KR20150016233A

KR20150016233A - 핵산 추출 방법

Info

Publication number: KR20150016233A
Application number: KR1020147031350A
Authority: KR
Inventors: 벤 콥
Original assignee: 에피스템 리미티드
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2015-02-11
Also published as: IL235325A0; BR112014028123A2; WO2013175188A1; EP2855677A1; US20150344870A1; JP2015518720A; CN104334726A; CA2873183A1; ES2618925T3; GB201209229D0; AU2013264984A1; JP6182599B2; RU2014152827A; RU2617947C2; EP2855677B1; MX2014013392A; SG11201406962YA

Abstract

생물 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법과 장치를 기술한다. 본 장치는 살생물제의 상기 기질과의 결합에 관여하는 결합 모이어티; 소수성 모이어티; 및 하전된 모이어티를 포함하는, 복수의 관능기를 가진 살생물제로 관능화된, 셀룰로스 필터와 같은 기질을 포함한다. 다양한 관능기들은, 기질에 살생물제를 결합시켜, 샘플의 세포벽 또는 세포막을 약화 또는 용해하며, 기질 상에 핵산을 유지시킨다. 바람직한 살생물제는 실릴화된 4급 암모늄 화합물 (SiQAC), 예를 들어 3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드이다.

Description

핵산 추출 방법 {NUCLEIC ACID EXTRACTION}

본 발명은 생물 샘플, 주로 세포성 물질을 포함하는 생물 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법과 그 산물에 관한 것이다. 본 발명의 측면들은 또한 핵산 증폭을 위한 생물 샘플들로부터 핵산을 준비하는 방법에 관한 것이다.

핵산 증폭 기법을 이용하는 진단 방법의 한가지 주된 문제점은 증폭 공정 전에 핵산을 추출하기 위해 세포성 물질을 전처리한다는 것이다. 실리카 기반의 기술과 자기 비드를 이용하는 기술은 비효율적이며 (≤10%), 특정 타겟 타입에 대한 최적화가 필요하며; 동일 공정이 일반적으로 다른 타입의 샘플들에는 상용적이지 않다. 페놀 클로로포름을 이용하는 고수율의 공정도 구성 성분들의 독성으로 인해 적합하지 않다. 디터전트를 이용하는 방법은 간단한 세포 용해 (lysis) 공정을 제공해주지만, 높은 온도가 요구되며, 역전사효소는 열에 안정하지 않으므로 싱글 스텝 RT-PCR에서는 사용할 수 없다.

현행 방법들은 다른 세포성 물질로부터 핵산을 정제된 형태로 분리하는 것을 포함한다. 이는 일반적으로 라이소자임과 같은 효소 또는 디터전트를 이용하여 세포를 파괴하는 과정을 요구한다. 미코박테리움은 세포 파괴를 위해 유해한 NALC-NaOH의 전처리가 필요하다. 단백질은 적절한 프로테아제 (예, 프로테아제 K)를 이용하여 분해함으로써 제거된다. 핵산은 지지체 수지 또는 하전된 기질 (예, 자가 입자)에 결합시켜, 세척한다. 핵산은 하전된 지지체로부터 pH 변화를 통해 적절한 완충제로 방출된다. 이로써 고순도의 핵산이 수득된다.

예를 들어, Cepheid, Enigma Diagnostics, Roche, Geneprobe, BD 등의 당해 기술 분야의 시스템들은, 이러한 통상적인 실험실의 핵산 추출 공정 전체를 진단 장치에 적용하고 있다. 하지만, 이것은 복잡하고, 비싸며, 특정 타입의 샘플에 대한 것이다.

본원에서는, 이러한 공정의 복잡성을 해결함으로써, 단순하고 일회성이며 실온에서 작동하는 페이퍼 기반의 시스템으로 PCR을 통해 증폭될 수 있는 핵산을 제공해 주며, 박테리아, 진균 및 바이러스 세포를 파괴할 수 있으며, 직접 PCR 분석용 용액으로 핵산을 방출하는 방법을 기술한다.

왓트만 사의 국제 특허 출원 WO00/62023과 WO02/16383에는, 코팅된 필터 매질을 이용하여 세포를 용해하고 핵산을 분리하는 방법이 개시되어 있다. 이 필터 매질은 FTA-처리된 니트로셀룰로스로서, 이것은 음이온성 디터전트, 예를 들어 SDS로 코팅되어 있다. 이러한 코팅은 세포를 용해하고, FTA-처리된 필터는 핵산을 흡착한다. 코팅은 필터에 공유 결합되어 있지 않으며, 세척을 통해 제거될 수 있다. 후속적인 처리 공정을 위해 핵산을 필터에서 해리시킬 수 있다.

3M 이노베이티브 프로퍼티즈 컴퍼니의 국제 특허 출원 WO2008/134464에는, 샘플에서 핵산을 분리하는데 사용하기 위한, 관능기가 부착된 기질, 세포 용해 (lysis) 물질, 매트릭스 물질 및 사카라이드가 개시되어 있다.

아카반-타프티의 미국 특허 출원 2007/0185322에는, 예비적인 세포 용해를 수행하지 않고도, 핵산을 해리시킬 수 있는 산성 용액과 고상 결합 물질의 사용을 포함하는, 샘플로부터 RNA를 추출하는 방법이 개시되어 있다. 핵산과의 결합을 위해 4급 암모늄 염을 사용하는 것이 언급되어 있다. 타크카넨 등의 미국 출원 2005/0042661에도, 세포로부터 핵산을 선택적으로 분리하기 위한 4급 암모늄 화합물의 사용이 개시되어 있다.

어피어텍스 AB의 국제 특허 출원 WO2004/087226 및 WO2006/071191과 힉스 등의 미국 특허 5,064,613에는 4급 암모늄 염을 포함하는 항미생물 조성물이 개시되어 있다.

본 발명의 제1 측면은, a) 세포막을 가진 세포성 물질, b) 세포벽을 가진 세포성 물질, c) 바이러스 외막을 가진 바이러스성 물질 또는 d) 바이러스 캡시드를 가진 바이러스성 물질을 포함하는 생물 샘플로부터 핵산을 준비하는 방법을 제공하며, 본 방법은 샘플을 기질과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 기질은 i) 세포막, 세포벽, 바이러스 외막 또는 바이러스 캡시드를 약화시키거나 또는 ii) 세포성 물질 또는 바이러스성 물질을 세포 용해 (lysis)할 수 있는, 살생물제로 관능화된 것이다.

