CN113430123A - 一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群及其筛选方法和应用，属于疾病治疗技术领域。从食管鳞癌癌组织与癌旁组织中筛选到10种丰度差异菌群，包括Preussiapersica、Fusariumsolani、Nigrosporaoryzae、Acremoniumfurcatum和Tausoniapullulans、Hanseniasporalachancei、Spegazziniatessarthra、Rhodotorulatoruloides、Golovinomycesartemisiae和Malasseziadermatis，可以用于全面诊断或辅助诊断食管鳞癌发病情况。

Description

一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于疾病治疗技术领域，具体涉及一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群及其筛选方法和应用。
背景技术
口腔到胃部的连接器官为食管，食管原发的肿瘤叫食管癌。食管鳞癌是食管癌的一种，是来源于食管鳞状上皮黏膜细胞的恶性肿瘤。食管癌在中国属于高发病种，食管腺癌发病率非常低，其它食管癌包括食管黑色素瘤、小细胞癌、未分化癌，但是鳞癌发病较高，占90％～95％以上。
目前，食管鳞癌采取以手术为主的综合治疗，早期食管癌或者中期食管癌要给予手术治疗，中晚期食管癌讲究综合治疗，术前给化疗或者放疗，或者现在最新的免疫治疗缩小肿瘤，以便手术能完整切除，提高治愈率。晚期食管癌以放化疗为主，不采取手术干预，应尽量做到早期诊断、早期治疗。
现有技术中，对食管鳞癌的诊断包括组织病理学诊断、循环DNA分子检测、和血清蛋白标志物检测等。目前食管癌与真菌菌群的研究仍处于起步阶段。丁政云等利用体外分离培养法首次初步测定了食管癌和胃癌高发地区人群的口腔与食管的真菌分布情况，发现食管真菌带菌率明显低于口腔，且食管内与口腔内的优势真菌基本相似，如曲霉菌和青霉素。此研究为分离培养已知真菌，仅探讨特定几种真菌，特异性差，代表性不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群及其筛选方法和应用，从筛选的食管鳞癌癌组织与癌旁组织中的差异菌群中获得，能够全面探讨与食管鳞癌发病相关的真菌组成，可以作为生物标志物用于全面诊断或辅助诊断食管鳞癌发病情况。
本发明提供了一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群，包括Preussia persica、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、分枝枝顶孢菌(Acremoniumfurcatum)和Tausonia pullulans、Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢(Spegazzinia tessarthra)、Rhodotorula toruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌。
本发明提供了所述与食管鳞癌发病相关的真菌菌群的筛选方法，包括以下步骤：
1)分别从食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中提取样本总DNA；
2)用ITS1通用引物对步骤1)中提取的样本总DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中PCR扩增产物进行文库构建和高通量测序，得到测序数据；
4)从步骤3)中所述测序数据中提取ITS1特异区段经降噪、比对和物种注释，得到注释后的数据；
5)采用微生物群落组成分析法分析步骤4)中所述注释后的数据，筛选得到食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中差异菌种。
优选的，步骤4)中所述降噪采用DADA2算法进行。
优选的，步骤5)中在进行所述筛选前，包括对所述注释后的数据进行菌群多样性分析和菌群的相对丰度计算。
优选的，所述菌群多样性分析包括Alpha和/或Beta多样性分析。
优选的，步骤2)中ITS1通用引物包括ITS1-1F-F和ITS1-1F-R；
所述ITS1-1F-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1；
所述ITS1-1F-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。
本发明提供了所述与食管鳞癌发病相关的真菌菌群作为生物标志物在制备诊断食管鳞癌的试剂盒中的应用。
优选的，所述真菌菌群作为生物标记物时，判断方法为与癌旁组织相比，食管鳞状细胞癌组织中Preussia persica、腐皮镰刀菌、稻黑孢菌、分枝枝顶孢菌和Tausoniapullulans菌丰度显著降低，而Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢、Rhodotorulatoruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌的丰度显著升高。
本发明提供了一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群，包括Preussia persica、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、分枝枝顶孢菌(Acremoniumfurcatum)和Tausonia pullulans、Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢(Spegazzinia tessarthra)、Rhodotorula toruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌。本发明从以39例癌组织和53例癌旁组织为材料，针对组织中所有菌群进行检测，提取总DNA，ITS1扩增，文库构建和测度，提取ITS1序列进行全面分析癌组织和癌旁组织的差异真菌，结果筛选出由10个真菌菌种组成的、与食管鳞癌相关的真菌菌群。本发明提供的真菌菌群解决现有方案使用PCR、免疫组化检测食管中特定真菌存在特异性差，以及仅针对单一菌群检测，代表性不足的问题，并且深入了解食管鳞癌的发生机制，以及进一步制定针对食管鳞癌的预防措施具有公共卫生学意义。
