KR20230107921A - 다중 시료로부터의 핵산 추출용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상이한 다수의 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 다목적(universal) 시약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 상이한 동물 유래의 이질적인 분석 시료들에 공통적, 획일적으로 적용되어 분석 시료 내 타겟 유전자의 존재를 신속하고 경제적으로 동시, 대량 분석하기 위한 공통 시약 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. 이에, 본 발명의 조성물은 이제까지 동물 종 및 시료 형태에 따라 각각 맞춤형으로 제작되던 핵산 증폭용 시료를 일원화함으로써 돼지, 반추동물, 가금류 및 연체동물 유래의 근육, 지방, 혈액, 모발 등 전혀 이질적인 생물학적 시료에 대한 유전자 분석 과정이 규격화 및 단순화될 수 있도록 하였다.

Description

다중 시료로부터의 핵산 추출용 조성물{A Composition for Extracting Nucleic Acids from Multi-Samples}
본 발명은 이질적인 다수의 생물학적 시료에 공통적으로 적용될 수 있는 규격화된 핵산 추출용 시약 조성물에 관한 것이다.
핵산은 병원균의 존재나 개체의 질환 발병 여부를 확인하기 위한 중요한 분석 수단으로서, 병원균 특이적인 핵산 염기서열의 존재 뿐 아니라 돌연변이, DNA 메틸화, 단일염기다형성(SNP) 등의 핵산 표지자들은 다양한 질환의 유전적 위험성에 대한 단서를 제공함으로써 질환의 조기 진단과 치료 전략의 조기 수립 및 예후 예측을 가능하도록 한다. 그러나, DNA와 같은 핵산 분자는 조직이나 혈액 시료 내에 매우 낮은 생리적 농도로 존재하는데, 예를 들어, 전혈 1μL 당 수십μg의 단백질이 존재함에 반하여 DNA는 수십 ng 수준으로 존재한다. 이에, 검체 내 타겟 유전자의 존부에 대한 신뢰도 높은 정보를 제공할 수 있을 정도의 유효량의 DNA를 효과적으로 추출하는 공정의 개발은 고감염성 가축 질환의 조기 진단을 통한 감염의 확산 차단을 위해 매우 중요한 과제가 되어오고 있다.
아울러 가축의 감염성 질환 진단과 원산지 분석 등을 위한 유전자 분석에 있어, 가축의 종류에 따른 특성 뿐 아니라 분리된 시료(조직, 세포, 혈액 등)의 화학적·생물학적 성상에 따라 추출되는 핵산의 수율이 다양하므로, 이질적인 다중 시료에 획일적으로 적용되어 이들을 신속하고 경제적으로 동시, 대량 분석하기 위한 다목적(universal) 시약 조성물의 개발이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
특허문헌 1. 한국공개특허공보 제10-2018-0022615호
본 발명자들은 다양한 동물종 유래의 다양한 조직으로부터 핵산 분자를 일정한 수율로 추출할 수 있는 효율적인 다중시료(multisample)용 핵산 분석 시약 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 세린 단백질 분해효소, 구체적으로는 단백분해효소 K(proteinase K)와 포스핀계 환원제, 구체적으로는 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 일정한 함량비로 포함하는 시약을 이용할 경우 돼지, 반추동물, 가금류 및 연체동물 유래의 근육, 지방, 혈액, 모발 등의 이질적인 생물학적 시료로부터 진단학적 유효량의 핵산 분자를 안정적으로 수득할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 상이한 다수의 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 시약 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세린 단백질 분해효소(serine protease); 및 하기 화학식 1로 표시되는 환원제 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 생물학적 시료로부터의 핵산 추출용 조성물을 제공한다:
화학식 1
상기 화학식 1에서, R1 내지 R3는 각각 독립적으로 C6-C10 아릴 또는 -C(O)OR4 (R4는 수소 또는 C1-C3 알킬)이다.
