WO2000071999A1 - Vorrichtung und verfahren zur isolierung von elektrisch geladenen molekülen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur isolierung von elektrisch geladenen molekülen Download PDF

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WO2000071999A1
WO2000071999A1 PCT/EP2000/004560 EP0004560W WO0071999A1 WO 2000071999 A1 WO2000071999 A1 WO 2000071999A1 EP 0004560 W EP0004560 W EP 0004560W WO 0071999 A1 WO0071999 A1 WO 0071999A1
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WO
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electroelution
shape
gel
chamber
stabilized
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PCT/EP2000/004560
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English (en)
French (fr)
Inventor
Clemens Bergmann
Thomas Kaplan
Gerhard Bienhaus
Hans R. Lange
Original Assignee
Bilatec Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/4473—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by electric means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
    • B01D57/02—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C by electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to methods and devices for the isolation of charged molecules with a wide range of applications, for example in the isolation of electrically charged molecules in receptor-ligand mixtures or in the sample preparation of nucleic acids.
  • electrophoretic processes such as electroelution
  • electroelution can be used, as described in WO 97/34908 and WO 98/58251.
  • charged molecules are first bound to an adsorber and then released again in an electroelution process, transferred to a removal volume and also concentrated there.
  • Other devices for electroelution are e.g. in US 5340449 and US 4608147.
  • the devices described there are not designed or provided for methods according to WO97 / 34908, but rather comprise closed and screwed chamber systems. These are then appropriately anchored in an electrophoresis buffer tank, the chamber system being hermetically sealed against the electrophoresis buffer tank.
  • a major disadvantage of these devices is that they are not suitable for automation in a pipetting robot. This means that they cannot be used for standard procedures with a large sample throughput.
  • the problem is particularly serious that, in conventional devices, due to the occurrence of an electroosmotic flow, one of the chambers runs empty before the desired insulation can be completed. In order to avoid such draining of one of the chambers, complicated measures, such as a liquid exchange between the anode and cathode chambers, have been necessary to compensate for the electroosmotic flow.
  • An object of the invention was therefore to provide a device for isolating charged molecules which can be automated and in which the problems of the prior art which arise due to the electroosmotic flow are at least partially eliminated.
  • the device according to the invention for the isolation of electrically charged molecules consists of a downwardly closed base body with at least one upwardly open channel and at least two electrodes as the right and left outer boundaries of the channel, and is characterized in that one or more between the electrodes in the channel Intermediate installation (s) are arranged, which divide the channel into two or more chambers.
  • Intermediate installation s
  • the use of a channel which is open at the top in the sample entry and sampling areas enables the device according to the invention to be used in automated processes, for example with pipetting robots or x, y, z robots.
  • the intermediate installations prevent or reduce the electroosmotic flow.
  • the intermediate internals in particular allow only a small electroosmotic flow, which is desired for concentration, but which does not lead to the emptying of a chamber, so that electroelution of charged molecules is possible.
  • the intermediate internals of the device according to the invention are thus permeable, in particular, to electrically charged molecules, but on the other hand represent a liquid barrier through which the electroosmotic flow can be limited. Depending on the application, it is possible to completely prevent the electroosmotic flow or to allow a low osmotic flow, which can advantageously be used for concentration.
  • the intermediate installations of the devices according to the invention preferably limit the electroosmotic flow in such a way that the volume of the sample entry or removal chamber within a period of at most 60 minutes, preferably at most 30 minutes and particularly preferably at most 10 minutes and at least 30 seconds, preferably at least 1 minute and more preferably at least 2 minutes of electroelution does not decrease by more than 90% by volume, preferably not more than 50% by volume and particularly preferably not more than 30% by volume.
  • the device according to the invention can be operated at any voltages, voltages ⁇ 250 V and in particular voltages ⁇ 42 V are preferably used.
  • the size of the device according to the invention can be chosen arbitrarily depending on the application, for example on a production scale from a few liters or larger to miniaturized devices with a few microliters of chamber volume, for example for use on conventional microtiter plates, as described below.
  • the volume of the upwardly open channel is preferably 0.01 to 5 ml, more preferably 0.2 to 2 ml.
  • biomolecules such as nucleic acids, in particular DNA, RNA, proteins and others
  • the device can e.g. for protein mixture analysis and for immunoassays.
  • a particularly interesting field of application is the use of
  • nucleic acid itself can also be isolated.
  • the device according to the invention can be used to isolate molecules in a large molecular weight range from less than 100 Da to more than a few million Da. It has been observed that, in addition to small molecules, such as dye molecules or polypeptides, large molecules, such as genomic yeast DNA, can penetrate the internals and can thus be isolated or purified.
  • At least one of the intermediate internals consists of a shape-stabilized gel.
  • gels for example an agarose gel, outstanding in a low concentration, for example from 0.1% gel to 10% gel, preferably 0.2% gel to 1.2% gel, more preferably up to 0.8% gel
  • the problem with gels in such a low concentration is that they are dimensionally stable or mechanically very unstable and no films or films can be produced therefrom that could be used as separating elements.
  • mechanically stable elements with the above-mentioned advantageous properties can be obtained by stabilizing the shape of such gels.
  • the invention therefore also relates to such dimensionally stabilized gels and their use as an intermediate installation in the device described above.
  • Preferred gels are easily deformable, liquid or gas-rich disperse systems composed of at least two components, consisting of a solid colloidally divided substance with long or / and highly branched particles and a liquid, in particular water.
  • suitable gels are polysaccharide and protein gels such as gelatin, agar, carrageen, alginates, alginic acid, phyllophoran, furcellaran, agarose and others, as well as polymer gels such as polyacrylamide gels.
  • the stabilized gels are used as separating elements, for example as separating filters or separating membranes, and not as a carrier material. They are preferably used as thin disks with a density of at least 0.1 mm and preferably 0.5 mm, and at most 20 mm, preferably at most 5 mm and particularly preferably at most 2 mm.
  • the molecules move across the gels across the thinnest dimension.
  • the dimensional stability is preferably achieved by a support element on or into which the gel is introduced.
  • sintered plastic for example sintered polypropylene or polyethylene with a pore size of 1 to 200 ⁇ m, preferably of 20 to 1 20 ⁇ m, has proven particularly advantageous. Excellent results can also be achieved by using fabrics, for example made of plastics such as polyester or polyamide, with a mesh size of 0.1 to 500 ⁇ m, preferably 0.5 to 10 ⁇ m, as the support element.
  • the permeability of the shape-stabilized gel can be adjusted by the degree of crosslinking of the gel. It is possible to choose the permeability in such a way that the desired charged molecule passes through the gel at the applied voltages and can then be obtained from the sampling chamber. For many applications, however, it can also be advantageous to choose the degree of crosslinking such that the charged molecule remains in the gel and is then recovered from the shape-stabilized gel in further steps.
  • the desired analyte can get stuck in the gel by suitable derivatization with functional groups that bind specifically (e.g. streptavidin or biotin) or non-specifically (e.g. hydrophilic or hydrophobic groups) to the analyte.
  • a fabric is used as an intermediate installation. It may be preferred here that a small electroosmotic flow from the anode to the cathode is generated through the tissue under the electroelution conditions.
  • the fabric preferably has a mesh size of 0.1 to 50 ⁇ m, preferably 0.5 to 5 ⁇ m.
  • the absorption of electrically charged molecules on the tissue is preferably less than 40%, particularly preferably less than 10%, in order to allow the desired analyte to pass into the sampling chamber. Particularly advantageous results are obtained when the fabric has been treated by calendering.
  • the mesh size is adjusted so that biologically active particles of a defined size cannot penetrate the tissue.
  • the device according to the invention allows flexible handling and corresponding configurations, depending on the intended application.
  • multi-chamber systems can be used if the desired analyte, for example a nucleic acid or a protein, does not pass the intermediate installation as the first molecule of the sample mixture. This can be the case, for example, when using detergents to lyse cells.
  • the arrangement is advantageously chosen so that the detergents which first pass through the intermediate installation are electroeluted through the sampling space into a further chamber.
  • the device according to the invention it is possible to provide desired molecules which have no charge even under the conditions applied, by means of carriers, for example by using specific charged antibodies or hybridization probes. Furthermore, it is possible to design the device according to the invention to be multidimensional, for example in the form of a cross, which enables a multidimensional separation.
  • a device with at least four chambers is particularly preferred, the anode and cathode chambers which are adjacent to the anode or Are cathode, compared to the intermediate sample entry or Sampling chambers are relatively large.
  • the cathode and anode chamber preferably have a volume of 5 to 20: 1 to the volume of the sampling or sample insertion chamber. In this way, the sample volume can be kept small, while on the other hand the volume at the electrodes is large, so that any undesirable side reactions which may occur there are less important.
  • a reduction in the volume of the sampling or sample addition chamber in comparison to the anode or cathode chamber can be achieved, for example, in that the upwardly open channel has a taper in the middle.
  • a different buffer concentration is also preferably used in the individual chambers, the buffer concentration in the anode or cathode chamber preferably being 5 to 20: 1 to the volume of the sample entry or removal chamber.
  • the pH in the individual chambers can also be set differently.
  • the device consists of four chambers. Starting from the cathode on the left, there is first a cathode chamber which is relatively large, for example has a volume of 1.6 ml and contains a high-molecular buffer, for example in a concentration of 100 mM. This chamber is separated from the sample entry chamber by a membrane, which has a smaller volume, for example 1 60 ⁇ l, and a lower buffer concentration, for example 10 mM.
  • a shape-stabilized gel for example an agarose gel separating filter, which consists of a sintered plastic filled with agarose gel, is located between the sample entry and the sampling chamber.
  • the sampling chamber points again a small volume, for example 1 60 ⁇ l, and a low buffer concentration, for example 10 mM.
  • a further stabilized agarose gel filter acts as a separation between the sampling chamber and the anode chamber.
  • the anode chamber itself is again relatively large, for example 1.6 ml, and has a high buffer concentration, for example 100 mM. Passage of the desired analyte during electroelution through the second gel filter is prevented on the one hand by suitably adjusting the separation time and on the other hand by adjusting the buffer concentrations in the sampling chamber and the anode chamber.
  • the sample taken from the sampling chamber can, for example, be analyzed by means of mass spectrometry or further processed by means of PCR.
  • analyte can be processed during the transfer steps.
  • An enzymatic reaction or a receptor / ligand binding preferably takes place in the chambers, in particular during the electrophoretic transfer of the charged molecules.
  • a further improvement in the separation properties can be achieved by reversibly applying a magnetic field in the vicinity of at least one electrode.
  • the electrodes can be made from conductive materials, for example metals, and preferably from conductive plastics.
  • the entire device can also be assembled from individual modules in a modular system.
  • the device according to the invention can be used, for example, for separating the free phase from the bound phase in receptor ligand assays, for isolating nucleic acids, for isolating DNA without contamination from RNA or for isolating RNA without contamination with DNA.
  • the invention further relates to a method for isolating electrically charged molecules, which is carried out in a device as described above.
  • the invention further relates to a method for isolating charged molecules in mixtures with electrophoretic agents in a reaction channel, which is characterized in that a mixture in liquid form is introduced into a reaction channel, is subjected to electrophoresis in the reaction channel, in this electrophoresis in the reaction channel is processed and after this processing the isolated charged molecules are removed from the reaction channel in a soluble form.
  • the starting mixture is further processed during the electrophoresis, whereby a significant simplification of the overall process can be achieved.
  • ligand-receptor binding, an enzymatic reaction and / or concentration can take place in the reaction channel during electrophoresis.
  • the electroosmotic flow can be reduced in electrophoresis in such a way that electroelution of charged molecules is possible without one of the chambers running empty.
  • a lysed biological sample for example lysed cells, is particularly preferably used as a mixture. It is also possible to separate the free and the bound phase from a ligand-receptor assay, in particular from an immunoassay, and thereby enable a quantitative determination.
  • a quantitative determination can also be carried out by separating components with a label, for example a radioactive label, an enzyme label, a fluorescent or luminescent label.
  • a label for example a radioactive label, an enzyme label, a fluorescent or luminescent label.
  • Electroelution is carried out in particular under conditions such that the concentration of detergent in the withdrawn solution with the isolated charged molecules is less than the concentration of detergent in the solution of a lysed sample originally introduced into the reaction channel. It may also be advantageous to add at least one further buffer component to the lysis mixture before the electroelution.
  • sample mixtures e.g. Nucleic acids or adsorbers (e.g. in particle form) to which nucleic acids are bound
  • Such devices are generally suitable for automation using pipetting robots (e.g. from TECAN, Rosys, Canberra Packard and Beckman).
  • the devices according to the invention on the one hand enable automation with devices open at the top and on the other hand take into account the requirements of the electroosmotic flow. Surprisingly, they can be used for methods in which nucleic acids are bound to adsorbers, which are then introduced into a sample entry chamber and then into a corresponding one Electroelution with sample concentration are subjected.
  • a further process step should be linked with the transfer, i.e. the spatial change of the charged molecules . This process step can change the charged molecules themselves or change the environment of the charged molecules. Such a process step linked to the transfer during electroelution is not provided in the prior art.
  • nucleic acids are particularly suitable for the electrophoretic processes relevant here, in particular those with negatively charged detergent molecules, such as sodium dodecyl sulfate.
  • Another application of a completely different kind is derived from molecular oncology.
  • the analysis of an oncogene's mRNA for example important diagnostic parameter. It is crucial that the mRNA is isolated and separated from the analog genomic DNA, since residues of the genomic DNA interfere with the subsequent RT-PCR and falsify its informative value.
  • dT solid-phase-bound oligo
  • the present applications therefore also relate to methods and devices for the purpose of isolating charged molecules, which link further processing to the electrophoretic transfer, which processing may relate to the environment of the charged molecules or else to the molecules themselves.
  • Another preferred field of application is analytical test methods which are based on a ligand-receptor interaction, in particular those which use antibody-antigen reactions. Such methods are commonly referred to as immunoassays.
  • immunoassays There are basically two different applications: homogeneous and heterogeneous immunoassays.
  • homogeneous immunoassays methods are used in which, after incubation, a measurement signal is generated solely by dissolving the antibody and antigen in the form of specially labeled derivatives.
  • a so-called bound / free separation that is to say a separation of the antibody-antigen complexes formed during the incubation from the unbound free components, must take place after incubation.
  • the devices of the present application enable automation on the one hand because they are open at the top and on the other hand take into account the requirements of the electroosmotic flow. Surprisingly, they can be used in such a way that the incubated mixture of a ligand-receptor mixture is introduced into a sample entry chamber, then subjected to a corresponding electroelution and a direct evaluation is possible without further washing steps.
