KR102260014B1 - 미생물 농축 또는 핵산 추출용 개질된 실리카 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법 - Google Patents
미생물 농축 또는 핵산 추출용 개질된 실리카 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미생물 농축 또는 핵산 추출용 개질된 실리카 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 실리카 개질용 조성물은 하기의 화학식 1의 화합물을 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 1]
여기서,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
[화학식 1]
여기서,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
Description
본 발명은 미생물 농축 또는 핵산 추출용 개질된 실리카 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 미생물 또는 핵산과 복합체를 형성할 수 있는 화합물로 개질된 실리카를 이용하여, 보다 효율적으로 미생물을 농축하거나 핵산을 추출할 수 있는 방법에 대한 것으로서, 미생물 농축 또는 핵산 추출용 개질된 실리카 및 이를 이용한 미생물 농축 또는 핵산 추출 방법을 제공한다.
핵산은 질병 상태를 확인하기 위한 중요한 분석 수단이며, DNA 생체표지자(biomarker) 예를 들어, 단일염기다형성(SNP), 돌연변이 또는 DNA 메틸화는 연구자가 암의 원인을 찾도록 돕고 질병의 초기 단계 동안 질병의 상태를 진단하고 관찰하는 것은 물론 예후와 감시에 대한 큰 기회를 제공하는 데 중요한 실마리를 제공한다.
DNA와 같은 핵산은 단백질과 같은 다른 성분에 비해 매우 낮은 생리적 농도로 존재하기 때문에(예를 들어, 전혈 마이크로리터당 수십 나노그람의 DNA 대 수십 마이크로그람의 단백질), 임상 시료로부터 DNA를 효과적으로 추출하고 예비 농축하는 것은 증폭 및 검출과 같은 이후의 공정에 매우 중요하다.
기존의 미생물 검출을 위한 방법들은 환자 샘플 1∼2 ㎖에서 전체 용액을 다 이용하지 못하고, 그 중 일부만을 이용해서 핵산을 추출하고 이를 이용한 검출을 진행해 왔다. 많은 양의 미생물의 경우에는 큰 문제가 없지만, 적은 양의 미생물의 경우, 정확한 검출이 되지 못해서 추가적 감염병에 대한 조절에 문제가 생기는데, 1∼2 ㎖ 샘플에서 최대한 모든 미생물을 이용하기 위한 농축 방법에 대한 연구가 필요하다.
또한, 최근 들어 생명공학을 비롯한 진단의학, 약물의학, 대사의학 등 다양한 분야에서 고순도로 정제된 핵산의 사용량이 늘어남에 따라 다양한 생물시료로부터 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하고자 하는 노력이 계속되고 있다.
그러나 일반적인 핵산 분리 방법은 세포 또는 핵산 흡착, 세척 및 용출 등과 같은 여러 분리된 단계를 요하고, 각 단계를 거치면서 표적 물질이 다량 소실되는 문제가 있다. 이에, 보다 신속하고 순수하게 핵산을 분리하기 위하여 무엇보다 세포 잔해 입자와 단백질 변성 응집물, 기타 다양한 세포 분해 물질들로부터 신속하게 원하는 핵산만을 분리할 수 있는 기술의 개발이 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은 실리카 개질용 조성물; 상기 실리카 개질용 조성물로 개질된 실리카 또는 실리카를 개질하는 방법: 상기 개질된 실리카를 포함하는 미생물 농축, 핵산 추출용, 또는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물 또는 키트; 및 상기 개질된 실리카를 이용한 미생물 농축, 핵산 추출, 또는 미생물 농축과 동시에 핵산을 추출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 실리카를 균일하게 개질하는데 적합하고, 미생물 농축, 핵산 추출 및 이를 동시에 수행하는데 유용한 실리카 개질용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 상기 개질된 실리카 또는 이를 포함하는 조성물을 이용하여, 기존의 미생물 검출을 위한 방법들과 비교하여 적은 양의 미생물도 검출이 가능하고, 곧바로 핵산을 추출하여 핵산 소실량이 적으며, 하나의 튜브에서 미생물 농축 및 핵산 추출을 가능하게 함으로써, 외부로 오는 오염이나, 비용, 시간, 복잡성 등을 현저하게 절감할 수 있게 하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 실리카 개질용 조성물은 화학식 1의 화합물을 포함하는 것이다.
