ES2618925T3 - Extracción de ácido nucleico - Google Patents

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Abstract

Un metodo de preparacion de acidos nucleicos a partir de una muestra biologica, que comprende a) material celular que tiene una membrana celular, o b) material celular que tiene una pared celular, o c) material virico que tiene una envuelta virica o d) material virico que tiene una capsida virica; comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con un sustrato, estando el sustrato funcionalizado con un agente biocida que es capaz de i) debilitar la membrana celular, la pared celular, la envuelta virica o la capsida virica; o ii) producir la lisis del material celular o virico; en donde el agente biocida comprende multiples grupos funcionales, comprendiendo los multiples grupos funcionales un grupo sililo, que esta implicado en la union del agente al sustrato; una cadena alquilo; y un grupo de cloruro de amonio.

Description

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DESCRIPCION
Extraccion de acido nucleico Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos y productos para la extraccion de acidos nucleicos de muestras biologicas, principalmente muestras biologicas que comprenden material celular. Los aspectos de la invencion se refieren adicionalmente a metodos para preparar acidos nucleicos a partir de muestras biologicas para la amplificacion de acido nucleico.
Antecedentes de la invencion
Uno de los retos principales para el diagnostico usando tecnologia de amplificacion de acido nucleico es el pretratamiento del material celular para extraer acidos nucleicos antes del proceso de amplificacion. Las tecnologias basadas en silice y basadas en perlas magneticas son ineficaces (<10 %) y requieren la optimization para tipos especificos de diana; el mismo proceso generalmente no es compatible con otros tipos de muestra. Los procesos de alto rendimiento que usan fenol y cloroformo no son adecuados a causa de la toxicidad de los componentes. Los metodos basados en detergente ofrecen un proceso de lisis simple, pero requieren temperaturas elevadas (95 °C), que no son compatibles con RT-PCR de una unica etapa ya que la transcriptasa inversa no es termicamente estable.
Los metodos actuales implican el aislamiento de acidos nucleicos en una forma purificada, del resto de material celular. Esto generalmente requiere descomponer las celulas usando enzimas tales como lisozimas o detergentes. Las micobacterias requieren un pretratamiento duro con NALC-NaOH para romper las celulas. Las proteinas se retiran por digestion usando proteasas apropiadas (por ejemplo, proteinasa K). Los acidos nucleicos se unen a una resina de soporte o a una matriz cargada (por ejemplo, particulas magneticas) y se lavan. Los acidos nucleicos se retiran del soporte cargado a traves de cambio de pH a un tampon apropiado. Esto produce acidos nucleicos de alta pureza.
Los sistemas del estado de la tecnica, por ejemplo, de Cepheid, Enigma Diagnostics, Roche, Geneprobe, BD, etc., integran este proceso convencional de extraccion de acido nucleico en laboratorio en sus instrumentos de diagnostico. Sin embargo, esto es complejo, costoso y esta dirigido a tipos especificos de muestras.
En el presente documento se describe un proceso para eliminar la complejidad de este proceso, suministrando acidos nucleicos con capacidad de amplificarse por PCR en un sistema simple, desechable, basado en papel que funciona a temperatura ambiente, es capaz de romper celulas bacterianas, fungicas y viricas, y libera acidos nucleicos en solution para analisis directo para PCR.
Las solicitudes de patente internacional WO00/62023 y WO02/16383 de Whatman, Inc, describen metodos para producir la lisis de las celulas y aislar acidos nucleicos usando medios de filtro recubiertos. El medio de filtro es nitrocelulosa tratada con FTA, que se recubre con un detergente anionico, por ejemplo, SDS. El recubrimiento lisa las celulas, y el filtro tratado con FTA absorbe acidos nucleicos en el mismo. El recubrimiento no se une covalentemente al filtro, y puede retirarse por lavado. Los acidos nucleicos pueden eluirse del filtro para posterior procesamiento.
La solicitud de patente internacional WO2008/134464 de 3M Innovative Properties Company describe un sustrato con grupos funcionales unidos, un material de lisis, un material de matriz y un sacarido, para su uso en el aislamiento de acidos nucleicos de las muestras.
La solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0185322 to Akhavan-Tafti describe metodos para la extraccion de ARN de una muestra, que implica el uso de una solucion acida y un material de union a fase solida que puede liberar acidos nucleicos sin realizar lisis preliminar de las celulas. Se menciona el uso de sales de amonio cuaternario para unir los acidos nucleicos. La solicitud de Estados Unidos 2005/0042661 de Tarkkanen et al. tambien describen el uso de compuestos de amonio cuaternario para liberar selectivamente acidos nucleicos de las celulas.
Las solicitudes de patente internacional WO2004/087226 y WO2006/071191 de Appeartex AB, y la patente de Estados Unidos 5.064.613 de Higgs et al. describen composiciones antimicrobianas que incluyen sales de amonio cuaternario.
Kim et al: "Microfluidic sample preparation: cell lysis and nucleic acid purification", Integrative Biology, Royal Society of Chemistry, R.U., vol. 1, n.° 10, 1 de octubre de 2009, paginas 574-586, es una revision que describe diversidad tecnicas de lisis celular y de purificacion de acido nucleico.
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Sumario de la invencion
De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona un metodo de preparacion de acidos nucleicos a partir de una muestra biologica que comprende a) material celular que tiene una membrana celular, o b) material celular que tiene una pared celular, o c) material virico que tiene una envuelta virica o d) material virico que tiene una capsida vmca; comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con un sustrato, estando el sustrato funcionalizado con un agente biocida que es capaz de i) debilitar la membrana celular, la pared celular, la envuelta virica o la capsida virica; o ii) producir la lisis del material celular o virico; donde el agente biocida comprende multiples grupos funcionales, comprendiendo los multiples grupos funcionales un grupo sililo, que esta implicado en la union del agente al sustrato; una cadena alquilo; y un grupo de cloruro de amonio.