  • detection can be carried out by measuring radioactivity (beta or gamma radiation), by photometric, fluorimetric or luminometric measurements, or else by mass spectrometric or nuclear magnetic resonance spectrometric methods.
  • the present applications therefore also relate to easily automated methods and devices for the purpose of isolating charged molecules in receptor-ligand mixtures.
  • Figure 1 a shows schematically the perspective view of an inventive device. It is a basic body (1) into which a
  • reaction channel (2) was incorporated.
  • the reaction channel (2) is characterized in that it is open at the top, a corresponding bottom and
  • reaction channel (2) is preferably designed in a rectangular or cylindrical shape, in which the short sides each
  • Electrodes (3,4) are provided at the outer ends. Between these
  • Electrodes (3, 4) extend the reaction channel (2), which according to the invention can be provided with at least one intermediate installation (28), so that at least two liquid chambers (for example 10, 7 in FIG. 2a) can be generated.
  • the channel (2) typically has a volume of 0.01-5 ml, preferably 0.2-2 ml.
  • the base body (1) consists of electrically non-conductive material, generally of plastics such as polyacetal, Polycarbonate, polyamide, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyacrylates, polyvinyl chloride or the like and can be produced from semi-finished products or by injection molding or bubble drawing. In individual cases, glass fiber reinforced plastics or plastics with other additives can also be used.
  • Fig. 1 b shows an inventive variant of the basic shape of the channel (2) described above. Here it is constricted in the middle. Surprisingly, it was found that a particularly efficient concentration of charged molecules can be achieved with this shape. This form takes account of the following phenomena that occur during electroelution: a) The pH changes due to the electrolytic decomposition on the electrodes. The chambers around the electrodes must therefore have a sufficient volume to provide sufficient buffer capacity. B) In order to achieve a sufficient concentration, however, it is necessary to obtain the smallest possible sampling volume. Both can be achieved accordingly by the constriction (32) when the sampling space (7) is located on the constriction (32). The embodiment shown in Fig.
  • 1 b is preferably intended as an injection molded part for single use and has slots (1 2) in the base body (1) for the intermediate fittings, such as the semipermeable membrane (1 4), which are described in more detail below are.
  • a plurality of devices can also be present in a composite, for example in strip form or as plates, the 96-microtitration plate format as described in US Pat. No. 4,154,795 being a preferred solution.
  • 1 h shows such an embodiment with microtitration plate strips (1 9) having 8 channels (2) and a suitable microtitration plate frame (1 8).
  • formats with 384 and 1 536 channels can also be used.
  • the channel (2) can also be composed of various individual elements Fig.
  • FIG. 1 cg and held together, for example, with a tensioning device (23) in Fig. 1g.
  • This inventive design consists of individual basic elements (Fig.1c - 1f), which are strung together by means of sealing elements (25) on mating surfaces (20) and then pressed together with one or more clamping devices (23).
  • the basic elements are usually open at the top and U-shaped. However, it is also possible to use individual elements which are closed at the top, such as a prefilled closed cathode and / or anode chamber.
  • 1c shows the downwardly closed base body (1) with a corresponding recess (2) which then form the reaction channel (2) when a plurality of base elements connected to sealing elements (25) on the corresponding mating surface (20) by means of a clamping device (23) be pressed together.
  • 1d shows an embodiment of an intermediate installation (28) for the reaction channel (2). It consists of a frame (29) with a rectangular or round window into which materials for the intermediate fittings (28) can be inserted.
  • this element is manufactured in a layered structure, with laminating foils (29) on the outside and the corresponding intermediate installation materials (28) in the middle. The element is then welded with the aid of a laminator and thus has a smooth fitting surface (20) and thus also a good seal.
  • Fig. 1e represents a corresponding sealing element (25) with the two-sided fitting surfaces (20).
  • this sealing element is preferably made of silicone or Teflon, depending on the use of the reactants.
  • Fig. 1f shows an embodiment for electrodes, which is constructed as a plate electrode or in a layered structure like Fig.1d.
  • FIGS. 1 i and 1 j show a top view of a reaction channel composed of basic elements with various intermediate internals. It has proven to be advantageous to insert the basic elements in a receptacle (26) to which a corresponding clamping device (23) is attached. Instead of the receptacle (26) with the clamping device (23), inventive elements such as FIGS. 1 i and 1 j can also be used, which can be plugged together via a corresponding clamping cone (9) with or without latches (1 6) and also without a clamping device (23) hold liquid-tight together.
  • variant 1 i shows the basic element for delimiting the channel, which in this case can be produced in any length by plugging it together with the basic element for the extension from FIG. 1 j. Then on the opposite side there is a boundary with an identical basic element as FIG. 1 i. This either has corresponding slots for receiving electrodes (3) as shown in Fig. 1 i.
  • variant A an electrode made of conductive plastic is injected directly into the production process in a two-component injection molding process.
  • variant B can also be used to produce the entire base element from conductive plastic. This is a particularly cost-effective variant.
  • FIG. 1 j Materials with resistances of less than 1,000 ohms, such as, for example, Cabelec 3827 and Pre-Elec 1 362, have proven to be particularly advantageous as blend additives for polypropylene.
  • the extension element according to Fig. 1j must accordingly be made of non-conductive plastics, preferably polypropylene.
  • a further inventive variant is shown in FIG. 1 j, since here an opening (31) enables access to the reaction channel (2). This opening (31) can also be used for suctioning off solutions, for example during washing processes.
  • reaction channels can be connected to one another via integrated connecting elements (21) as described above, preferably in the 96-microtitration plate format. Integration into a corresponding framework is also easy to achieve.
  • the reaction channel can also include branching so that, for example, multi-dimensional isolation can be carried out.
  • an intermediate installation (28) must meet the following criteria in order to be suitable, for example for electroelution.
  • the intermediate installation must a) impart electrical conductivity, b) enable permeability to charged molecules c) represent a liquid barrier so that the two spaces (1 0, 7) have no liquid exchange when there is no voltage at the electrodes, d) if necessary Retain particles and e) if necessary generate an electroosmotic flow for concentration, but limit the electroosmotic flow in such a way that electroelution can be carried out.
  • an inventive device such as FIG. 3 fulfills these criteria, for example.
  • a semipermeable membrane (14) is attached in the vicinity of the anode (4), so that an anode space (8) is created between the membrane (1 4) and the anode (4).
  • a further element namely a fabric (5) or, as described below, a shape-stabilized gel is introduced between the semipermeable membrane (1 4) and the cathode (3).
  • This is preferably a precision sieve fabric with a defined mesh size and with a defined open sieve area, as described in “Synthetic monofilament precision sieve fabrics (company brochure from Sefar, Rüschlikon, Switzerland).
  • This fabric (5) can be, for example, nylon and / or polyester fabric. These fabrics (5) can also be appropriately calendered or treated similarly.
  • the type of material also plays an important role. As shown in Example 1, an electroosmotic flow is generated on the tissue (5) which reduces the volume of the sampling space (7).
  • This type of fabric (5) can also use other types of fabric, such as wool or cotton.
  • Such a tissue (5) can be used in an intermediate installation (28) in a device according to FIG.
  • the tissue ensures that when the nucleic acid is removed with a pipette, electrolyte solution flows in only to a limited extent from the sample entry chamber (10 here identical 6) and contaminates the isolated nucleic acid.
  • 3 has a semipermeable membrane (1 4), which prevents charged molecules from a certain molecular weight from migrating into the anode compartment (8).
  • This intermediate installation therefore has a protective function and prevents the charged molecules from penetrating into the anode compartment and from being oxidatively destroyed on the electrode surface.
  • a liquid barrier (1 3) can also be used, which is guided through corresponding guides (1 2) in the Base body (1) can be introduced in a liquid-tight and movable manner, as shown in FIGS. 4 and 5a and 5b.
  • Figure 5a shows the liquid barrier (1 3) in the open state
  • Figure 5b shows the closed state, in which the reaction channel (2) is closed by pressing the liquid barrier (1 3) into the base body (1).
  • FIG. 6 now illustrates the area of application of such a liquid barrier (1 3).
  • the corresponding device provides a corresponding tissue (5) and / or a frit (27).
  • the latter form a sample entry space (10) in the direction of the cathode (3), into which particles according to Example 4 can be introduced.
  • the charged molecules accumulate in the sampling space (7), since the liquid barrier (1 3) is initially open.
  • a sampling space (7) is created that is liquid-tight against the space (6), from which, with the help of pipettes, e.g. the charged molecules, such as nucleic acid, can be removed.
  • Fig. 8 shows a special inventive device for the use of adsorbers with magnetic properties. These can be retained at certain points in the reaction channel (2) by means of permanent magnets (17). To do this, a permanent magnet (1 7) must be brought close to the reaction channel. For electroelution, it is therefore particularly appropriate to bring a suitable permanent magnet close to the sample entry space (10) so that the particles can be drawn onto the floor or the side wall after the charged molecules have been released. With this measure, the subsequent electroelution cannot be adversely affected by the fact that they clog tissues or other internals in the reagent channel by particles. In addition to electroelution (example 4), devices according to the invention can also be used to recover nucleic acid from gels (agarose or polyacrylamide) (example 2).
  • Disks or blocks made from conventional agarose or polyacrylamide gels represent particularly suitable intermediate internals, with devices for nucleic acid isolation e.g. It was found that gels with a low degree of crosslinking, that is to say small proportions of gel filler, are particularly advantageous. Again, it turned out that the thickness of the intermediate fittings should be correspondingly thin. They are in particular 0.1-20 mm, preferably 0.5-5 mm.
  • the proportions of gel filler in shape-stabilized gels according to the invention, e.g. Agarose is 0.1-1.0%, preferably 0.1-12-4%. Attempts to produce such thin gel slices in a conventional manner fail because of the lack of dimensional stability. Surprisingly, it has now been found that these gels can be dimensionally stabilized in a wide variety of ways, so that they can then be introduced into an inventive device.
  • variant A the space between two tissues (5) is poured out with the warm, liquid gel mass. After cooling, the gel mass becomes solid and is correspondingly stabilized in shape by the tissue, so that gel layers with low agarose concentrations can also be used.
  • Examples 5 and 7 describe the production in detail. 7b shows this layer-like stabilization structure with the two tissues (5) and the gel layer (34) in between. This overall structure is referred to below as a shape-stabilized gel (33).
  • Another inventive variant B is the use of a sintered plastic as a support element which is soaked with initially still liquid gel so that after the gel has solidified, its pores are filled with gel.
  • Such sintered plastics are made of polyethylene, polypropylene or similar material and are foamed by a sintering process, so that a wide variety of capillary structures arise.
  • the dimensions of the capillaries are in particular 1 to 200 ⁇ m, preferably 20 to 1 20 ⁇ m.
  • Such form-stabilized gels serve the purpose that they are permeable to charged molecules, in particular biomolecules in certain molecular weight ranges, but that they also represent liquid barriers.
  • Example 7 describes further details of the production of this variant B.
  • Such shape-stabilized gels are widely used in a wide variety of blotting techniques.
  • tearing can occur as a result of improper handling, since it is precisely for these techniques that gels have to be transferred manually several times.
  • shape stabilization according to the invention there is a great advantage in terms of simple and safe handling when transferring the gels, since protection is provided with regard to the destruction of the gel body.
  • an electroosmotic flow (EOF) must be expected.
  • This flow triggered, for example, by capillary openings in the electroelution area, can significantly influence the electroelution process, even making it impossible.
  • the fact that individual chambers run empty in conventional systems, that is to say the transfer of almost the entire liquid volume from one chamber to another due to Electro-osmosis terminates the elution process.
  • the EOF is used in such a way that on the one hand it leads to a moderate reduction in the volume of the sampling space, but on the other hand it does not hinder the migration of the charged molecules too much, it can be concentrated, which is advantageous for the entire process. Surprisingly, it has been found that this can be achieved with shape-stabilized gels, for which further details are described in the examples.
  • Another problem is the use of a suitable voltage for the inventive transfer processes. For safety reasons, it makes sense here to remain below 42 V DC in the so-called low-voltage range, since then it is not necessary to cover the current-carrying reagent channel. Above all, this makes automation easier. Surprisingly, it was found that this can be achieved by using a buffer with higher ionic conductivity in the anode and cathode compartment.
  • the buffer can be 2 - 30 times, but preferably 5 - 1 5 times more concentrated than in the inner chambers.
  • the shape-stabilized gel is more permeable to detergents.
  • buffer gradients between the electrode chambers and the chambers in the interior can also be used according to the invention, the more concentrated buffers being used on the electrodes.
  • Multi-buffer systems have also proven to be inventive in which adjacent chambers with different buffer substances and different pH values are used. This advantage can also be used by mixing different buffers during sample entry.
  • shape-stabilized gel layers in a reaction channel according to the invention taking into account the boundary conditions described above, enables a variety of applications in which charged molecules can be transferred and at the same time the environment can be processed, as will be described in more detail below.
  • a device according to Fig. 7a with a tissue (5), a shape-stabilized gel layer (33) and a semipermeable membrane (1 4) as liquid barriers can be used as follows to isolate e.g. Nucleic acids are used. Nucleic acid is introduced into the sample entry space (10), the device is filled with electrolyte or electrophoresis buffer to such an extent that the intermediate fittings still protrude, and a DC voltage is applied to the electrodes. The nucleic acid travels through the shape-stabilized gel (33) and accumulates in front of the semipermeable membrane (1 4) in the sampling space (7). Due to the electroosmotic flow, the liquid level in chamber (7) is reduced and the nucleic acid is removed in a concentrated form. Depending on the proportion of gel filler in the stabilized gel, the nucleic acids can also be selected according to molecular weight.
  • a semipermeable membrane (14) closes off the cathode space (6) and represents the connection to the sample entry space (1 0).
  • a lysis mixture with released nucleic acids obtained from a biological sample is introduced into the sample entry chamber (10).
  • the lysis mixture contains to release the nucleic acids and destroy the biological structures detergents such as lithium, sodium dodecyl sulfate, cetylammonium bromide, ionic surfactants or ionic glycosides or the like.
  • chaotropic salts such as guanidinium thiocynate, guanidinuium hydrochloride, iodine salts, perchlorates or the like can also be used.
  • the device is filled with electrolyte solution and a voltage is applied.
  • the shape-stabilized gel (33) has a small proportion of gel filler, which is 0.1 2% -0.2% and not only retains coarser cell debris but also larger protein aggregates.
  • the released nucleic acids and the detergent eg sodium dodecyl sulfate, passes through this intermediate installation, the detergent passing through the chamber (7) into the anode chamber (8) faster than the nucleic acid due to its smaller molecular weight.
  • the shape-stabilized gel (33a) thus separates the nucleic acids from the detergent.
  • the nucleic acids are retained by this form-stabilized gel (33a) and removed from the chamber (7).