同时，鉴于现有技术中以动物为研究对照，采用免疫组化技术研究真菌感染和食管癌发生发展关系，无法全面评估与癌症发生有关的所有真菌，同时鉴于动物与人的菌群差异，难以将研究所得到的真菌种类推知到人群的问题，本发明以来源于人的癌组织和癌旁组织为样本，对癌组织和癌旁组织中所有真菌进行差异分析，能够全面评估与食管鳞癌发病相关的差异真菌，为后续作为生物标志物在诊断食管鳞癌中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明提供的真菌菌群的筛选方法示意图；
图2为食管鳞癌组织和癌旁组织菌群Alpha多样性指数比较；其中图2a为Evenness指数结果；图2b为Observed ASVs数结果；图2c为Shannon指数结果；
图3为癌组织和癌旁组织菌群主坐标轴分析图，图3a为基于Bray Curtis距离的主坐标轴分析图，图3b为基于Jaccard距离的主坐标轴分析图。
具体实施方式
本发明提供了一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群，包括Preussia persica、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、分枝枝顶孢菌(Acremoniumfurcatum)和Tausonia pullulans、Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢(Spegazzinia tessarthra)、Rhodotorula toruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌。
在本发明中，所述真菌菌群是从人源的癌组织和癌旁组织中经过丰度角度进行差异分析后获得。具体的，与癌旁组织相比，食管鳞状细胞癌组织中Preussia persica、腐皮镰刀菌、稻黑孢菌、分枝枝顶孢菌和Tausonia pullulans菌丰度显著降低，而Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢、Rhodotorula toruloides、Golovinomycesartemisiae和Malassezia dermatis菌的丰度显著升高。这表明所述真菌菌群与食管鳞癌的发病相关。
本发明提供了所述与食管鳞癌发病相关的真菌菌群的筛选方法，见图1，具体包括以下步骤：
1)分别从食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中提取样本总DNA；
2)用ITS1通用引物对步骤1)中提取的样本总DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中PCR扩增产物进行文库构建和高通量测序，得到测序数据；
4)从步骤3)中所述测序数据中提取ITS1特异区段经降噪、比对和物种注释，得到注释后的数据；
5)采用微生物群落组成分析法分析步骤4)中所述注释后的数据，筛选得到食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中差异菌种。
本发明分别从食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中提取样本总DNA。
在本发明中，所述食管鳞状细胞癌组织是经过医学鉴定后确诊为患食管鳞状细胞癌的组织。所述癌旁组织是指与食管鳞状细胞癌组织相邻的、且健康的组织。所述食管鳞状细胞癌组织经过病理苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)检测，确诊为食管鳞状细胞癌，同时经过病理苏木素-伊红染色检测并未在癌旁组织标本中检测到有肿瘤细胞存在。本发明对所述食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织的来源即可。所述食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织优选为新鲜材料。所述新鲜材料优选离体1～3h内的材料。
本发明对提取样本总DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的总DNA提取试剂盒即可。
得到总DNA后，本发明用ITS1通用引物对提取的样本总DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
在本发明中，所述ITS1通用引物包括ITS1-1F-F和ITS1-1F-R。所述ITS1-1F-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1(CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA)；所述ITS1-1F-R的核苷酸序列如SEQID NO：2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。所述PCR扩增的反应程序：95℃预变性5min，(98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s)，共35个循环，最终72℃延伸2min，4℃保温。所述PCR扩增的反应体系优选如下：KAPAHiFi HotStart Ready MixPCR Kit 25μl、模板DNA 22μl、ITS1-1F-F 1.5μl和ITS1-1F-R 1.5μl。
在本发明中，得到PCR扩增产物后，本发明对所述PCR扩增产物进行混样和纯化。所述混样将不同组织来源的样本等质量混合。本发明对所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方法即可。
得到PCR扩增产物后，本发明将所述PCR扩增产物进行文库构建和高通量测序，得到测序数据。在本发明中，使用
