CN105885075A - 一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,包括:将纯化的纳米细菌纤维素水凝胶加入到N,N‑二甲基‑N‑[3‑(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液中,pH调节至2.0~7.0,5~95℃均匀反应,清洗,即得。本发明的方法条件温和,不会破坏纳米细菌纤维素的纳米纤维网络结构;且是一步法反应,操作简单;接枝反应发生在纳米纤维表面,接枝可及率高;得到的材料具备优良的抗金黄色葡萄球菌等抗菌性能,在食品保鲜领域有很好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于抗菌材料制备领域,特别涉及一种类壳聚糖抗菌纳米纤维素的制备方法。
背景技术
纳米细菌纤维素是由某些细菌直接合成分泌的纳米纤维素,也称为生物纳米纤维素。纳米细菌纤维素具备高比表面、高含水率、高生物相容性,高生物活性,可观的湿强等与植物纤维素所不具有的独特性能,因此被认为是一种具有广泛应用前景的新型生物材料。目前该纳米细菌纤维素作为膳食纤维和“增趣”食材已被广泛用于饮料和烘焙食品等领域,但在食品保鲜领域,尤其在肉类保鲜领域鲜有报道。
目前的肉类保鲜技术包括低温、降低水分、低pH值、真空包装、加天然防腐剂、辐照等,其中添加壳聚糖和乳链菌肽抗菌素(商品名为Nisin)等天然防腐剂的应用较普遍。壳聚糖是一类带氨基的纤维素,化学名为(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖,也可称为动物纤维素,纳米细菌纤维素与壳聚糖的主链都是葡聚糖。壳聚糖价格相对较低,但是不具备吸液储液性能,在生肉生鱼等鲜活食材的保鲜效果上有待进一步提升。纳米细菌纤维素具有很好的吸液储液性能,不仅适合用于鲜肉包装中的吸收垫,也可以作为保湿膜调控食材水分,但是纳米细菌纤维素与壳聚糖的主要区别是没有氨基,不具有抗菌抑菌性,因此如用于保鲜膜和保鲜垫需要通过负载抗菌剂。
现有技术普遍采用负载纳米银等抗菌剂的方式实现纳米细菌纤维素材料的抗菌功能化,虽然这项技术的抗菌性能已获得普遍认识,但是长期大范围使用会导致生物积累和毒副作用,不可忽视其不利影响。
现有技术普遍采用浸渍法进行纳米细菌纤维素的抗菌功能化,通过渗透作用实现纳米银的负载,一方面纳米银的负载量十分有限,低剂量负载量的抗菌效果不明显,高剂量负载量又会产生明显的生物积累和毒副作用,另一方面纳米银在纳米细菌纤维素中的结合稳定性差,易于脱落,不具备长效性。
现在技术采用化学接枝法进行纳米细菌纤维素的抗菌功能化,化学作用过于强烈,容易破坏纳米细菌纤维素表面基团和网络结构,从而破坏了天然纳米细菌纤维素所具备的优良性能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,该方法反应条件温和,操作简单,可及性高,同时保留了纳米细菌纤维素的网络结构,得到的类壳聚糖抗菌纳米纤维素具备长效抗菌性、吸液储液性、机械强度好等优点。
本发明的一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,包括:
将纯化的纳米细菌纤维素水凝胶加入到N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液中,pH调节至2.0~7.0,5~95℃均匀反应,清洗,即得到类壳聚糖抗菌纳米纤维素。
所述纳米细菌纤维素水凝胶加入到N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液中后,N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵的浓度为6.2×10-5mmol/L–6.2mmol/L;反应最优pH为4。
所述纳米细菌纤维素水凝胶的纯化方法为5g/L的氢氧化钠溶液80℃反复浸泡3次,每次持续2h,再用去离子水浸泡24h,最后洗至pH值为中性。
所述N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液中N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵的质量分数为1~100%;溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、丙酮或石油醚。
所述pH调节方式为:用冰醋酸、柠檬酸、硫酸、盐酸或磷酸调节。
所述均匀反应采用搅拌或震荡。
所述清洗为去离子水反复冲洗。