  • a semipermeable membrane has to be omitted: on the one hand, the protection provided by the shape-stabilized gel (33a) is sufficient; on the other hand, it has surprisingly been found that detergents such as SDS form-stabilized gels generally pass easily, while presumably due to mycelial formation, semipermeable membranes as detachments retain the detergent .
  • the electrophoretic process takes 1 to 30 minutes, but preferably 2 to 1 2 minutes, and can be automated very easily by placing the device according to the invention on a pipetting robot together with a suitable power supply unit. The liquids can then be pipetted automatically, and for the isolation process an electrical signal is provided by the pipetting robot to turn the power supply on and off. The isolated nucleic acid can then be removed with the robot and used for further processing.
  • Gel layers (33) and (33a) are used as liquid barriers, a modified process for isolating nucleic acids as follows.
  • particles preferably those which have magnetic properties, are introduced into the cathode compartment (6) which have been previously loaded with nucleic acid and, if appropriate, also treated with washing solutions.
  • the first fabric (5) is designed so that it retains the particles.
  • Hydrophobic macroporous particles with a large inner surface such as, for example, detergent adsorber gel [Fa. Röche Diagnostics, Mannheim Cat. No.: 1 500 678] can be used.
  • the aforementioned materials can also be used in sintered form as an intermediate installation (28) in order to bind detergents.
  • the shape-stabilized gel layer can also be used to protect the anode and replace the semipermeable membrane (14). If agarose is used, the agarose concentration for this should be 2-5%, preferably 2.5-3.5%.
  • RNA ribonucleic acid
  • mRNA messenger RNA
  • the processing of the lysis mixture consists according to the invention in a DNase digestion during the nucleic acid transfer step. Since the electrolyte solution generally has a pH of 7.25 ⁇ 0.5, this process can be carried out in a device according to FIG. 7d when using a DNase with a p1> 7, preferably p1 8-9.
  • the detergent-containing lysis mixture resulting from the biological sample is filled into the cathode chamber (6), the reaction channel is filled with electrolyte and the transfer is started by applying a voltage to the electrodes.
  • a third shape-stabilized agarose gel can also be used. Nucleic acids, in this case DNA and RNA, pass this intermediate installation together with the detergent if it is also negatively charged. However, the detergent migrates faster and sometimes also passes through the subsequent shape-stabilized gel (33). In this way, the chamber (35) becomes detergent-free and DNA degradation can be carried out using DNase, which is inhibited by detergents. For this purpose, the voltage is interrupted and a DNase solution is added to the reaction chamber (35), if necessary briefly incubated, and the transfer process is then continued.
  • the Suitable inventive selection of the p1 value of the DNase can be achieved so that it is separated from the remaining RNA and an RNA preparation can be removed DNase-free from the chamber (7).
  • the corresponding detergent has meanwhile penetrated through the shape-stabilized gel (33a) into the anode chamber (8). Due to its pl value, the DNase is, for example, positively charged and migrates in the opposite direction to the RNA.
  • the DNA is digested by means of DNase bound to the solid phase, which is pipetted into chamber (35).
  • This variant has the advantage that it is independent of the pl of the DNase used. This also applies when using thermolabile DNases, which can be destroyed in the subsequent RT-PCR, for example in a first heating step.
  • the nuclease migrates together with the nucleic acid.
  • FIG. 7e with an additional form-stabilized gel (33b) compared to FIG. 7d at the cathode (3), in which the nuclease is filled with the electrolyte into the reaction chamber (35b) and the lysed sample into the sample entry chamber (10) the nuclease migrates slower than the detergent but faster than the DNA from the sample and destroys it.
  • the pI of the complete proteinase K is at pH 6.60, whereas the pI of a particularly active partial fragment (amino acids 106-384) is 8.25.
  • This fragment is particularly suitable for inventive use, since it is positively charged at neutral pH and migrates to the cathode and does not migrate into the sampling space.
  • a further possibility is also that solid phase-bound proteinase K or else solid phase-bound antibodies against the DNase are added to the still liquid gel and are thus kept in a shape-stabilized gel layer, which in turn saves a pipetting step.
  • a comparable application is the removal of RNA from a DNA / RNA mixture by treatment with RNase or the isolation of protein mixtures using analogous methods.
  • FIG. 7g An agarose flat bed gel (36) with three incorporated pockets, which are used as a sample entry chamber (1 0), reaction chamber (35) and sample removal chamber (7). Care must be taken to ensure that the electrolyte does not rise above the upper edge of the flatbed gel in order to avoid mixing of the various reactants, especially in chamber (35).
  • the processes described here cannot be carried out in devices of this type, since the chambers (35) and (7) run empty as a result of EOF and thus no stable electroelution is possible.
  • Fig. 1 a Perspective view: Rectangular reaction channel with intermediate installation
  • Fig. 1 b Top view: Rectangular reaction channel with constriction
  • Fig. 1 i basic element with electrode holders and clamping
  • Fig. 1 j basic element with opening and clamping
  • FIG. 2a Top view: reaction channel with intermediate installation
  • Fig. 2b section reaction channel with intermediate installation
  • Fig. 7b device for electroelution with shape-stabilized gel after
  • Fig. 7e device with three form-stabilized gel layers Fig. 7f perspective view of a flat bed gel
  • Reaction chambers Fig. 7g section through a flat bed gel with reaction chambers
  • Fig. 10a pieces of agarose gel before and after electroelution
  • Fig. 10b Agarose gel for electroelution with device Fig. 9a
  • Fig. 1 1 Agarose gel for electroelution with device Fig. 9b
  • Fig. 1 2 Agarose gel for nucleic acid isolation from yeast by means of
  • Example 5 Fig. 14 Standard agarose gel for analysis of electroelution according to example 7
  • Fig. 1 9 standard agarose gel for analysis of the isolation genomic
  • DNA from yeast after amplification in a kinetic 25 electroelution of a fluorescent dye in a device with four chambers, the charged dye migrating through a shape-stabilized gel.
  • the structure of the device used is as follows (from left to right :)
  • Anode chamber anode.
  • FIG. 26 shows a schematic representation of the device from FIG. 25.
  • Fig. 27 Results of a radioimmunoassay using electroelution.
  • Electrode A e.g. cathode
  • electrode B e.g. anode
  • reaction chamber or chamber open
  • a device according to Fig. 9a with two fabrics (5) [No. 07/5/1 from SEFAR, Rüschlikon, Switzerland] and a semipermeable membrane (14) [Size 3; Medicell Int. Ltd., London, UK], which then delimit a cathode space (6), a sample entry space (10) and an anode space (8).
  • the device was made up of individual basic elements according to FIG. 1 c [No. : 01 1 1 1 20 005 05; J. Pützfeld B.V., Amsterdam, Netherlands].
  • the device was filled with electrophoresis buffer (10 mM Tris / acetate [from Roth, Düsseldorf], 1 mM EDTA [from Sigma], pH 8.0) and a voltage of 40-80 was applied to the electrodes (3,4) V applied at a constant 10 mA for 10 min.
  • electrophoresis buffer (10 mM Tris / acetate [from Roth, Düsseldorf], 1 mM EDTA [from Sigma], pH 8.0) and a voltage of 40-80 was applied to the electrodes (3,4) V applied at a constant 10 mA for 10 min.
  • the following table shows the volumes in the individual chambers before and after electroelution.
  • the excised agarose gel was brought into the sample entry space and the entire device according to Fig. 9 a was filled with 1.9 ml electrophoresis buffer (see above). A voltage between 40-60 V at a constant 10 A for 7 or 10 minutes was applied to the electrodes with an electrophoresis transformer. created.
  • Fig. 10 b shows the result of the electroelution in a standard agarose gel (see above):
  • the device was assembled as described in Example 1.
  • Fig. 1 1 shows the result of the electroelution in a standard agarose gel (see above) with withdrawals from the sample entry space and immediately next to it, sample removal space in a kinetics of 0-1 0 min. M denotes the track of the marker as in Example 1. 4.) Isolation of nucleic acid from yeast using magnetic particles and electroelution
  • a device with a fabric (5) [Fa. SEFAR see Example 1] and a dialysis membrane [Fa. Medicell see Example 1] as used in Fig. 9c.
  • the lysis and the binding and washing of the magnetic particles were carried out in accordance with US Pat. No. 5,705,628. After the last washing step, the magnetic particles were separated, the washing solution was carefully removed and the particles were taken up in 150 ⁇ l elution buffer (see Example 1 for electrophoresis buffer).
  • the suspension was then filled into the sample entry chamber (in this case identical to the cathode compartment (6)) of a device according to FIG. 9 c that had already been filled with elution buffer.
  • the electroelution was carried out by applying a voltage of 40-70 V at 1 mA current flow for 5 min.
  • the nucleic acid was pipetted from the removal chamber and subjected to agarose gel electrophoresis as in Example 1.
  • Fig. 1 2 shows the associated gel picture.
  • a device according to FIG. 7a with a fabric (5) [No. 07/5/1 from SEFAR, Rüschlikon, Switzerland] and a semipermeable membrane (14) [Size 3; Medicell Int. Ltd., London, UK], which initially delimit a cathode compartment (6) and an anode compartment (8).
  • a shape-stabilized gel (33) is introduced between these two internals, which delimits a sample entry space (10) and a sample removal space (7), each with a volume of approximately 250 ⁇ l.
  • the device was made up of individual basic elements [No. : 01 1 1 1 20 005 05 J. Pützfeld B: V., Amsterdam, Netherlands].
  • the gel was dimensionally stabilized as follows: A sintered plastic [pore size 45-90 ⁇ m, No. X-4899, from Porex., Singwitz] was mixed in a heated mixture of agarose (0.4% - 3%) [ Fa. Sigma, Kunststoff] and electrophoresis buffer 1 0 mM Tris / acetate [Fa. Roth, Düsseldorf] with 1 mM EDTA [Fa. Sigma] pH 8.0), the agarose was allowed to solidify and the shape-stabilized gel (33) was introduced into the device according to FIG. 7a.
  • Electrodes were with an electrophoresis transformer [Fa. Hölzel, Dorfen] a voltage of 50 - 500 V at a constant 10 mA for 10 min. created.
  • Fig. 13 shows the result of the electroelution with different agarose concentrations in the shape-stabilized gel, wherein both withdrawals from the sample entry space (10) and from the sample removal space (7) were analyzed using a 0.8% standard agarose gel (see above) with a kinetics of 0-10 min.
  • gel traces is the time after which DNA was detectable on a gel. Agarose conc. Gel traces in stable shape. Gel (33)
  • the volume in the sampling space (7) is reduced, so that the eluted nucleic acid is concentrated accordingly.
  • a device according to FIG. 7b which contains a shape-stabilized gel according to variant B.
  • the preparation was carried out as follows: Two layers of tissue (5) were placed in the device at a distance of approximately 2 mm and the interspace was filled with a heated mixture of agarose (0.4%) and electrophoresis buffer. The agarose was cooled and thus allowed to solidify.
  • Fig. 1 4 shows the result of electroelution, both Withdrawals from the sample entry space (10) and from the sampling chamber (7) were analyzed using an 0.8% standard agarose gel (see above) with an elution rate of 0-1 0 min. Agarose conc. Gel traces in stable shape.
  • FIGS. 7b and 7 were used with a shape-stabilized gel of variant B with 0.4% agarose used.
  • the entire device according to FIG. 7b was operated as in Example 1.
  • the volume in the sampling chamber (7) is reduced, so that the eluted nucleic acid is concentrated accordingly.
  • Example 5 A device according to FIG. 7c and Example 5 with a shape-stabilized gel (33) of variant A with 0.8% agarose was used for this application.
  • the entire device was operated with a 10-fold concentrated electrophoresis buffer in the anode compartment (6). 1 0 mA were achieved with this arrangement with a voltage of 20 - 25 V.
  • the volumes were determined before us after electroelution as follows:
  • This example shows a minimum of electroosmotic flow at low voltage range for electroelution, which can also be advantageous for some applications.
  • a device according to FIG. 7f with a dialysis membrane (14) [Fa. Medicell see Example 1] and two dimensionally stabilized gels (33 and 33a) were used.
  • the agarose concentration was 0.2% in (33) and 2% in (33a) with shape stabilization according to variant A.
  • Anode (8) and cathode compartments (6) were each filled with 600 ⁇ l of a 10-fold concentrated electrophoresis buffer as in Example 1 and the remaining chambers (7) with 1 50 ⁇ l of a 1-fold concentrate.
  • the electroelution was carried out by applying a voltage of 7.5 V at 10 mA current flow for 5 min or 10 min.
  • the nucleic acid was pipetted from the removal chamber (7) and subjected to agarose gel electrophoresis as in Example 1.
  • Fig. 1 6 shows the associated gel picture.
  • Lane content M marker ( ⁇ -Hindlll): 23, 1 1 9.4 j 6.614.4 ' t 2.31 2.0
  • the gel picture shows the genomic DNA and RNA.
  • Shape-stabilized gel (33) was prepared with 0.4% agarose and (33a) with 4% agarose.
  • a sodium dodecyl sulfate solution in electrophoresis buffer (see above) was used in the sample entry chamber (10) in a concentration of 0.1% and 1%, respectively, and subjected to electroelution as in Example 11. Thereafter, 1 ⁇ l of the solutions from the sample entry chamber (10), the sampling chamber (7) and the anode chamber (8) were added to a standard PCR of the BCY gene of the yeast, as described in more detail in Example 1 3. The PCR products were analyzed using an agarose gel and FIG. 17 shows the result.
  • the agarose concentration was 0.15% in (33) and in (33a) with shape stabilization according to variant A.
  • Anode (8) and cathode compartments (6) were each filled with 600 ⁇ l of a 10-fold electrophoresis buffer as in Example 1 and the remaining chambers (7) with 1 50 ⁇ l of a 1-fold concentrate.
  • the electroelution was carried out by applying a voltage of 7.5 V at 1 mA current flow for 2 min.
  • the nucleic acid was pipetted from the removal chamber (7) and subjected to agarose gel electrophoresis as in Example 1.
  • Fig. 1 8 shows the associated gel picture. Trace content
  • a shape-stabilized gel (33a) together with an anode chamber (8), filled with a buffer concentration 10 times higher than in the sampling chamber (1 0), represents a barrier to the nucleic acid, comparable to a semipermeable membrane.
  • the program includes the following steps:
  • genomic yeast DNA was obtained from a SDS-containing lysis mixture with electroelution, which was subsequently used directly in a PCR.
  • Example 1 3 For this application, a device according to FIG. 7f according to Example 1 3 was carried out. In contrast to Example 1 3, 50 ⁇ l detergent adsorber [Röche Diagnostics Mannheim, Cat. No. 1 500 678] was added after lysis and the resulting mixture was added to the sample entry chamber. The electroelution was carried out at a voltage of 1 0, 1 V and 1 0 mA current for 1 0 min.