[화학식 1]
여기서,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
상기 실리카 개질용 조성물에 있어서 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물인 것일 수 있다.
[화학식 2]
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 실리카는 상기 실리카 개질용 조성물로 개질된 것일 수 있다.
상기 실리카는 3.6 ㎛ 내지 6.2 ㎛의 평균 입경을 갖는 것일 수 있다.
상기 실리카는 실란 화합물을 이용하여 추가로 개질된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축용 조성물은 상기 실리카를 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물 농축용 조성물에 있어서 상기 미생물은 박테리아, 바이러스, 또는 세포인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 방법은 상기 개질된 실리카에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물 농축 방법에 있어서, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 개체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 것인 미생물 농축 방법.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 키트는 상기 미생물 농축용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출용 조성물은 상기 개질된 실리카를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법은 상기 개질된 실리카를 추출 대상 핵산이 함유된 시료에 첨가하여 반응시키는 단계; 및 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출용 키트는 상기 핵산 추출용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물은 상기 개질된 실리카를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법은 상기 개질된 실리카를 미생물이 함유된 시료와 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계; 상기 농축된 미생물을 용해시키는 단계; 및 상기 용해물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하기 위한 키트는 상기 미생물 농축 및 및 핵산 추출용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 실리카의 개질 방법은 실리카를 3.6 ㎛ 내지 6.2 ㎛의 평균 입경을 갖도록 미분화 하는 단계; 및 상기 실리카 개질용 조성물로 상기 미분화된 실리카를 개질하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 실리카 개질용 조성물은 화학식 1의 화합물을 포함하는 것이다.
[화학식 1]
여기서,
R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐기, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C10 헤테로시클로알킬기 및 치환 또는 비치환된 C6-C10 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
X1 및 X2는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
상기 치환기는 서로 독립적으로, 할로겐, 시아노기, 히드록실기, 치올기, 옥소, 니트로기, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, C3-C6 시클로알킬기, 및 C3-C6 헤테로시클로알킬기 중 선택되는 것이다.
일 구체예에서, 화학식 1의 상기 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이하며, 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있다.
상기 할로겐기는 F, Cl, Br, 또는 I일 수 있다.
상기 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄 일 수 있고, 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, n-프로필, 이소프로필, 부틸, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, sec-부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸부틸, 펜틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, t-펜틸, 헥실, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 헵틸, n-헵틸, 1-메틸헥실, 시클로펜틸메틸, 시클로헥실메틸, 옥틸, n-옥틸, t-옥틸, 1-메틸헵틸, 2-에틸헥실, 2-프로필펜틸, n-노닐, 2,2-디메틸헵틸, 1-에틸프로필, 1,1-디메틸프로필, 이소헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 시클로알킬기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 3-메틸시클로펜틸, 2,3-디메틸시클로펜틸, 시클로헥실, 3-메틸시클로헥실, 4-메틸시클로헥실, 2,3-디메틸시클로헥실, 3,4,5-트리메틸시클로헥실, 4-t-부틸시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 헤테로시클로알킬기는 O, S, Se, N, P 또는 Si 등의 헤테로 원자를 포함하는 것으로서, 단환 또는 다환인 것으로 포함한다.
상기 아릴기는 단환 또는 다환의 탄소수 6 내지 10의 불포화 방향족 고리화합물을 의미하고, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 톨릴, 크실린 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 실리카 개질용 조성물에 있어서 상기 화학식 1의 화합물은 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물인 것일 수 있다.
[화학식 2]
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 실리카는 상기 실리카 개질용 조성물로 개질된 것일 수 있다.
다른 양상은, 상기 실리카 개질용 조성물로 개질된 실리카를 제공한다.
상기 실리카는 3.6 ㎛ 내지 6.2 ㎛의 평균 입경을 갖는 것일 수 있다. 실리카의 평균 입경이 3.6 ㎛ 미만인 경우 흡유량과 비표면적이 증가하나 개질 과정에서 뭉침 현상이 발생하여 개질 효율이 떨어질 뿐만 아니라, 개질되더라도 기능이 감소된다. 또한 실리카의 평균 입경이 6.2 ㎛를 초과하는 경우 흡유량과 비표면적이 감소하고 충분히 개질될 수 있도록 반응시간을 가하여도 개질 효율이 떨어져 기능이 감소된다. 바람직하게는, 상기 평균 입경은 4 ㎛ 내지 6 ㎛일 수 있다.