본 방법은, 접촉 단계 이후에, 샘플을 가열하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 핵산 증폭 반응에 바로 투입될 수 있다. 가열 단계는 약화된 세포벽, 세포막, 바이러스 외막 또는 바이러스 캡시드를 용해하여, 핵산을 분리시킬 것이다. 만일 살생물제가 세포성 물질 또는 바이러스성 물질을 용해할 수 있다면, 가열 단계가 핵산 분리에 항상 필수적인 것은 아니다.

이런 방식으로, 본 방법은 후속적인 처리 공정을 위한 핵산을 생물 샘플로부터 신속하고 용이하게 준비하는 것을 가능하게 한다.

기질은, 바람직하게는 셀룰로스 물질이며; 예를 들어, 셀룰로스 필터 페이터 또는 셀룰로스 매트릭스이다. 셀룰로스 물질은 복합 페이퍼 (composite paper)일 수 있으며; 예를 들어, 복합 셀룰로스 페이퍼는, 페이퍼의 표면 상에 증착된 샘플로부터 액체와 저분자량 오염물 및 저해제를 제거하기 위해, 측방 유동 층 (lateral flow layer)을 포함할 수 있다. 셀룰로스는 살생물제가 부착될 수 있는 노출된 하이드록시 기들을 다수를 가지고 있어서 유리하다. 특정 구현예들에서, 셀룰로스 물질은 샘플에 대해 필요한 작용을 수행하기 위한 반응제들을 더 포함할 수 있으며; 예를 들어 샘플 세척을 위한 RNAse, 프로테아제 등을 더 포함할 수 있다. 바람직한 기질은 코튼 유래 셀룰로스 페이퍼이며, 특히 Hahnemuhle FineArt GmbH (독일) 사의 FP 2992 페이퍼이다.

다른 기질 물질, 바람직하게는, 노출된 하이드록시 기들을 가진 것도 사용할 수 있다. 예를 들어, 기질은 유리, 플라스틱 또는 이와 유사한 것일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 기질은 핵산 증폭 반응에 바로 투입될 수 있는 필터 페이퍼이지만, 다른 구현예들에서, 기질은 미세유체 채널 또는 반응 용기나 그외 컨테이너 형태를 취할 수 있으며, 생물 샘플이 기질을 통과하거나 기질에 수용될 수 있다.

살생물제는, 바람직하게는, 복수의 관능기를 포함한다. 관능기는, 바람직하게는, 기질로의 살생물제의 결합에 관여하는 결합 모이어티; 소수성 모이어티; 및 하전된 모이어티를 포함한다. 소수성 모이어티는 세포벽 또는 세포막과 상호작용하여 관통할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 소수성 모이어티는 알킬 체인, 예를 들어 C5-C30 알킬, 바람직하게는 C10-C20 알킬일 수 있다. 알킬 체인이 약한 세포벽을 통과함에 따라, 세포벽이 약화되고 천공이 발생된다. 하전된 모이어티는 바람직하게는 양으로 하전되어, 하전된 세포벽을 공격할 수 있으며, 세포막과의 접촉시 이온 흐름과 항상성을 교란하여 세포 파괴와 핵산 분비에 일조할 수 있다. 하전된 모이어티는 바람직하게는 4급 암모늄 기이다. 결합 모이어티는 하이드록시 기를 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 관능기는 바람직하게는 알킬 체인 (소수성 모이어티), 실릴 기 (결합 모이어티) 및 암모늄 클로라이드 기 (하전된 모이어티)이다.

바람직한 살생물제로는 실릴화된 4급 암모늄 화합물 (SiQACs)이 있으며, 특히 3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드 (3-TPAC)이다. 다른 살생물제로는 벤질 암모늄 클로라이드가 있다. SiQAC의 치사 작용 방식은 일반적으로 양으로 하전된 분자의 음으로 하전된 세포벽 상으로의 흡착, SiQAC 분자 상의 친지성 체인에 의한 세포막의 파괴, 및 막 통과 및 확산에 의한 세포 용해 발생에 의해 진행되는 것으로 보인다.

당업자들은 사용가능한 그외 적절한 살생물제들을 알 것이다. 특정 물질의 선택은 전술한 바람직한 관능기의 존재 및 의도한 생물 샘플의 특성에 따라 정해질 것이며 - 예를 들어, 처리할 샘플이 포유류의 세포 샘플인 경우, 세포벽 침투가 이루어지지 않으므로 다른 관능기가 적절할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 다른 살생물제의 예로는, 다음과 같은 것이 있다:

a) 텔레킬릭 (telechelic) 폴리(2-알킬-1,3-옥사졸린);

b) PEtOx를 통해 항미생물 DDA 기가 그래프트된 셀룰로스, 이는 접촉시 접근하는 미생물 세포를 사멸시킴 (Bieser et al (2011), Contact-Active Animicrobial and Potentially Self-Polishing Coations Based on Cellulose. Macromol. Biosci., 11, 111-121);

c) 사포닌, 이는 다수의 식물들에서 공통적인 스테로이드 또는 트리테르페노이드 글리코시드이며, 적혈구 막에 대해 세포 용해 작용을 가지는 것으로 오랜동안 알려져 있으며, 다수의 사포닌들은 항미생물성인 것으로 공지되어 있다 (Francis et al, British Journal of Nutrition (2002), 88, 587-605). 사포닌의 막 투과 특성에 대해서는 광범위한 연구가 수행되어 왔다. 이의 구조적으로 다양한 화합물들이 원생 동물을 사멸시키며, 항진균제 및 항바이러스제로서 작용하는 것으로 관찰되고 있다. 사포닌으로 처리하였을 때 인공막에서 80 Å의 기공이 형성되는 것에 반해, 인간 적혈구로부터 분리된 세포막에서는 40 - 50 Å의 기공이 발생된다 (Seeman et al. 1973 Structure of membrane holes in osmotic and saponin hemolysis. Journal of Cell Biology 56, 519-527).

이용가능한 그외 조성물에 대한 리뷰로, "용액 중의 표면 상의 항미생물 폴리머", Siedenbiedel and Tiller (2012) Polymers, 4, 46-71을 참조한다.

바람직하게는, 생물 샘플은 세포벽을 가진 세포성 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포성 물질은 박테리아 세포와 같은 원핵동물의 세포이거나, 또는 식물 또는 식물의 세포일 수 있다. 다른 예로, 생물 샘플은 세포막을 가지지만 세포벽은 없는 세포성 물질을 포함한다. 예를 들어, 세포성 물질은 포유류 또는 곤충 세포를 비롯한 진핵 동물의 세포일 수 있다. 다른 예로, 생물 샘플은 바이러스성 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 생물 샘플에서 핵산을 증폭하는 방법을 제공하며, 이 방법은, 본 발명의 상기 제1 측면에 따른 방법으로 핵산을 준비하는 단계, 및 준비된 핵산에 대한 핵산 증폭 단계, 바람직하게는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 증폭을 수행하는 단계를 포함한다.

