CN111471199A

CN111471199A - 基于细菌纳米纤维素的食品包装膜的制备方法

Info

Publication number: CN111471199A
Application number: CN202010310983.4A
Authority: CN
Inventors: 钟建江; 魏鹏飞; 冯利芳; 周亚琴; 步国建
Original assignee: Jiangsu Donghui Biotechnology Co ltd; Shanghai Dongzhihui Biotechnology Co ltd; Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Jiangsu Donghui Biotechnology Co ltd; Shanghai Dongzhihui Biotechnology Co ltd; Taixing Dongsheng Bio Tech Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2020-07-31

Abstract

一种基于细菌纳米纤维素的生物包装膜的制备方法，以从诱变筛选的木葡糖酸醋杆菌发酵获得的细菌纳米纤维素、淀粉、山梨醇和甘油为基础原料，经加水混合制成成膜液并进一步糊化后添加生物活性组分，通过涂覆晾干后即得到生物包装膜。本发明能够大幅度降低BC用量且保持膜的可生物降解、可食用性、增强生物功能，制备得到的包装膜不但具有较好的强度、拉升度、可生物降解、具抗菌等生物活性功能，而且性价比高、食品包装应用面大，为实现BC包装膜的商业应用奠定扎实的基础。

Description

基于细菌纳米纤维素的食品包装膜的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程和食品领域的技术，具体是一种通过使用从木葡糖酸醋杆菌发酵获得的细菌纳米纤维素(BC)以及其它食品添加物，制备获得廉价、可食用的、具有生物活性功能的食品包装膜的方法。

背景技术

细菌纳米纤维素(Bacterial cellulose,BC)是一种由木醋杆菌等细菌发酵合成的多孔网状胞外多糖类生物大分子聚合物，与植物纤维相比，它具高持水性、高结晶度、高抗张强度及优良的生物亲合性、生物相容性、生物适应性和生物可降解性等优点。近年BC在医疗、食品、化妆品等领域的应用前景受到全世界的广泛关注。中国专利文献号CN108570156A公开了一种蔬菜味细菌纤维素可食用调料包装膜及其制备方法和应用，使用了市购的细菌纤维素，成本较大，且该包装膜缺乏生物活性功能。中国专利文献号CN106633127A，公开了一种细菌纤维素-茶多酚复合膜在食品保鲜中的应用，但是其细菌纤维素的用量大、成本高，制备的具抗菌作用的包装膜的应用前景欠佳。

但是，至今BC的来源依赖于微生物发酵，由于其生产效率低、大规模发酵受到种子细胞扩种的制约，所以，目前的BC生产成本高，由它来制造食品包装膜存在成本昂贵、难以商业化的困境。所以，如何降低BC使用量并增加包装膜的附加值，直接关系到其市场竞争力，对于BC包装膜的商业化非常关键。

发明内容

本发明针对现有BC发酵产量较低、实际制膜的BC用量较高，造成膜制造成本较大，以及常规食品包装膜的生物可降解性较差、生物活性功能不足等问题，提出了一种基于细菌纳米纤维素的食品包装膜的制备方法，基于从木葡糖酸醋杆菌高产菌来发酵获得BC并用以制备生物包装膜，能够大幅度降低BC用量且保持膜的可生物降解、可食用性、增强生物功能，制备得到的包装膜不但具有较好的强度、拉升度、可生物降解、具抗菌等生物活性功能，而且性价比高、食品包装应用面大，为实现BC包装膜的商业应用奠定扎实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于细菌纳米纤维素的食品包装膜的制备方法，以从诱变筛选的木葡糖酸醋杆菌发酵获得的细菌纳米纤维素、淀粉、山梨醇和甘油为基础原料，经加水混合制成成膜液并进一步糊化后添加生物活性组分，通过涂覆晾干后即得到生物包装膜。