상기 개질용 조성물은 실리카 1중량부 대비 1.5 내지 14 중량부, 2 내지 12 중량부, 또는 4 내지 10 중량부 일 수 있다. 상기 정의된 중량부를 초과하는 경우 개질이 균일하지 못하게 되거나 충분히 개질되지 못하게 되어 미생물 농축 효율 또는 핵산 추출 효율이 더 감소할 수 있다.
상기 실리카는 실란 화합물을 이용하여 추가로 개질된 것일 수 있다.
상기 실란 화합물은 하기의 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 3]
상기 식에서, 상기 식에서, R3 내지 R6은 각각 같거나 다를 수 있으며, C1-C4 알킬 또는 C1-C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R8은 아미노(C1-C10)알킬, 3-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1-C4)알킬아미노)(C1-C4)알킬아미노](C1-C4)알킬 중 어느 하나이다.
보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane; APDMS), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 또는 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES) 또는 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(APDMS)이 가장 적합하다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축용 조성물은 상기 실리카를 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물 농축용 조성물에 있어서 상기 미생물은 박테리아, 바이러스, 또는 세포인 것일 수 있다. 또한 이에 한정하지 않으며 음전하를 띄는 미생물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 방법은 상기 개질된 실리카에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 실리카는 수용액, 유기용매, 또는 이들의 혼합물과 같은 용매에 혼합된 형태로서 사용될 수 있고, 기판에 고정된 형태로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액, 조직 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축 키트는 상기 미생물 농축용 조성물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 키트에는 효과적인 미생물 농축에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출용 조성물은 상기 개질된 실리카를 포함하는 것일 수 있다.
상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법은 상기 개질된 실리카를 추출 대상 핵산이 함유된 시료에 첨가하여 반응시키는 단계; 및 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 핵산 추출용 키트는 상기 핵산 추출용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물은 상기 개질된 실리카를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 개질된 실리카를 추출 대상 핵산 시료에 첨가하여 반응시키는 단계; 및 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다. 상기 핵산 추출 방법은 구체적으로, 상기 핵산 추출용 조성물에 포함된 개질된 실리카를 시료와 혼합하는 단계; 상기 핵산 추출용 조성물 내 화학식 1의 화합물과 핵산 간의 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체에 용출액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상은, 상기 핵산 추출용 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트를 제공한다. 상기 키트에는 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있으며, 효과적인 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법은 상기 개질된 실리카를 미생물이 함유된 시료와 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계; 상기 농축된 미생물을 용해시키는 단계; 및 상기 용해물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
이 조성물은 미생물의 농축과 핵산 추출을 동시에 진행하는데 적합하다. 용어 "동시에 진행하는"은 각 단계 별로 별도의 튜브를 사용하거나, 크로마토그래피와 같은 추가의 정제 단계 없이 하나의 튜브에서 농축 및/또는 추출이 가능한 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하기 위한 키트는 상기 미생물 농축 및 및 핵산 추출용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 개질된 실리카를 미생물이 함유된 시료와 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계; 상기 농축된 미생물을 용해시키는 단계; 및 상기 용해물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로 개질된 실리카의 화학식 1의 화합물과 미생물 간의 복합체를 형성시켜 상기 미생물을 농축시키는 단계; 상기 농축된 미생물을 용해하여 그로부터 핵산을 분리하는 단계; 상기 분리된 핵산과 상기 화학식 1의 화합물이 개질된 실리카와 접촉시켜 핵산과 상기 화합물 간의 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체에 용출액을 처리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 하나의 튜브에서 가능하고, 미생물의 농축과 핵산의 추출을 위해 각 단계를 분리하거나 추가의 정제 단계를 필요로 하지 않는다.
또 다른 양상은, 상기 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에는 효과적인 미생물 농축 및 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있으며, 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있다.