  • Example 1 3 For this application, a device according to FIG. 7f according to Example 1 3 was carried out.
  • 50 ⁇ l of a phosphate buffer (250 mM pH 7.0) consisting of Na 2 HPO 4 and NaH 2 PO 4 was obtained after lysis [Merck, Darmstadt, Cat. No. 1 .06580J 000 or 1 .06346J 000] was added and the resulting mixture was added to the sample entry chamber.
  • the electroelution was carried out at a voltage of 8.6 V and 10 mA current for 10 minutes.
  • the gel was shape-stabilized as follows: A sintered plastic [pore size 45-90 ⁇ m, No. X-4899, from Porex., Singwitz] was mixed in a heated mixture of agarose (0, 4% - 3%) [Fa. Sigma, Kunststoff] and electrophoresis buffer 10 mM Tris / acetate [Fa. Roth, Düsseldorf] with 1 mM EDTA [Fa. Sigma] pH 8.0), the agarose was allowed to solidify and the shape-stabilized gel (33) was introduced into the device according to FIG. 7a.
  • variant B the production of a shape-stabilized Gesl was carried out as follows: Two layers of tissue (5) were placed in the device at a distance of approx. 2 mm and the space in between was filled with a heated mixture of agarose (0.4%) and electrophoresis buffer . The agarose was cooled and thus allowed to solidify.
  • Variant C with acrylamide
  • Electrode chambers consisting of two electrode chambers, each with a volume of 600 ⁇ l, an entry chamber (1 0) [1 60 ⁇ l] and a removal chamber [1 60 ⁇ l], with the intermediate fittings dialysis membrane (1 4), and two shape-stabilized gels (33, 33a) according to variant A with 0.2% agarose
  • the electrode chambers were each with twice 600 ⁇ l 1 0 times concentrated electrophoresis buffer from Example 17, the removal chamber (7) with 1 50 ⁇ l electrophoresis buffer (see before) and the entry chamber (10) with a solution of Cascade ® -Blue-biocytin (0.067 mg / ml) [Molecular Probes, Eugene, USA; Order No .: C-6949] filled in electrophoresis buffer as in Example 1.
  • the device according to the invention was on a UV light table [Fa. Vilbert Lourmat, Marne la Vallee, France; Order No .: TFX-20M] and provided with a money detection system [EDAS 1 20, Kodak, Rochester USA].
  • 25a shows the arrangement at the time 0 seconds as the starting point.
  • a fluorescent band of the dye can be seen in the entry chamber (10).
  • a voltage of approximately 7.5 V was then applied at a constant 15 mA current flow for 120 seconds.
  • Figure 25b shows a band of the dyes in the sampling chamber.
  • T3 triiodothyronine
  • 50 .mu.l sample or standard were with 50 .mu.l anti-T3 antiserum and 50 .mu.l T3 tracer each from the above test kit for 1.5 hours at room temperature incubated.
  • 80 ⁇ l of the incubation mixture and 80 ⁇ l electrophoresis buffer were mixed and filled into the sample entry space (1 0) of a 4-chamber device as shown in FIG.

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Abstract

Es wird eine nach oben offene Vorrichtung zur Elektroelution von geladenen Molekülen in einem Reaktionskanal (2) mit Elektroden (3, 4) an den Enden und mindestens einem Zwischeneinbau (28) beschrieben. Die Vorrichtung ist insbesondere für die Automatisierung in einem x,y,z-Roboter ausgelegt.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von elektrisch geladenen Molekülen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Isolierung von geladenen Molekülen mit einem breiten Anwendungsfeld zum Beispiel bei der Isolierung von elektrisch geladenen Molekülen in Rezeptor- Liganden-Gemischen oder bei der Probenvorbereitung von Nukleinsäuren.
Vor allem für letztere Anwendung können spezielle elektrophoretische Prozesse wie zum Beispiel die Elektroelution zur Anwendung kommen, wie sie in WO 97/34908 und WO 98/58251 beschrieben ist. Bei diesem Verfahren werden geladene Moleküle zunächst an einen Adsorber gebunden und dann in einem Elektroelutionsverfahren wieder freigesetzt, in ein Entnahmevolumen transferiert und dort auch konzentriert. Weitere Vorrichtungen zur Elektroelution sind z.B. in US 5340449 sowie US 4608147 beschrieben. Die dort beschriebenen Vorrichtungen sind jedoch nicht für Verfahren nach WO97/34908 ausgelegt oder vorgesehen, sondern umfassen geschlossene und verschraubte Kammersysteme. Diese werden dann in einem Elektrophoresepuffertank entsprechend verankert, wobei das Kammersystem hermetisch gegen den Elektrophoresepuffertank abgeriegelt ist. Ein wesentlicher Nachteil dieser Vorrichtungen besteht darin, daß sie für eine Automatisierung in einem Pipettierroboter nicht geeignet sind. Somit können sie nicht für Standardverfahraen mit einem großen Probendurchsatz eingesetzt werden.
Bei der Entwicklung von nach oben offenen Elektroelutionsvorrichtungen muß der Tatsache Rechnung getragen werden, daß, je nach dem wie die Gestaltung im Detail aussieht, mit einem elektroosmotischen Fluß (EOF) gerechnet werden muß. Einzelheiten dazu sind z.B. in „Capillary Electrochromatography - Technology and Applications" (CEC-Guidebook Hewlett-Packard Publication Nr.: 5968-3231 E) Kapitel 2 und „Analysis of Nucleic Acids by Capillary Electrophoresis" (Chr. Heller (Ed.) ISBN 3-528- 06871 -X, 1 997) Seite 24 ff beschrieben. Dieser Fluß, ausgelöst z.B. durch Kapillaröffnungen in dem Eiektroelutionsbereich, kann das Elektroelutionsverfahren erheblich beeinflussen, ja sogar unmöglich machen.
Besonders schwerwiegend ist das Problem, daß bei herkömmlichen Vorrichtungen aufgrund des Auftretens eines elektroosmotischen Flusses eine der Kammern leerläuft, bevor die gewünschte Isolierung abgeschlossen werden kann. Um ein solches Leerlaufen einer der Kammern zu vermeiden, sind bisher komplizierte Maßnahmen, wie etwa ein Flüssigkeitsaustausch zwischen der Anoden- und der Kathodenkammer, zum Ausgleich des elektroosmotischen Flusses notwendig.
Eine Aufgabe der Erfindung bestand deshalb darin, eine Vorrichtung zur Isolierung von geladenen Molekülen bereitzustellen, welche automatisierbar ist und bei welcher die aufgrund des elektroosmotischen Flusses auftretenden Probleme des Standes der Technik zumindest teilweise beseitigt sind.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung und ein Verfahren gelöst, wie sie in den Ansprüchen beschrieben sind.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Isolierung von elektrisch geladenen Molekülen besteht aus einem nach unten geschlossenen Grundkörper mit mindestens einem nach oben offenen Kanal und mindestens zwei Elektroden als rechten und linken äußeren Begrenzungen des Kanals, und ist dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Elektroden im Kanal ein oder mehrere Zwischeneinbau(ten) angeordnet sind, die den Kanal in zwei oder mehr Kammern teilen. Die Verwendung eines zumindest in den Probeeintrags- und Probeentnahmebereichen nach oben offenen Kanals ermöglicht die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in automatisierten Verfahren, beispielsweise mit Pipettierrobotern oder x,y,z-Robotern. Weiterhin wird durch die Zwischeneinbauten der elektroosmotische Fluß verhindert bzw. reduziert. Die Zwischeneinbauten lassen insbesondere nur einen geringen elektroosmotischen Fluß zu, der für eine Aufkonzentrierung gewünscht ist, der aber nicht zum Leerlaufen einer Kammer führt, so daß eine Elektroelution von geladenen Molekülen möglich ist. Die Zwischeneinbauten der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind somit insbesondere für elektrisch geladene Moleküle durchlässig, stellen aber andererseits eine Flüssigkeitssperre dar, durch die der elektroosmotische Fluß begrenzt werden kann. Je nach Anwendung ist es dabei möglich, den elektroosmotischen Fluß vollständig zu verhindern oder aber einen geringen osmotischen Fluß zuzulassen, der vorteilhafterweise zur Aufkonzentrierung eingesetzt werden kann. Bevorzugt wird durch die Zwischeneinbauten der erfindungsgemäßen Vorrichtungen der elektroosmotische Fluß derart begrenzt, daßdas Volumen der Probeeintrags- bzw. Probeentnahmekammer innerhalb eines Zeitraums von maximal 60 Minuten, bevorzugt maximal 30 Minuten und besonders bevorzugt maximal 1 0 Minuten und mindestens 30 Sekunden, bevorzugt mindestens 1 Minute und mehr bevorzugt mindestens 2 Minuten einer Elektroelution nicht mehr als 90 Volumen-%, bevorzugt nicht mehr als 50 Volumen-% und besonders bevorzugt nicht mehr als 30 Volumen-% abnimmt. Es ist aber auch möglich, den elektroosmotischen Fluß derart zu beschränken, daß das Kammervolumen in den angegebenen Zeitintervallen nicht mehr als 1 0 Volumen-%, bevorzugt nicht mehr als 5 Volumen-% abnimmt.
Während die erfindungsgemäße Vorrichtung bei beliebigen Spannungen betrieben werden kann, werden bevorzugt Spannungen < 250 V und insbesondere Spannungen < 42 V verwendet. Die Größe der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann je nach Anwendungszweck beliebig gewählt werden, beispielsweise im Produktionsmaßstab von einigen Litern oder größer bis hin zu miniaturisierten Vorrichtungen mit einigen Mikrolitern Kammervolumen, beispielsweise zur Anwendung auf herkömmlichen Mikrotiterplatten, wie unten beschrieben. Bevorzugt beträgt das Volumen des nach oben offenen Kanals 0,01 bis 5 ml, mehr bevorzugt von 0,2 bis 2 ml.
Grundsätzlich können mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung alle elektrisch geladenen Moleküle einschließlich deren übergeordneter Strukturen, wie etwa Komplexe, Cluster, spezifische Bindepaare usw. isoliert werden.
Beispiele für bevorzugte elektrisch geladene Moleküle sind Biomoleküle, wie etwa Nukleinsäuren, insbesondere DNA, RNA, Proteine und andere
Naturstoffe sowie Farbstoffe. So kann die Vorrichtung z.B. zur Proteingemischanalyse und für Immunoassays eingesetzt werden. Ein besonders interessantes Anwendungsfeld ist die Verwendung der
Vorrichtung zur Elution von Proteinen aus Gelen, beispielsweise aus zweidimensionalen Elektrophoresegelen. Diese Technik wird insbesondere bei Proteomics zur Bestimmung der Proteinfunktionen der bei den Genomprojekten (z.B. Hugo) aufgefundenen DNA-Sequenzen angewendet.
Erfindungsgemäß kann aber auch die Nukleinsäure selbst isoliert werden.
Es wurde festgestellt, daß mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung Moleküle in einem großen Molekulargewichtsbereich von kleiner als 1 00 Da bis zu mehr als einigen Millionen Da isoliert werden können. So wurde beobachtet, daß neben kleinen Molekülen, wie etwa Farbstoffmolekülen oder Polypeptiden, auch große Moleküle, wie etwa genomische Hefe-DNA, die Zwischeneinbauten durchdringen und somit isoliert bzw. gereinigt werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht mindestens eine der Zwischeneinbauten aus einem formstabilisierten Gel. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daßGele, beispielsweise ein Agarose-Gel, in einer geringen Konzentration, beispielsweise von 0, 1 % Gel bis 10 % Gel, bevorzugt 0,2 % Gel bis 1 ,2 % Gel, mehr bevorzugt bis 0,8 % Gel hervorragende Trenn- bzw. Filtereigenschaften aufweisen, wobei geladene Teilchen durchgelassen werden, während der unerwünschte elektroosmotische Fluß auf ein Minimum begrenzt wird. Problematisch bei Gelen in solch geringer Konzentration ist aber, daß sie formstabil oder mechanisch sehr instabil sind und daraus keine Folien oder Filme hergestellt werden können, die als Trennelemente verwendet werden könnten. Es wurde nun festgestellt, daß durch Formstabilisierung von solchen Gelen mechanisch stabile Elemente mit den oben genannten vorteilhaften Eigenschaften erhalten werden können. Die Erfindung betrifft deshalb auch solche formstabilisierten Gele sowie deren Verwendung als Zwischeneinbau in der oben beschriebenen Vorrichtung.
Bevorzugte Gele sind leicht deformierbare, an Flüssigkeiten bzw. Gasen reiche disperse Systeme aus mindestens zwei Komponenten, bestehend aus einem festen kolloid zerteilten Stoff mit langen oder/und stark verzweigten Teilchen und einer Flüssigkeit, insbesondere Wasser. Beispiele für geeignete Gele sind Polysaccharid- und Proteingele, wie etwa Gelatine, Agar-Agar, Carrageen, Alginate, Alginsäure, Phyllophoran, Furcellaran, Agarose u.a., sowie Polymergele, wie etwa Polyacrylamidgele.
Erfindungsgemäß werden die stabilisierten Gele als Trennelemente, also z.B. als Trennfilter oder Trennmembranen, eingesetzt und nicht als Trägermaterial. Sie werden bevorzugt als dünne Scheiben mit einer Dichte von mindestens 0, 1 mm und bevorzugt 0,5 mm, und maximal 20 mm, bevorzugt maximal 5 mm und besonders bevorzugt maximal 2 mm eingesetzt. Die Moleküle durchwandern dabei die Gele quer, also durch die dünnste Dimension. Die Formstabilität wird bevorzugt durch ein Stützelement erzielt, auf bzw. in das das Gel eingebracht wird. Besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von gesintertem Kunststoff, beispielsweise gesintertem Polypropylen oder Polyethylen mit einer Porenweite von 1 bis 200 μm, bevorzugt von 20 bis 1 20 μm verwiesen. Aber auch durch die Verwendung von Geweben, beispielsweise aus Kunststoffen wie etwa Polyester oder Polyamid, mit einer Maschenweite von 0, 1 bis 500 μm, bevorzugt von 0,5 bis 1 0 μm als Stützelement lassen sich hervorragende Ergebnisse erzielen.