증폭은 진단 목적으로 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, a) 세포막을 가진 세포성 물질, b) 세포벽을 가진 세포성 물질, c) 바이러스 외막을 가진 바이러스성 물질 또는 d) 바이러스 캡시드를 가진 바이러스성 물질을 포함하는 생물 샘플로부터 핵산을 준비하는 장치를 제공하며, 상기 장치는 i) 세포막, 세포벽, 바이러스 외막 또는 바이러스 캡시드를 약화시키거나 또는 ii) 세포성 물질 또는 바이러스성 물질을 세포 용해 (lysis)할 수 있는, 살생물제로 관능화된 기질을 포함한다.

기질은 바람직하게는 셀룰로스 물질이다.

특정 구현예들에서, 기질은 샘플 준비 카트리지 등에 통합될 수 있다. 즉, 본 장치는 기질 또는 기질의 일부를 수용하기 위한 반응 용기를 더 포함할 수 있다. 본 장치는 기질의 일부를 나머지 기질로부터 분리하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있으며; 샘플이 첨가되면 기질의 일부를 분리할 수 있으며, 이렇게 분리된 부분은 반응 용기에 도입하여 PCR에 사용할 수 있다.

도 1은 SiQAC 분자, 3-TPAC의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 SiQAC에 의한 셀룰로스의 관능화를 예시한 것이다.
도 3은 세포 상에서의 SiQAC의 작동 방식을 계략적으로 도시한 것이다.
도 4는 SiQAC로 처리한 혈액으로부터 플라스모디움 (Plasmodium) 종들의 검출을 도시한 것이다.
도 5는 마이코박테리움 DNA를 추출하기 위한 여러가지 페이퍼 처리 방법들을 비교한 것이다.
도 6은 임상 샘플에 대한 정확성 데이타를 도시한 것이다.
도 7은 기술된 공정을 이용하여 객담으로부터 추출된 여러가지 농도의 MTB에 대한 복수의 반복 실험들의 결과를 도시한 것으로, y 축은 피크 용융 온도이고, x 축은 피크 높이를 나타낸다.
도 8은 SiQAC 관능화된 페이퍼의 생산과 샘플 분석을 위한 최적화된 처리 공정 흐름도이다.
도 9는 전유 (whole dairy milk)로부터 미생물 DNA의 분리를 도시한 것이다.
도 10은 HIV 양성 혈장 샘플에서 수득된 핵산의 증폭을 도시한 것이다.
도 11은 증폭된 HIV 핵산으로부터 입수된 서열을 도시한 것이다.

본 발명은 일반적으로 다음과 같이 작동한다. 셀룰로스 필터 페이퍼와 같은 기질이 살생물제, 바람직하게는 SiQAC, 더 바람직하게는 3-TPAC로 관능화된다. 관능화된 기질은 PCR 반응에 사용하기 위해 세포성 샘플로부터 핵산을 추출하는 샘플 준비에 사용할 수 있다.

세포성 물질은 페이퍼의 상부 층 상에 증착된다. 액체는 페이퍼를 통해 흐르며, 세포성 물질은 표면 상에 포획된다. 액상과 임의의 저분자량 저해성 이온은 상기 관능화된 셀룰로스 표면 층 아래에 위치된 2차 측방 흐름 층으로 이산된다.

샘플내 미생물 세포 (또는 식물, 동물 또는 진균의 세포)는 SiQAC 관능화된 셀룰로스와 상호작용하여, 약화 및/또는 용해되며, 전형적으로 접촉한 지 5분 이내에 이의 세포성 내용물은 방출된다.

기질로부터 복합 파이퍼의 플러그를 적출할 수 있으며, 이를 10분 후 PCR 반응에 바로 투입할 수 있다. PCR에서의 첫 가열은 잔류하는 모든 세포들을 추가로 용해시켜, 추가의 핵산을 방출시키는데 사용될 수 있다.

SiQAC 분자 [3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드 (3-TPAC)]의 구조를 도 1에 도시한다. 3-TPAC는 1972년에 최초로 언급되었다 (Isquith et al (1972), Appl. Microbiol, 24:6 859-863, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC380687/pdf/applmicro00052-0033.pdf).

수많은 버전의 기본 화학제들이 존재하지만 (예, 벤질 암모늄 클로라이드 BAC), 모두 비슷한 주요 성분들을 공유한다: 암모늄 클로라이드 변형체 (활성형 항미생물), 결합제로서 규소 (실릴의 일부) 및 알칸 체인. 암모늄 클로라이드는 2개의 메틸기와 효율적으로는 2개의 장쇄 알킬기가 부착된 4급 암모늄기이다. 이의 양이온 기능은, 박테리아, 진균 및 바이러스의 막을 파괴하여, 핵산 함유물을 방출시키는, 항미생물 특성을 제공한다. 소수성 알칸 체인은 세포벽을 통과한다. 트리메톡시실릴기는 활성형 하이드록시 기를 경유하여 분자를 기질 (예, 셀룰로스)에 결합시킨다.

4급 암모늄 화합물은 박테리아, 진균 및 외막형 바이러스 등의 매우 다양한 유기체에 치사성이며, 내생포자, 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 비-외막형 바이러스에 대해서도 정도는 덜하지만 치사성을 나타낸다. 다수의 살생물성 폴리머는 4급 암모늄 기를 가지는 것으로 알려져 있다. 4급 암모늄 (QA) 화합물은 의학 및 공중 보건적인 용도로 가장 널리 사용되는 항세균제에 속하며, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 모두에 유효한 것으로 알려져 있다 (Tashiro (2001) Macromol. Mater. Eng.; 286, 63-87).

QA 기를 가진 양이온성 폴리머는 일반적으로 이의 대응되는 저분자량 모노머 보다 높은 항미생물 활성을 나타낸다 [Ikeda and Tazuke, 1983, Makromol. Chem., Rapid Commun. 4 (1983) 459-461]. 이러한 높은 활성은, 폴리머의 높은 전하 밀도로 인한, 세포와 폴리머 사이의 높은 정전기적 인력에 기인한 것이다.