所述类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素,部分浸泡于去离子水中存放于4℃冰箱中,部分采用冷冻干燥,部分80℃烘干箱中烘干24h后保存。
所述类壳聚糖抗菌纳米纤维素应用于抗菌包装和鲜肉制品保鲜。
有益效果
本发明所要解决的技术问题是提供一种通过表面接枝改性的纳米细菌纤维素材料,该材料具备长效抗菌性、吸液储液性好、机械强度好等优点,且一步法反应效率高,制备方法操作简单,条件温和,反应可及度高,同时保留了纳米细菌纤维素的纳米纤维网络结构。
附图说明
图1为实施例1中细菌纤维素氨基接枝改性前后的宏观形貌图;其中,a为接枝改性前;b为接枝改性后;
图2为实施例1中纳米细菌纤维素改性前与改性后细菌纤维素SEM图(a:接枝改性前;b:接枝改性后);
图3为实施例1中表面接枝改性前后的纳米细菌纤维素材料的红外光谱图;
图4为实施例2中纯纳米细菌纤维素的抗金黄色葡萄球菌效果图;其中a为洗脱液稀释104倍,b为洗脱液稀释105倍;
图5为实施例2中类壳聚糖抗菌纳米纤维素冻干膜的抗金黄色葡萄球菌效果图;其中,a为洗脱液稀释10倍,b为洗脱液稀释100倍;
图6为实施例2中类壳聚糖抗菌纳米纤维素湿态膜的抗金黄色葡萄球菌效果图(改性BC湿膜的洗脱液涂板);
图7为实施例4中不同改性剂浓度制备的表面接枝改性纳米细菌纤维素的细胞毒性实验图;
图8为实施例5中4℃保藏条件下三种BC样品对猪肉色泽的影响;
图9为实施例5中三种BC样品对猪肉表面细菌生长的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
按照以下步骤制备类壳聚糖抗菌纳米纤维素材料:
(1)添加60g N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵至40g甲醇溶液中,配制质量分数为60%的N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液;
(2)添加10片直径1.5cm的纳米细菌纤维素湿态膜片至10mL超纯水中,在25℃水浴锅中以20rpm的速度搅拌;
(3)向以上体系中添加4.62mL的N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液;
(4)滴加冰醋酸调至pH4.0,25℃、20rpm持续搅拌反应48h;
(5)收集反应后的纳米细菌纤维素膜片,超纯水清洗3次,每次间隔4h,即得;获得的样品如图1(1b)所示;
(6)得到的类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素,部分浸泡于去离子水中存放于4℃冰箱中,部分采用冷冻干燥,部分80℃烘干箱中烘干24h后保存。
冻干的样品仅喷金制样后,采用扫描电子显微镜观察发现接枝氨基的纳米细菌纤维素仍保持了纳米纤维网络结构(图2b)。采用FTIR对所得的功能化纳米细菌纤维素材料进行检测,结果如图3所示。
由图1可看出,与未接枝改性的纳米细菌纤维素膜(图1a)相比,纳米细菌纤维素改性前后的外貌发生很大变化。改性前纳米细菌纤维素为半透明色(图1a),而氨基接枝改性后纳米细菌纤维素变为白色(图1b)。图2显示纳米细菌纤维素接枝后纤维网络依然维持三维结构。图3结果显示,与未改性的纳米细菌纤维素比较可以看出,与未改性的纳米细菌纤维素比较可以看出,改性后的纳米细菌纤维素在2900cm-1、800cm-1附近出现新的吸收峰,并且在1600cm-1处峰的强度增强,表明N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵成功接枝在纳米细菌纤维素上。
实施例2
将质量分数为60%的N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液按照以下步骤制备1倍、25倍、100倍稀释度的原60%N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液改性剂,然后制备类壳聚糖抗菌纳米纤维素材料:
(1)添加10片直径1.5cm的纳米细菌纤维素湿态膜片至10mL超纯水中,保持20rpm25℃水浴锅中转动;
(2)向以上体系中分别添加4.62mL、184μL、46μL的60%质量比的N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液;
(3)滴加冰醋酸调至pH4.0,25℃、20rpm持续搅拌反应48h;
(4)收集反应后的纳米细菌纤维素膜片,超纯水清洗3次,每次间隔4h,即得;
(5)部分放置在超纯水中,部分80℃烘干箱中烘干24h后保存。