De acuerdo con un aspecto de la descripcion, se proporciona un metodo de preparacion de acidos nucleicos a partir de una muestra biologica que comprende a) material celular que tiene una membrana celular, o b) material celular que tiene una pared celular, o c) material virico que tiene una envuelta virica o d) material virico que tiene una capsida virica; comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con un sustrato, estando el sustrato funcionalizado con un agente biocida que es capaz de i) debilitar la membrana celular, la pared celular, la envuelta virica o la capsida virica; o ii) producir la lisis del material celular o virico.
El metodo puede comprender adicionalmente la etapa de someter la muestra a calor despues de la etapa de contacto. Por ejemplo, la muestra puede anadirse directamente a una reaccion de amplificacion de acido nucleico. La etapa de calor servira para producir la lisis de la pared celular, la membrana celular, la envuelta virica o la capsida virica debilitada, para liberar el acido nucleico. La etapa de calor no siempre es necesaria para liberar el acido nucleico, por ejemplo, si el agente biocida es capaz de producir la lisis del material celular o virico.
De este modo, el metodo permite una preparacion rapida y facil de acido nucleico a partir de una muestra biologica para procesamiento adicional.
El sustrato es preferiblemente un material de celulosa; por ejemplo, un papel de filtro de celulosa o una matriz de celulosa. El material de celulosa puede ser un papel compuesto; por ejemplo, un papel de celulosa compuesta que puede comprender una capa de flujo lateral, para retirar los contaminantes liquidos y de bajo peso molecular y los inhibidores de la muestra que se deposita sobre una superficie del papel. La celulosa tiene la ventaja de que tiene varios grupos hidroxilo expuestos a los que pueden unirse agentes biocidas. En ciertas realizaciones, el material de celulosa puede comprender adicionalmente reactivos para realizar acciones deseadas sobre la muestra; por ejemplo, RNasas, proteasas y similares, para la limpieza de la muestra. Un sustrato preferido es un papel de celulosa derivado de algodon y, en particular, papel FP 2992 de Hahnemuhle FineArt GmbH (Alemania).
Pueden usarse otros materiales de sustrato, preferiblemente aquellos que tienen grupos hidroxilo expuestos. Por ejemplo, el sustrato puede ser vidrio, plastico o similares. Aunque en una realizacion preferida el sustrato es un papel de filtro, que puede anadirse directamente a una reaccion de amplificacion de acido nucleico, en otras realizaciones el sustrato puede adoptar la forma de un canal microfluidico o de un vaso de reaccion o de otro recipiente, junto con el cual o dentro del cual puede pasar o estar contenida la muestra biologica.
El agente biocida comprende multiples grupos funcionales. Los grupos funcionales incluyen un resto de union, que esta implicado en la union del agente al sustrato; un resto hidrofobo; y un resto cargado. El resto hidrofobo es capaz de interaccionar con y penetrar en la pared celular o en la membrana celular. El resto hidrofobo es una cadena de alquilo, por ejemplo, alquilo C5-C30, preferiblemente alquilo C10-C20. Segun la cadena alquilo penetra la pared celular delicada, la pared se debilita y perfora. El resto cargado esta cargado positivamente, y es capaz de atraer una pared celular cargada, y puede alterar el flujo de iones y la homeostasis en contacto con una membrana celular, ayudando de ese modo a alterar la celula y liberar los acidos nucleicos. El resto cargado es un grupo amonio cuaternario.
Los grupos funcionales son una cadena alquilo (el resto hidrofobo), un grupo sililo (el resto de union) y un grupo de cloruro de amonio (el resto cargado).
Los agentes biocidas preferidos incluyen compuestos de amonio cuaternario sililados (SiQAC); en particular cloruro de 3-(trimetoxisilil) propildimetiloctadecil amonio (3-TPAC). Otros agentes biocidas de la descripcion incluyen cloruros de bencilamonio. El modo letal de accion de los SiQAC esta generalmente aceptado que discurre por adsorcion de la molecula cargada positivamente en la superficie celular cargada negativamente, la alteracion de la membrana celular por una cadena lipofila en la molecula de SiQAC, y difusion a traves de la membrana que conduce a lisis celular.
Los expertos en la materia seran conscientes de otros agentes biocidas adecuados que pueden usarse. La seleccion de un agente particular estara guiada por la presencia de los grupos funcionales preferidos descritos anteriormente, y de la naturaleza de la muestra biologica pretendida - por ejemplo, cuando la muestra a procesarse es una muestra celular de mamifero, entonces no hay pared celular que penetrar, y pueden ser apropiados otros grupos funcionales.
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Ejemplos de otros agentes biocidas que pueden usarse en la presente descripcion incluyen:
a) poli(2-alquil-1,3-oxazolinas) telequelicas;
b) celulosa con un grupo de DDA antimicrobiano injertado a traves de PEtOx, que elimina las celulas microbianas que se aproximan en contacto (Bieser et al., (2011), Contact-Active Antimicrobial and Potentially Self-Polishing Coatings Based on Cellulose. Macromol. Biosci., 11, 111-121);
c) saponinas que son glucosidos esteroides o triterpenoides, comunes en una gran cantidad de plantas, y se sabe desde hace tiempo que tienen una accion lftica sobre la membrana de los eritrocitos y muchas saponinas se sabe que son antimicrobianas (Francis et al., British Journal of Nutrition (2002), 88, 587-605). Se ha realizado investigacion extensiva sobre las propiedades de permeabilizacion de membranas de las saponinas. Tambien se ha observado que estos compuestos estructuralmente diversos eliminan protozoos y actuan como agente antifungicos y antiviricos. Las membranas celulares aisladas de eritrocitos humanos, cuando se tratan con saponina, desarrollan poros de 40-50 A de diametro frente a los poros de 80 A producidos en membranas artificiales (Seeman et al., 1973 Structure of membrane holes in osmotic and saponin hemolysis. Journal of Cell Biology 56, 519-527).