SiQAC는 2 단계 공정으로 작동한다. SiQAC 상의 양으로 하전된 부분이 미생물의 음으로 하전된 세포벽을 끌어당긴다. 먼저, 소수성 알킬 체인이 유기체의 유사한 소수성의 세포벽에 침투하여 접촉하게 된다. 알킬 체인이 약한 세포벽을 침투함에 따라, 세포벽은 약화되고, 천공이 발생되게 된다. 이차적으로, 양이온성의 4급 암모늄 기가 세포벽과 접촉함에 따라, 이온 흐름이 파괴되고, 세포벽의 안으로 또는 밖으로의 누출이 야기되며, 이로써 통상적으로 이온 조건에 따라 세포 내용물의 유실 또는 버스팅 (bursting)이 발생한다. 하전된 4급 암모늄 알킬기는 변하지 않고 유지되므로, 이를 이용하여 공정을 무한히 반복할 수 있다.

"물리적" 및 "전기적" 사멸 기전으로 인해, 미생물은 SiQAC에 대한 저항성 또는 면역성을 발현할 기회를 갖지 못한다.

4급 암모늄 화합물은 소독제, 살균제, 약제학적 산물 및 화장품에 널리 사용되고 있으며, 과일 및 채소 소독의 대안제일 수 있다. 모든 4급 암모늄 화합물들 (QACs)은 기본 구조 (NH4+)를 가진 양이온성 화합물이다. 이들 화합물은 박테리아 세포벽에 침투하여, 세포질 막과 반응함으로써 자가분해성 효소에 의한 세포벽 용해를 유도한다 (McDonnell, G. & Russell, A. D. 1999 Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance. Clinical Microbiology Reviews 12, 147-179).

트리메톡시실릴 기는 유리 및 코튼 등의 표면의 하이드록시 기와 반응하여, 표면에 QA 화합물을 보유한 공유 결합을 형성하며, 물에 용해되지 않게 한다. 또한, 트리메톡시실릴 기는 상호 반응하여, 처리된 표면과 결합된 고도로 안정한 가교된 실란 코팅을 형성할 수도 있다. 이들 코팅제들은 주변 환경으로 화학제를 방출하지 않고도 다수의 사례들에서 표면에 살생물 활성을 부여한다는 것이 입증된 바 있다 [Isquith et al, 1972; Isquith et al, 1973 U. S. Patent 3,730,701; Speier and Malek, 1982 J of Colloid and Interface Science 89, 68; Walters et al., 1973, J., Appl. Microbiol. 25, 253].

이들 코팅제들은 살진균제 및 항세균제와 같이 매우 효과적이지만, 포자에 대해서는 효과가 없다.

도 2는 셀룰로스의 SiQAC 분자, 3-TPAC를 이용한 관능화를 예시한 것이다. 비-변형 천연 셀룰로스에서, X는 다수의 펜던트 하이드록시 (OH) 기를 형성하는, 수소를 나타낸다. 신속한 첫 단계에서, 분자와 하이드록시 기 사이에 결합이 이루어져 실릴 에테르가 형성된다. 더 느린 2번째 단계에서는, 인접한 다이메톡시실릴 기들 간에 가교되어, 기질 표면과 평행하게 배열된 랜덤 실리콘 에테르 폴리머가 형성된다.

양이온성 모이어티는 표면과의 결합에 한 부분으로 작용하진 않지만, 여전히 기질 표면과의 결합에 이용될 수 있다. 이의 구조는 다이데실다이메틸암모늄 클로라이드 (DDAC)가 전형적인 일 예인 국소 살균제로 알려진 4급 암모늄 화합물과 유사한다.

SiQAC 분자가 기질 표면에 결합하는 기전은 폴리에텐을 가교하여 PEX를 형성하는 기전과 화학적으로 유사하다.

도 3은 SiQAC로 관능화된 셀룰로스의 작용 방식을 보여주는 계략적인 도표이다. SiQAC 체인이 셀롤로스 파이버에 결합하고, 배향 (orientation) 및 가교되어 (A로 표시됨), 활성 층이 형성된다. 소수성 알킬 체인 (B로 표시됨)이 비슷한 소수성의 미생물 세포벽으로 침투한다. 알킬 체인이 약한 세포벽을 침투함에 따라, 세포벽은 약화되고, 천공이 발생된다. 그런 후, 양이온성 4급 암모늄 기 (C)가 세포벽과 접하게 되고, 이온 흐름이 교란되며, 세포벽 안으로 또는 바깥으로의 누출이 야기됨으로써, 통상적으로 세포는 자신의 내용물을 유실하거나 또는 이온 환경에 따라 세포는 완전히 버스팅된다. 약화된 상태에서는, 세포벽의 신속한 건조 과정이 더욱 세포벽을 약화시키게 되어, PCR의 사이클링 초기에, 핵산 물질이 용액으로 방출되어 PCR을 통해 증폭되게 된다.

따라서, SiQAC 분자의 작용 방식에는 다수의 개별 인자들이 참여한다. 알킬 체인에 의해 세포질과 외막 지질 이중층 및 세포벽에 교란이 발생되어, 세포질 물질의 광범위적이고 점진적인 누출이 이루어지며, 이로써 일부 또는 전적으로 주변 용액의 이온 강도에 따라 세포는 용해된다. 이는, 음으로 하전된 막 인지질과 조합되는, 양으로 하전된 암모늄 기에 의해 증대된다. 심지어 활성 성분의 농도가 낮은 경우에도, 몰 질량이 낮은 세포질 성분들 (예, K+, 핵산 및 아미노산)의 누출이 발생한다. SiQAC 화합물은, 실릴 기가 표면에 결합하여 항미생물성 부분의 국소 농화와 배향화를 야기하기 때문에, 비-실릴화된 4급 암모늄 화합물 보다 더 강력한 것으로 간주된다.

SiQAC 화합물에 의한 세포 용해 공정은, 당해 기술 분야의 다른 공정들과는 달리, 실온에서 작동한다. SiQAC로 관능화된 셀룰로스는 박테리아, 진균 및 바이러스 입자의 단백질 막을 약화 및/또는 파괴하는데 적합하다. 바람직한 구현예에서, 이것은 5분 이내에 PCR 준비가 된 세포 용해된 세포성 물질을 제공해준다. 본 발명의 관능화된 기질과 방법은 싱글 스텝로 DNA 및 RNA의 핵산 추출과 샘플내 잠재적으로 유해한 물질의 제거를 구현할 수 있다. 또한, 바이러스 입자로부터 RNA를 추출할 수 있어, RT-PCR 이전에 RNA를 입수하기 위한 복잡한 샘플 처리 공정의 필요성이 없는 싱글 스텝 공정을 제공해준다.

본 방법은 세포 용해용 세포 타입을 선택하는 수단으로서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 본원의 데이타는 혈액에서 24시간 인큐베이션한 후, 화이트 적혈구는 세포 용해되지만 전체 혈액 세포는 무손상된 상태로 유지됨을 보여준다.

