路径以与所述微通道的入口连通；以及密封部，所述密封部密封所述上部薄膜和所述下部薄膜中的每一个的侧面，以密封所述微通道室。
实施例
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于以下实施例。
参见图1，根据本发明的核酸分析是DTBP/薄膜样品分析，该DTBP/薄膜样品分析是在薄膜装置中使用DTBP的核酸分析。核酸分析包括三个步骤，如样品洗脱/孵育步骤、清洁步骤以及洗脱步骤，并且是在不离心的情况下进行。例如，薄膜装置用作为硅烷化合物的APTES进行改性，并且通过改性从疏水性转化为亲水性。
将核酸样品、洗脱缓冲液以及DTBP溶液注射到经改性的薄膜装置上。通过核酸的氨基与DTBP的双官能胺反应器(bifunctional amine reactor)之间的相互作用，可以利用核酸和DTBP之间的交联机制形成核酸和DTBP的复合物，由此可以从样品中提取DNA。
在这种情况下，由于DTBP具有由式2表示的结构并且包含双官能亚氨酸酯和二硫键，DTBP形成可逆交联结构，因此被用作细胞、蛋白质以及核酸的氨基反应性交联剂。通过DTBP和核酸之间快速且强烈的相互偶联(而不是DTBP和蛋白质之间的相互作用)，可以高效地从核酸样品中提取核酸。
[式2]
在下文中，将参考实施例详细描述本发明，实施例是为了理解本发明而给出的，并不旨在限制本发明的范围。本发明的实施例是为使本发明相关领域的技术人员完全理解本发明而提供的。
<实施例1>薄膜装置的制造和预处理
1.薄膜装置的制造
使用激光切割装置(由Universal Laser Systems,Scottsdale,USA制造)制造根据本发明的薄膜装置(见图2A)。首先，薄膜装置包含上部薄膜、下部薄膜以及介于上部薄膜和下部薄膜之间的微流体室。微流体室包含多个通过室中的通道彼此连接的狭槽型微孔，以从核酸源提取DNA。
为了制造微流体室，使用激光切割装置切割300μm厚的双面胶带(包含插入在100μm厚的双面胶带之间的100μm厚的聚酯膜)上的微流体室设计，从而制造微流体室。使用激光切割装置将(上部和下部)薄膜切割成具有与微流体室相同的尺寸。
在上部薄膜中形成作为通孔的入口和出口。使用永久性粘合剂将激光切割的(上部和下部)薄膜分别附着于激光切割的微流体室的上表面和下表面。微流体室的高度为约300μm，总体积为300μl(体积为300μl，8.4cm×3.7cm)。
将3mm厚的铸造丙烯酸板(cast acrylic sheet)(印度尼西亚制造的MARGACIPTA)附接到双面胶带的一个表面上，并使用激光切割装置切割和打孔，从而制造用于注射核酸源的管适配器(tubing adapter)。将制造的管适配器附接到微流体室的入口和出口中的每一个。此后，将预切割的Tygon管(由Cole-Parmer,Vernon Hills,USA制造的AAC02548)置于适配器的孔中，然后使用环氧树脂密封。
所制造的薄膜装置可以处理各种体积(100μl、300μl以及500μl)的核酸样品。
2.薄膜装置的预处理
为了使用薄膜装置分析DNA，用氧等离子体处理薄膜装置的内部10分钟，并将用等离子体处理的薄膜装置在65℃的温度下浸入包含2％APTES的水溶液中10分钟-60分钟，然后用去离子水彻底清洗。在清洗之后，为了使薄膜装置固化，将经清洗的薄膜装置在氮气流中快速干燥，以用胺将薄膜装置改性。
通过使用液滴形状分析仪(由德国KRUSS制造的DSA100)对胺改性薄膜装置的水接触角进行测量，可以看出薄膜装置的亲水性随温度和孵育时间显著改变。用APTES在65℃的温度下将薄膜装置硅烷化10分钟后，薄膜的表面亲水性增加(约30℃至约40℃)。
<实施例2>DTBP/薄膜样品分析
在本发明中，将把DTBP应用于先前制造的薄膜装置的核酸分析方法称为DTBP分析，并且在以下实验中进行DTBP分析。
也就是说，首先制备优化的分析溶液以使用预先用胺改性的薄膜装置(体积为300μl，8.4cm×3.7cm)提取DNA。通过将包含100mM tris-HCl(pH 8.0)、10nm EDTA、1％SDS以及10％triton X-100的洗脱缓冲液与DTBP(100mg/ml)混合，制备优化的分析溶液，然后，将100μl核酸分析样品(即来源于细胞、细菌、血液或尿液的样品)与200μl分析溶液混合。
将其中混合了核酸分析样品和分析溶液的混合溶液经由用胺改性的薄膜装置的上部基板的入口引入并移动到微流体室中。因此，DTBP的两个胺基与DNA结合并且经改性的薄膜装置中的胺基与DNA结合，以形成复合物，从而分离DNA。在这种情况下，为了从核酸分析样品中充分提取DNA，将薄膜装置置于保持在56℃的温度下20分钟的培养箱和包含控制器(由Alpha Omega Instruments公司制造)的热电冷却器(TEC)中的任何一个中。