Para una revision de otras composiciones que pueden usarse, vease "Antimicrobial Polymers in Solution and on Surfaces", Siedenbiedel y Tiller (2012) Polymers, 4, 46-71.
Preferiblemente, la muestra biologica puede comprender material celular que tiene una pared celular. Por ejemplo, el material celular puede ser celulas procariotas, tales como celulas bacterianas; o puede ser celulas vegetales o fungicas. Como alternativa, la muestra biologica comprende material celular que tiene una membrana celular y ninguna pared celular. Por ejemplo, el material celular puede ser celulas eucariotas de animales, incluyendo celulas de mamifero o de insecto. Como alternativa, la muestra biologica puede comprender material virico.
Un aspecto adicional de la presente descripcion proporciona un metodo de amplificacion de acidos nucleicos en una muestra biologica, comprendiendo el metodo: preparar acidos nucleicos de acuerdo con el metodo del primer aspecto anterior de la descripcion; y someter los acidos preparados a una etapa de amplificacion de acido nucleico, preferiblemente una amplificacion por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).
La amplificacion puede realizarse con fines de diagnostico.
Un aspecto adicional de la invencion proporciona un dispositivo para preparar acidos nucleicos a partir de una muestra biologica que comprende a) material celular que tiene una membrana celular, o b) material celular que tiene una pared celular, o c) material virico que tiene una envuelta virica o d) material virico que tiene una capsida virica; comprendiendo el dispositivo un sustrato funcionalizado con un agente biocida que es capaz de i) debilitar la membrana celular, la pared celular, la envuelta virica o la capsida virica; o ii) producir la lisis del material celular o virico, donde el agente biocida comprende multiples grupos funcionales, comprendiendo lo multiples grupos funcionales un grupo sililo, que esta implicado en la union del agente al sustrato; una cadena alquilo; y un grupo de cloruro de amonio.
El sustrato es preferiblemente un material de celulosa.
En ciertas realizaciones, el sustrato puede integrarse en un cartucho de preparation de muestra o similar. Por tanto, el dispositivo puede comprender adicionalmente un vaso de reaccion para recibir el sustrato, o una parte del sustrato. El dispositivo tambien puede comprender adicionalmente un medio para separar una parte del sustrato del resto del sustrato; esto puede permitir que un trozo del sustrato se separe una vez se ha anadido la muestra, y el trozo separado entonces se deja entrar en el vaso de reaccion y se usa en una PCR.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la estructura de una molecula de SiQAC, 3-TPAC.
La Figura 2 ilustra la funcionalizacion de celulosa por un SiQAC.
La Figura 3 es un esquema del modo de accion de un SiQAC sobre una celula.
La Figura 4 muestra la detection de especies de un Plasmodium de sangre tratada con un SiQAC.
La Figura 5 compara diferentes metodos de procesamiento con papel para la extraction de ADN de Mycobacterium.
La Figura 6 muestra los datos de precision para muestras clinicas.
La Figura 7 muestra ensayos de multiples repeticiones de MTB a diferentes concentraciones extraidos de esputo usando el proceso descrito, mostrando el eje Y la temperatura de fusion maxima y mostrando el eje X la altura maxima.
La Figura 8 muestra el flujo de trabajo del proceso optimizado para la production de papel funcionalizado con SiQAC y el analisis de muestras.
La Figura 9 muestra el aislamiento de ADN microbiano a partir de leche entera completa.
La Figura 10 muestra la amplificacion de acido nucleico obtenido de muestras de plasma positivo al VIH.
La Figura 11 muestra las secuencias obtenidas del acido nucleico de VIH amplificado.
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Descripcion detallada de los dibujos
La presente descripcion funciona generalmente del siguiente modo. Un sustrato, tal como papel de filtro de celulosa, se funcionaliza con un agente biocida, preferiblemente un SiQAC, mas preferiblemente 3-TPAC. El sustrato funcionalizado puede usarse en la preparacion de la muestra para extraer los acidos nucleicos de una muestra celular para su uso en reacciones de PCR.
El material celular se deposita en la capa superior del papel. El liquido fluye a traves del papel y el material celular queda atrapado sobre la superficie. La fase liquida y cualquier ion inhibidor de bajo peso molecular se dispersa en una capa de flujo lateral secundaria localizada por debajo de la capa de celulosa funcionalizada superficial.
Las celulas microbianas en la muestra (o celulas vegetales, animales o fungicas) interactuan con la celulosa funcionalizada con SiQAC y se debilitan y/o lisan, liberando su contenido celular normalmente en 5 minutos de contacto.
Puede escindirse un tampon de papel compuesto del sustrato, y anadirse directamente una reaccion de PCR despues de un periodo de 10 minutos. Adicionalmente, el calor inicial de la PCR puede servir para producir la lisis de cualquier celula restante con e l fin de liberar los acidos nucleicos adicionales.
La estructura de una molecula SiQAC [cloruro de 3-(trimetoxisililo) propildimetiloctadecil amonio (3-TPAC)] se muestra en la Figura 1. 3-TPAC se describio por primera vez en 1972 (vease, Isquith et al., (1972), Appl. Microbiol, 24:6 859-863,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC380687/pdf/applmicro00052-0033.pdf).
Hay muchas versiones de la quimica basica (por ejemplo, cloruros de bencilamonio BAC), pero todos comparten ingredientes claves similares: variante de cloruro de amonio (el antimicrobiano activo), silicio como agente de union (la parte sililo) y una cadena alcano. El cloruro de amonio es un grupo amonio cuaternario que se une a dos grupos metilo y de forma eficaz a dos grupos alquilo de cadena mas larga. Esta funcion cationica confiere propiedades antimicrobianas que provocan la descomposicion de las membranas bacterianas, fungicas y viricas, liberando el contenido de acidos nucleicos. La cadena de alcano hidrofoba penetra en las paredes celulares. El grupo trimetoxisililo une la molecula a un sustrato (por ejemplo, celulosa) a traves del grupo hidroxilo activo.