본 발명자들은, SiQAC 공정이 아래 미생물 유기체들에 대해 적어도 사용가능한 것으로 생각한다:

박테리아: MRSA, CA-MRSA; 마이크로코커스 (Micrococcus) sp.; 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis); 엔테로박터 어글로메란스 (Enterobacter agglomerans); 액시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus); 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (색소성 (pigmented)); 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (비-색소성); 클립시엘라 뉴모니아 모니아 (Klibsiella pneumonial moniae); 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa); 스트렙토코커스 패칼리스 (Streptococcus faecalis); 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli); 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis); 시트로박터 디버수스 (Citrobacter diversus); 살모넬라 티포사 (Salmonella typhosa); 살모넬라 콜레레수이스 (Salmonella choleraesuis); 코리네박테리움 보비스 (Cornyebacterium bovis); 미코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis); 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis); 브루셀라 카니스 (Brucella canis); 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus); 브루셀라 수이스 (Brucella suis); 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans); 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis); 클로스트리듐 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens); 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae); 헤모필러스 수이스 (Haemophilus suis); 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casel); 루코노스톡 라티스 (Leuconostoc lactis); 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes); 프로피오니박테리움 아크네 (Propionibacterium acnes); 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris).

진균: 알터나리아 (Alternaria); 아스퍼질러스 플라부스 (Aspergillus flavus); 아스퍼질러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus); 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger); 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus); 아스퍼질러스 베르시콜러 (Aspergillus versicolor); 아우레오바디시움 풀루란스 (Aureobadisium pullulans); 세팔다스쿠스 프라그란스 (Cephaldascus fragrans); 케토미눔 글로보숨 (Chaetomium globosum); 클라도스포리움 허바룸 (Cladosporium herbarum); 에피더모피톤 (Epidermophyton); 푸라시움 니그룸 (Fusarium nigrum); 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani); 글리코클라디움 로세움 (Glicocladium roseum); 뮤코 (Mucor); 옵스포라 락티스 (Oospora lactis); 페니실리움 알비칸스 (Pencillium albicans); 트리코피톤 멘타그라포피테스 (Tricophyton mentagraphophytes); 페니실리움 엘레간스 (Pencillium elegans); 페니실리움 푸니쿨로숨 (Pencillium funiculosum); 페니실리움 휴미콜라 (Pencillium humicola); 페니실리움 노타툼 (Pencillium notatum); 풀룰라리아 풀루란스 (Pullularia pullulans); 페니실리움 바리아빌 (Penicillium variabile); 리조푸스 니그리칸스 (Rhizopus nigricans); 리코덤 (Ricoderm); 스타키모트리스 아트라 (Stachybotrys atra); 트리코피톤 인테디지탈리 (Trichophyton interdigitalie); 트리코더마 플라부스 (Trichoderma flavus); 페니실리움 시트리눔 (Penicillium citrinum).

효모 및 조류: 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae); 칸디다 알비칸스 (Candida albicans); 오실라토리아 보르네티 (Oscillatoria borneti) LB143; 아나바나 실린드리카 (Anabaena cylindrica); 셀레나스트룸 그라실 (Selenastrum gracile) B-325; 플루로코커스 (Pleurococcus) LB11; 쉔데스무스쿠아드리쿠아다 (Schenedesmus quadricuada); 고니움 (Gonium) LB 9c; 볼보스 (Volvox) LB 9; 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris); 시아노피타 (Cyanophyta) (청녹색); 크리소피타 (Chrysophyta) (갈색); 클로로피타 (Chlorophyta) (녹색) 세이에나스툼 (Seienastum); 클로로피타 프로토코커스 (Chlorophyta) (녹색) 프로토코커스 (Protococcus).

바이러스; HIV; 뎅귀; 인플루엔자 A/B; SARS; H1N1 (조류 독감); H3N2; 헤르페스 심플렉스 1형

기타: 플라스모디움 말라리아 (Plasmodium malariae).

SiQAC의 항미생물 작용에 대한 상세 내용은 Isquith et al (1972)에서 찾아볼 수 있다.

실시예

모든 실시예들에서 사용되는 페이퍼는 달리 언급되지 않은 한 Hahnemuhle FineArt GmbH (독일) 사의 코튼-유래 셀룰로스 페이퍼 FP 2992이다.

실시예 1: SiQAC 용액을 이용한 페이퍼 기반의 박테리아 배양물의 정제 및 PCR 산물의 특징 규명

프로토콜:

1.　해당 박테리아 (K. 뉴모니아, S.　아우레우스 및 M. 투베르쿨로시스*)의 하룻밤 배양물을 준비하여, 50 ㎕를 취한다. [*MTB 배양은 2주간 배양하였다 (O.D. 1.1)]

2. 밤새 건조시킬 3세트의 카드를 준비한다.

i. 무처리 페이퍼

ii. 물 15 ㎕에 희석한 SiQAC (3-TPAC) 용액 5 ㎕로 관능화한 페이퍼

iii. TRIS-Cl [pH 7.5] 15 ㎕에 희석한 SiQAC (3-TPAC) 용액 5 ㎕로 관능화한 페이퍼

3. 처리 및 무처리 페이퍼 각각에 배양물　20 ㎕를 첨가하고, 실온에서 10분간 건조한다 [각각의 배양물 별로, 여러 페이퍼에서 x4 반복]

4. 멸균 생검 펀치를 이용하여 페이퍼를 펀칭하여 디스크를 취한다 (1.5 mm).

5. 이 펀칭된 디스크를 PCR 혼합물에 첨가한다 (최종 부피 20 ㎕).

6. 각 테스트에서 16S 유니버셜 35회 사이클을 수행한다; K. 뉴모니아 및 S.　아우레우스,　GD의 MTB/RIF

7. K. 뉴모니아 및 S.　아우레우스의 PCR 산물에 대해 표준 피로시퀀싱을 수행한다.　

결과:

1. std 패드　(세트 1)에 대해 K. 뉴모니아를 PCR하여, 평균 18 bp의 고품질 피로시퀀싱 정보를 수득하였다.

2. SiQAC (3-TPAC)　용액 5 ㎕ + 물 15 ㎕로 농화된 패드 (세트 2)에 대해 K. 뉴모니아를 PCR하여, 평균 24 bp의 중간 품질의 피로시퀀싱 정보를 수득하였다.

3. SiQAC (3-TPAC)　용액 5 ㎕ + TRIS-Cl [pH 7.5] 15 ㎕로 농화된 패드 (세트 3)에 대해 K. 뉴모니아를 PCR하여, 평균 28 bp의 고품질의 피로시퀀싱 정보를 수득하였다.

4. 무처리 패드　(세트 1)에 대해 S.　아우레우스를 PCR하여, 평균 16 bp의 고품질의 피로시퀀싱 정보를 수득하였다.