用PBS缓冲液清洗DTBP-DNA复合物以从DTBP-DNA复合物中除去异物，然后使用洗脱缓冲液(pH为10.6的10mM碳酸氢钠)提取DNA。在测量提取的DNA的量和纯度后，使用Enspire Multimode Plate Reader(由Perkin-Elmer制造)在260nm(DNA)和280nm(蛋白质)下测定样品的光密度比。为了将现有DNA提取方法与本发明的DTBP分析进行比较，使用QIAamp DNA mini试剂盒(由Qiagen,Hilden,Germany制造)根据已知方法进行分析。
如图3所示，作为确认每种DTBP浓度的结合力的结果，当DTBP浓度为100mg/ml时，确认DNA结合效率最高。
<实施例3>使用DTBP分析从真核细胞中提取DNA
在将两种真核细胞(如HCT116和MCF)中的每一种在包含补充有10％胎牛血清(下文中称为“FCS”)的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(由DMEM Life Technology制造的DMEM)的塑料培养板中在保持在5％CO2气氛中的37℃加湿培养箱中培养之后，以与实施例1相同的方式从真核细胞中提取DNA，并且处理作为蛋白水解酶的蛋白酶K以提取基因组DNA。为了比较，使用QIAamp DNA mini试剂盒从真核细胞中提取DNA。本实施例中使用的HCT116和MCF购自美国ATCC(https://www.atcc.org)。
进行终点聚合酶链式反应(PCR)和实时PCR以确认DNA的量和纯度。合成一些基因(肌动蛋白)的正向引物和反向引物，使其具有约24个碱基对的正常长度。终点PCR的条件如下：初始变性步骤在95℃的温度下进行15分钟；在95℃的温度下45秒、在59℃的温度下45秒(肌动蛋白)以及在72℃的温度下45秒作为1个循环，共进行45个循环；最终延伸步骤在72℃的温度下进行10分钟。在总体积25μl的混合物中扩增5μl-10μl DNA，所述混合物包含1×PCR缓冲液(由Qiagen制造)、2.5mM氯化镁(MgCl2)、0.25mM三磷酸脱氧核苷酸、25pmol的每种引物以及1单位的Taq DNA聚合酶。
对于实时PCR分析，将LightCycler 2.0(Roche Diagnostics)中提供的方法修改如下，作为下一步骤。在总体积20μl的混合物中扩增5μl-10μl DNA，所述混合物包含4μlLightCycler FastStart DNA Master Mix、25pmol的每种引物、2μl 1×PCR缓冲液(由Qiagen,Hilden,Germany制造)、2.5mM氯化镁(MgCl2)、0.25mM三磷酸脱氧核苷酸以及蒸馏水。初始预处理在95℃的温度下进行10分钟；在95℃的温度下10秒、在59℃的温度下30秒(肌动蛋白)以及在72℃的温度下10秒作为1个循环，共进行50个循环；然后在40℃的温度下进行冷却步骤30秒。在LightCycler 2.0(Roche Diagnostics)中处理具有SYBR green信号的扩增产物。
参考图4和图5的终点PCR(见图4A和图5A)和实时PCR(见图4B和图5B)，在使用DTBP提取的DNA的终点PCR结果中，可以确认从HCT116提取的DNA量是使用Qiagen产品的情况的约1.3倍，并且从MCF提取的DNA量是使用Qiagen产品的情况的约2.6倍；在实时PCR结果中，可以确认DTBP和Qiagen产品之间没有显著差异。
<实施例4>使用DTBP分析从细菌细胞中提取DNA
为了确认DTBP分析对于细菌细胞的性能，使用利用DTBP分析提取的DNA进行基于PCR的DNA扩增。所有引物均为针对大肠杆菌(Escherichia coli)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)以及沙门氏菌属(Salmonella)菌株(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、新港沙门氏菌(Salmonella Newport)以及圣保罗沙门氏菌(Salmonella Saintpaul))的商业引物。本实施例中所使用的相应菌株的商业引物购自美国IDT(https://www.idtdna.com)。