所述的基础原料，其具体组分及在成膜液中的重量百分比含量为：细菌纳米纤维素BC0.5-3％(w/v)、淀粉5-20％(w/v)、山梨醇0.5-3％(w/v)、甘油0.5-3％(w/v)。

所述的细菌纳米纤维素，具体为木葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter xylinusTDS-114，于2020年3月30日保藏于中国普通微生物保藏中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCCNo.19536，该木葡糖酸醋杆菌来自诱变筛选的高产菌株，经从葡萄中分离筛选以及使用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)的诱变分离获得。

所述的摇瓶发酵，包括先采用pH为5.0的种子培养基进行100rpm转速动态培养，再采用pH为5.0的发酵培养基进行发酵培养。

所述的种子培养基，pH为5.0，组分及每升含量为：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 6.8g/L、一水合柠檬酸1.15g/L，余量为水。

所述的发酵培养基，pH为5.0，其组分及每升含量为：蔗糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 3.3g/L、KH₂PO₄ 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.25g/L、玉米浆5％(v/v)，余量为水。

所述的成膜液中的细菌纳米纤维素，优选经摇瓶发酵后加入碱性试剂并进行破碎碱煮处理后得到。

所述的碱性试剂，采用但不限于NaOH。

所述的破碎碱煮处理具体为：将摇瓶发酵后得到的发酵液经过10000rpm离心5-10min，水洗2次后，每瓶样品加200mL 0.4％NaOH，用手持式搅拌器破碎均质；破碎后的BC碱溶液于80-100℃、碱煮20-30min；碱煮后的产物于漏斗中过滤、水洗至中性。

所述的淀粉、山梨醇、甘油为市售食品级。

所述的生物活性组分为壳聚糖、ε-聚赖氨酸及中草药提取液，其组分及含量优选为：壳聚糖0.05-1.5％、ε-聚赖氨酸0.01-1％、甘草提取液5-15％、肉桂提取液5-15％。

所述的壳聚糖和、ε-聚赖氨酸优选采用食品级。

所述的涂覆晾干是指：将糊化的成膜液倒于有机玻璃板上，用刮膜器刮膜，保证膜面厚度适中，均匀透明；涂抹后静置并自然晾干，揭膜。

本发明涉及上述方法制备得到的生物包装膜，其自动杨氏弹性模量为200MPa以上、最大应力6N以上、位移拉伸应变10％以上、抗拉强度12MPa以上，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌具有抑制作用；整个BC膜具有完全可生物降解性、可食用性。

技术效果

本发明整体所解决的技术问题是：BC复合膜具有完全的可食用性、适合于食品包装，其强度和抗拉伸应变接近或高于常规包装纸，并且其制造原料廉价、具有工业实用价值。

与现有技术相比，本发明在BC淀粉膜基础上、添加生物活性成分，通过成分优化，使制得的膜完全可生物降解、可食用、具生物活性功能的特点，并且维持了膜的拉伸和强度，满足食品包装要求。由于本发明BC用量低且来自高产发酵菌株、整体BC膜制造的材料成本低廉，制作工艺简单，制得的BC复合膜的强度和抗拉伸应变这些关键指标接近或高于常规包装纸，可望具有良好的商业应用前景。

附图说明

图1为实施例制备得到BC抗菌复合膜示意图；

图中：a-f依次为；壳聚糖005％、壳聚糖0.1％、壳聚糖0.5％、ε-聚赖氨酸0.02％、ε-聚赖氢酸0.05％、ε聚赖氨酸0.1％；

图2为实施例中含中草药成分的BC复合膜示意图；

图中：a-f依次为:甘草3％、甘草5％、甘草10％、肉桂3％、肉桂5％、肉桂10％；

图3为实施例中添加壳聚糖、ε-聚赖氨酸或甘草提取液的BC复合膜对细菌的抑制作用示意图；

图中：a-e依次为：B.枯草芽孢杆菌(subtilis 168)/壳聚糖膜、B.subtilis 168/8-聚赖氨酸膜、E.coli/壳聚糖膜、E.coli/ε-聚赖氨酸膜、B.subtilis 168/甘草膜；