Los compuestos de amonio cuaternario son mortales para una amplia diversidad de organismos incluyendo bacterias, hongos y virus recubiertos, y a un menor grado para endosporas, Mycobacterium tuberculosis y virus sin envuelta. Muchos polimeros biocidas son conocidos con grupos de amonio cuaternario. Los compuestos de amonio cuaternario (QA) estan entre los agentes antibacterianos mas ampliamente usados para aplicaciones de salud medica y publica y han demostrado ser eficaces contra bacterias tanto gram negativas como gram positivas (Tashiro (2001) Macromol. Mater. Eng.; 286, 63-87).
Los polimeros cationicos con grupos QA generalmente muestran mayores actividades antimicrobianas que sus correspondientes monomeros de bajo peso molecular [Ikeda y Tazuke, 1983, Makromol. Chem., Rapid Commun. 4 (1983) 459-461]. La mayor actividad se atribuye a mayor atraccion electrostatica entre la celula y el polimero debido a la mayor densidad de carga del polimero.
Los SiQAC funcionan a traves de un proceso de dos etapas. La accion cargada positivamente sobre la molecula SiQAC atrae la pared celular cargada negativamente del microorganismo. Inicialmente, la cadena alquilo hidrofoba penetra en la pared celular similarmente hidrofoba de un organismo que entra en contacto con la misma. Segun la cadena alquilo penetra en la pared celular delicada, la pared se debilita y perfora. En segundo lugar, segun el grupo amonio cuaternario cationico entra en contacto con la pared celular altera el flujo de iones y causa filtraciones en o desde la pared celular, provocando habitualmente la perdida de la celula de sus contenidos o rotura dependiendo del entorno ionico. El grupo alquilo de amonio cuaternario cargado permanece sin cargar y esta disponible para repetir el proceso indefinidamente.
A causa de este mecanismo de eliminacion "fisico" y "electrico", los microbios no tienen oportunidad de desarrollar resistencia o inmunidad contra el SiQAC.
Los compuestos de amonio cuaternario se usan ampliamente como desinfectantes, antisepticos, productos farmaceuticos y cosmeticos y podrian ser una alternativa en la desinfeccion de frutos y hortalizas. Todos los compuestos de amonio cuaternario (QAC) son compuestos cationicos que poseen una estructura basica (NH4+). Estos compuestos penetran en la pared celular de las baterias, reaccionando con la membrana citoplasmatica induciendo lisis de la pared causada por enzimas autoliticas (McDonnell, G. y Russell, A. D. 1999 Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance. Clinical Microbiology Reviews 12, 147-179).
Los grupos trimetoxisililo reaccionan con los grupos hidroxilo sobre superficies tales como vidrio y algodon para formar enlaces covalentes que retienen el compuesto QA en la superficie y evitan que se disuelva en agua. Los grupos trimetoxisililo tambien pueden reaccionar entre si para formar un recubrimiento de silano reticulado, altamente estable, unido a superficies tratadas. Estos recubrimientos han demostrado conferir actividad biocida a las
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superficies en muchas aplicaciones sin producir liberacion de agentes quimicos al entorno adyacente [Isquith et al., 1972; Isquith et al., 1973 patente de Estados Unidos 3.730.701; Speier y Malek, 1982 J of Colloid and Interface Science 89, 68; Walters et al., 1973, J., Appl. Microbiol. 25, 253].
Aunque estos recubrimientos eran muy eficaces como agente fungicida y antibacteriano, han sido ineficaces contra las esporas.
La Figura 2 ilustra la funcionalizacion de celulosa con una molecula SiQAC, 3-TPAC. En celulosa nativa inalterada, X representa hidrogeno, formando varios grupos hidroxilo (OH) colgantes. En la fase inicial mas rapida, se forma un enlace entre la molecula y el grupo hidroxilo formando un eter de sililo. En la segunda etapa mas lenta se forman entrecruzamientos entre los grupos dimetoxisililo adyacentes para formar un polimero de eter de silicona aleatorio alineado paralelo a la superficie del sustrato.
El resto cationico no desempena ninguna funcion en la union a la superficie, pero esta disponible ya que esta unido a la superficie del sustrato. Su estructura es analoga a los compuestos de amonio cuaternario reconocidos como antisepticos topicos de los que el cloruro de didecildimetilamonio (DDAC) es un ejemplo tipico.
El mecanismo por el cual la molecula SiQAC queda unida a la superficie del sustrato es quimicamente similar al de la reticulacion de polieteno para formar PEX.
La Figura 3 es un diagrama esquematico que muestra el metodo de accion de la celulosa funcionalizada con SiQAC. Las cadenas de SiQAC se unen a las fibras de celulosa y quedan orientadas y reticuladas (marcadas A) para formar una capa activa. La cadena alquilo hidrofoba (marcada B) penetra en la pared celular similarmente hidrofoba del microorganismo. Segun la cadena alquilo penetra en la pared celular delicada, la pared se debilita y perfora. Entonces, el grupo de amonio cuaternario cationico (C) entra en contacto con la pared celular y altera el flujo de iones y causa filtraciones en o desde la pared celular, provocando habitualmente la perdida de la celula de sus contenidos o, dependiendo del entorno ionico, la rotura de la celula completamente. En su estado debilitado, el proceso de secado rapido de las celulas debilita adicionalmente la pared celular de modo que durante el ciclo temprano de PCR, el material de acido nucleico se libera en la solucion y se amplifica durante la PCR.