对于优化反应，将包含100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、1％SDS、10％tritonX-100以及20mg/ml溶菌酶的洗脱缓冲液与50mg/ml DTBP混合。进行一般PCR以验证根据本发明的DTBP方法的有效性。将大肠杆菌(E.coli)即XL1-blue菌株(购自Korean Collectionfor Type Cultures(https://kctc.kribb.re.kr))接种到50μg/ml四环素和Luria-Bertani(LB)培养基中并在37℃的温度下在振荡条件下培养1天，并使用包含103-107个集落形成单位(CFU)的样品进行测试。从所培养的大肠杆菌、脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌以及沙门氏菌属菌株(鼠伤寒沙门氏菌、新港沙门氏菌、圣保罗沙门氏菌)和绵羊布鲁氏菌中的每一种中提取细菌DNA，以用于DTBP分析和Qiagen试剂盒分析中。本实施例中所使用的菌株购自Korean Collection for Type Cultures(https://kctc.kribb.re.kr)。
对于细菌基因的遗传分析，使用总体积25μl的混合物(所述混合物包含1×PCR缓冲液(由Qiagen,Hilden,Germany制造)、2.5mM氯化镁(MgCl2)、0.25mM三磷酸脱氧核苷酸、25pmol的每种引物以及1单位的Taq DNA聚合酶)将在DTBP分析和Qiagen试剂盒分析中提取的2μl DNA在如下条件下进行扩增：在95℃的温度下15分钟；在95℃的温度下30秒、在60℃的温度下30秒(脓肿分枝杆菌、戈登分枝杆菌、沙门氏菌属菌株以及绵羊布鲁氏菌)以及在72℃的温度下30秒作为1个循环，共进行45个循环；以及最终延伸步骤在72℃的温度下进行7分钟。通过凝胶电泳将PCR扩增产物可视化，该凝胶电泳用于在包含溴化乙锭(EtBr)(由Sigma-Aldrich制造)的2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物。使用Gel Doc System(由Bio-RadLaboratories Inc.制造)使凝胶可视化。使用UV分光光度计(由Perkin-Elmer制造)测量DNA的浓度和纯度。
作为使用利用DTBP从绵羊布鲁氏菌提取的DNA进行PCR分析的结果，可以确认DTBP和Qiagen产品之间没有显著差异(图6)。
<实施例5>使用DTBP分析从人体液中提取DNA
为了验证DTBP分析对于人体液的性能，将200μl体液样品(全血和尿液)引入薄膜装置中以提取DNA。首先，将包含蛋白酶K和DTBP的洗脱缓冲液以及体液样品引入先前制造的薄膜装置中并移动到微通道室中，以形成体液样品中的DNA与DTBP之间的复合物，从而以与实施例2相同的方式提取DNA。在这种情况下，使用注射泵(由KD Scientific,MA制造)经由两个不同的入口以1.5ml/hr的流速引入洗脱缓冲液和体液样品10分钟。将料筒(cartridge)在56℃的温度下孵育20分钟，以提取和纯化DNA。用于通过注射泵引入PBS洗脱缓冲液的入口中的流速增加至4ml/hr，持续10分钟。最后，用100μl洗脱缓冲液洗脱所提取的DNA。另外，为了比较，使用QIAamp DNA mini试剂盒(由Qiagen,Hilden,Germany制造)利用200μl全血或尿液提取基因组DNA。使用UV分光光度计(由Perkin-Elmer制造)测定所有提取的DNA的浓度和纯度。
<实施例6>使用DTBP分析提取RNA
以与实施例2相同的方式使用DTBP分析提取RNA。如图7A所示，在外部合成cDNA后，通过18S rRNA扩增确认良好提取了RNA。
如图7B所示，RNA提取和cDNA合成可以通过DTBP分析在一个薄膜装置中进行，随后通过18S rRNA扩增确认良好开发了这种方法。
<实施例7>使用DTBP浓缩病原体(大肠杆菌)和提取核酸
用APDMS在65℃的温度下对先前制造的薄膜装置进行表面处理1小时。为了浓缩病原体，将1ml-2ml病原体样品与100mg/ml DTBP一起注射，并在室温下以100μl/min的流速浓缩。将浓缩的样品悬浮在100μl中。在本实施例中，使用大肠杆菌(E.coli)作为病原体样品。同时，用Qiagen DNA试剂盒提取DNA，并进行比较。
结果确认了当使用DTBP进行浓缩时，与使用现有Qiagen方法的没有浓缩步骤的核酸提取相比，RT-PCR Ct值降低至接近绝对值(见图8)。