图4复配抗菌剂复合BC膜抗菌实验示意图；

图中：a为B.subtilis 168，b为大肠杆菌(E.coli)，1为壳聚糖0.03％(0.3g/L)；2为聚赖氨酸0.01％(0.1g/L)，3为壳聚糖0.03％(0.3g/L)+聚赖氨酸0.01％(0.1g/L)复合，4为甘草提取液3％(30ml/L)+聚赖氨酸0.015％(0.15g/L)，5为肉桂提取液3％(30ml/L)+聚赖氨酸0.015％(0.15g/L)；

图5为实施例中BC复合膜对食源病原菌的抑菌效果示意图；

图中：a、b、c分别是壳聚糖、聚赖氨酸、甘草提取液的BC复合膜对副溶血弧菌的抑菌图。

具体实施方式

实施例1

本实施例涉及BC抗菌复合膜的制备方法，具体包括：

①成膜液制备：依次称取成膜液成分(w/v)淀粉10％、细菌纳米纤维素1％、山梨醇1％、甘油2％后，混合配制成成膜液，其中的细菌纳米纤维素，具体为木葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter xylinus TDS-114，于2020年3月30日保藏于中国普通微生物保藏中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No.19536，该木葡糖酸醋杆菌来自诱变筛选的高产菌株，经从葡萄中分离筛选以及使用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)的诱变分离获得。

②成膜液处理：得到成膜液在恒温磁力搅拌器上(85-2，上海驰久)于90℃搅拌糊化30min；

③抗菌剂添加：糊化后的成膜液加入不同的抗菌剂：壳聚糖(食品级，河南万邦实业有限公司)0.05-0.5％，或ε聚赖氨酸(食品级，郑州康本生物科技有限公司)0.02-0.5％，或壳聚糖0.03％+ε聚赖氨酸0.01％；继续搅拌均匀；

④涂膜制膜：将糊化的成膜液倒于有机玻璃板上用刮膜器(KTQ可调式涂膜器，上海久然仪器设备有限公司)缓慢匀速刮膜，保证膜面厚度适中(刮膜器调节1mm)，均匀且透明(含甘草、肉桂等膜颜色为相应中药颜色)，涂抹后静置15min，自然晾干约24h，揭膜。

本实施例按上述制膜方法得到BC抗菌复合膜，结果如图1测定抗菌复合膜的机械性能，结果见表1，结果显示，与市场上常见的3种不同代表类型的包装膜相比，实验室所制部分复合膜拉伸应力差异不大；杨氏模量较市售包装膜小很多，但实验室所制复合膜拉伸应变明显大于市面商用包装膜。

不同抑菌剂含量对复合膜的机械性能也有一定的影响，主要表现在杨氏模量有较明显的差异，从不同含量的ε-聚赖氨酸对复合膜的影响结果可知，抗菌剂含量越高，其对应的杨氏模量越高，拉伸应力存在同样的规律。

表1BC抗菌复合膜的机械性能

实施例2

本实施例涉及含中草药成分的BC复合膜的制备方法，具体包括：

步骤1)中草药提取液的制备，具体包括：

①将购自市场的200g甘草、肉桂(淘宝采购)置于60℃烘箱干燥至恒重；

②将烘干恒重的甘草、肉桂等粉碎研磨，称取粉末50-150g；

③按照料液比1:10的比例加入500mL的95％乙醇，浸泡并超声(SK300B，上海科导超声仪器有限公司)处理2-4h；

④用200目筛子过滤并分别收集滤液和滤渣，滤液存储备用；

⑤再在收集到的滤渣中加入200-500mL的95％乙醇，浸泡并超声处理2-4h；

⑥过滤并收集滤液；

⑦合并两次收集到的滤液(甘草1.3L\肉桂1L)，在旋转蒸发仪(RE-52AA，上海亚荣生化一起厂)中50℃减压蒸发浓缩，甘草液浓缩至140ml以下，肉桂液浓缩至120ml以下；