Por tanto, el modo de accion de las moleculas SiQAC implica varios elementos distintos. Hay una perturbacion de las bicapas lipidicas de la membrana citoplasmatica y externas y las paredes celulares a traves de la cadena alquilo, provocando una filtracion generalizada y progresiva del material citoplasmatico que provoca lisis celular, parcial o completa dependiendo de la fuerza ionica de la solucion adyacente. Esto se aumenta por el grupo de amonio cargado positivamente que se asocia con el fosfolipido de membrana cargado negativamente. Incluso a baja concentracion de los componentes activos, se produce la filtracion de los componentes citoplasmaticos de baja masa molar (por ejemplo, K+, acidos nucleicos y aminoacidos). Los compuestos SiQAC son considerablemente mas potentes que un compuesto de amonio cuaternario no sililado porque el grupo sililo se une a superficies causando que la parte antimicrobiana quede localmente concentrada y orientada.
El proceso de lisis celular por compuestos SiQAC funciona a temperatura ambiente, a diferencia de otros procesos en el estado actual de la tecnica. La celulosa funcionalizada con SiQAC es adecuada para debilitar y/o destruir las paredes celulares de bacterias, de hongos y la envuelta proteica de particulas viricas. En realizaciones preferidas, proporciona material celular lisado que esta listo para PCR en 5 minutos. Los sustratos funcionalizados y los metodos de la presente descripcion posibilitan la extraccion del acido nucleico de ADN y de ARN combinado con descontaminacion de otros agentes potencialmente daninos dentro de la muestra en una unica etapa. Tambien es posible extraer el ARN de particulas viricas, proporcionando un proceso de una unica etapa que elimina la necesidad de un procesamiento de muestras complejas para acceder al ARN antes de RT-PCR.
Los metodos podrian usarse como medios de seleccion de tipos celulares para lisis, por ejemplo, los presentes datos muestran que despues de 24 horas de incubacion en sangre, las celulas de la sangre completa permanecen intactas, mientras que los eritrocitos blancos quedan lisados.
Se cree que el proceso de SiQAC es compatible con al menos los siguientes microorganismos:
Bacterias: MRSA, CA-MRSA; Micrococcus sp.; Staphylococcus epidermis; Enterobacter agglomerans; Acinetobacter calcoaceticus; Staphylococcus aureus (pigmentado); Staphylococcus aureus (no pigmentado); Klibsiella pneumonial moniae; Pseudomonas aeruginosa ; Streptococcus faecalis; Escherichia coli; Proteus mirabilis; Citrobacter diversus; Salmonella typhosa; Salmonella choleraesuis; Cornyebacterium bovis; Mycobacterium smegmatis; Mycobacterium tuberculosis; Brucella canis; Brucella abortus; Brucella suis; Streptococcus mutans; Bacillus subtilis; Clostridium perfringens; Haemophilus influenzae; Haemophilus suis; Lactobacillus casel; Leuconostoc lactis; Listeria monocytogenes; Propionibacterium acnes; Proteus vulgaris.
Hongos: Altemaria; Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus niger, Aspergillus terreus; Aspergillus versicolor, Aureobadisium pullulans; Cephaldascus fragrans; Chaetomium globosum; Cladosporium herbarum; Epidermophyton; Fusarium nigrum; Fusarium solani; Glicocladium roseum; Mucor, Oospora lactis; Pencillium
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albicans; Tricophyton mentagraphophytes; Pencillium elegans; Pencillium funiculosum; Pencillium humicola; Pencillium notatum; Pullularia pullulans; Penicillium variabile; Rhizopus nigricans; Ricoderm; Stachybotrys atra; Trichophyton interdigitalie; Trichderma flavus; Penicillium citrinum.
Levaduras y algas: Saccharomyces cerevisiae; Candida albicans; Oscillatoria borneti LB143; Anabaena cylindrica; Selenastrum gracile B-325; Pleurococcus LB11; Schenedesmus quadricuada; Gonium LB 9c; Volvox LB 9; Chlorella vulgaris; Cyanophyta (verdeazuladas); Chrysophyta (marrones); Chlorophyta (verdes) Seienastum; Chlorophyta (verdes) Protococcus.
Virus: VIH; dengue; gripe A/B; SARS; H1N1 (gripe porcina); H3N2; herpes simple de tipo 1.
Otros: Plasmodium malariae.
Los detalles de la accion antimicrobiana de los SiQAC pueden encontrarse en Isquith et al (1972).
Ejemplos
El papel usado en todos los ejemplos fue el papel de celulosa derivado de algodon FP 2992 de Hahnemuhle FineArt GmbH (Alemania), salvo que se indique de otro modo:
Ejemplo 1: Purificacion basada en papel de cultivos bacterianos con solucion de SiQAC y caracterizacion del producto de PCR
Protocolo:
1. Preparar un cultivo O/N para una bacteria dada (K. pneumoniae, S. aureus y M. Tuberculosis*) y recoger 50 |jl. [*el cultivo MTB se ha inoculado durante dos semanas (D.O. 1,1)]
2. Preparar tres conjuntos de tarjetas a secar O/N
i. Papel no tratado
ii. Funcionalizado con 5 jl de solucion de SiQAC (3-TPAC) diluida en 15 jl de agua
iii. Funcionalizado con 5 jl de solucion de SiQAC /3-TPAC) diluida en 15 jl de TRIS-Cl [pH 7,5]
3. Anadir 20 jl de los cultivos a cada conjunto de papel tratado y no tratado y secar a temperatura ambiente durante 10 minutos [repeticiones x4 en papel diferente para cada cultivo]