본 발명자들은 다양한 동물종 유래의 다양한 조직으로부터 핵산 분자를 일정한 수율로 추출할 수 있는 효율적인 다중시료(multisample)용 핵산 분석 시약 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 세린 단백질 분해효소, 구체적으로는 단백분해효소 K(proteinase K)와 상기 화학식 1의 환원제, 구체적으로는 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 일정한 함량비로 포함하는 시약을 이용할 경우 돼지, 반추동물, 가금류 및 연체동물 유래의 근육, 지방, 혈액, 모발 등의 이질적인 생물학적 시료로부터 진단학적 유효량의 핵산 분자를 안정적으로 수득할 수 있음을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“세린 단백질 분해효소(serine protease)”는 친수성 아미노산으로서 세린을 포함하는 단백질에서 펩타이드 결합을 절단하는 효소를 의미한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 세린 단백질 분해효소는 단백분해효소 K (proteinase K)이다.
본 명세서에서 용어“환원제(reducing agent)”는 비공유전자쌍을 가져 전자를 다른 화학종에 공여할 수 있는 임의의 화학종을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 환원제는 예를 들어 DTT(Dithiothreitol), 2-ME(2-mercaptoethanol) 및 TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 생리학적으로 적합한 환원제로서 당업계에 공지된 여하한 환원제도 제한없이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어“아릴”은 전체적 또는 부분적으로 불포화되고 방향성(aromaticity)를 가지는 단일환 또는 다중환 탄소 고리를 의미한다. 보다 구체적으로는, 상기 C6-C10 아릴은 C6 아릴(페닐)이다.
본 명세서에서 용어“알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필 등을 포함한다. C1-C3 알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유닛을 가지는 알킬기를 의미하며, C1-C3 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 R1 내지 R3는 -C(O)OR4 (R4는 수소)이다. R1-R3가 모두 -C(O)OH인 화학식 1 화합물은 TCEP(tris(2- carboxyethyl)phosphine, C9H15O6P)이다. TCEP는 염산염 형태(TCEP-HCl)로 종종 사용되는 가용성 환원제로 단잭질 간의 이황화 결합을 절단하여 조직을 균질화하는 데에 적용된다.
본 명세서에서 용어“생리학적으로 허용되는 염”은 생리적 pH 환경에서 사용 가능한 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 트리플루로초산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 동물로부터 얻어지는, 분석 대상의 핵산 분자를 포함하고 있거나 포함할 가능성이 있는 모든 시료로서, 혈액, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히 본 발명의 생물학적 시료는 포유류, 조류, 연체동물 등 광범위한 대상체로부터 분리된 근육, 지방, 혈액, 모발 등의 상이한 시료를 모두 포함하며, 본 발명의 조성물은 이러한 이질적인 시료에서 핵산 분자를 추출하기 위해 특별한 성분의 부가, 희석, 성상의 변형 또는 최적화 없이 공통적으로 적용될 수 있는 기술적 이점을 가진다.
본 명세서에서 용어“대상체”는 타겟 핵산 분자의 존재 여부 또는 이의 발현량을 분석하기 위한 시료를 제공하고, 궁극적으로 이러한 분석 결과를 통해 표현형, 유전적 특징, 특정 병원성 균주에 의해 감염되었는지 여부(즉, 진단) 또는 원산지의 판정 대상이 되는 개체를 의미한다. 개체는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 닭, 원숭이, 침팬지, 비비, 붉은털 원숭이, 연체동물을 포함하며, 구체적으로는 소, 돼지, 닭 및/또는 전복이다.
본 명세서에서, 용어“핵산”또는“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.
본 명세서에서 용어“핵산 추출용 조성물”은 대상체의 유전적 특성 등을 판단하기 위해 생물학적 시료로부터 유효량의 핵산이 효율적으로 수득되도록 하는 추출 수단을 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“핵산 추출용 키트”로 표현될 수도 있다.