另一方面，当根据本发明在一个芯片中同时进行病原体(大肠杆菌)浓缩和核酸提取时，确认了与其它方法相比，Ct值更显著地降低并且看起来类似于绝对值。即，在根据本发明的方法中，可以有效地浓缩1ml-2ml中的病原体，同时确认核酸提取效率高(见图9)。
<实施例8>使用DTBP浓缩病原体(RNA病毒(PIV3))
为了确认根据本发明的方法的病原体(病毒)检测效率，对怀疑已经感染RNA病毒(PIV3)的四个样品进行比较实验，以与在现有方法中广泛使用的Qiagen试剂盒进行比较。
也就是说，将取每种样品1ml并用Qiagen试剂盒提取以检验RNA病毒(PIV3)检测的情况(图10的泳道1、泳道2、泳道3和泳道4)与根据本发明利用DTBP浓缩每种样品1ml并提取以检验RNA病毒(PIV3)检测的情况(图10的泳道1-1、泳道2-1、泳道3-1和泳道4-1)进行比较。
结果，当使用DTBP方法将1ml样品中的RNA病毒(PIV3)浓缩时，通过现有方法将样品1诊断为阴性，但是在根据本发明的DTBP浓缩后确认样品为阳性。样品2和样品3确实为阴性；并且在样品4的情况下，可以确认之前为阳性的样品的条带强度确实会增加(见图10)。
在上文中，已经通过具体实施方式和附图描述了本发明，但是本发明不限于此，并且应当理解，本领域普通技术人员可以在本发明和所附权利要求及其等同物的精神和范围内进行各种变化和修改。

Claims (16)

1.一种浓缩微生物的方法，所述方法按照下述顺序包括：
步骤1：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性；以及
步骤2：使包含所述微生物的样品和3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)在经改性的所述对象物上彼此接触，
其中，所述微生物选自于真核细胞、细菌细胞或RNA病毒。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述对象物是薄膜装置、磁珠、环形谐振器以及纳米颗粒中的任何一种。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述对象物具有用含有所述胺基的硅烷化合物改性的表面。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述硅烷化合物是由下式1表示的化合物：
[式1]
其中，在式1中，R1至R3彼此相同或彼此不同，并且是选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基中的任何一种；R4是选自氨基(C1-C10)烷基、3-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基以及3-[2-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基氨基](C1-C4)烷基中的任何一种。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述硅烷化合物是选自由(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(1-氨基甲基)三乙氧基硅烷、(2-氨基乙基)三乙氧基硅烷、(4-氨基丁基)三乙氧基硅烷、(5-氨基戊基)三乙氧基硅烷、(6-氨基己基)三乙氧基硅烷、3-氨基丙基(二乙氧基)甲基硅烷(APDMS)、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷(AEAPTMS)以及3-[(三甲氧基甲硅烷基)丙基]二亚乙基三胺(TMPTA)所组成的组中的至少一种。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述包含微生物的样品是选自由怀疑已经被微生物感染的对象物的粪便、尿液、泪液、唾液、皮肤外部分泌物、呼吸道外部分泌物、肠道外部分泌物、消化道外部分泌物、血浆、血清、血液、脊髓液、淋巴液、体液以及组织所组成的组中的任何一种的样品。
7.一种提取微生物的核酸的方法，所述方法按照下述顺序包括：
步骤1：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性；
步骤2：将核酸样品和3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)注射到经改性的所述对象物上并形成所述核酸和所述DTBP的复合物；以及
步骤3：通过用洗脱缓冲液处理所述对象物来提取所述核酸，在所述对象物上形成所述复合物，