⑧收集浓缩液，用无水乙醇分别定容至甘草浓缩液140ml，肉桂浓缩液120ml，即得到浓度为1g/ml的甘草提取液，放4℃冰箱保存备用。

步骤2)成膜液制膜，具体包括：

①成膜液制备：依次称取(w/w)：淀粉(郑州苍宇食品化工有限公司)10％、BC干重1％、山梨醇(国药)1％、甘油(国药)2％后，配制成成膜液；

②成膜液处理：得到成膜液于90℃糊化30min；

③抗菌剂添加：糊化后的成膜加入不同的中草药提取物5-20％，或甘草提取物3％+ε聚赖氨酸0.015％，或肉桂提取物3％+ε聚赖氨酸0.015％；继续搅拌均匀；

④涂膜制膜：将糊化的成膜液倒于有机玻璃板上用刮膜器刮膜，保证膜面厚度适中，均匀且透明，涂抹后静置15min，自然晾干，揭膜。

本实施例按上述制膜方法得到含中草药成分的BC复合膜，如表2测定其机械性能所示示，与市场上常见的3种典型的包装膜相比，所制备的BC复合膜，其弹性模量较小，但是其拉伸应力、最大力均优于市售包装膜，具有实际可应用的潜力。

表2含中草药成分的BC复合膜的机械性能

效果评价

BC复合膜的抑菌效果评价：采用透明圈抑菌实验方法，试验菌株为大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌168，具体包括：

①菌液制备：将新鲜斜面菌种大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌168用LB培养基37℃、220rpm过夜培养。测OD₆₀₀，稀释为OD₆₀₀为0.05(大约4×10⁸cfu/mL)的菌悬液备用；

②裁膜：将制好的成膜用打孔器裁成直径为16mm的均匀小圆片；

③杀菌：将裁剪好的成膜置于超净工作台紫外灭菌30min(正反面各照射15分钟)；

④涂膜菌液：将提前准备好的菌液用涂布棒均匀涂布于平板上；

⑤贴膜：用镊子将裁好的BC/淀粉抗菌复合膜及对照膜贴在平板上；

⑥平行实验：为保证实验的可靠性，每个BC膜或对照条件、均有3个重复；

⑦培养与观察：将平板置于37℃培养箱中静置培养，观察并拍照记录。

平板抑菌圈法实验结果如下图3所示：添加壳聚糖和ε-聚赖氨酸抑菌剂的BC复合膜对大肠杆菌具有明显的抑菌作用(图3c、d)；而甘草或肉桂提取液的BC复合膜对大肠杆菌没有抑制作用。壳聚糖、ε-聚赖氨酸类BC复合膜对枯草芽孢杆菌有抑菌作用(图3a、b)，抑菌效果随抑菌剂浓度的增大而增加；15％的甘草提取液-BC复合膜对枯草芽孢杆菌表现出抑菌作用(图3e)。

观察添加ε-聚赖氨酸抑菌圈，当ε-聚赖氨酸添加量为1％时，抑菌效果明显，抑菌环大小约20mm；

观察添加壳聚糖的抑菌圈，壳聚糖添加量为1％和1.5％均有明显的抑菌效果，壳聚糖添加量为1％时，抑菌环的大小约为27.5±2.5mm，壳聚糖添加量为1.5％时，抑菌环的大小约为32±2mm，抑菌效果明显(表3)。

甘草和肉桂提取液虽然对大肠杆菌的抑菌效果不显著，但是它们属于中草药成分、具有降血压、滋阴益气、补肾健脾、温通心阳等其它生物活性功效。较高用量的甘草提取液，其BC复合膜对枯草芽孢杆菌具有抑菌效果(图3e)。

图4为复配抗菌剂的BC复合膜的抗菌实验结果：壳聚糖0.03％、聚赖氨酸0.01％以及两者复合、甘草提取液3％+聚赖氨酸0.015％复合对枯草168都表现出一定的抑制作用。但对大肠杆菌均未见抑菌作用。