Figure BDA0003135033970000051
DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit2.0和Agilent Bioanalyzer 2100system的定量和质量检测合格后，运用Illumina Hiseq 2500平台PE250测序策略对ITS1区进行测序，得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，得到测序数据。
得到测序数据后，本发明从所述测序数据中提取ITS1特异区段经降噪、比对和物种注释，得到注释后的数据。
在本发明中，所述降噪采用DADA2算法进行。所述降噪时，优选设置质量过滤参数为q-score＝20。所述DADA2方法仅去噪去嵌合，不再按相似度聚类，比QIIME默认的97％相似度聚类的OUT具有更高的分辨率和质量，因此可以对样本的多样性和分类组成进行更准确的估计。本发明对比对和物种注释没有特殊限制，采用本领域所熟知的比对和物种注释即可。在本发明实施例中，优选用
Figure BDA0003135033970000052
Bayes Classifier(NBC)方法与UNITE(v2020.4,https://unite.ut.ee/)数据库中的基因序列进行比对和物种注释。
得到注释后的数据，本发明采用微生物群落组成分析法分析所述注释后的数据，筛选得到食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中差异菌种。
在本发明中，在进行所述筛选前，优选包括对所述注释后的数据进行菌群多样性分析和菌群的相对丰度计算。所述菌群多样性分析优选包括Alpha和/或Beta多样性分析。在进行Alpha和Beta多样性分析中，重抽样深度为每样本10000条序列以保证足够序列及样本含量。
在本发明中，微生物群落组成分析法优选参见现有技术进行(Mandal S,VanTreuren W,White RA,
Figure BDA0003135033970000061
M,Knight R,Peddada SD.Analysis of composition ofmicrobiomes:a novel method for studying microbial composition.Microb EcolHealth Dis.2015；26:27663.doi:10.3402/mehd.v26.27663.)。
本发明提供了所述与食管鳞癌发病相关的真菌菌群作为生物标志物在制备诊断食管鳞癌的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述与食管鳞癌发病相关的真菌菌群作为阳性标准品存在于试剂盒中。所述试剂盒还优选包括ITS1通用引物和PCR扩增试剂。本发明对所述试剂盒制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的试剂盒的制备方法即可。
在本发明中，所述真菌菌群作为生物标记物时，判断方法优选为与癌旁组织相比，食管鳞状细胞癌组织中Preussia persica、腐皮镰刀菌、稻黑孢菌、分枝枝顶孢菌和Tausonia pullulans菌丰度显著降低，而Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢、Rhodotorula toruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌的丰度显著升高。
本发明还优选提供了一种食管鳞癌的诊断方法，通过检测待测样本中真菌菌群的丰度，与癌旁组织的真菌菌群的丰富做对比，从而判断食管鳞癌是否发生。所述判断的方法同上，在此不做赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群及其筛选方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.食管鳞癌组织样本的获得
选取2013年2月～2017年10月就诊于福建省肿瘤医院和福建省漳州市医院的66名食管鳞癌患者的样本，其中癌组织来源于39例患者，癌旁组织来源于53例患者。
癌组织标本均经过病理苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)确诊为食管鳞状细胞癌，同时并未在癌旁组织标本中检测到有肿瘤细胞存在。
2基因组DNA的提取与检测
(1)配制溶菌酶缓冲液。如下表1所示进行配制，颠倒混匀，充分溶解后加入Millipore Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter中10000rpm离心20min，然后分装至无菌、无DNA的EP管中，储存于-20℃冰箱。
表1溶菌酶缓冲液的配方
Figure BDA0003135033970000071
(2)将样本从-80℃冰箱中取出，使用无菌剪刀分别剪取35mg食管组织，放入2.0mlEP管中，加入200μl PBS，使用组织匀浆机处理5min。将经匀浆机处理后的EP管放入离心机当中，14000rpm离心20min，弃去上清液。
(3)加入配制的溶菌酶缓冲液200μl，同时引入对照(阳性对照：加入一种已知的真菌(烟曲霉菌)，并配制相应的体系。阴性对照：不加入已知真菌，使用Elution buffer)。移至金属加热器上混匀，37℃，4000rpm，孵育1h。
(4)旋涡混匀，瞬离，加入玻璃珠(用PCR EP管取玻璃珠，先在50ml离心管中先后加入各10ml的0.5mm和1mm玻璃珠，并进行紫外照射30min)。将装有玻璃珠的EP管放入组织匀浆机中匀浆5min，取上清液至新的EP管中。
(5)采用Mag Maxi Kit提取样本总DNA：
①按照说明配好Protease(酶)并分装，-20℃保存。
②每个EP管中加入200μl Lysis buffer BLM和20μl Protease，移移液枪调至350μl吹打混匀，55℃孵育10min后冷却至室温。
③每个EP管中先加入200μl无水乙醇，再将mag particle suspension BLM充分混匀，加20μl至EP管中。移液枪调至550μl吹打混匀。室温旋涡混匀2min。