본 명세서에서 용어“추출”은 생물학적 시료로부터 핵산을 분리하고, 단리시키는 임의의 과정을 모두 포괄하는 의미한다. 핵산, 예컨대 RNA 및 DNA는 예를 들어, 세포 용해에 의해 유리될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 핵산은 증발식 세포 용해를 통해 유리될 수도 있고, 다른 구현예에 따르면 세포 시약을 포함하는 매트릭스와의 접촉을 통해 세포가 용해됨으로써 유리될 수도 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조성물은 EDS (Ethane-1,2-Dimethanesulfonate); 유기산염; 음이온성 계면활성제; 염화나트륨; 및 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 전처리 완충액을 추가적으로 포함한다:
화학식 2
상기 화학식 2에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 산소이며, 는 단일결합 또는 이중결합을 나타내고, n은 1 또는 2이고, m은 100 내지 1000의 정수이다.
본 명세서에서 용어“유기산염”은 수소이온을 공여하거나 전자를 공여받는 성질을 가지는 유기화합물의 염 형태를 총칭하는 의미이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 유기산염은 C2-C6 카르복실산, 설폰산 및 인산의 염 형태를 포함하나 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 생리학적으로 허용가능한 유기산염을 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 유기산염은 아세트산나트륨이다.
본 명세서에서 용어“음이온성 계면활성제(anionic surfactants)”는 분자 내에 소수성 부분과 친수성 부분을 모두 포함하고 전체 분자에 음전하를 띄는 양친매성을 가지는 분자를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용될 수 있는 음이온성 계면활성제는 포스파티딜 글리세롤(phosphatidylglycerol), 카르디올리핀(cardiolipin), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 디아실포스파티딜세린(diacylphosphatidylserine), 디세틸포스페이트(dicetylphosphate), 포스파티딕 에시드(phosphatidic acid), NSPE(N-succinyl phosphatidylethanolamine), NGPE(N-glutaryl phosphatidylethanolamine) 및 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 음이온성 계면활성제는 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 화학식 2의 A1은 수소이고 A2는 산소이며 n은 1이다. 옥텟 규칙(octet rule)에 의할 때, A1이 수소인 경우 는 단일결합이고 A2가 산소인 경우 가 이중결합임은 자명하다. A1은 수소이고 A2는 산소이며 n은 1인 화학식 1 화합물은 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 생물학적 시료는 동물의 혈액일 수 있으며, 이 경우 상기 조성물은 단백질 변성제, 킬레이트화제, 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 전혈시약을 추가적으로 포함한다.
본 발명에 따르면, 동물의 혈액으로부터 타겟 핵산을 검출하고자 할 때, 본 발명의 조성물에 상술한 전혈 시약을 추가적으로 포함시킴으로써 추출되는 핵산의 수율을 더욱 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어“단백질 변성제(protein denaturant)”는 온도의 상승 없이도 시료 내 단백질의 2차, 3차 및 4차 구조를 비가역적으로 변화시키는 물질을 의미한다. 단백질 변성제는 예를 들어 강산, 강염기, 농축된 유기용매 또는 무기염일 수 있다. 단백질 변성제는 시료 내 RNA 또는 DNA와 같은 핵산 분자를 뉴클레아제로부터 보호함으로써 추출 효율을 개선하는 역할을 한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용될 수 있는 단백질 변성제는 GuHCl(Guanidine hydrochloride) 또는 GuSCN(Guanidine Thiocyanate)이며, 보다 구체적으로는 GuSCN이다.
본 명세서에서 용어“킬레이트화제(chelating agent)”는 금속 이온과 배위결합을 하여 안정적인 수용성 금속 복합체를 형성하는 유기 또는 무기화합물을 총칭하는 의미이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 킬레이트화제는 예를 들어 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, CTAB(cetyltrimethylamminobromide) 및 EDTA (Ethylene-Diamine-Tetraacetic Acid)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 킬레이트화제는 EDTA이다. EDTA는 금속 양이온과 결합하여 핵산 분해효소의 활성을 억제함으로써 생체시료 내 DNA 및 RNA를 보호한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리소르베이트는 Tween 20(폴리소르베이트 20)이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리에틸렌글리콜은 PEG 1000이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 생물학적 시료는 돼지, 반추동물, 가금류 및 연체동물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동물로부터 유래한 생물학적 시료이다.
본 명세서에서 용어“반추동물(ruminant)”은 반추위를 갖는 포유동물을 의미하며, 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과 및 소과의 동물을 포함한다. 보다 구체적으로는, 상기 반추동물은 소(Bos taurus)이다.