4. Retirar un disco perforado de papel usando una perforadora de biopsia esteril (1,5 mm).
5. Anadir el disco perforado a la mezcla de PCR (20 jl de volumen final)
6. Realizar 35 ciclos de 16S universal para cada uno de los ensayos; K. pneumoniae y S. aureus, MTB de GD/RIF
7. Usar pirosecuenciacion convencional de los productos de PCR para K. pneumoniae y S. aureus Resultados
1. La PCR de lechos convencionales (conjunto 1) para K. pneumoniae produjo un promedio de 18 lecturas de pb de alta calidad en pirosecuenciacion
2. La PCR de lechos enriquecidos con 5 jl de solucion de SiQAC (3-TPAC) anadidos a 15 jl de agua (conjunto 2) para K. pneumoniae produjo un promedio de 24 lecturas de pb de calidad media en pirosecuenciacion
3. La PCR de lechos enriquecidos con 5 jl de solucion de SiQAC (3-TPAC) anadidos a 15 jl de TRIS-Cl [pH 7,5] (conjunto 3) para K. pneumoniae produjo un promedio de 28 lecturas de pb de alta calidad en pirosecuenciacion
4. La PCR de lechos no tratados (conjunto 1) de S. aureus produjo un promedio de 16 lecturas de pb de alta calidad en pirosecuenciacion
5. La PCR de lechos enriquecidos con 5 jl de solucion de SiQAC (3-TPAC) anadidos a 15 jl de agua (conjunto 2) para S. aureus produjo un promedio de 20 lecturas de pb de alta calidad en pirosecuenciacion
6. La PCR de lechos enriquecidos con 5 jl de solucion de SiQAC (3-TPAC) anadidos a 15 jl TRIS-Cl [pH 7,5] (conjunto 3) para S. aureus produjo un promedio de 25 lecturas de pb de alta calidad en pirosecuenciacion
7. MTB de Gd/RIF: la identification de MTB fue correcta para los tres conjuntos de muestras, incluyendo la identification de RIF en muestras procesadas a traves de lechos enriquecidos con 5 jl de solucion de SiQAC (3- TPAC) diluidos con 15 jl de TRIS-Cl [pH 7,5]
Conclusiones:
El papel enriquecido con solucion de SiQAC (3-TPAC) liso de forma satisfactoria las celulas bacterianas permitiendo la PCR de los acidos nucleicos extraidos. Esto se confirmo por la longitud sin procesar de la secuencia obtenida a traves de pirosecuenciacion, y la detection de punto final de MTB-RIF de Mycobacterium tuberculosis que es una celula dificil de descomponer, que requiere convencionalmente tratamientos duros con NALC-NaOH para conseguir el mismo nivel de alteration celular. El papel no tratado no produjo los mismos resultados. Se necesita TRIS-Cl [pH
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7,5] para tamponar el SiQAC.
Ejemplo 2: Detection de especies de Plasmodium de sangre tratado con solution de SiQAC.
La figura 4 muestra los resultados de deteccion de acidos nucleicos de diferentes especies de Plasmodium en muestras de sangre obtenidas de pacientes infectados.
Ejemplo 3: Funcionalizacion de papel y metodos de uso
Se dan tres metodos alternativos de funcionalizacion de papel:
Proceso A
Papel funcionalizado con 20 |jl de solucion de SiQAC (3-TPAC), secado durante 24 horas y despues lavado en 20 |jl de TRIS-Cl 5 mM [pH 9,0], MgCl2 0,2 mM despues secado y;
i. Aplicar la muestra, secar durante 20 minutos, retirar el disco y anadir 20 jl de agua miliQ para PCR, o
ii. Aplicar la muestra, secar durante 20 minutos, retirar el disco y aclarar en 20 jl de agua miliQ usando pipeteo suave, usar 20 jl en PCR
Proceso B
Papel funcionalizado con 20 jl de solucion de SiQAC (3-TPAC), secado durante 30 minutos y lavado en TRIS-Cl 5 mM [pH 9,0], MgCl2 0,2 mM despues secado y;
i. Aplicar la muestra, secar durante 20 minutos, retirar el disco y anadir 20 jl de agua miliQ para PCR, o
ii. Aplicar la muestra, secar durante 20 minutos, retirar el disco y aclarar en 20 jl de agua miliQ usando pipeteo suave, usar 20 jl en PCR
Proceso C
Papel funcionalizado con 20 jl de SiQAC (3-TPAC) y secado durante 30 minutos y;
i. Aplicar la muestra, secar durante 20 minutos, retirar el disco y aclarar en 20 jl de agua miliQ usando pipeteo suave, usar 20 jl en PCR, o
ii. Aplicar la muestra, secar durante 20 minutos, retirar el disco y anadir 20 jl de TRIS-Cl 5 mM [pH 9,0], MgCl2 0,2 mM para PCR; o
iii. Aplicar la muestra, secar durante 20 minutos, retirar el disco y aclarar en 20 jl de TRIS-Cl 5 mM [pH 9,0], MgCl2 0,2 mM usando pipeteo suave, usar 20 jl en PCR
Los diversos procedimientos de procesamiento de papel diferentes se compararon para la extraction de ADN de Mycobacterium tuberculosis de muestras clinicas de esputos sin procesar y los resultados se obtuvieron usando el procesamiento convencional de MTB Cepheid GeneXpert® usando NALC-NaOH. Los resultados se muestran en la Figura 5. (MTB = gen rpoB de Mycobacterium detectado; RIFs o RIFr = mutaciones de rifampicina detectadas; FALLIDO= sin deteccion). Los tres metodos de procesamiento liberaron acidos nucleicos a un grado variable en solucion para PCR permitiendo la deteccion del gen rpoB de multiples copias y de una unica copia y para detectar la mutation de rifampicina. Todos los procesos dieron datos comparativos al sistema patron de oro GeneXpert®. El proceso C dio resultados "mejores" en comparacion con el patron de oro, dando un alto grado de alteration celular y estabilidad de ADN de alta calidad para el analisis de PCR, confirmado adicionalmente por pirosecuenciacion. La pirosecuenciacion mostro variaciones de secuencia observadas en 30 pb de secuencia de amplicones del ADN ribosomico de V2, las lecturas largas amarillas y azules ilustran la ausencia de mutaciones en la secuencia, que confirma la presencia de buenos productos de amplification.