5. SiQAC (3-TPAC)　용액 5 ㎕ + 물 15 ㎕로 농화된 패드 (세트 2)에 대해 S.　아우레우스를 PCR하여, 평균 20 bp의 중간 품질의 피로시퀀싱 정보를 수득하였다.

6. SiQAC (3-TPAC)　용액 5 ㎕ + TRIS-Cl [pH 7.5] 15 ㎕로 농화된 패드 (세트 3)에 대해 S.　아우레우스를 PCR하여, 평균 25 bp의 고품질의 피로시퀀싱 정보를 수득하였다.

7. GD의 MTB/RIF: TRIS-Cl [pH 7.5] 15 ㎕로 희석한 SiQAC (3-TPAC) 용액 5 ㎕를 농화시킨 패드를 통해 처리된 샘플에서의, RIF 동정 (identification)을 비롯하여,　MTB 동정 (identification)은 상기 3가지 세트의 샘플들을 보정하였다.

결론:

SiQAC (3-TPAC) 용액으로 농화된 페이퍼는 박테리아 세포를 성공적으로 세포 용해하여, 추출된 핵산의 PCR이 가능하였다. 이는 피로시퀀싱을 통해 수득된 서열의 원 길이 (raw length)와, 용해시키기 어려워 일반적으로 동일한 수준의 세포 파괴를 달성하기 위해서는 NALC-NaOH를 이용한 매우 강력한 처리가 필요한 미코박테리움 투베르쿨로시스에 대한 종료 시점의 MTB-RIF 검출을 통해 검증되었다. 무처리 페이퍼에서는 동일한 결과가 나타나지 않았다. TRIS-Cl [pH 7.5]는 SiQAC를 완화하는데 필요하다.

실시예 2: SiQAC 용액으로 처리된 혈액으로부터의 플라스모듐 종들의 검출.

도 4는 감염된 환자로부터 수득한 혈액 샘플에서 여러가지 플라스모듐 종들의 핵산을 검출한 결과를 도시한다.

실시예 3: 페이퍼 관능화 및 이용 방법

3가지 다른 페이퍼 관능화 방법이 제공된다:

공정 A

페이퍼를 SiQAC (3-TPAC) 용액 20 ㎕로 관능화하여 24시간 건조한 다음 5 mM　TRIS-Cl [pH 9.0] 20 ㎕, 0.2 mM MgCl₂ 중에 헹구고 건조한 다음, 하기 중 한가지를 수행하였다;

i. 샘플을 적용하고, 20분간 건조한 후 디스크를 적출하고, PCR용 miliQ 워터　20 ㎕를 첨가하거나, 또는

ii. 샘플을 적용하고, 20분간 건조한 후 디스크를 적출하고, 천천히 파이펫팅하여 miliQ 워터　20 ㎕에서 헹군 다음 PCR에서 20 ㎕를 사용함

공정 B

페이퍼를 SiQAC (3-TPAC) 용액 20 ㎕로 관능화하여 30분간 건조한 다음 5 mM　TRIS-Cl [pH 9.0], 0.2 mM MgCl₂ 중에 헹구고 건조한 다음, 하기 중 한가지를 수행하였다;

공정 C

페이퍼를 SiQAC (3-TPAC) 용액 20 ㎕로 관능화하여 30분간 건조한 다음, 하기 중 한가지를 수행하였다;

i. 샘플을 적용하고, 20분간 건조한 후 디스크를 적출하고, 천천히 파이펫팅하여 miliQ 워터　20 ㎕에서 헹군 다음 PCR에서 20 ㎕를 사용하거나,

ii. 샘플을 적용하고, 20분간 건조한 후 디스크를 적출하고, PCR을 위해 20 ㎕ TRIS-Cl [pH 9.0], 0.2 mM MgCl₂를 가하거나, 또는

iii. 샘플을 적용하고, 20분간 건조한 후 디스크를 적출하고, 천천히 파이펫팅하여 20 ㎕ TRIS-Cl [pH 9.0], 0.2 mM MgCl₂ 중에서 헹군 다음 PCR에서 20 ㎕를 사용함.

무처리 객담 (raw sputum) 임상 샘플로부터 미코박테리움 투베르쿨로시스 DNA 추출에 대해 여러가지 다양한 페이퍼 처리 방법들을 비교하였으며, NALC-NaOH를 이용한 표준 Cepheid GeneXpert^® MTB 공정으로 결과를 수득하였다. 그 결과는 도 5에 나타낸다 (MTB = 검출된 미코박테리움 rpoB 유전자; RIFs 또는 RIFr = 검출된 리팜피신 돌연변이; FAILED = 검출 안됨). 3가지 처리 방법들은 다양한 수준으로 핵산을 PCR용 용액으로 방출시켜, 복수-카피 및 단일 카피의 rpoB 유전자의 검출이 가능하였으며, 리팜피신 돌연변이의 검출도 가능하였다. 모든 공정들은 GeneXpert^®골드 스탠다드 시스템에 대한 비교 데이타를 제공해주었다. 공정 C는 골드 스탠다드에 비해 '우수한' 결과를 나타내어, PCR 분석을 위한 세포 파괴 수준과 고품질 DNA의 안정성 정도가 높았으며, 이는 피로시퀀싱에 의해 추가로 검증되었다. 피로시퀀싱을 통해, V2 리보좀 DNA 증폭 산물의 서열에서 30 bp에 서열 변형들이 확인되었으며, 긴 노란색 & 파란색 판독 결과 (read)들은 서열에 돌연변이가 없음을 나타내주며 이는 양호한 증폭 산물들의 존재를 검증해준다.

도 6은 기술한 7가지의 변형을 적용 처리한, 임상 객담 샘플 5종 (4x RIFs and 1x RIFr)의 누적 정확도 데이타를 도시한다 (즉. 35번의 테스트 결과). RIF 상태 (RIFs, RIFr)를 나타내는 MTB (연파란색) 및 rpoB 돌연변이에 대한 용융 온도 측정치와 측정된 데이타 포인트들 전체에 대한 표준 편차를 표시하는 첨부된 에러 막대는, 용융 피크 결정값의 정확도에 영향을 미치지 않으며 ± 0.5℃ 이내임을 보여준다. 표준 방법은 측정의 정확도에 영향을 미칠 수 있다.

도 7은 기술된 공정을 이용하여 객담으로부터 추출된 MTB에 대한 여러가지 농도에서의 다회 반복 테스트 결과를 도시한 것으로, y 축은 피크 용융 온도이고, x 축은 피크 길이를 나타낸다.