본 명세서에서 용어“가금류(poultry)”는 인간생활에 유용하도록 길들여지거나 품종 개량되어 육성한 조류를 의미하며, 구체적으로는 알, 고기, 깃털의 생산을 주목적으로 사육되거나 또는 애완용, 관상용 목적으로 사육되는 조류를 통칭한다. 구체적으로는, 본 발명의 조성물이 적용되는 가금류는 닭, 오리, 거위, 메추리, 꿩 및 칠면조로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 구체적으로는 닭 또는 오리이고, 가장 구체적으로는 닭(Gallus gallus domesticus)이다.
본 명세서에서 용어“연체동물(Mollusca)”은 연성의 체표면과 외투막을 가진 무척추동물을 의미한다. 구체적으로는, 본 발명의 조성물이 적용되는 연체동물은 복족강(Gastropoda) 연체동물이며, 보다 구체적으로는 전복(Haliotis gigantea)이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 상이한 다수의 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 다목적(universal) 시약 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 상이한 동물 유래의 이질적인 분석 시료들에 공통적, 획일적으로 적용되어 분석 시료 내 타겟 유전자의 존재를 신속하고 경제적으로 동시, 대량 분석하기 위한 공통 시약 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
(c) 본 발명의 조성물은 이제까지 동물 종 및 시료 형태에 따라 각각 맞춤형으로 제작되던 핵산 증폭용 시료를 일원화함으로써 돼지, 반추동물, 가금류 및 연체동물 유래의 근육, 지방, 혈액, 모발 등 전혀 이질적인 생물학적 시료에 대한 유전자 분석 과정이 단순화 및 규격화될 수 있도록 하였다.
도 1은 본 발명의 소 전혈시약을 이용한 핵산 추출결과를 보여주는 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법
다중시료(Multisample)용 분석 시약의 제작
본 발명의 다중시료 분석 시약은 전처리 완충액, TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine), 프로티네이즈 K 및 전혈시약(용해/결합 완충액)으로 구성된다.
전처리 완충액은 0.05M EDS, 0.1M 아세트산나트륨, 1.4% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 0.5M 염화나트륨 및 2% PVP(Polyvinylpyrrolidone)을 혼합하여 제조하였다. 전혈시약(용해/결합 완충액)은 3.75M의 구아니딘 티오시아네이트(GuSCN), 0.1M의 Tris 완충액(pH8.0), 0.005M의 EDTA (Ethylene-Diamine-Tetraacetic Acid, pH 8.0), 2.5% Tween20, 17.5% PEG1000 및 1.25M KCl을 혼합하여 제조하였다.
분석 시료의 제작
혈액, 조직 및 털을 분석 대상 검체로 하여, 각 검체는 2개 개체로부터 추출하여 시료를 제작하였다.
혈액: 소의 혈액 샘플(100 또는 200μL), 닭의 혈액 샘플(10μL)에 전처리 완충액 200μL, 1M TCEP, pH7 100μL, 프로티네이즈 K 15μL를 첨가하고, 65℃에서 10분 인큐베이션 후 300μL를 취하여 추출과정에 사용하였다.
조직: 소의 조직 샘플, 전복의 조직 샘플에 전처리 완충액 200μL, 1M TCEP, pH7 100μL, 프로티네이즈 K 15μL를 첨가하고, 65℃에서 밤새 약 18시간 인큐베이션 후 300μL를 취하여 추출과정에 사용하였다.
털: 소의 털 샘플(10/20/30가닥, 모근으로부터 1cm 정도 잘라서 준비)에 전처리 완충액 200μL, 1M TCEP, pH7 100μL, 프로티네이즈 K 15μL를 첨가하고, 65℃에서 밤새 인큐베이션 후 액체 전부를 추출과정에 사용한다.
핵산의 추출
본 발명의 전혈시약을 사용하여 각 분석 시료로부터 Libex(Tianlong Technology Co., Ltd, China) 기기를 통해 Sera-MagTM 자성비드(Cytiva)로 제조사의 설명서에 따라 핵산을 추출하였다. 핵산 추출 과정의 파라미터는 아래 표 1에 정리하였다.