La Figura 6 muestra los datos de precision cumulativa de cinco muestras clinicas de esputo (RIFs 4x y RIFr 1x), procesadas usando las 7 modificaciones diferentes descritas (es decir, 35 ensayos). La medicion de las temperaturas de fusion para MTB (azul claro) y las mutaciones de rpoB que indican el estado de RIF (RIFs, RIFr) y las barras de error asociadas que representan la desviacion tipica a traves de los datos puntuales medidos muestran que el proceso no influye en la precision de la determination del pico de fusion que esta en ± 0,5 °C. Las metodologias convencionales pueden incluir en la precision de la medicion.
La Figura 7 muestra multiples ensayos de repetition de MTB a diferentes concentraciones extraidas de esputo usando el proceso descrito, mostrando el eje Y la temperatura de fusion maxima y mostrando el eje X la altura maxima.
A la luz de estos ejemplos, la Figura 8 muestra el proceso optimizado para la funcionalizacion de papel con compuestos SiQAC y el analisis de la muestra.
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Ejemplo 4. Pirosecuenciacion de Mycobacterium tuberculosis extraido usando SiQAC de muestras de esputo
Se procesaron tres muestras de esputo usando tarjetas compuestas funcionalizadas con SiQAC (3-TPAC). Se anadieron discos de 1,5 mm a una amplificacion convencional de ADN ribosomico de 16S sin inicio caliente (es decir, solamente ciclado) y los amplicones resultantes se analizaron usando pirosecuenciacion. Los resultados mostraron buena amplificacion de las regiones de secuencia central proporcionando >25 nucleotidos de longitudes de lectura indicativas de una buena extraccion y amplificacion:
Modo de busqueda: busqueda completa Valor de identidad medio: 100 %
Motor de busqueda: PyroMark Q96 ID Base de datos de referencia: HULPII Secuencia de referencia: M. microti ATCC19422.
Muestra 1 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT Muestra 2 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT Muestra 3 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCC
Ejemplo 5: Aislamiento de ADN microbiano de leche completa
La leche completa es un tipo de muestra dificil para PCR con muchos inhibidores. El papel compuesto se funcionalizo usando el metodo preferido (ilustrado en la Figura 8). Se anadio un unico disco de 1,5 mm de papel funcionalizado mas muestra de leche en polvo a una mezcla convencional de PCR con cebadores para la amplificacion de ADN ribosomico de 16S universal. El ADN amplificado se ejecuto en un gel convencional. La Figura 9 muestra los resultados. (Carril 1: marcador de peso molecular; Carril 2: 5 pl de ADNg de referencia de E. coli + 1 pl de solucion de SiQAC (3-TPAC) al 100 %; Carril 3: 5 pl de ADNg de referencia de E. coli + 1 pl de solucion de SiQAC (3-TPAC) al 10 %; Carril 4: 5 pl de ADNg de referencia de E. coli + 1 pl de solucion de SiQAC (3-TPAC) al 1 %; Carril 5: disco de 1,5 mm funcionalizado con solucion de SiQAC (3-TPAC) al 10 % + 20 pl de leche entera completa; Carril 6: disco de 1,5 mm funcionalizado con solucion de SiQAC (3-TPAC) al 1 % + 20 pl de leche entera completa; Carril 7: disco de 1,5 mm funcionalizado + 20 pl de leche entera completa; Carril 8: 1 pl leche entera completa).
Los datos mostrados demuestran que la funcionalizacion con SiQAC (3-TPAC) al 1 % potencia la amplificacion en comparacion con papel no tratado (carriles 6 y 7)
Los discos se comprobaron para bacterias residuales inoculando medio de enriquecimiento para bacterias lacticas (5 g/l de triptona, 1 g/l de dextrosa, 2,5 g/l de extracto de levadura y 1 g/l de leche desnatada en polvo) mas agar al 4 % - R.C. MARSHALL (1993) Standard Methods for the Microbiological examination of dairy products, 16a Ed. (American Public Health Association). El cultivo durante una noche mostro ausencia de crecimiento bacteriano en los discos tratados con SiQAC (3-TPAC) pero crecieron hasta confluencia en placas de cultivo de discos no tratados, lo que confirma que el papel funcionalizado descontaminaba el liquido en 15 minutos.
Ejemplo 6: RT-PCR de ARN extraido de virus VIH de suero usando tarjetas funcionalizadas
Sumario
Las tarjetas funcionalizadas funcionaban para RT-PCR anidada del amplicon K103 de VIH con una muestra de plasma de un paciente anonimo de diagnostico positivo. Un ensayo paralelo con una muestra de sangre completa de un paciente diferente (tambien diagnosticado positivo) no dio resultados en PCR (sin fragmentos detectados en geles de agarosa al 1 %) o pirosecuenciacion.
Descripcion del ensayo
Se funcionalizaron dos tarjetas usando solucion de purificacion (solucion PF, que contenia 3-TPAC) siguiendo el protocolo normalizado:
1. Abrir la tarjeta y aplicar 20 pl de solucion PF 1/100 diluida en tampon (Tris HCl 5 mM (pH 9,0), MgCl2 0,2 mM)
2. Secar durante 15 minutos
3. Aplicar 20 pl de muestra*
4. Secar durante 15 minutos
5. Perforar un unico disco y anadir a RT
*Las muestras seran plasma de sangre VIH positiva periferica (1) y sangre VIH positiva periferica (2)
La mezcla RT usada era el kit de sintesis de ADNc de Applied Biosystems Superscript VILO como se describe en el manual del usuario ajustando a un volumen final de 30 microlitros.
La PCR se preparo posteriormente del siguiente modo:
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H20 - 5,8 Ml
Tampon de PCR 10x - 5 Ml
MgCl2 [50 mM] - 2 Ml
dNTP •lO mM^ - 1,2 Ml
1849+ •lO mM^ - 1 Ml
3500- •lO mM^ - 1 Ml
Taq polimerasa Ultratools [1 u/ml] - 1 Ml
ADNc del kit de smtesis de ADNc Superscript VILO - 30 Ml
Los cebadores usados fueron:
1849+ 5'-GAT GACAG CAT GT C AG G GAG
3500- 5'-CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA
Programa de PCR:
94 °C 2 min, seguido por 45 ciclos de
94 °C 30 segundos
50 °C 30 segundos
72 °C 1 minuto 30 segundos; seguido por
72 °C 5 minutos
10 °C ~
El producto de esta PCR es de 1702 pb de longitud y contiene la region gag-pro-pol de VIH1. Este amplicon se uso como molde para la segunda PCR.