④将EP管转移至磁力架，静置1min后吸弃上清液。
⑤将EP管从磁力架上取下，每管加入720μl Wash buffer BLM1，移液枪调至650μl吹打混匀。室温旋涡混匀2min，使沉淀团块充分溶解，室温静置10min；再放回磁力架上，静置1min，吸弃上清液。
⑥用720μl Wash buffer BLM2重复第⑤步骤。
⑦再次用720μl Wash buffer BLM2重复第⑤步骤，先用大量程移液枪，再用小量程移液枪，尽可能弃净上清液。
⑧用金属干燥器，55℃孵育10min，开盖让残留的乙醇挥发，若担心不能充分孵育，可进行低速旋转。
⑨每管加入200μl Elution buffer BLM，移液枪调至150μl吹打混匀。用金属加热器55℃，4000rpm，孵育10min。
⑩将EP管移至磁力架上，静置3min，吸取180μl上清液至新的EP管中。
(6)取1μl样品进行检测，在紫外分光光度计检测A260/A280，提取的总DNA的OD值均在1.8-2.0之间。1％琼脂糖凝胶电泳检测：电压150V，30min，UVI凝胶成像系统拍照记录，DNA电泳主带清晰，未出现杂带、拖尾，说明DNA片段纯度较好，无明显降解。DNA于-20℃储存备用。
3PCR扩增及高通量测序
(1)利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA进行定量，以确定PCR反应中应加入的DNA量。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带标签的ITS1区通用引物ITS1-1F-F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，SEQ ID NO:1)和ITS1-1F-R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’，SEQ ID NO:2)进行扩增，使用高效和高保真的酶(
Figure BDA0003135033970000091
High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,New England Biolabs)进行PCR，确保扩增效率和准确性。
(2)PCR反应体系(50μl)，具体见表2。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003135033970000092
(3)PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s)，共35个循环，最终72℃延伸2min，4℃∞。
(4)PCR扩增产物的混样与纯化：根据PCR产物浓度进行等质量混样，充分混匀后使用1×TAE浓度2％的琼脂糖胶电泳检测和纯化PCR产物，电压220V，25min。UVI凝胶成像系统拍照记录：无断裂、无引物二聚体，大多数样本未出现杂带，扩增出单一明亮的目的片段，说明扩增产物特异性高。选择主带大小在400～450bp之间的序列，割胶回收目标条带。PCR产物于-20℃储存备用。
(5)文库构建和高通量测序：使用
Figure BDA0003135033970000093
DNA PCR-Free Sample PreparationKit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit2.0和Agilent Bioanalyzer2100system的定量和质量检测合格后，运用Illumina Hiseq 2500平台PE250测序策略对ITS1区进行测序，得到的原始图像数据文件，经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储。
4测序数据处理
将真菌菌群测序的原始数据导入生物信息学分析软件Quantitative Insightsinto Microbial Ecology 2(QIIME2,version 2020.2,http://qiime2.org/)软件进行分析。将正反链测序数据导入软件拼接后，利用q2itsxpress插件去除引物和barcode，提取ITS1特异区段。提取后的ITS1区段使用DADA2算法进行降噪。随后，将过滤后的ASVs用
Figure BDA0003135033970000101
Bayes Classifier(NBC)方法与UNITE(v2020.4,https://unite.ut.ee/)数据库中的基因序列进行比对和物种注释。在进行Alpha和Beta多样性分析中，重抽样深度为每样本10000条序列以保证足够序列及样本含量。
5.统计方法
采用QIIME2(v2020.2)软件对ESCC癌组织和癌旁组织中的真菌菌群测序数据进行分析，分别计算菌群的Alpha、Beta多样性和菌群的相对丰度。Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，本部分通过计算Evenness指数、Observed ASVs、Shannon指数这三个指数来评价物种的Alpha多样性。Evenness指数指的是物种的均匀度，即每个物种的数量及分布情况。Observed ASVs(代表性扩增子变异体)表示样本当中ASV的个数即物种丰富度；Shannon指数衡量菌群群落的异质性，其数值越大，物种多样性越大。Beta多样性是不同物种之间多样性的比较，用来表示生物种类对环境异质性的反应，其本质上是一个量化的数值，值的大小反映每个组内各个样本间的群落物种组成差异，通过计算样本间的Bray-Curtis、Jaccard距离矩阵(distance matrix)，用于体现样本间真菌群落构成的差异性。本部分研究通过基于Bray-Curtis distance和Jaccard distance的主坐标轴分析(Principal Co-ordinates Analysis，PCoA)对两组数据在图中PC坐标轴的投影距离进行比较，从而评价物种的Beta多样性。采用“qiime diversity core-metrics-phylogenetic”命令，设置重抽样深度为每样本10000条序列，计算菌群的Alpha、Beta多样性。采用“qiimefeature-table relative-frequency”命令计算菌群的相对丰度。