No 웰 단계 대기
(분)		 혼합
(분)		 자기
(분)		 혼합
모드		 부피
(μL)		 Temp Stat 온도
(℃)
1 1 용해/결합 0 20 3 8 800 Heat 65
2 3 1차 세척 0 1 1.5 8 750 Close 0
3 4 2차 세척(70%) 0 1 1.5 8 750 Heat 65
4 6 용출 1 5 5 8 50 Heat 65
5 2 어밴던 비드 0 0.5 0 8 500 Close 0
실험결과
1. 소 혈액
부피 농도(ng/μL) 260/280 260/230
소 혈액, 혼합물(9/13) 100μL 62.6 1.72 1.43
소 혈액 200μL 125.2 1.79 1.78
소 혈액 100μL 72.1 1.78 1.55
소 혈액, 혼합물(10/27) 200μL 122.8 1.79 1.76
2. 닭 혈액
부피 농도(ng/μL) 260/280 260/230
닭 혈액, 1260번 10μL 1222.8 1.87 2.33
닭 혈액, 1029번 10μL 870.9 1.84 2.25
3. 소 조직
무게 농도(ng/μL) 260/280 260/230
소 조직 4.2 mg 107.5 1.8 1.51
소 조직 11 mg 376.2 1.8 1.29
소 조직 20.1 mg 418.6 1.87 1.71
소 조직 29.5 mg 428.8 1.87 2
소 조직 44 mg 335.5 1.78 1.08
소 조직 100.5 mg 629.6 1.82 1.35
4. 전복 조직
무게 농도(ng/μL) 260/280 260/230
전복 조직, 199번 30mg 506.9 1.95 2.17
전복 조직, 190번 20mg 499.8 1.94 2.13
5. 모근
개수 농도(ng/μL) 260/280 260/230
모근, 3135 10 33.5 1.68 1.02
20 120.4 1.89 1.56
30 143.4 1.89 1.7
모근, 5514 10 58.3 1.8 1.25
20 73.6 1.83 1.43
30 88.4 1.87 1.54
소 전혈시약을 이용한 핵산의 추출
소 혈액 100μL에 용해/결합 완충액 500μL, PBS 100μL, 프로티네이즈 K 10μL를 넣고 65℃에서 10분 인큐베이션하였다. Libex(Tianlong Technology Co., Ltd, China) 기기를 통해 Sera-MagTM 자성비드(Cytiva)로 제조사의 설명서에 따라 핵산을 추출하였다.
No 웰 Name 대기
(분)		 혼합
(분)		 자기
(분)		 혼합
모드		 부피
(μL)		 Temp Stat 온도
(℃)
1 2 Move 비드 0 1 1.5 8 500 Close
2 1 용해/결합 0 5 2 8 700 Close
3 3 1차 세척 0 1 1.5 8 750 Close
4 4 2차 세척(50%) 0 1 1.5 8 750 Close
5 6 용출 1 1 1.5 8 50 Close
6 2 어밴던 비드 0 1 0 1 500 Close
농도(ng/μL) 260/280 260/230
2-1, 소 mix 100μL 11.5 1.39 0.71
소혈액은 전혈시약 만으로 분석 가능한 양의 핵산 추출이 이루어지지 않아 TCEP를 추가로 첨가하였다.
실험#2 (211008)
소혈액(200μL), 돼지혈액(200μL), 닭혈액(10μL)에 용해/결합 완충액 500μL, 1M TCEP (pH7.0), 프로티네이즈 K 15μL 넣은 후 핵산 추출을 진행하였다.