表3BC复合膜对细菌的抑制作用

	壳聚糖(1.0％)	壳聚糖(1.5％)	ε-聚赖氨酸(1.0％)
				大肠杆菌	27.5±2.5mm	32±2mm	20±0.2mm
枯草芽孢杆菌	18.5±0.5mm	19.2±0.5mm	20.5±0.5mm

BC复合膜对食源病原菌的抑制作用评价：

①食品致病菌的菌液制备：将新鲜斜面菌种沙门氏菌ATCC13076、金黄色葡萄球菌ATCC25923、致病性大肠杆菌0157、副溶血弧菌ATCC33896分别用LB培养基37℃、220rpm过夜培养。测OD₆₀₀，稀释为OD₆₀₀为0.05的菌悬液备用。

②裁膜：将制好的成膜用打孔器裁成直径为6mm的均匀小圆片；

⑦培养与观察：将平板置于36℃培养箱中静置培养，观察并拍照记录。

依据上述操作步骤进行了抑菌实验，结果如图5所示，壳聚糖、ε聚赖氨酸和甘草提取液这三种BC复合膜，均对副溶血弧菌ATCC33896有抑菌作用，浓度越大抑菌效果越明显，而对其他三种食源致病菌未观察到明显抑菌作用。

与现有技术相比，本发明利用了BC复合膜的物理性能较佳，在拉伸度和抗拉强度优于在食品行业使用的包装纸或包装袋且具有良好的抗菌生物活性的特点，制备得到的BC复合膜的弹性模量(自动杨氏)200MPa以上、最大应力6N以上、拉伸应变(位移)10％以上、抗拉强度12MPa以上，对枯草芽孢杆菌等具有抑制效果；整个BC膜具有完全可生物降解性、可食用性的特点。所以，本发明的BC复合膜具有在食品包装、特别是即食快餐等行业应用的良好潜力。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims

1.一种基于细菌纳米纤维素的生物包装膜的制备方法，其特征在于，以从诱变筛选的木葡糖酸醋杆菌发酵获得的细菌纳米纤维素、淀粉、山梨醇和甘油为基础原料，经加水混合制成成膜液并进一步糊化后添加生物活性组分，通过涂覆晾干后即得到生物包装膜；

所述的细菌纳米纤维素，具体为木葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter xylinus TDS-114，于2020年3月30日保藏于中国普通微生物保藏中心(CGMCC)保藏，保藏编号CGMCCNo.19536。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的基础原料，其具体组分及在成膜液中的重量百分比含量为：BC 0.5-3％(w/v)、淀粉5-20％(w/v)、山梨醇0.5-3％(w/v)、甘油0.5-3％(w/v)。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的摇瓶发酵，包括先采用pH为5.0的种子培养基进行100rpm转速动态培养，再采用pH为5.0的发酵培养基进行发酵培养。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的种子培养基的组分及每升含量为：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 6.8g/L、一水合柠檬酸1.15g/L，余量为水；

所述的发酵培养基的组分及每升含量为：蔗糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 3.3g/L、KH₂PO₄ 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.25g/L、玉米浆5％(v/v)，余量为水。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的成膜液中的细菌纳米纤维素，经摇瓶发酵后加入碱性试剂并进行破碎碱煮处理后得到。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的生物活性组分为壳聚糖、ε-聚赖氨酸及中草药提取液。

7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征是，所述的生物活性组分的组分及含量优选为：壳聚糖0.05-1.5％、ε-聚赖氨酸0.01-1％、甘草提取液5-15％、肉桂提取液5-15％。

8.根据权利要求1～7中任一所述的制备方法得到的对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌具有抑制作用的生物包装膜，其特征在于，自动杨氏弹性模量为200MPa以上、最大应力6N以上、位移拉伸应变10％以上、抗拉强度12MPa以上。