용어 “대상물”은 시료 또는 반응의 해당 단계 또는 이전 단계에서의 반응물 결과물을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 실리카의 개질 방법은 실리카를 3.6 ㎛ 내지 6.2 ㎛의 평균 입경을 갖도록 미분화 하는 단계; 및 상기 실리카 개질용 조성물로 상기 미분화된 실리카를 개질하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 실리카 개질용 조성물; 상기 실리카 개질용 조성물로 개질된 실리카 또는 실리카를 개질하는 방법: 상기 개질된 실리카를 포함하는 미생물 농축, 핵산 추출용, 또는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물 또는 키트; 및 상기 개질된 실리카를 이용한 미생물 농축, 핵산 추출, 또는 미생물 농축과 동시에 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 실리카를 균일하게 개질하는데 적합하고, 미생물 농축, 핵산 추출 및 이를 동시에 수행하는데 유용한 실리카 개질용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 개질된 실리카 또는 이를 포함하는 조성물을 이용하여, 기존의 미생물 검출을 위한 방법들과 비교하여 적은 양의 미생물도 검출이 가능하고, 곧바로 핵산을 추출하여 핵산 소실량이 적으며, 하나의 튜브에서 미생물 농축 및 핵산 추출을 가능하게 함으로써, 외부로 오는 오염이나, 비용, 시간, 복잡성 등을 현저하게 절감할 수 있게 한다.
한편, 본 발명에 따른 미생물 농축 및/또는 핵산 추출용 조성물은 하나의 튜브에서 반응을 완료할 수 있으나, 반응 효율을 높이기 위해 세척이나 반응 잔여물을 제거하기 위한 목적으로 원심분리 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물 내 화학식 1의 화합물은 구조 내 이미도에스터(imidoesters) 및 에터(ehter) 결합을 포함하고 있기 때문에, 핵산의 아미노기와 가역적인 가교 구조를 형성할 수 있고, 이들 간에 형성된 복합체로부터 핵산을 용출시킴으로써 시료에서 핵산을 추출할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1: 개질된 실리카의 제조]
하기의 [표 1]과 같은 물성을 가지는 미분말 실리카 T1, C1 및 C2를 구매하고, 상기 화학식 2로 이루어진 화합물에 대한 합성을 의뢰하여 이를 이용하여 상기 미분말 실시카에 대한 개질함으로서, 개질된 실리카 T1-1, C1-1, C2-1을 제조하였다. 구체적으로, 1g의 각 미분말 실리카를 증류수에 30분 동안 담가서 세척하고, 이후 70v% 에탄올, 및 99v% 에탄올에 순차적으로 30분 담가서 세척한 후, 진공 환경에서 완전히 건조시켰다. 건조된 500 mg 실리카를 80 ml의 98v% 에탄올 용액에 넣고 상기 화학식 2의 화합물 2g을 첨가한 후 혼합하여 4시간 동안 상온에서 반응시킴으로써 실리카를 개질하였다. 이후 증류수로 세척하고, 최종 50 mg/ml로 만들어 사용하고 보관하였다.
| 평균 입경 (㎛) | 흡유량 (ml/100g) | 비표면적(m2/g) | |
| T1 | 4-6 | 210-280 | 280-340 |
| C1 | 6.3-8 | 150-200 | 200-260 |
| C2 | 2-3.5 | 290-320 | 280-520 |
한편, 상기 표 1의 평균 입경에 따라 실리카를 개질하였을 때, T1 및 C1은 개질 과정에서 특별한 점이 관찰되지 않았으나 C2의 경우 개질 과정에서 뭉침 현상이 발생하였다.
[제조예 2: 실란 화합물과의 혼합물로 개질된 실리카의 제조]
T1-1을 상술한 제조방법에 따라 화합물 2로 개질 및 건조하고, 이를 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)을 함유한 수용액에 침지시켜 65 ℃에서 10분 동안 반응시킨 후 탈이온수로 세정하여 T1-2를 제조하였다. 또한 동일한 방법으로 C1-1를 이용하여 C1-2를 제조하였다.
이와 같이 개질된 실리카는 Drop Shape Analyzer(DSA100, KRUSS, Germany)을 이용한 아민-개질된 박막 장치의 물 접촉각 측정을 통해 표면 친수성 변화 여부를 측정한 결과, APTES로 추가로 실란화(silanization)한 경우 실리카의 표면 친수성이 더욱 증가함을 확인하여 추가 개질이 가능함을 확인하였다.