농도(ng/μL) 260/280 260/230
1-1, 소혈액 200μL 55.2 1.68 1.01
1-2, 돼지혈액 200μL 92.8 1.77 1.25
1-3, 닭혈액 10μL 859.2 1.85 1.84
전혈시약과 TCEP을 이용하면 소혈액, 돼지혈액에서 핵산 추출 가능
실험#3 (211026)
소혈액에서 stool시약과 전혈시약으로 핵산 추출
소혈액(100μL, 200μL)에 전혈시약(용해/결합 완충액) 500μL 또는 stool시약 (용해/결합 완충액), 1M TCEP (pH7.0), 프로티네이즈 K 15μL를 넣고 핵산 추출
농도(ng/μL) 260/280 260/230
2-1, 소혈액, 전혈시약 100μL 62.9 1.63 1.03
2-2, 소혈액, 전혈시약 200μL 59.9 1.6 0.89
2-3, 소혈액, stool시약 100μL 65.4 1.29 0.43
2-4, 소혈액, stool시약 200μL 377.9 1.35 0.34
소 혈액은 TCEP이 있어도 stool시약으로 핵산추출이 안 됨
실험#4 (211026)
소 혈액(100μL, 200μL)에 전처리 완충액 200μL, 1M TCEP (pH7.0) 50μL/100μL/150μL, 프로티네이즈 K 15μL를 넣고 65도에서 10분 incubation 후 300μL를 전혈시약(용해/결합 완충액)을 사용하여 핵산 추출
소 털(20개)에 전처리 완충액 200μL, 1M TCEP (pH7.0) 50μL/100μL/150μL, 프로티네이즈 K 15μL를 넣고 65℃에서 밤새 인큐베이션한 후 300μL를 전혈시약 (용해/결합 완충액)을 사용하여 핵산 추출
농도(ng/μL) 260/280 260/230
1-1, 소혈액 100μL 72.7 1.75 1.52
1-2, 소혈액 100μL 46.9 1.66 1.23
1-3, 소혈액 100μL 51.4 1.69 1.29
1-4, 소혈액 200μL 108.8 1.78 1.73
1-5, 소혈액 200μL 106.7 1.77 1.74
1-6, 소혈액 200μL 92.3 1.78 1.63
실험#5 (211008)
닭조직 (닭안심살 약 50g), 돼지모발 (모근쪽 약 0.5cm, 30개)에 용해/결합 완충액 500μL, PBS 300μL, 프로티네이즈 15μL를 넣고 vortexing 후 65℃에서 밤새 인큐베이션. 상층액 500μL를 핵산 추출에 사용한다.
농도(ng/μL) 260/280 260/230
1-4, 닭 조직 약 50g 8.7 1.28 0.47
1-5, 돼지 모발 30개 6.9 1.2 0.37
닭조직과 돼지모발은 전혈시약만으로 핵산이 추출되지 않아 TCEP가 필요함을 확인하였다.
농도(ng/μL) 260/280 260/230
1-7, 소 털 20개 56 1.77 1.36
1-8, 소 털 20개 128 1.88 1.55
1-9, 소 털 20개 130 1.9 1.52
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 세린 단백질 분해효소(serine protease); 및 하기 화학식 1로 표시되는 환원제 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 생물학적 시료로부터의 핵산 추출용 조성물:
    화학식 1

    상기 화학식 1에서, R1 내지 R3는 각각 독립적으로 C6-C10 아릴 또는 -C(O)OR4 (R4는 수소 또는 C1-C3 알킬)이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세린 단백질 분해효소는 단백분해효소 K (proteinase K)인 것으로 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 R1 내지 R3는 -C(O)OR4 (R4는 수소)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 EDS(Ethane-1,2-Dimethanesulfonate); 유기산염; 음이온성 계면활성제; 염화나트륨; 및 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 전처리 완충액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
    화학식 2

    상기 화학식 2에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 산소이며, 는 단일결합 또는 이중결합을 나타내고, n은 1 또는 2이고, m은 100 내지 1000의 정수이다.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 유기산염은 아세트산나트륨인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 음이온성 계면활성제는 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 화학식 2의 A1은 수소이고 A2는 산소이며 n은 1인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 동물의 혈액이며, 상기 조성물은 단백질 변성제, 킬레이트화제, 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 전혈시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 단백질 변성제는 GuSCN(Guanidine Thiocyanate)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 EDTA(Ethylene-Diamine- Tetraacetic Acid)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 폴리소르베이트는 Tween 20인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 PEG 1000인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 돼지, 반추동물, 가금류 및 연체동물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동물로부터 유래한 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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