其中，所述微生物选自于真核细胞、细菌细胞或RNA病毒。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述对象物是薄膜装置、磁珠、环形谐振器以及纳米颗粒中的任何一种。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述对象物具有用含有所述胺基的硅烷化合物改性的表面。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述硅烷化合物是由下式1表示的化合物：
[式1]
其中，在式1中，R1至R3彼此相同或彼此不同，并且是选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基中的任何一种；R4是选自氨基(C1-C10)烷基、3-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基以及3-[2-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基氨基](C1-C4)烷基中的任何一种。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述硅烷化合物是选自由(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(1-氨基甲基)三乙氧基硅烷、(2-氨基乙基)三乙氧基硅烷、(4-氨基丁基)三乙氧基硅烷、(5-氨基戊基)三乙氧基硅烷、(6-氨基己基)三乙氧基硅烷、3-氨基丙基(二乙氧基)甲基硅烷(APDMS)、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷(AEAPTMS)以及3-[(三甲氧基甲硅烷基)丙基]二亚乙基三胺(TMPTA)所组成的组中的至少一种。
12.一种浓缩微生物并同时从所浓缩的微生物中提取核酸的方法，所述方法按照下述顺序包括：
步骤1：通过将胺基引入对象物中来将所述对象物改性；
步骤2：通过使包含所述微生物的样品和3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)在经改性的所述对象物上彼此接触来浓缩所述微生物；
步骤3：从经浓缩的所述微生物中分离核酸；
步骤4：形成经分离的所述核酸和所述DTBP的复合物；以及
步骤5：通过用洗脱缓冲液处理所述对象物来提取所述核酸，在所述对象物上形成所述复合物，
其中，所述微生物选自于真核细胞、细菌细胞或RNA病毒。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述对象物具有用含有所述胺基的硅烷化合物改性的表面。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述硅烷化合物是由下式1表示的化合物：
[式1]
其中，在式1中，R1至R3彼此相同或彼此不同，并且是选自C1-C4烷基和C1-C4烷氧基中的任何一种；R4是选自氨基(C1-C10)烷基、3-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基以及3-[2-(2-氨基(C1-C4)烷基氨基)(C1-C4)烷基氨基](C1-C4)烷基中的任何一种。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述硅烷化合物是选自由(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(1-氨基甲基)三乙氧基硅烷、(2-氨基乙基)三乙氧基硅烷、(4-氨基丁基)三乙氧基硅烷、(5-氨基戊基)三乙氧基硅烷、(6-氨基己基)三乙氧基硅烷、3-氨基丙基(二乙氧基)甲基硅烷(APDMS)、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、[3-(2-氨基乙基氨基)丙基]三甲氧基硅烷(AEAPTMS)以及3-[(三甲氧基甲硅烷基)丙基]二亚乙基三胺(TMPTA)所组成的组中的至少一种。
16.如权利要求12所述的方法，其中，所述包含微生物的样品是选自由怀疑已经被微生物感染的对象物的粪便、尿液、泪液、唾液、皮肤外部分泌物、呼吸道外部分泌物、肠道外部分泌物、消化道外部分泌物、血浆、血清、血液、脊髓液、淋巴液、体液以及组织所组成的组中的任何一种的样品。
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