[시험예 1: 병원균 농축 효과 확인]
시험 대상 병원균으로는 브루셀라 오비스(Brucella ovis)를 사용하였다. 실험을 위해, 100 mM 트리스-염산 (pH 8.0), 10 mM의 EDTA, 1% SDS, 및 10%의 트리톤 X-100을 혼합한 용액에 106 cfu/ml의 브루셀라 균을 혼합한 용액 1 ml을 시료로서 사용하였다.
구체적으로, 상기 시료의 200 ㎕를 취하여, Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하고, 이를 대조군으로 사용하였다. 상기 개질된 실리카 T1-1, C1-1, C2-1을 이용하여 시료 1 ml을 각각 농축하였다. 병원균을 농축시키기 위해서, 200 ㎕ 용출 완충액(10 mM의 중탄산나트륨, pH 10.6)을 사용하였다. 원심분리 후, 상등액을 취하여 Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하여 Q-PCR 함으로써 농축 정도를 확인하였다.
Q-PCR은 15분 동안 95℃에서 초기 변성 단계; 95℃에서 45초, 59℃에서 45초(Actin), 및 72℃에서 45초를 1사이클로하여 총 45 사이클; 및 72℃, 10분 동안 최종 연장 단계로 하여 수행하였다. 5 내지 10 ㎕의 반응 시료를 취하여 1 × PCR 완충액(Qiagen), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 25 pmol의 각 프라이머, 및 Taq DNA 중합효소 1 유닛을 포함하는 총 부피 25 ㎕에서 증폭하였다. 실시간 PCR(real time-PCR) 분석에서 다음 단계가 LightCycler 2.0(로슈 다이어그노스틱스)에서 제공된 방법을 하기와 같이 변형하였다. 5 내지 10 ㎕의 반응 시료를 4 ㎕의 LightCycler FastStart DNA Master 믹스, 25 pmol의 각 프라이머, 1 × PCR 완충액 2 ㎕(큐아젠, 힐덴, 독일), 2.5 mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(deoxynucleotide triphosphate), 및 증류수를 포함하는 총 부피 20 ㎕에서 증폭하였다. 95℃에서 10분 동안 처음 예비 처리한 후 95℃에서 10초, 59℃에서 30초(Actin), 및 72℃에서 10초를 1사이클로하여 총 50 사이클을 수행하고, 30초 동안 40℃에서 냉각 단계를 거쳤다. SYBR 녹색 신호를 가진 증폭된 생성물은 LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics)에서 수행하였다.
그 결과, [표 2]에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 T1-1의 개질된 실리카를 사용하는 경우 병원균의 농축 효과가 가장 우수한 것으로 확인되었다. C1-1 및 C2-1은 상기 T1-1에 비해 농축 효과가 현저히 낮고, 개질 반응 시간을 더욱 늘려 주었음에도 불구하고 개선되지 않았다.
| Ct | 대조군 | T1-1 | C1-1 | C2-1 |
| Brucella Ovi 유래 DNA | 21.02 | 20.10 | 22.5 | 23.08 |
[시험예 2: DNA 추출 효과 확인]
5% CO2 분위기, 37 ℃ 습한 배양기에서 10 % 태아우아혈청(fetal calf serum; 이하 'FCS')을 보충한 고 글루코오스 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium; DMEM, DMEM Life Technology)의 플라스틱 배양 플레이트에서 HCT116을 배양하여 세포를 준비하였다. 상기 세포에 200 ㎕의 용해 완충액(Lysis Buffer) 및 20 ㎕의 Protease K를 첨가하고 반응 시킨 후, 50 mg/ml의 DA 용액 80 ㎕를 상기 반응물 220 ㎕에 첨가하고 혼합하여 반응 시켰다. 상기 혼합물에 100 ㎕의 T1-1 및 C1-1 및 C2-1의 개질된 실리카를 첨가하고 혼합한 후 DNA가 결합하도록 56℃에서 20분 동안 반응시켰다. 그런 다음 원심 분리하고 상등액을 제거한 후, 100 ㎕의 PBS 완충액을 첨가하고 혼합하고 다시 원심 분리하였다. 상등액을 제거한 후 시험예 1의 용출 완충액을 첨가하고 반응시키고, 원심 분리하여 상등액을 취하여 상기 시험예 1과 같이 Q-PCR 하여 농축 효과를 확인하였다. 대조군으로서 QIAmp DNA 미니 키트를 이용하여 진핵세포로부터 DNA를 추출한 것을 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 HCT116은 미국 ATCC(https://www.atcc.org)에서 구입하여 사용하였다.