采用微生物群落组成分析(Analysis of Composition of Microbiomes，ANCOM)方法筛选癌组织与癌旁组织之间的差异菌。
6.研究结果
6.1食管鳞癌患者癌组织和癌旁组织真菌多样性比较
在菌群多样性的研究中，Alpha多样性研究结果显示，使用符号秩和检验比较癌与癌旁组织间的Alpha多样性，其中Observed ASVs(图2b)及Shannon指数(图2c)均有差异(P<0.05)。下图显示食管癌组织与癌旁组织真菌群落的Alpha多样性存在差异(图2)。
物种丰度用于计算标本间的Bray-Curtis(BC)及Jaccard(JD)距离矩阵，使用主坐标轴分析(PCoA)寻找上述距离矩阵中最主要的坐标轴，用于呈现癌与癌旁组织微生物的组成差异。结果显示，不论使用BC(图3a)、JD(图3b)合成主坐标轴，癌与癌旁组织微生物组成在空间上均有差异(图3)，Beta多样性不同。
6.2食管鳞癌患者癌组织和癌旁组织差异真菌筛选
根据菌群的性质，可以将菌群分为界门纲目科属种7个水平，本申请将分析食管鳞癌患者的癌组织和癌旁组织中差异真菌菌种水平的分布情况，菌种水平研究结果显示，Preussia persica、Hanseniaspora lachancei、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、分枝枝顶孢菌(Acremonium furcatum)、Golovinomycesartemisiae、十字斯氏格孢(Spegazzinia tessarthra)、Rhodotorula toruloides、Tausonia pullulans、Malassezia dermatis在癌组织和癌旁组织中分布存在差异。相比于癌旁组织，癌组织中Preussia persica、腐皮镰刀菌、稻黑孢菌、分枝枝顶孢菌和Tausoniapullulans菌丰度明显降低，Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢、Rhodotorulatoruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌的丰度明显升高(见表3)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0003135033970000121
序列表
<110> 福建医科大学
<120> 一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群及其筛选方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttggtcatt tagaggaagt aa 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgcgttct tcatcgatgc 20

Claims (8)

1.一种与食管鳞癌发病相关的真菌菌群，其特征在于，包括Preussia persica、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)、分枝枝顶孢菌(Acremoniumfurcatum)和Tausoniapullulans、Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢(Spegazzinia tessarthra)、Rhodotorula toruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌。
2.权利要求1所述与食管鳞癌发病相关的真菌菌群的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别从食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中提取样本总DNA；
2)用ITS1通用引物对步骤1)中提取的样本总DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
3)将步骤2)中PCR扩增产物进行文库构建和高通量测序，得到测序数据；
4)从步骤3)中所述测序数据中提取ITS1特异区段经降噪、比对和物种注释，得到注释后的数据；
5)采用微生物群落组成分析法分析步骤4)中所述注释后的数据，筛选得到食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中差异菌种。
3.根据权利要求2所述筛选方法，其特征在于，步骤4)中所述降噪采用DADA2算法进行。
4.根据权利要求2所述筛选方法，其特征在于，步骤5)中在进行所述筛选前，包括对所述注释后的数据进行菌群多样性分析和菌群的相对丰度计算。
5.根据权利要求4所述筛选方法，其特征在于，所述菌群多样性分析包括Alpha和/或Beta多样性分析。
6.根据权利要求2～5任意一项所述筛选方法，其特征在于，步骤2)中ITS1通用引物包括ITS1-1F-F和ITS1-1F-R；
所述ITS1-1F-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1；
所述ITS1-1F-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2。
7.权利要求1所述与食管鳞癌发病相关的真菌菌群作为生物标志物在制备诊断食管鳞癌的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述真菌菌群作为生物标记物时，判断方法为与癌旁组织相比，食管鳞状细胞癌组织中Preussiapersica、腐皮镰刀菌、稻黑孢菌、分枝枝顶孢菌和Tausoniapullulans菌丰度显著降低，Hanseniaspora lachancei、十字斯氏格孢、Rhodotorula toruloides、Golovinomyces artemisiae和Malassezia dermatis菌的丰度显著升高。
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