La segunda PCR se preparo del siguiente modo:
H20 - 20 Ml
Tampon de PCR 10x - 4 Ml
MgCl2 [50 mM] - 1,6 Ml
dNTP ^10 mM^ - 0,8 Ml
K103F ^10 mM^ - 3,2 Ml
BioK103F ^10 mM^ - 3,2 Ml
Taq polimerasa Biotools [1 u/ Ml] - 0,5 Ml
Producto de PCR de la PCR anidada - 5 Ml
Los cebadores usados fueron:
K193F
5'-GGAATACCACATCCYGCAGG
BioK103R
5'-[Biotina]AATATTGCTGGTGATCCTTTCC
Programa de PCR:
95 °C
5 min, seguido por 30 ciclos de
95 °C
30 segundos
55 °C
30 segundos
72 °C
30 segundos; seguido por
72 °C
5 minutos
10 °C
El producto de PCR de la segunda PCR es de 203 pb y se uso en la reaccion de pirosecuenciacion siguiendo el enfoque de enriquecimiento mostrado en la Figura 10.
RESULTADOS
Solamente la muestra de plasma dio buenas senales en el pirosecuenciador, la muestra de sangre no dio resultados en absoluto siguiendo el protocolo descrito. El cebador de secuenciacion usado fue K103F (5'- GGAATACCACATCCYGCAGG) y la secuencia obtenida se enfrento al genoma completo de VIH usando la herramienta BLAST del NCBI. La secuencia coincidia satisfactoriamente con el VIH - vease la Figura 11.

Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de preparacion de acidos nucleicos a partir de una muestra biologica, que comprende a) material celular que tiene una membrana celular, o b) material celular que tiene una pared celular, o c) material virico que tiene una envuelta virica o d) material virico que tiene una capsida virica; comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con un sustrato, estando el sustrato funcionalizado con un agente biocida que es capaz de i) debilitar la membrana celular, la pared celular, la envuelta virica o la capsida virica; o ii) producir la lisis del material celular o virico; en donde el agente biocida comprende multiples grupos funcionales, comprendiendo los multiples grupos funcionales un grupo sililo, que esta implicado en la union del agente al sustrato; una cadena alquilo; y un grupo de cloruro de amonio.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la etapa de someter la muestra a calor despues de la etapa de contacto.
  3. 3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que a) el sustrato es un material de celulosa; preferiblemente un papel de filtro de celulosa o una matriz de celulosa; mas preferiblemente en donde el material de celulosa es un papel compuesto; mucho mas preferiblemente, en donde el papel compuesto comprende una capa de flujo lateral para retirar el liquido y los contaminantes de bajo peso molecular y los inhibidores de la muestra que se depositan sobre una superficie del papel; o b) en donde el sustrato es vidrio o plastico.
  4. 4. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que el sustrato esta en forma de un canal microfluidico o de un vaso de reaccion o de otro recipiente.
  5. 5. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que la cadena alquilo es alquilo C5-C30, preferiblemente alquilo C10-C20.
  6. 6. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en el que el agente biocida es un compuesto de amonio cuaternario sililado (SiQAC); mas preferiblemente en el que el agente biocida es cloruro de 3-(trimetoxisililo) propildimetiloctadecil amonio.
  7. 7. El metodo de cualquier reivindicacion anterior
    i. en el que a) la muestra biologica comprende material celular que tiene una pared celular; b) la muestra biologica comprende celulas animales eucariotas; o c) la muestra biologica comprende material virico; o
    ii. en el que el material celular comprende una celula procariota, o en el que el material celular comprende celulas vegetales o fungicas.
  8. 8. Un metodo de amplificacion de acidos nucleicos en una muestra biologica, comprendiendo el metodo: preparar acidos nucleicos de acuerdo con el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y someter los acidos preparados a una etapa de amplificacion de acido nucleico, preferiblemente una amplificacion por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).
  9. 9. Un dispositivo para preparar acidos nucleicos a partir de una muestra biologica, que comprende a) material celular que tiene una membrana celular, o b) material celular que tiene una pared celular, o c) material virico que tiene una envuelta virica o d) material virico que tiene una capsida virica; comprendiendo el dispositivo un sustrato funcionalizado con un agente biocida que es capaz de i) debilitar la membrana celular, la pared celular, la envuelta virica o la capsida virica; o ii) producir la lisis del material celular o virico, en donde el agente biocida comprende multiples grupos funcionales, comprendiendo los multiples grupos funcionales un grupo sililo, que esta implicado en la union del agente al sustrato; una cadena alquilo; y un grupo de cloruro de amonio.
  10. 10. El dispositivo de la reivindicacion 9, en el que sustrato es a) un material de celulosa; preferiblemente un papel de filtro de celulosa o una matriz de celulosa; mas preferiblemente en el que el material de celulosa es un papel compuesto; o b) es vidrio o plastico.
  11. 11. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en el que el sustrato esta en forma de un canal microfluidico o de un vaso de reaccion o de otro recipiente.
  12. 12. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que la cadena alquilo es alquilo C5-C30, preferiblemente alquilo C10-C20.
  13. 13. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en el que el agente biocida es un compuesto de amonio cuaternario sililado (SiQAC); mas preferiblemente en el que el agente biocida es cloruro de 3-(trimetoxisililo) propildimetiloctadecil amonio.
  14. 14. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el sustrato esta integrado en un cartucho de preparacion de muestras o similar.
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