그 결과, 하기의 [표 3]과 같이 진핵세포에서도 성공적으로 DNA가 추출되었고, 추출된 핵산을 정량하여 비교한 결과, T1-1의 경우 단일 화합물을 이용한 C1-1 및 C2-1에 비해 현저히 DNA 추출 효율이 높음을 확인하였다.
| Ct | 대조군 | T1-1 | C1-1 | C2-1 |
| HCT116 유래 DNA | 16.90 | 15.32 | 20.08 | 20.98 |
[시험예 3: RNA 추출 효과 확인]
상기 시험예 2와 같이 세포와 대조군을 준비하되, 세포에 20 ㎕의 DNase를 추가로 처리하고, DA 용액 40 ㎕를 사용하였다. 대조군과 RNA 추출 결과물을 시험예 1과 같이 Q-PCR 하여 농축 효과를 확인하였다.
그 결과, 하기의 [표 4]와 같이 진핵세포에서도 성공적으로 핵산이 추출되었고, 추출된 핵산을 정량하여 비교한 결과, T1-1의 경우 단일 화합물을 이용한 C1-1 및 C2-1에 비해 현저히 DNA 추출 효율이 높음을 확인하였다.
| Ct | 대조군 | T1-1 | C1-1 | C2-1 |
| HCT116 유래 RNA | 18.77 | 16.89 | 20.01 | 19.11 |
[시험예 4: 한 튜브에서 병원균 농축 및 DNA 추출 효능 확인]
병원균 시료는 시험예 1과 같이 준비하고, 준비된 시료 100 ㎕를 취하여, Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하고, 이를 대조군으로 사용하였다.
병원균 시료에 50 mg/ml의 T1-1을 혼합하고 40 분 동안 가볍게 흔들어 반응시키고, 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 나머지를 증류수로 씻은 후 시험예 1과 같이 용출 완충액을 첨가하고, 가라 앉혔다. 그런 다음 상기 혼합물에 100 mg/ml DMA를 100 ㎕를 첨가하여 혼합하고, 56℃에서 20분 동안 650 RPM으로 흔들면서 반응시켰다. 그런 다음 상등액을 모두 제거하고 PBS 완충액 (pH7.4)로 2번 씻어내고, 100 ㎕ 용출 완충액을 첨가한 후의 상등액을 취함으로써 DNA를 추출하였다. 결과물과 대조군을 시험예 1과 같이 Q-PCR 하여 농축 효과를 확인하였다.
그 결과, 하나의 튜브에서 성공적으로 병원균의 농축 및 DNA 추출이 가능함을 확인하였다.
<시험예 4> 표면 개질 화합물의 농도에 따른 효과 차이 확인
T1에 대한 실리카 개질에 사용되는 화합물의 함량을 조절하면서, T1-1을 제조하였다. 구체적으로 T1의 건조된 미분말 실리카 1 중량부 대비 표면 개질 화합물의 중량비를 하기의 [표 5]와 같이 달리하면서 시험예 2와 동일한 방법에 따라 DNA를 추출하였다.
그 결과, 실리카 1 중량부 대비 표면 개질 화합물의 중량비가 4 또는 10인 경우 다른 중량비에 비해 농축 효과가 우수하다는 점을 확인하였다.
| (중량비) | 대조군 | 1:1 | 1:4 | 1:10 | 1:15 |
| Ct | 19.71 | 21.55 | 18.03 | 16.63 | 20.18 |
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (7)
- 실리카 개질용 조성물로,
상기 실리카의 평균 입경은 4 내지 6 ㎛이며,
상기 조성물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는
실리카 개질용 조성물:
[화학식 2]
- 삭제
- 제1항에 따른 실리카 개질용 조성물로 개질된 실리카.
- 제3항에 따른 개질된 실리카를 포함하는 미생물 농축용 조성물.
- 제3항에 따른 개질된 실리카에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는
미생물 농축 방법. - 제3항에 따른 개질된 실리카를 추출 대상 핵산이 함유된 시료에 첨가하여 반응시키는 단계; 및
상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는
핵산 추출 방법. - 제3항에 따른 개질된 실리카를 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
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| GRNT | Written decision to grant | ||
| G170 | Re-publication after modification of scope of protection [patent] |