(6)按照中国人民共和国国家标准GB/T 20994.2-2007纺织品抗菌性能的评价第2部分:吸收法对上述制备的1倍稀释度添加剂的功能化纳米细菌纤维素材料湿态膜和烘干膜进行抗金黄色葡萄球菌检测实验,结果见图4、图5和图6以及统计结果表1和表2。
表1.表面接枝改性纳米细菌纤维素的抗金黄色葡萄球菌菌落数统计表
表2.表面接枝改性纳米细菌纤维素的抗金黄色葡萄球菌菌落数结果总结
表1和表2结果显示F=2.9>1.5,实验判定为有效;功能化纳米细菌纤维素湿态膜A=4.89>2,抑菌率=99.999%>99%;功能化纳米细菌纤维素冻干膜A=3.15>2,抑菌率=99.93%>99%,表明接枝改性后的纳米细菌纤维素材料具有良好的抗菌效果。
实施例3
按照以下步骤制备25倍稀释度的原60%N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液改性剂,改性制备类壳聚糖抗菌纳米纤维素:
(1)添加10片直径1.5cm的纳米细菌纤维素湿态膜片至10mL超纯水中,分别25℃和60℃温度的水浴锅中以20rpm的速度搅拌;
(2)向体系中添加分别添加184μL的60%质量比的N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液;
(3)滴加冰醋酸调至pH4.0,60℃,20rpm持续搅拌反应48h;
(4)收集反应后的纳米细菌纤维素膜片,超纯水清洗3次,每次间隔4h,即得;
(5)部分放置在超纯水中,部分80℃烘干箱中烘干24h后保存。
实施例4
以原60%N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液稀释25倍稀释度的改性剂,分别在25和60℃条件下制得的纳米细菌纤维素材料为实验组(样品编号分别为25、25+60℃);以原60%N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液稀释100倍稀释度的改性剂在25℃条件下制得的纳米细菌纤维素材料为实验组(样品编号100);以玻璃板、空白24孔板、纯BC作为对照组;以L929小鼠成纤维细胞为实验细胞,以24孔板每孔10000个细胞的接种量开展MTT实验。
结果如图7所示:接种在天然纳米细菌纤维素上的细胞量随培养时间增长逐步增长,接种在改性纳米细菌纤维素材料上的细胞量同样随时间增长而增长,且增长趋势与天然纳米细菌纤维素保持一致,表明接枝改性后的纳米细菌纤维素材料无明显的细胞毒性。
实施例5
将2片直径约5cm的纳米细菌纤维素湿态膜片置于20mL超纯水中,在25℃水浴锅中以20rpm的速度搅拌;加入N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液至终浓度为3.1×10-3mmol/L;滴加冰醋酸调至pH4.0,持续搅拌反应48h;反应结束后取出纳米细菌纤维素膜片,超纯水浸泡清洗3次,每次间隔4h,即得氨基化样品。
参照中国人民共和国国家标准GB/T 20994.2-2007《纺织品抗菌性能的评价第2部分:吸收法》对制备的氨基化纳米细菌纤维素湿膜和未改性的对照膜进行抗金黄色葡萄球菌检测实验。将菌体与膜样品接触暴露后振荡洗脱,依该洗脱液中的菌数计算出样品菌量下降百分率。具体步骤如下:
将改性纳米细菌纤维素膜以及两片对照膜(未改性膜)分别平放在3个无菌250ml带塞广口瓶底部。在膜表面滴加0.1ml菌液(菌液不可接触瓶壁)。向一个盛有对照膜的广口瓶中加入10ml 0.03mol/L的PBS,放置5min,用手摇晃30s(摆幅约30cm)将细菌洗下,做梯度稀释(一般为三个梯度的浓度稀释)后,取0.1ml涂布在琼脂平板(一个稀释度制作两块平板),37℃下培养24h,计数菌数。另一片对照样和改性纳米细菌纤维素膜试样塞紧塞子,防止蒸发,室温暴露18h。暴露后,也将细菌洗下,做梯度稀释,涂板,37℃下培养24h,计数菌数。
计数出现30-300个菌落平皿上的菌落数(Colony forming units,CFU)。若最小稀释度倍数的菌落数<30,则按实际数量记录;若无菌落生长,则菌落数记为“<1”。
细菌增长值F的计算:F=lgCt-lgC0
判断试验是否有效,看细菌在空白对照样品上的生长值F>1.5,就可以判定试验有效性。抑菌率A计算:A(%)=100×(Ct-Tt)/Ct
C0:对照样接种后立即洗下培养测得的细菌数的平均值;
Ct:对照样接种并培养18小时后洗下培养测得的细菌数的平均值;
Tt:抗菌BC膜试样接种并培养18小时后洗下培养测得的细菌数的平均值。
抗菌效果的评价:当抑菌率A大于等于90%,样品具有抗菌效果。当抑菌率A大于等于99%,样品具有良好的抗菌效果。