Durch den Vernetzungsgrad des Gels kann die Durchlässigkeit des formstabilisierten Gels eingestellt werden. Es ist dabei möglich, die Durchlässigkeit derart zu wählen, daßdas gewünschte geladene Molekül bei den angelegten Spannungen durch das Gel durchtritt und dann aus der Probeentnahmekammer gewonnen werden kann. Für viele Anwendungen kann es aber auch vorteilhaft sein, den Vernetzungsgrad so zu wählen, daß das geladene Molekül im Gel hängen bleibt und dann in weiteren Schritten aus dem formstabilisierten Gel wieder rückgewonnen wird. Ein Hängenbleiben des gewünschten Analyten im Gel kann auch durch geeignete Derivatisierung mit funktioneilen Gruppen, die spezifisch (z.B. Streptavidin bzw. Biotin) oder unspezifisch (z.B. hydrophile oder hydrophobe Gruppen) an den Analyten binden, erreicht werden.
Weiterhin ist es möglich, als Zwischeneinbau eine Flüssigkeitssperre zu verwenden, die sich öffnen und schließen läßt.
In einer weiteren Ausführungsform wird als Zwischeneinbau ein Gewebe verwendet. Hierbei kann es bevorzugt sein, daß unter den Elektroelutionsbedingungen ein geringer elektroosmotischer Fluß von der Anode zur Kathode durch das Gewebe erzeugt wird. Um einen Durchtritt von elektrisch geladenen Teilchen bei gleichzeitigem Vermeiden eines übermäßigen elektroosmotischen Flusses zu erzielen, weist das Gewebe bevorzugt eine Maschenweite von 0, 1 bis 50 μm, bevorzugt von 0,5 bis 5 μm auf. Die Absorption von elektrisch geladenen Molekülen an das Gewebe ist bevorzugt kleiner als 40 %, besonders bevorzugt kleiner als 10 %, um einen Durchtritt des gewünschten Analyten in die Probeentnahmekammer zu ermöglichen. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erhalten, wenn das Gewebe durch Kalandrieren behandelt wurde.
Insbesondere bei einer Abtrennung von Analyten aus biologischen Proben von beispielsweise Zellresten wird die Maschenweite so abgestimmt, daß biologisch aktive Partikel definierter Größe nicht durch das Gewebe dringen können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt eine flexible Handhabung und entsprechende Ausgestaltungen, je nach der beabsichtigten Anwendung. Beispielsweise können Mehrkammersysteme eingesetzt werden, falls der gewünschte Analyt, beispielsweise eine Nukleinsäure oder ein Protein, nicht als erstes Molekül der Probemischung den Zwischeneinbau passiert. Dies kann beispielsweise bei der Verwendung von Detergentien zur Lyse von Zellen der Fall sein. Hier wird die Anordnung vorteilhafterweise so gewählt, daß die Detergentien, die als erstes durch den Zwischeneinbau gelangen, durch den Probeentnahmeraum hindurch in eine weitere Kammer elektroeluiert werden.
Weiterhin ist es möglich, gewünschte Moleküle, die selbst unter den angelegten Bedingungen keine Ladung aufweisen, durch Träger mit Ladungen zu versehen, beispielsweise durch die Verwendung von spezifischen geladenen Antikörpern oder Hybridisierungssonden. Weiterhin ist es möglich, die erfindungsgemäße Vorrichtung mehrdimensional zu gestalten, beispielsweise in Form eines Kreuzes, wodurch eine mehrdimensionale Auftrennung möglich wird.
Besonders bevorzugt ist eine Vorrichtung mit mindestens vier Kammern, wobei die Anoden- und Kathodenkammer, die benachbart zur Anode bzw. Kathode liegen, im Vergleich zu den dazwischenliegenden Probeeintragsbzw. Probeentnahmekammern relativ groß sind. Bevorzugt weisen die Kathoden- und Anodenkammer ein Volumen von 5 bis 20 : 1 zum Volumen der Probeentnahme- bzw. Probeeintragskammer auf. Auf diese Weise kann das Probevolumen gering gehalten werden, während auf der anderen Seite das Volumen an den Elektroden groß ist, so daß dort möglicherweise auftretende unerwünschste Nebenreaktionen weniger ins Gewicht fallen.
Eine Verringerung des Volumens der Probeentnahme- bzw. Probezugabekammer im Vergleich zur Anoden- bzw. Kathodenkammer kann beispielsweise dadurch erzielt werden, daß der nach oben offene Kanal in der Mitte eine Verjüngung aufweist.
Zusätzlich zu den unterschiedlichen Volumina wird bevorzugt auch eine unterschiedliche Pufferkonzentration in den einzelnen Kammern eingesetzt, wobei die Pufferkonzentration in der Anoden- bzw. Kathodenkammer bevorzugt 5 bis 20 : 1 zum Volumen der Probeeintrags- bzw. Probeentnahmekammer beträgt. Neben der Pufferkonzentration kann auch der pH-Wert in den einzelnen Kammern unterschiedlich eingestellt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, wie sie beispielsweise in Figur 26 dargestellt ist, besteht die Vorrichtung aus vier Kammern. Ausgehend von der Kathode auf der linken Seite ist zunächst eine Kathodenkammer, die relativ groß ist, beispielsweise ein Volumen von 1 ,6 ml aufweist und einen hochmolaren Puffer, beispielsweise in einer Konzentration von 1 00 mM, enthält. Diese Kammer wird durch eine Membran von der Probeneintragskammer getrennt, welche ein geringeres Volumen, beispielsweise 1 60 μl, und eine geringere Pufferkonzentration, beispielsweise 10 mM, aufweist. Zwischen der Probeeintrags- und der Probeentnahmekammer befindet sich ein formstabilisiertes Gel, beispielsweise ein Agarosegeltrennfilter, der aus einem mit Agarosegel gefüllten gesinterten Kunststoff besteht. Die Probeentnahmekammer weist wiederum ein geringes Volumen, beispielsweise 1 60 μl, und eine geringe Pufferkonzentration, beispielsweise 10 mM auf. Als Trennung zwischen der Probeentnahmekammer und der Anodenkammer wirkt in dieser bevorzugten Ausführungsform ein weiterer stabilisierter Agarosegelfilter. Die Anodenkammer selbst ist wieder relativ groß, beispielsweise 1 ,6 ml, und weist eine hohe Pufferkonzentration, beispielsweise 1 00 mM, auf. Ein Durchtreten des gewünschten Analyten bei einer Elektroelution durch den zweiten Gelfilter wird zum einen durch geeignetes Einstellen der Separationszeit und zum anderen d urch Einstellung der Pufferkonzentrationen in der Probeentnahmekammer und der Anodenkammer verhindert. Es wurde festgestellt, daß eine hohe Pufferkonzentration im Anoden- und Kathodenraum im Vergleich zum Probeentnahme- und Probeeintragsraum einen zusätzlichen günstigen Einfluß auf die Trennleistung der Vorrichtung und auf eine Verringerung des osmotischen Flusses hat. Die aus der Probeentnahmekammer entnommene Probe kann beispielsweise mittels Massenspektrometrie analysiert oder mittels PCR weiter verarbeitet werden.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, daß während der Transferschritte eine Prozessierung des Analyten erfolgen kann. Bevorzugt findet in den Kammern eine enzymatische Reaktion oder eine Rezeptor/Liganden-Bindung, insbesondere während des elektrophoretischen Transfers der geladenen Moleküle, statt.
Eine weitere Verbesserung der Trenneigenschaften kann durch reversibles Anlegen eines magnetischen Feldes in der Umgebung mindestens einer Elektrode erreicht werden.
Die Elektroden können aus leitfähigen Materialien, z.B. Metallen, und bevorzugt aus leitfähigen Kunststoffen hergestellt sein. Die gesamte Vorrichtung kann auch aus einzelnen Modulen im Baukastensystem zusammengesetzt werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann beispielsweise für das Separieren der freien von der gebundenen Phase bei Rezeptor-Liganden-Assays, zur Isolierung von Nukleinsäuren, zur Isolierung von DNA ohne Kontamination durch RNA oder zur Isolierung von RNA ohne Kontamination durch DNA eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von elektrisch geladenen Molekülen, welches in einer wie oben beschriebenen Vorrichtung durchgeführt wird.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von geladenen Molekülen in Gemischen mit elektrophoretischen Mitteln in einem Reaktionskanal, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Gemisch in flüssiger Form in einen Reaktionskanal eingebracht wird, einer Elektrophorese im Reaktionskanal unterworfen wird, bei dieser Elektrophorese im Reaktionskanal weiter prozessiert wird und nach dieser Prozessierung die isolierten geladenen Moleküle in löslicher Form aus dem Reaktionskanal entnommen werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das Ausgangsgemisch während der Elektrophorese weiter verarbeitet bzw. prozessiert, wodurch eine deutliche Vereinfachung des Gesamtverfahrens erzielt werden kann. Beispielsweise kann bei der Elektrophorese im Reaktionskanal eine Liganden- Rezeptor-Bindung, eine enzymatische Reaktion oder/und eine Aufkonzentrierung stattfinden.
Durch Verwendung einer wie oben beschriebenen Vorrichtung, insbesondere einer Vorrichtung, in der ein oder mehrere formstabilisierte Gele bzw. andere der oben beschriebenen Einbauten dem Reaktionskanal in verschiedene Kammern unterteilen, kann bei der Elektrophorese der elektroosmotische Fluß derart reduziert werden, daß eine Elektroelution von geladenen Molekülen möglich ist, ohne daß eine der Kammern leerläuft. Besonders bevorzugt wird als Gemisch eine lysierte biologische Probe, beispielsweise lysierte Zellen eingesetzt. Weiterhin ist es möglich, die freie und die gebundene Phase von einem Liganden-Rezeptor-Assay, insbesondere von einem immunoassay, zu trennen und dadurch eine quantitative Bestimmung zu ermöglichen.
Weiterhin kann auch durch Abtrennen von Komponenten mit einer Markierung, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, einer Enzymmarkierung, einerfluoreszierenden oder lumineszierenden Markierung aus einem Gemisch eine quantitative Bestimmung durchgeführt werden.
Die Elektroelution wird insbesondere unter solchen Bedingungen ausgeführt, daß die Konzentration an Detergenz in der entnommenen Lösung mit den isolierten geladenen Molekülen kleiner ist als die Konzentration des Detergenz in der ursprünglich in den Reaktionskanal eingebrachten Lösung einer lysierten Probe. Es kann auch vorteilhaft sein, zur Lysemischung vor der Elektroelution mindestens eine weitere Pufferkomponente zuzugeben.
Werden, wie hier beschrieben, Vorrichtungen eingesetzt, die nach oben geöffnet sind, können mit Hilfe einer automatisierbaren Pipettiervorrichtung Probengemische, z.B. Nukleinsäuren bzw. Adsorber (z.B. in Partikelform), an die Nukleinsäuren gebunden sind, eingebracht werden. Solche Vorrichtungen sind generell für die Automatisierung mit der Verwendung von Pipettierrobotern (z.B. von der Firma TECAN, Rosys, Canberra Packard und Beckman) geeignet.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen ermöglichen einerseits eine Automatisierung mit nach oben offenen Vorrichtungen und tragen andererseits den Anforderungen des elektroosmotischen Flusses Rechnung. Sie lassen sich überraschenderweise für Verfahren einsetzen, bei der Nukleinsäuren an Adsorber gebunden werden, die dann in eine Probeneintragskammer eingebracht und anschließend einer entsprechenden Elektroelution mit Probenaufkonzentration unterworfen werden. Bei der Probenvorbereitung speziell von Nukleinsäuren aber auch von anderen geladenen Molekülen hat es sich gezeigt, daß es für eine möglichst einfache Handhabung - auch im Hinblick für eine Automatisierung - mit dem Transfer, also der räumlichen Veränderung der geladenen Moleküle noch ein weiterer Prozeßschritt verknüpft werden sollte. Dieser Prozeßschritt kann eine Veränderung der geladenen Moleküle selbst oder aber die Veränderung des Umfeldes der geladenen Moleküle bewirken. Ein solcher Prozeßschritt verknüpft mit dem Transfer bei der Elektroelution ist im Stand der Technik nicht vorgesehen.
Eine der wichtigsten Anwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren ist die Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischem Probenmaterial. Dazu ist zunächst eine Lyse des Probenmaterials notwendig, um die Nukleinsäuren aus den biologischen Kompartimenten, wie etwa Zellkern, Mitochondrien, Virushüllen etc. freizusetzen. Für diese Lyse wiederum erwies sich der Einsatz von hohen Konzentrationen an Detergentien jeglicher Art als hilfreich. Für die hier relevanten elektrophoretischen Prozesse eignen sich insbesondere ionisch aufgebaute Detergentien, insbesondere wiederum solche, mit negativ geladenen Detergensmolekülen, wie etwa Natriumdodecylsulfat.
Will man die freigesetzte Nukleinsäure der lysierten Probe weiter verarbeiten, z.B. in einer PCR nach US 46831 95 oder einem Verdau mit Restriktionsenzymen, stören die hohen Detergenskonzentrationen und müssen entfernt werden. Diese Veränderung der Umgebung der geladenen Moleküle als neuer Prozeßschritt läßt sich erfindungsgemäß zusammen mit dem Transferschritt in entsprechenden Vorrichtungen und mit den erfindungsgemäßen Verfahren durchführen.
Eine weitere Anwendung gänzlich anderer Art leitet sich der molekularen Onkologie ab. Hier ist die Analyse von mRNA eines Onkogens z.B. ein wichtiger diagnostischer Parameter. Dabei ist es entscheidend, daß die mRNA von der analogen genomischen DNA isoliert und getrennt wird, da Reste der genomischen DNA die anschließende RT-PCR stört und ihre Aussagekraft verfälscht. Für die Gewinnung der mRNA in einem Probenvorbereitungsprozeß gibt es derzeit zwei Standardverfahren: a) die Hybridisierung der mRNA mit einem festphasengebundenen oligo(dT), der an die von Natur aus vorhandenen oligo(A)-Sequenz der mRNA bindet und anschließende Freisetzung nach einem Waschen, sowie b) Verfahren, die durch selektive Fällung die mRNA isolieren.
Beide Verfahren weisen jedoch gravierende Nachteile auf. So neigt die mRNA bei a) dazu, zu zerbrechen, so daß man mit diesem Verfahren nur Teile der mRNA erfaßt, was für eine quantitative Analyse unmöglich macht. Die Verfahren nach b) sind von der Handhabung aufwendig und lassen sich schwer automatisieren, da Zentrifugationsschritte notwendig sind.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch Verknüpfung von Transfer und einem weiteren Prozeßschritt, nämlich des enzymatischen DNA-Verdaus in diesem Falle, die Isolierung der mRNA ohne DNA- Verunreinigungen möglich ist.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldungen sind daher auch Verfahren und Vorrichtungen zum Zwecke der Isolierung von geladenen Molekülen, die mit dem elektrophoretischen Transfer eine weitere Prozessierung verknüpfen, wobei sich diese Prozessierung auf die Umgebung der geladenen Moleküle oder aber auf die Moleküle selbst beziehen kann.