이들 실시예에 비추어, 도 8에 SiQAC 화합물로 관능화된 페이퍼 및 샘플 분석에 대한 최적화된 공정을 도시한다.

실시예 4. 객담 샘플로부터 SiQAC를 이용하여 추출된 미코박테리움 투베르쿨로시스의 피로시퀀싱

3개 객담 샘플을 SiQAC (3-TPAC) 관능화된 복합 카드를 이용하여 처리하였다. 1.5 mm 디스크를 표준적인 16S 리보좀 DNA 증폭 단계에 투입하였으며 핫 스타트 (hot start)는 수행하지 않았으며 (즉, 사이클링만 수행함), 수득되는 증폭산물들을 피로시퀀싱으로 분석하였다. 그 결과, 뉴클레오티드 판독 길이가 >25개인 코어 영역이 양호하게 증폭되었으며, 이는 추출과 증폭이 훌륭하게 수행되었다는 것을 의미한다.

검색 모드: 전체 검색

평균 동일성 스코어 (Mean identity score): 100%

검색 엔진:　PyroMark　Q96 ID

참조 데이타베이스: HULPII

참조 서열: M. microti ATCC19422.

샘플 1 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT

샘플 2 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT

샘플 3 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCC

실시예 5: 전유로부터 미생물 DNA의 분리

전유는 많은 저해제들이 함유되어 있어 PCR하기 어려운 샘플 타입이다. 복합 페이퍼를 (도 9에 예시된) 바람직한 방법을 이용하여 관능화하였다. 관능화된 페이퍼 + 건조된 우유 샘플로 구성된 하나의 1.5 mm 디스크를, 유니버셜 16S 리보좀 DNA 증폭용 프라이머와 함께 표준 PCR 믹스에 첨가하였다. 증폭된 DNA를 표준 겔에서 전개시켰다. 도 9에 그 결과를 도시한다 (레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 5 ㎕ E. coli 참조 gDNA + 1 ㎕ 100% Si-QAC (3-TPAC) 용액; 레인 3: 5 ㎕ E. coli 참조 gDNA + 1 ㎕ 10% Si-QAC (3-TPAC) 용액; 레인 4: 5 ㎕ E. coli 참조 gDNA + 1 ㎕ 1% Si-QAC (3-TPAC) 용액; 레인 5: 10% Si-QAC (3-TPAC) 용액으로 관능화된 1.5 mm 디스크 + 전유 (whole dairy milk) 20 ㎕; 레인 6: 1% Si-QAC (3-TPAC) 용액으로 관능화된 1.5 mm 디스크 + 전유 20 ㎕; 레인 7: 관능화된 1.5 mm 디스크 + 전유 20 ㎕; 레인 8: 전유 1 ㎕).

나타낸 데이타는, 1% Si-QAC (3-TPAC)를 이용한 관능화가 무처리 페이퍼에 비해 증폭을 강화함을 입증해준다 (레인 6 & 7).

디스크는, 유산균 농화 배지 (트립톤 5g/l, 덱스트로스 1g/l, 효모 추출물 2.5g/l 및 탈지 분말 1g/l) + 4% 아가에 접종하여, 체류 박테리아를 체크하였다 - R.C. MARSHALL (1993) Standard Methods for the Microbiological examination of dairy products, 16th Ed. (American Public Health Association). 밤새 배양시 Si-QAC (3-TPAC)로 처리된 디스크에서는 박테리아 증식이 나타나지 않았지만, 무처리 디스크의 배양 플레이트에서는 컨플루언트로 증식되었는 바, 관능화된 페이퍼가 15분 이내에 액체를 살균시킨다는 것을 검증해준다.

실시예 6: 관능화된 카드를 이용한 혈청 유래 HIV 바이러스로부터 추출된 RNA에 대한 RT-PCR

요약

관능화된 카드는 양성으로 진단받은 익명의 환자로부터 수득한 혈장 샘플에 대한 HIV K103 amplicon의 RT-nested PCR에서 작동하였다. 다른 환자 (이 역시 양성으로 진단받은 환자)로부터 수득한 전체 혈액 샘플에 대한 병행 분석에서는 PCR (1% 아가로스겔에서 단편들이 검출되지 않았음) 또는 피로시퀀싱 어디에서도 결과가 나타나지 않았다.

분석에 대한 설명

2개의 카드를 정제 용액 (3-TPAC를 함유한 PF 용액)을 이용하여 표준 프로토콜에 따라 관능화하였다:

1. 카드를 개봉하고, 완충제 (5 mM Tris HCl (pH 9.0), 0.2 mM MgCl₂)에 희석한 1/100 PF 용액 20 ㎕를 적용한다.

2. 15분간 건조한다.

3. 샘플* 20 ㎕를 적용한다.

4. 15분간 건조한다.

5. 디스크 하나를 펀칭하여 RT에 첨가한다.

*샘플은 말초 HIV 양성 혈액 (1)과 말초 HIV 양형 혈액 (2)로부터 입수한 혈장이었다.

사용된 RT 믹스는 Applied Biosystems Superscript VILO cDNA 합성 키트였으며, 기술된 바에 따라 사용자가 수동으로 최종 부피 30 ㎕로 맞추었다.

이후, 다음과 같은 방식으로 PCR을 준비하였다:

H2O - 5.8 ㎕

10x PCR 완충제 - 5 ㎕

MgCl₂ [50 mM] - 2 ㎕

dNTPs 　·10 mM·- 1.2 ㎕

1849+ ·10 μM·- 1 ㎕

3500- 　·10 μM·- 1 ㎕

Ultratools Taq 중합효소 [1u/㎕] - 1 ㎕

Superscript VILO cDNA 합성 키트 유래 cDNA - 30 ㎕

사용된 프라이머는 다음과 같다:

1849+ 5'-GATGACAGCATGTCAGGGAG

3500- 5'-CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA

PCR 프로그램:

94℃ 　　　2분 후, 이하 사이클을 45회 수행함:

94℃ 　　　30초

50℃ 　　　30초

72℃ 　　　1분 30초; 이후,

72℃ 　　　　5분

10℃ 　　　　∞

PCR 산물은 1702 bp 길이이며, H1V1의 gag-pro-pol 영역을 포함한다. 이 증폭산물을 2차 PCR의 주형으로 사용하였다.