购买新鲜猪肉,切成适当大小,采取“馍夹肉”的方式将纳米细菌纤维素膜材料与鲜肉置于冰箱4℃环境中保藏6天。每天观察肉质颜色和气味变化,并取肉1g用9mL无菌水清洗肉表面,洗水经梯度稀释后涂布于琼脂平板培养测量肉表面活菌总数。未氨基化改性的纳米细菌纤维素膜,以及与壳聚糖交联的纳米细菌纤维素复合膜被作为对照样品参与测试实验,实验结果见表3,图8和图9。
表3 4℃保藏条件下三种BC样品对猪肉气味及组织弹性的影响
由表3可知,未改性纳米细菌纤维素包裹的猪肉在冷藏的头2天,肉味正常且组织弹性未受影响,但从第3天起肉味变淡,且组织弹性出现变化,指压后形态恢复缓慢;第4天起出现异味且弹性消失。壳聚糖与BC交联的复合膜与纯BC膜相比,未显示出抗菌保鲜作用,同样是在第3天起肉味变淡,且组织指压后形态恢复缓慢。而经氨基接枝改性的BC膜则显示很好的抗菌保鲜效果,从第4天起才开始出现肉味变淡,以及组织弹性变差的现象;第6天才出现异味,比未改性BC的保鲜时间延长了2天。
图8的结果显示未改性BC膜和壳聚糖交联BC复合膜包裹的猪肉的鲜红色都比氨基接枝改性的BC膜褪色要早(由于照相机CCD的原因以及光线的影响,照片上的颜色比肉眼所见的颜色有些失真)。
图9结果表明保藏的前两天,3种BC膜在是否能抑制生肉表面细菌繁殖方面,分不出差异。第3天的样品洗脱液经稀释十万倍时,能够看出氨基接枝BC膜有明显的抑菌效果。但是随着时间的延长,细菌增殖加快,菌体数量呈指数级增长,氨基接枝BC膜与其它膜的差异在缩小。可喜的是在第5天时,仍能看出由改性膜包裹的生肉洗脱下的液体,培养出的菌落少于另外两种BC膜。
由以上结果可知,以N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵为改性试剂,通过室温下的一步法反应在BC膜中成功接上氨基,通过金黄色葡萄球菌的抗菌实验证明氨基化改性使纯纳米细菌纤维素获得了良好的抗菌效果。通过评价该膜材料在生鲜猪肉上的保鲜效果可知,相对于纯BC和壳聚糖交联BC,该膜有更好的保鲜效果,在6天内能使鲜肉保持鲜红的色泽,对鲜肉表面活菌有明显的抑制作用,表明该改性膜具有很好的实际应用前景。
Claims (7)
1.一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,包括:
将纯化的纳米细菌纤维素水凝胶加入到N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液中,pH调节至2.0~7.0,5~95℃均匀反应,清洗,即得到类壳聚糖抗菌纳米纤维素;其中,纳米细菌纤维素水凝胶加入到N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液中后,N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵的浓度为6.2×10-5mmol/L–6.2mmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,其特征在于,所述N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵溶液中N,N-二甲基-N-[3-(三甲氧硅)丙基]氯化十八烷基铵的质量分数为1~100%;溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、丙酮或石油醚。
3.根据权利要求1所述的一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,其特征在于,所述pH调节方式为:用冰醋酸、柠檬酸、硫酸、盐酸或磷酸调节。
4.根据权利要求1所述的一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,其特征在于,所述均匀反应采用搅拌或震荡。
5.根据权利要求1所述的一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,其特征在于,所述清洗为去离子水反复冲洗。
6.根据权利要求1所述的一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,其特征在于,所述类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素,部分浸泡于去离子水中存放于4℃冰箱中,部分采用冷冻干燥,部分80℃烘干箱中烘干24h后保存。
7.根据权利要求1所述的一种类壳聚糖抗菌纳米细菌纤维素的制备方法,其特征在于,所述类壳聚糖抗菌纳米纤维素应用于抗菌包装和鲜肉制品保鲜。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160824 |