Ein weiteres bevorzugtes Anwendungsfeld sind analytische Testverfahren, die auf einer Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung beruhen, insbesondere solche, die Antikörper-Antigen-Reaktionen nutzen. Solche Verfahren werden allgemein als Immunassays bezeichnet. Es gibt dabei zwei prinzipiell unterschiedliche Anwendungen: homogene und heterogene Immunoassays. Bei den homogenen Immunoassays gelangen Verfahren zur Anwendung, bei denen alleine durch in Lösungbringen von Antikörper und Antigen in Form speziell markierter Derivate nach Inkubation ein Meßsignal erzeugt wird. Bei den heterogenen Immunoassays muß nach Inkubation eine sogenannte bound/free-Trennung, also eine Trennung der während der Inkubation entstandenen Antikörper-Antigen-Komplexe von den nicht gebundenen freien Komponenten erfolgen. Eine zusammenfassende Darstellung dieser Techniken findet sich z.B. im „Handbook of Experimental Immunology", Weir, D.M. (Editor); Oxford; Blackwell Scientific und EP 0 1 63 1 22, sowie den darin enthaltenen Zitaten zum Stand der Technik.
Der Verfahrensschritt der bound/free-Trennung stellt vor allem dann eine schwierige Aufgabe dar, wenn der Prozeß möglichst einfach automatisiert werden soll. Dazu wurden in der Vergangenheit verschiedenste Verfahren wie z. B. Doppelantikörpertechniken, Techniken mit Festphasen-gebundenen Antikörpern, wie z.B. mit Mikro- und Makropartikeln, oder beschichteten Reaktionsgefäßen (coated tubes) beschrieben.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß die hier beschriebenen Vorrichtungen eine einfache Automatisierung der bound/free-Trennung von Liganden/Rezeptor-Assays ermöglichen. Im Gegensatz zu allen bisherigen Techniken, muß erfindungsgemäß nämlich kein Waschschritt in dem Sinne erfolgen, daß die Liganden-Rezeptor-Komplexe, die zunächst in einem ersten Trennschritt separiert wurden, mit einer Waschlösung versetzt, suspendiert und erneut separiert werden müssen, um die an den Komplexen anhängende Reste von freien Komponenten ebenfalls zu entfernen. Dieser Waschschritt muß im Stand der Technik im allgemeinen sogar zweimal durchgeführt werden und stellt in den gängigen Immunoassays-Automaten wie z.B. ES 600 der Fa. Boehringer-Mannheim jetzt Röche Diagnostics oder dem Gerät Architect der Fa. Abbott z.B. gerade den Verfahrensschritt dar, der eine Limitierung des Durchsatzes bewirkt. Die Vorrichtungen der vorliegenden Anmeldung ermöglichen einerseits eine Automatisierung, da sie nach oben offen sind und tragen andererseits den Anforderungen des elektroosmotischen Flusses Rechnung. Sie lassen sich überraschenderweise so einsetzen, daß die inkubierte Mischung eines Liganden-Rezeptor-Gemisches in eine Probeneintragskammer eingebracht, anschließend einer entsprechenden Elektroelution unterworfen wird und eine direkte Auswertung ohne weitere Waschschritte möglich ist.
Dabei kann eine Detektion je nach eingesetzten Liganden- bzw. Rezeptormarkierungen durch Messung von Radioaktivität (beta- oder gamma-Strahlung) , durch photometrische, fluorimetrische oder luminometrische Messungen, oder aber auch durch massenspektrometrische oder kernresonanzspektrometrische Verfahren erfolgen.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldungen sind daher auch einfach automatisierbare Verfahren und Vorrichtungen zum Zwecke der Isolierung von geladenen Molekülen in Rezeptor-Liganden-Gemischen.
Figur 1 a zeigt schematisch die perspektivische Ansicht einer erfinderischen Vorrichtung. Es handelt sich dabei um einen Grundkörper ( 1 ), in den ein
Reaktionskanal (2) eingearbeitet wurde. Der Reaktionskanal (2) zeichnet sich dadurch aus, daß er oben offen ist, einen entsprechenden Boden sowie
Seitenwandungen enthält, so daßder Innenraum mit Elektrolytlösung gefüllt werden kann. Der Reaktionskanal (2) ist bevorzugt in einer rechteckigen oder zylindrischen Form ausgeführt, bei der die kurzen Seiten jeweils mit
Elektroden (3,4) an den äußeren Enden versehen werden. Zwischen diesen
Elektroden (3,4) erstreckt sich der Reaktionskanal (2), der erfindungsgemäß mit mindestens einem Zwischeneinbau (28) versehen werden kann, so daß mindestens zwei Flüssigkeitskammern (z.B. 1 0, 7 in Fig. 2a) erzeugt werden können. Der Kanal (2) hat typischerweise ein Volumen von 0,01 - 5 ml, bevorzugt von 0,2 - 2 ml. Der Grundkörper ( 1 ) besteht aus elektrisch nicht leitendem Material, in der Regel aus Kunststoffen wie Polyacetal, Polycarbonat, Polyamid, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, Polyacrylaten, Polyvinylchlorid oder ähnlichem und kann aus Halbzeug oder im Spritzguß- oder Blasenziehverfahren hergestellt werden. Im Einzelfall können auch glasfaserverstärkte Kunststoffe oder Kunststoffe mit anderen Zuschlagstoffen Verwendung finden.
Fig. 1 b zeigt eine erfinderische Variante der oben geschilderten Grundform des Kanals (2) . Hier ist er in der Mitte eingeschnürt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß mit dieser Formgebung eine besonders effiziente Aufkonzentration von geladenen Molekülen erreicht werden kann. Diese Form trägt folgenden Phänomenen Rechnung, die bei der Elektroelution auftreten: a) Durch die elektrolytische Zersetzung an den Elektroden verändert sich der pH-Wert. Die Kammern um die Elektroden müssen deshalb ein ausreichendes Volumen aufweisen, um ausreichend Pufferkapazität zur Verfügung zu stellen, b) Um eine ausreichende Aufkonzentration zu erreichen ist es jedoch erforderlich, ein möglichst kleines Probenentnahmevolumen zu erhalten. Beides kann durch die Einschnürung (32) entsprechend erreicht werden, wenn sich der Probenentnahmeraum (7) an der Einschnürung (32) befindet. Die in Fig.1 b gezeigte Ausführung ist bevorzugt als Spritzgußteil zum einmaligen Gebrauch bestimmt und weist Schlitze ( 1 2) im Grundkörper ( 1 ) für die Zwischeneinbauten, wie zum Beispiel die semipermeable Membran ( 1 4), auf, die im folgenden näher beschrieben sind. Erfindungsgemäß können auch mehrere Vorrichtungen in einem Verbund vorliegen, so zum Beispiel in Streifenform oder als Platten, wobei das 96-Mikrotitrationsplattenformat, wie beschrieben in US 4 1 54 795 eine bevorzugte Lösung ist. Fig. 1 h zeigt eine solche Ausführung mit Mikrotitrationsplattenstreifen ( 1 9) ä 8 Kanäle (2) und einem passenden Mikrotitrationsplattenrahmen ( 1 8) . In einer miniaturisierten Version können auch Formate mit 384 und 1 536 Kanälen zum Einsatz kommen. Der Kanal (2) kann auch aus verschiedenen Einzelelementen Fig. 1 c-g zusammengesetzt und z B. mit einer Spannvorrichtung (23) in Fig. 1g zusammengehalten werden. Diese erfinderische Ausführung besteht aus einzelnen Grundelementen (Fig.1c - 1f), die mittels Dichtelemente (25) an Paßflächen (20) aneinandergereiht und dann mit einer oder mehrerer Spannvorrichtungen (23) zusammen gepreßt werden. Die Grundelemente sind in der Regel nach oben offen und U-förmig. Es können jedoch auch einzelne nach oben geschlossene Elemente verwendet werden, wie z.B. eine vorgefüllte geschlossene Kathoden- oder/und Anodenkammer.
Fig. 1c zeigt den nach unten geschlossenen Grundkörper (1) mit einer entsprechenden Aussparung (2), die dann den Reaktionskanal (2) bilden, wenn mehrere Grundelemente verbunden mit Dichtelementen (25) an der entsprechende Paßfläche (20) mittels Spannvorrichtung (23) zusammengepreßt werden.
Fig. 1d zeigt eine Ausführung eines Zwischeneinbaus (28) für den Reaktionskanal (2). Sie besteht aus einem Rahmen (29) mit einem rechteckigen oder runden Fenster, in das Materialien für die Zwischeneinbauten (28) eingebracht werden können. In einer bevorzugten Ausführung ist dieses Element in einem schichtweisen Aufbau gefertigt, mit Lamininierfolien (29) außen und den entsprechenden Zwischeneinbaumaterialien (28) in der Mitte. Das Element wird dann mit Hilfe eines Laminiergerätes verschweißt und weißt dadurch eine glatte Paßfläche (20) und somit auch eine gute Dichtigkeit auf.
Fig. 1e stellt eine entsprechendes Dichtelement (25) dar mit den beidseitigen Paßflächen (20). Diese Dichtungselement ist erfindungsgemäß bevorzugt aus Silikon oder aus Teflon, je nach Einsatz der Reaktanten.
Fig. 1f stellt eine Ausführung für Elektroden dar, die als Plattenelektrode oder aber in schichtweisem Aufbau wie Fig.1d aufgebaut ist. Dabei ist eine elektrische Zuleitung (30) für die im Fenster befindlichen Elektroden (3,4) vorgesehen.
Fig. 1 g zeigt in der Aufsicht einen aus Grundelementen zusammengesetzten Reaktionskanal mit verschiedenen Zwischeneinbauten. Es erwies sich als vorteilhaft die Grundelemente in einer Aufnahme (26) einzubringen, an der eine entsprechende Spannvorrichtung (23) angebracht ist. Anstelle der Aufnahme (26) mit Spannvorrichtung (23) können auch erfinderische Elemente wie Fig. 1 i und 1 j zum Einsatz gelangen, die über einen entsprechenden Klemmkonus (9) mit oder ohne Rastnasen ( 1 6) zusammengesteckt werden können und auch ohne Spannvorrichtung (23) flüssigkeitsdicht zusammenhalten.
In Fig. 1 i ist das Grundelement zur Begrenzung des Kanals dargestellt, der in diesem Falle durch Zusammenstecken mit dem Grundelement zur Verlängerung aus Fig. 1 j in beliebiger Länge erzeugt werden kann. Auf der entgegengesetzten Seite erfolgt dann eine Begrenzung mit einem identischen Grundelement wie Fig. 1 i. Dieses hat entweder wie in Fig. 1 i dargestellt entsprechende Schlitze zur Aufnahme von Elektroden (3) . Erfindungsgemäß haben sich jedoch zwei davon abweichende Varianten als vorteilhaft erwiesen: Bei Variante A wird dabei in einem Zweikomponentenspritzgußprozeßeine Elektrode aus leitfähigem Kunststoff beim Produktionsprozeß direkt eingespritzt. Überraschenderweise läßt sich in Variante B auch das gesamte Grundelement aus leitfähigem Kunststoff herstellen. Dies stellt eine besonders kostengünstige Variante dar. Als Blendzuschlagsstoffe für Polypropylen haben sich als besonders vorteilhaft dafür Materialien mit Widerständen kleiner 1 000 Ohm wie zum Beispiel Cabelec 3827 und Pre-Elec 1 362 erwiesen. Das Verlängerungselement nach Fig. 1j muß entsprechend aus nichtleitendem Kunststoffen, bevorzugt Polypropylen hergestellt werden. In Fig. 1 j ist eine weitere erfinderische Variante dargestellt, da hier eine Öffnung (31 ) einen Zugang zum Reaktionskanal (2) ermöglicht. Diese Öffnung (31 ) kann auch zum Absaugen von Lösungen, z.B. bei Waschvorgängen, benutzt werden.
Mehrere solcher Reaktionskanäle können über integrierte Verbindungselemente (21 ) wie zuvor geschildert zu einem Verbund, bevorzugt im das 96-Mikrotitrationsplattenformat zusammengesteckt werden. Eine Integration in einen entsprechenden Rahmen ist ebenfalls einfach zu erreichen.
Der Reaktionskanal kann auch eine Verzweigung beinhalten, so daß beispielsweise eine mehrdimensionale Isolierung durchgeführt werden kann.