2차 PCR은 다음과 같은 방식으로 준비하였다:

H2O - 20 ㎕

10x PCR 완충제 - 4 ㎕

MgCl₂ [50 mM] - 1.6 ㎕

dNTPs 　·10 mM·- 0.8 ㎕

K103F ·10 μM·- 3.2 ㎕

BioK103F 　·10 μM·- 3.2 ㎕

Biotools Taq 　중합효소 [1u/㎕] - 0.5 ㎕

상기 nested PCR의 PCR 산물 - 5 ㎕

사용된 프라이머는 다음과 같다:

K193F 5'-GGAATACCACATCCYGCAGG

BioK103R 5'-[Biotin]AATATTGCTGGTGATCCTTTCC

PCR 프로그램:

95℃ 　　　5분 후, 이하 사이클을 30회 수행함:

95℃ 　　　30초

55℃ 　　　30초

72℃ 　　　30초; 이후

72℃ 　　　　5분

10℃ 　　　　∞

2차 PCR의 PCR 산물은 203 bp 길이이며, 이를 도 10에 나타낸 농화 방법 이후에, 피로시퀀싱 반응에 사용하였다.

결과

피로시퀀서에서 오직 혈장 샘플에서만 양호한 신호가 나타났으며, 혈액 샘플에서는 기술된 프로토콜에 따라 수행한 이후에도 결과가 전혀 나타나지 않았다. 사용된 서열분석용 프라이머는 K103F (5'-GGAATACCACATCCYGCAGG)이며, 수득한 서열을 NCBI의 BLAST 툴을 이용하여 HIV 전체 게놈에 대해 매칭시켰다. 이 서열은 HIV와 성공적으로 일치되었으며, 도 11을 참조한다.

Claims

생물 샘플로부터 핵산을 준비하는 방법으로서,
상기 생물 샘플은, a) 세포막을 가진 세포성 물질, b) 세포벽을 가진 세포성 물질, c) 바이러스 외막을 가진 바이러스성 물질 또는 d) 바이러스 캡시드를 가진 바이러스성 물질을 포함하며,
상기 방법은 샘플을 기질과 접촉시키는 단계를 포함하며,
상기 기질은 i) 세포막, 세포벽, 바이러스 외막 또는 바이러스 캡시드를 약화시키거나, 또는 ii) 세포성 물질 또는 바이러스성 물질을 세포 용해 (lysis)할 수 있는, 살생물제로 관능화된 것이며,
상기 살생물제는 살생물제의 상기 기질과의 결합에 관여하는 결합 모이어티; 소수성 모이어티; 및 하전된 모이어티를 포함하는, 복수의 관능기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 접촉 단계 이후에 샘플을 가열하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기질이 셀룰로스 매트릭스, 바람직하게는 셀룰로스 필터 페이퍼 또는 셀룰로스 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 셀룰로스 물질이 복합 페이퍼 (composite paper)인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 복합 페이퍼가 페이퍼의 표면 상에 증착된 샘플로부터 액체와 저분자량 오염물 및 저해제를 제거하기 위한 측방 흐름 층 (lateral flow layer)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기질이 유리 또는 플라스틱인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 기질이 미세유체 채널, 반응 용기 또는 그외 컨테이너 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 소수성 모이어티가 알킬 체인, 예를 들어 C5-C30 알킬, 바람직하게는 C10-C20 알킬을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하전된 모이어티가 양으로 하전된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하전된 모이어티가 4급 암모늄 기인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 결합 모이어티가 하이드록시 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 관능기가 알킬 체인, 실릴기 및 암모늄 클로라이드 기인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 살생물제가 실릴화된 4급 암모늄 화합물 (SiQAC)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서, 상기 살생물제가 3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 살생물제가
a) 텔레킬릭 (telechelic) 폴리(2-알킬-1,3-옥사졸린);
b) 항미생물 DDA 기를 가진 셀룰로스; 및
c) 사포닌으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 생물 샘플이 세포벽을 가진 세포성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포성 물질이 원핵생물의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포성 물질이 식물 또는 진균의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 생물 샘플이 진핵 동물 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 생물 샘플이 바이러스성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
생물 샘플에서 핵산을 증폭하는 방법으로서,
상기 방법은 제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 따른 방법으로 핵산을 준비하는 단계, 및 상기 준비된 핵산에 대한 핵산 증폭 단계, 바람직하게는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
생물 샘플로부터 핵산을 준비하기 위한 장치로서,
상기 생물 샘플은, a) 세포막을 가진 세포성 물질, b) 세포벽을 가진 세포성 물질, c) 바이러스 외막을 가진 바이러스성 물질 또는 d) 바이러스 캡시드를 가진 바이러스성 물질을 포함하며,
상기 장치는 i) 세포막, 세포벽, 바이러스 외막 또는 바이러스 캡시드를 약화시키거나 또는 ii) 세포성 물질 또는 바이러스성 물질을 용해 (lysis)할 수 있는, 살생물제로 관능화된 기질을 포함하며,
상기 살생물제는 살생물제의 상기 기질과의 결합에 관여하는 결합 모이어티; 소수성 모이어티; 및 하전된 모이어티를 포함하는, 복수의 관능기를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제22항에 있어서, 상기 기질이 셀룰로스 매트릭스, 바람직하게는 셀룰로스 필터 페이퍼 또는 셀룰로스 매트릭스인 것을 특징으로 하는 장치.
제23항에 있어서, 상기 셀룰로스 물질이 복합 페이퍼인 것을 특징으로 하는 장치.
제22항에 있어서, 상기 기질이 유리 또는 플라스틱인 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제25항 중 어느 한항에 있어서, 상기 기질이 미세유체 채널, 반응 용기 또는 그외 컨테이너 형태인 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제26항 중 어느 한항에 있어서, 상기 소수성 모이어티가 알킬 체인, 예를 들어 C5-C30 알킬, 바람직하게는 C10-C20 알킬을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제27항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하전된 모이어티가 양으로 하전된 것임을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제28항 중 어느 한항에 있어서, 상기 하전된 모이어티가 4급 암모늄 기인 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서, 상기 결합 모이어티가 하이드록시기를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제30항 중 어느 한항에 있어서, 상기 관능기가 알킬 체인, 실릴기 및 암모늄 클로라이드기인 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제31항 중 어느 한항에 있어서, 상기 살생물제가 실릴화된 4급 암모늄 화합물 (SiQAC)인 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제32항 중 어느 한항에 있어서, 상기 살생물제가 3-(트리메톡시실릴) 프로필다이메틸옥타데실 암모늄 클로라이드인 것을 특징으로 하는 장치.
제22항에 있어서, 상기 살생물제가
a) 텔레킬릭 (telechelic) 폴리(2-알킬-1,3-옥사졸린);
b) 항미생물 DDA 기를 가진 셀룰로스; 및
c) 사포닌으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 내지 제34항 중 어느 한항에 있어서, 상기 기질이 샘플 준비 카트리지 등에 통합되는 것을 특징으로 하는 장치.