Im Folgenden werden die verschiedensten Zwischeneinbauten (28) im Kanal (2) näher beschrieben werden, die verschiedenste Funktionen erfüllen, wobei ein Zwischeneinbau (28) den Reaktionskanal (2) in einen Probeneintragsraum ( 10) und in einen Probenentnahmeraum (7) teilt, wie in Fig.2 dargestellt (Fig. 2 a: Aufsicht, Fig. 2b: Schnittdarstellung)
In einer erfindungsgemäße Vorrichtung muß ein Zwischeneinbau (28) folgende Kriterien erfüllen, um, z.B. für eine Elektroelution, geeignet zu sein. Der Zwischeneinbau muß a) eine elektrische Leitfähigkeit vermitteln, b) eine Durchlässigkeit für geladenen Moleküle ermöglichen c) eine Flüssigkeitssperre darstellen, so daß die beiden Räume ( 1 0, 7) keinerlei Flüssigkeitsaustausch besitzen, wenn keine Spannung an den Elektroden anliegt, d) gegebenenfalls Partikel zurückzuhalten und e) ggfs. einen elektroosmotischen Flußzur Aufkonzentrierung erzeugen, aber den elektroosmotischen Fluß derart begrenzen, daß eine Elektroelution durchgeführt werden kann. Überraschenderweise wurde gefunden, das eine erfinderische Vorrichtung wie Fig. 3 z.B. diese Kriterien erfüllt. Dabei ist eine semipermeable Membran ( 14) in der Nähe der Anode (4) angebracht, so daß ein Anodenraum (8) zwischen der Membran ( 1 4) und der Anode (4) entsteht. Darüber hinaus ist ein weiteres Element, nämlich ein Gewebe (5) oder, wie unten beschrieben, ein formstabilisiertes Gel zwischen der semipermeablen Membran ( 1 4) und der Kathode (3) eingebracht. Hierbei handelt es sich bevorzugt um ein Präzisions-Siebgewebe mit einer definierten Maschenweite und mit einer definierten offenen Siebfläche, wie beschrieben in „Synthetische Monofilament Präzisions-Siebgewebe (Firmenbroschüre Fa. Sefar, Rüschlikon, Schweiz) . Bei diesem Gewebe (5) kann es sich z.B. um Nylon- und/oder Polyestergewebe handeln. Diese Gewebe (5) können auch entsprechend kalandriert oder ähnlich behandelt sein. Die Erfüllung der zuvor geschilderten Anforderungen wurde bei solchen Geweben nur in einem bestimmten Bereich für die Maschenweite und für die offene Siebfläche festgestellt. Die Maschen weite beträgt dabei 0, 1 - 500 μm, bevorzugt jedoch 0,5 - 1 0 μm, die offene Siebfläche 0,2 % - 40 %, bevorzugt jedoch 0,5 - 2 %. Die Art des Materials spielt dabei ebenfalls ein große Rolle. Wie in Beispiel 1 gezeigt, wird an dem Gewebe (5) ein elektroosmotischer Fluß erzeugt, der das Volumen des Probenentnahmeraums (7) verringert. Es können bei diesem Gewebe (5) auch andere Arten von Geweben, wie z.B. Wolle, Baumwolle zum Einsatz gelangen. Ein solches Gewebe (5) läßt sich in einem Zwischeneinbau (28) in einer Vorrichtung nach Fig. 3 zur Durchführung einer Elektroelution dahingehend verwenden, daß in den Probeneintragsraum, der hier dem Kathodenraum (6) entspricht, z.B. Partikel eingebracht werden, die als Adsorber mit elektrisch geladenen Molekülen, insbesondere Nukleinsäuren, beladen sind (Fig. 9c und Beispiel 4). Nach Befüllung des Probenentnahmeraums (7) sowie des Anodenraums (8) mit einer entsprechenden Elektroiytflüssigkeit läßt sich dann durch Anlegen einer Spannung zwischen den Elektroden (3,4) eine Trennung der geladenen Moleküle von dem Adsorber erreichen. Das Gewebe (5) behindert dabei die elektrische Leitfähigkeit nicht und läßt geladene Moleküle, insbesondere Nukleinsäuren, passieren. Außerdem erfüllt es die Aufgabe, die Partikel im Probeneintragsraum ( 10) zurückzuhalten, so daß aus dem Probenentnahmeraum (7) eine entsprechend klare Nukleinsäurelösung entnommen werden kann. Darüber hinaus wird durch das Gewebe gewährleistet, daß bei der Entnahme der Nukleinsäure mit einer Pipette nur im begrenzten Umfange Elektrolytlösung aus der Probeneintragskammer ( 10 hier identisch 6) nachfließt und die isolierte Nukleinsäure verunreinigt. Weiterhin hat die Ausführung nach Fig. 3 eine semipermeable Membran ( 1 4), die geladenen Moleküle ab einem gewissen Molekulargewicht daran hindert in den Anodenraum (8) zu wandern. Dieser Zwischeneinbau hat also eine Schutzfunktion und verhindert das Vordringen der geladenen Moleküle in den Anodenraum und eine oxidative Zerstörung dieser an der Elektrodenoberfläche.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß in Folge des zuvor erwähnten el e ktro o s m oti sc h e n Fl u sses d a s Puff e rvo l u me n i n d e r Probenentnahmekammer (7) bei richtiger Auswahl der Gewebe (5) reduziert wird und auf diese Art und Weise eine Aufkonzentralion der geladenen Moleküle stattfindet. Dies ist vor allem bei der Nukieinsäureanalytik ein entscheidender Vorteil. Bei der Anwendung einer Vorrichtung nach Fig. 3 mit Partikeln, die in den Kathodenraum (6), der dem Probeneintragsraum ( 1 0) entspricht, eingebracht werden, ist ein weiterer erfinderischer Vorteil, daß die Partikel bei geeignetem Gewebe im Probeneintragsraum ( 10 identisch 6) zurückgehalten werden, so daß aus dem Probenentnahmeraum (7) eine entsprechend klare Nukleinsäurelösung entnommen werden kann. Es muß dabei Sorge getragen werden, daß die Ausschlußgröße der Gewebemaschenweite dem der verwendeten Partikel entsprechend angepaßt werden muß.
Es kann in einer weiteren Variante auch eine Flüssigkeitssperre ( 1 3) eingesetzt werden, die durch entsprechende Führungen ( 1 2) in den Grundkörper ( 1 ) flüssigkeitsdicht und beweglich eingebracht werden kann, wie Figur 4 bzw. 5a und 5b zeigen. Figur 5a zeigt die Flüssigkeitssperre ( 1 3) im offenen Zustand, während Figur 5b den geschlossenen Zustand zeigt, bei dem durch Eindrücken der Flüssigkeitssperre ( 1 3) in den Grundkörper ( 1 ) der Reaktionskanal (2) geschlossen wird.
Figur 6 verdeutlicht nun den Anwendungsbereich einer solchen Flüssigkeitssperre ( 1 3) . Die entsprechende Vorrichtung sieht neben den Elektroden (3,4) und der semipermeablen Membran ( 1 4) ein entsprechendes Gewebe (5) und/oder eine Fritte (27) vor. Letztere bilden in Richtung der Kathode (3) einen Probeneintragsraum ( 10), in den Partikel nach Beispiel 4 eingebracht werden können. Nach erfolgter Elektroelution sammeln sich die geladenen Moleküle im Probenentnahmeraum (7) an, da die Flüssigkeitssperre ( 1 3) zunächst geöffnet ist. Durch Eindrücken der Flüssigkeitssperre ( 1 3) entsteht nun ein gegen den Raum (6) flüssigkeitsdicht geschlossener Probenentnahmeraum (7), aus dem mit Hilfe von Pipetten z.B. die geladenen Moleküle, wie etwa Nukleinsäure, entnommen werden können.
Fig. 8 zeigt eine spezielle erfinderische Vorrichtung für den Einsatz von Adsorbern mit magnetischen Eigenschaften. Solche können mittels Dauermagneten ( 1 7) an bestimmten Stellen des Reaktionskanals (2) zurückgehalten werde. Dazu muß eine Dauermagnet (1 7) in die Nähe des Reaktionskanals gebracht werden. Für die Elektroelution bietet sich daher insbesondere an, einen geeigneten Dauermagneten in die Nähe des Probeneintragsraumes ( 1 0) zu bringen, so daß die Partikel nach Abgabe der geladenen Moleküle z.B. auf den Boden oder an die Seitenwandung gezogen werden können. Durch diese Maßnahme kann die anschließende Elektroelution nicht dadurch beeinträchtigt werden, daß sie Gewebe oder andere Einbauten im Reagenzkanal durch Partikel verstopft werden. Neben der Elektroelution (Beispiel 4) können erfindungsgemäße Vorrichtungen auch zur Rückgewinnung von Nukleinsäure aus Gelen (Agarose oder Polyacrylamid) eingesetzt werden (Beispiel 2) .
Scheiben oder Blöcke aus herkömmlichen Agarose- oder Polyacrylamidgelen stellen besonders geeignete Zwischeneinbauten dar, wobei für Vorrichtungen zur Nukleinsäureisolierung z.B. gefunden wurde, daß besonders Gele mit niedrigem Vernetzungsgrad, also kleinen Anteilen an Gelfüllstoff von besonderem Vorteil sind. Wiederum zeigte sich, daß die Dicke der Zwischeneinbauten entsprechend dünn sein sollten. Sie betragen insbesondere 0, 1 - 20 mm, bevorzugt 0, 5 - 5 mm. Die Anteile an Gelfüllstoff in erfindungsgemäßen formstabilisierten Gelen wie z.B. Agarose beträgt 0, 1 - 1 0 %, bevorzugt 0, 1 2 - 4 %. Versuche, solche dünnen Gelscheiben auf herkömmliche Weise herzustellen, scheitern wegen der mangelnden Formstabilität. Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß diese Gele auf verschiedenste Arten formstabilisert werden können, so daß sie danach in eine erfinderische Vorrichtung eingebracht werden können.
Die Formstabiiisierung erfolgt insbesondere durch Einbringen von Stützelementen, wobei im Folgenden zwei erfinderische Varianten beschrieben werden. Bei Variante A wird der Zwischenraum zwischen zwei Geweben (5) mit der warmen, flüssigen Gelmasse ausgegossen. Nach Erkalten wird die Gelmasse fest und ist durch die Gewebe entsprechend formstabilisert, so daß auch Gelschichten mit nied rigen Agarosekonzentrationen eingesetzt werden können. Beispiele 5 und 7 schildern die Herstellung im Einzelnen. Fig. 7b zeigt diesen schichtartigen Stabilisierungsaufbau mit den zwei Geweben (5) und der dazwischenliegenden Gelschicht (34) . Dieser Gesamtaufbau wird im Folgenden als formstabilisertes Gel (33) bezeichnet. Eine weitere erfinderische Variante B (Beispiel 7) ist der Einsatz eines gesinterten Kunststoffs als Stützelement, das mit zunächst noch flüssigen Gel so getränkt ist, daß nach Festwerden des Gels seine Poren mit Gel ausgefüllt sind. Solche gesinterten Kunststoffe sind aus Polyethylen, Polypropylen oder ähnlichem Material und werden durch einen Sinterprozeß aufgeschäumt, so daß verschiedenste Kapillarstrukturen entstehen. Die Kapillaren sind von ihren Abmaßen insbesondere 1 - 200 μm, bevorzugt 20 - 1 20μm. Solche formstabilisierten Gele erfüllen zum einen den Zweck, daß sie für geladene Moleküle, insbesondere Biomoleküle in gewissen Molekulargewichtsbereichen durchlässig sind, daß sie zum anderen aber Flüssigkeitssperren darstellen. Beispiel 7 schildert weitere Details der Herstellung dieser Variante B.
Eine breite Anwendung solcher formstabilisierten Gelen ist bei verschiedensten Blotting-techniken gegeben. Hier kann es bei Verwendung von Gelen nach dem Stand der Technik ohne Formstabilisierung zu einem Zerreißen infolge unsachgemäßer Handhabung kommen, da gerade für diese Techniken Gele manuell mehrmals transferiert werden müssen. Durch Anwendung der erfindungsgemäße Formstabilisierung ergibt sich hier ein großer Vorteil hinsichtlich einfacher und sicherer Handhabung beim Umbetten der Gele, da ein Schutz hinsichtlich Zerstörung des Gelkörpers gegeben ist.
Bei der Verwendung von hier geschilderten nach oben offenen Vorrichtungen muß der Tatsache Rechnung getragen werden, daß je nachdem, wie die Gestaltung im Detail aussieht, mit einem elektroosmotischen Fluß (EOF) gerechnet werden muß. Dieser Fluß, ausgelöst z.B. durch Kapillaröffnungen in dem Elektroelutionsbereich, kann das Elektroelutionsverfahren erheblich beeinflussen, ja sogar unmöglich machen. Insbesondere bedingt ein Leerlaufen einzelner Kammern bei herkömmlichen Systemen, also der Transfer nahezu des gesamten Flüssigkeitsvolumens von einer Kammer in eine andere aufgrund von Elektroosmose einen Abbruch des Elutionsverfahrens. Wird der EOF so eingesetzt, daß er einerseits zu einer moderaten Reduktion des Volumens des Probeentnahmeraumes führt, andererseits aber die Wanderung der geladenen Moleküle nicht zu stark behindert, kann eine Aufkonzentration dieser erreicht werden, was für den gesamten Prozeß von Vorteil ist. Überraschenderweise wurde gefunden, daßdies mitformstabilisierten Gelen erreicht werden kann, wozu weitere Details in den Beispielen beschrieben sind.
Eine weitere Problematik ist die Anwendung einer geeigneten Stromspannung für die erfinderischen Transferprozesse. Hier ist es aus sicherheitstechnischen Erwägungen sinnvoll, im sogenannten Niederspannungsbereich unter 42 V Gleichspannung zu bleiben, da dann keine Abdeckungen des stromführenden Reagenzkanals notwendig ist. Die erleichtert vor allem eine Automatisierung. Überraschenderweise wurde gefunden, daß dies durch Einsatz eines Puffer mit höherer lonenleitfähigkeit im Anoden und Kathodenraum erzielt werden kann. Der Puffer kann dabei 2 - 30 fach, bevorzugt jedoch 5 - 1 5fach konzentrierter sein als in den innenliegenden Kammern. Ein formstabilisiertes Gel zwischen Probenentnahmeraum ( 10) und einer benachbarten Anodenkammer (8), die mit einer wie zuvor geschildert höheren Pufferkonzentration befüllt wird, wirkt erfindungsgemäß wie eine semipermeable Membran und schützt die geladenen Moleküle davor, an die Anode (4) zu gelangen und ggf. zersetzt zu werden. Als erfinderischer Vorteil ist das formstabilisierte Gel besser durchlässig für Detergentien.
Zur Lösung spezieller Aufkonzentration- und Fokusierungsfragestellungen können auch erfindungsgemäß Puffergradienten zwischen den Elektrodenkammern zu den Kammern im Innenraum zum Einsatz gelangen, wobei die stärker konzentrierten Puffer jeweils an den Elektroden eingesetzt werden. Auch haben sich Mehrpuffersysteme als erfinderisch erwiesen, bei denen benachbarte Kammern mit unterschiedlichen Puffersubstanzen und unterschiedlichen pH-Werten zum Einsatz gelangen. Dieser Vorteil kann auch durch Mischung von unterschiedlichen Puffern beim Probeneintrag genutzt werden. Die Verwendung von formstabilisierten Gelschichten in einem erfindungsgemäßen Reaktionskanal unter Berücksichtigung der zuvor geschilderten Randbedingungen ermöglichen eine Vielfalt von Anwendungen, bei denen geladene Moleküle transferiert und gleichzeitig die Umgebung prozessiert werden kann, wie im Folgenden näher beschrieben wird.
Eine Vorrichtung nach Fig. 7a mit einem Gewebe (5), einer formstabilisierten Gelschicht (33) und einer semipermeablen Membran ( 1 4) als Flüssigkeitssperren kann wie folgt zur Isolierung von z.B. Nukleinsäuren benutzt werden. In den Probeneintragsraum ( 1 0) wird Nukleinsäure eingebracht, die Vorrichtung wird mit Elektrolyt oder Elektrophoresepuffer soweit befüllt, daß die Zwischeneinbauten noch herausragen und an die Elektroden wird eine Gleichspannung angelegt. Die Nukleinsäure wandert durch das formstabilisierte Gel (33) und reichert sich vor der semipermeablen Membran ( 1 4) im Probenentnahmeraum (7) an. Durch den elektroosmotischen Fluß vermindert sich der Flüssigkeitspegel in Kammer (7) und die Nukleinsäure wird in konzentrierter Form entnommen. Je nach Anteile an Gelfüllstoff im fromstabilisierten Gel kann auch eine Selektionierung der Nukleinsäuren nach Molekulargewicht vorgenommen werden.
Zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Proben eignet sich u.a. Fig. 7f. Hier schließt eine semipermeable Membran ( 14) den Kathodenraum (6) ab und stellt die Verbindung zum Probeneintragsraum ( 1 0) dar. Zur Anode hin befinden sich zwei formstabilisierte Gele (33) und (33a), die den Probenentnahmeraum (7) und den Anodenraum (8) begrenzen. Eine aus einer biologischen Probe gewonnenen Lysemischung mit freigesetzten Nukleinsäuren wird in die Probeneintragskammer ( 1 0) eingebracht. Die Lysemischung enthält zur Freisetzung der Nukleinsäuren und Zerstörung der biologischen Strukturen Detergentien wie Lithium-, Natriumdodecylsulfat, Cetylammoniumbromid, ionische Tenside oder ionische Glykoside o.a.. Diese werden in Konzentrationen von 0, 1 - 1 0 %, bevorzugt jedoch 0, 1 -2 % eingesetzt. Es können aber auch chaotrope Salze wie Guanidiniumthiocynat, Guanidinuiumhydrochlorid, Jodsalze, Perchlorate o.a. zum Einsatz gelangen. Die Vorrichtung wird mit Elektrolytlösung befüllt und eine Spannung wird angelegt. Das formstabiliserte Gel (33) hat einen geringen Anteil an Gelfüllstoff, der 0, 1 2 % -0,2 % beträgt und hält nicht nur gröbere Zelltrümmer sondern auch größere Proteinaggregate zurück. Die freigesetzten Nukleinsäuren und das Detergens, z.B. Natriumdodecylsulfat passiert diesen Zwischeneinbau, wobei das Detergens infolge seines kleineren Molekulargewichtes über die Kammer (7) schneller in die Anodenkammer (8) durchläuft, als die Nukleinsäure. Das formstabilisierte Gel (33a) trennt somit die Nukleinsäuren vom Detergens. Die Nukleinsäuren werden von diesem formstabilisierten Gel (33a) zurückgehalten und aus der Kammer (7) entnommen. Eine semipermeable Membran muß in diesem Falle entfallen: Einerseits reicht der Schutz durch das formstabilisierte Gel (33a) aus, andererseits wurde überraschenderweise wurde festgestellt, daß Detergentien wie SDS formstabilisierte Gele generell leicht passieren, während vermutlich infolge von Mycellenbildung semipermeable Membranen als Zwischeneinbauten das Detergens zurückhalten. Der elektrophoretische Prozeß dauert 1 - 30 min, bevorzugt jedoch 2 - 1 2 min und läßt sich dadurch sehr einfach automatisieren, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung zusammen mit einer geeigneten Stromversorgungseinheit auf einen Pipettierroboter gestellt wird. Die Flüssigkeiten können dann automatisch pipettiert werden, und für den Isolierungsprozeß wird ein elektrisches Signal vom Pipettierroboter geliefert, um die Stromversorgungseinheit ein- und auszuschalten. Anschließend kann die isolierte Nukleinsäure mit dem Roboter entnommen und für die weitere Verarbeitung verwendet werden.
Reicht die direkte Abreicherung des Detergens aus der Lysemischung nicht aus, so kann in einer Vorrichtung nach Fig. 7d mit zwei formstabilisierten Gelschichten (33) und (33a) als Flüssigkeitssperren ein abgewandelter Prozeß zur Isolierung von Nukleinsäuren wie folgt benutzt werden. In diesem Falle werden in den Kathodenraum (6) Partikel, bevorzugt solche, die magnetische Eigenschaften besitzen, eingebracht, die mit Nukleinsäure zuvor beladen und ggf. auch mit Waschlösungen behandelt wurden. Das erste Gewebe (5) ist so ausgelegt, daß es die Partikel zurückhält. Nach Befüllung mit Elektrolyt und Anlegen einer Spannung an die Elektroden (3,4) wandern geladene Biomoleküle durch das Gewebe in die Kammer (35) und durch das formstabilisierte Gel (33) wie zuvor, werden dann aber durch das formstabilisierte Gel (33a) zurückgehalten, während Detergensreste die z.B. an den Partikel adsobiert sind diese passieren. Die detergensfreie Nukleinsäure wird aus dem Probenentnahmeraum (7) entnommen. Zur Entfernung größerer Detergensmengen, bei Natriumdodecylsulfat z.B. größer als 2 % können erfindungsgemäß auch spezielle Kammern eingesetzt werden, die detergensbindende Mittel beinhalten oder Mittel, die Detergens ausfällen. Es ist auch möglich, detergensbindende Mittel nach der Lyse zuzugeben und durch die Elektroelution dann abzutrennen. Als detergensbindende Mittel können bevorzugt hydrophobe makroporöse Partikel mit großer innerer Oberfläche wie z B. Detergenz Adsorber-Gel [Fa. Röche Diagnostics, Mannheim Kat. Nr. : 1 500 678] verwendet werden. Außerdem können zuvor genannte Materialien auch in gesinterter Form als Zwischeneinbau (28) zum Einsatz kommen, um Detergentien zu binden.
Je nach Konzentration der Agarose in Agarosegelen bzw. des Polyacrylamids in Polyacrylamidgelen können die Kapillarstrukturen der Gele verändert werden und dies Materialien werden im Elektrophoreseprozeß als Molekularsiebe eingesetzt („Electrophoresis Theorie, Technics and Biochemical and Clinical Applications" A. T. Andrews (Ed.) ISBN 0-1 9- 854633-5, Clarendon Press, Oxford 1 988). Dazu werden jedoch entsprechend große Wanderungsstrecken (2 - 80 cm) benötigt. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß mit der Vorrichtung gemäß Fig. 7 auch in dünnen formstabilisierten Gelschichten von 0, 1 - 20 mm, bevorzugt jedoch 0,5 - 5 mm eine Trennung von geladenen Molekülen stattfinden kann, so daß neben der oben geschilderten Flüssigkeitssperre auch die Funktion als Molekularsiebe für die Isolierung von geladenen Molekülen eingesetzt werden kann.
Darüber hinaus kann die formstabilisierte Gelschicht auch als Schutz der Anode eingesetzt werden und die semipermeable Membran ( 14) ersetzen. Im Falle des Einsatzes von Agarose sollte die Agarose-Konzentration dafür 2 - 5 %, bevorzugt 2,5 - 3,5 % sein.
Eine weitere Anwendung ist die Isolierung von Ribonukleinsäure (RNA), bevorzugt messenger RNA (mRNA) aus biologischen Proben, also in Gegenwart genomischer homologer DNA. Die Prozessierung der Lysemischung besteht in diesem Falle erfindungsgemäß in einem DNase- Verdau während des Nukleinsäuretransferschrittes. Da die Elektrolytlösung im allgemeinen einen pH-Wert von 7,25 ± 0,5 aufweist, kann bei Verwendung einer DNase mit einem pl > 7, bevorzugt pl 8 - 9, dieser Prozeß in einer Vorrichtung nach Fig. 7d durchgeführt werden. Die aus der biologischen Probe hervorgehende detergenshaltige Lysemischung wird in die Kathodenkammer (6) eingefüllt, der Reaktionskanal mit Elektrolyt befüllt und der Transfer durch Anlegen einer Spannung an die Elektroden gestartet. Zellreste und grobe Verunreinigungen bleiben an dem Gewebe (5) hängen. Statt dem Gewebe kann auch ein drittes formstabilisiertes Agarosegel zum Einsatz gelangen. Nukleinsäuren, in diesem Falle DNA und RNA passieren diesen Zwischeneinbau zusammen mit dem Detergens, wenn es ebenfalls negativ geladenen ist. Das Detergens wandert jedoch schneller und passiert teilweise auch das anschließende formstabilisierte Gel (33) . Auf diese Weise wird die Kammer (35) detergensfrei und ein DNA-Abbau kann mittels DNase, die durch Detergentien inhibiert wird, durchgeführt werden. Dazu wird die Spannung unterbrochen und eine DNase-Lösung wird in die Reaktionskammer (35) zugegeben ggf. kurz inkubiert und anschließend der Transferprozeß fortgesetzt. Nach dem Abbau der DNA kann durch die geeignete erfinderische Wahl des pl-Wertes der DNase, erreicht werden, daß diese von der zurückbleibende RNA separiert wird und eine RNA-Preparation DNase-frei aus der Kammer (7) entnommen werden kann. Das entsprechende Detergens ist derweil durch das formstabilisierte Gel (33a) bis in Anodenkammer (8) vorgedrungen. Die DNase ist auf Grund Ihres pl- Wertes z.B. positiv geladen und wandert in entgegengesetzte Richtung zur RNA. Bei einer etwas abgewandelten Anwendung erfolgt der DNA-Verdau mittels festphasengebundener DNase, die in Kammer (35) pipettiert wird. Diese Variante hat den Vorteil, daß sie unabhängig vom pl der eingesetzten DNase ist. Dies gilt auch bei Verwendung von thermolabilen DNasen, die bei der anschließenden RT-PCR z.B. in einem ersten Heizschritt zerstört werden kann.
Eine weitere Anwendung, die die bisher notwendige Unterbrechung der Stromzufuhr für einen Pipettierschritt umgeht, was wiederum für eine schnelle automatische Abarbeitung hinderlich ist, nutzt eine DNase mit einem pl kleiner als der pH-Wert des Elektrolyten. In diesem Falle wandert die Nuklease zusammen mit der Nukleinsäure. Durch Verwendung einer Vorrichtung nach Fig. 7e mit einem gegenüber Fig. 7d zusätzlichen formstabilisierten Gel (33b) bei der Kathode (3), bei der die Nuklease mit dem Elektrolyten in die Reaktionskammer (35b) eingefüllt und die lysierte Probe in Probeneintragskammer ( 10) wird, wandert die Nuklease langsamer als das Detergens jedoch schneller als die DNA aus der Probe und zerstört diese.
Neben den oben erwähnten Möglichkeiten der Deaktivierung der Nuklease besteht erfindungsgemäß die Möglichkeit, Festphasen-gebundene Antikörper gegen die Nuklease oder Festphasen-gebundene Proteinase K in das formstabilisierte Gel (33) einzubringen, die das Enzym binden bzw. abdauen und somit deaktivieren. Solche Prozesse würden dann z.B. wie folgt in Vorrichtungen nach Fig. 7d ablaufen: Die Kammer (6) wird mit der lysierten Probe und die übrigen Kammern mit Elektrolyt befüllt. Die Elektroelution wird gestartet und nach 1 -5 min, bevorzugt jedoch 1 -2 min unterbrochen. Anschließende wird Festphasen-gebundene DNase in die Reaktionskammer (35) eingefüllt und inkubiert. Anschließend wird die Elektroelution fortgesetzt und die DNA-freie Probe aus der Probenentnahmekammer (7) entnommen. Es hat sich gezeigt, daß in der Praxis ein geringer Anteil an DNase sich bei diesem Prozeß ablösen kann und je nach pl-Wert mit der Probe in die Probenentnahmekammer ( 1 0) wandert, was für die weitere Verarbeitung ungünstig ist. In diesem Falle kann erfindungsgemäß Festphasen-gebundene Proteinase K oder aber Antikörper gegen die DNase in löslicher oder Festphasen-gebundener Form in die Reaktionskammer (35) vor dem erneuten Start der Elektroelution gegeben werden, so daß die DNase deaktiviert wird. Dabei muß Sorge getragen werden, daß vor allem Proteinase K nicht in die Probenentnahmekammer ( 1 0) gelangt, da diese z.B. die anschließende PCR dahingehend stören kann, daß die dort verwendete Taq-Polymerase deaktiviert wird. Der pl der vollständigen Proteinase K liegt bei pH 6,60, wogegen der pl eines besonders aktiven Teilfragments (Aminosäuren 106 - 384) bei 8,25 liegt. Besonders dieses Fragment eignet sich für die erfinderische Anwendung, da es bei neutralem pH positiv geladen ist und zur Kathode wandert und nicht in den Probenentnahmeraum wandert.
Eine weitere Möglichkeit besteht auch, daß Festphasen-gebundene Proteinase K oder aber Festphasen-gebundene Antikörper gegen die DNase in das noch flüssige Gel gegeben und dadurch in einer formstabilisierten Gelschicht vorgehalten werden, was wiederum einen Pipettierschritt einspart. Eine vergleichbare Anwendung ist die Entfernung von RNA aus einem DNA/RNA-Gemisch durch Behandlung mit RNase oder die Isolierung von Proteingemischen mit analogen Methodiken.
Eine weitere erfinderische Lösung ist die Anwendung von Puffern mit unterschiedlichem pH-Werten in den verschiedenen Kammern der hier beschriebenen Vorrichtungen. Je nach pl Werten der zugesetzten Proteine oder Enzyme kann eine benachbarte Kammer mit einem pH-Wert dergestalt befüllt werden, daß die gewünschten geladenen Moleküle wie z.B. Nukleinsäuren diese Kammer passieren, die Zuschlagstoffe jedoch nicht. Eine denkbare Anwendung ist in Fig. 7g in der Perspektive und in Fig. 7h im Schnitt dargestellt. Es handelt sich um ein Agaroseflachbettgel (36) mit drei eingearbeiteten Aufnahmetaschen, die als Probeneintragskammer ( 1 0), Reaktionskammer (35) und Probenentnahmekammer (7) genutzt werden. Es ist dabei Sorge zu tragen, daß der Elektrolyt nicht über den oberen Rand des Flachbettgels steigt, um eine Vermischung der diversen Reaktanten vor allem in Kammer (35) zu vermeiden. In solchen Vorrichtungen sind die hier beschriebenen Prozesse nicht durchführbar, da in Folge von EOF die Kammern (35) und (7) leer laufen und somit keine stabile Elektroelution möglich ist.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und Beispiele weiter erläutert. Die Figuren zeigen:
Fig. 1 a Perspektivische Ansicht: Rechteckiger Reaktionskanal mit Zwischeneinbau Fig. 1 b Aufsicht: Rechteckiger Reaktionskanal mit Einschnürung
Fig. 1 c Grundelement
Fig. 1 d Zwischeneinbau
Fig. 1 e Dichtelement
Fig. 1 f Elektrodenaufnahme Fig. 1 g Aufnahme mit Spannvorrichtung
Fig. 1 h Mikrotitrationsrahmen mit 48 Reaktionskanälen
Fig. 1 i Grundelement mit Elektrodenaufnahmen und Klemmung
Fig. 1 j Grundelement mit Öffnung und Klemmung
Fig. 2a Aufsicht: Reaktionskanal mit Zwischeneinbau Fig. 2b Schnitt: Reaktionskanal mit Zwischeneinbau
Fig. 3 Reaktionskanal mit zwei Zwischeneinbauten
Fig. 4 Reaktionskanal mit Flüssigkeitssperre Fig. 5a Flüssigkeitssperre offen
Fig. 5b Flüssigkeitssperre geschlossen
Fig. 6 Reaktionskanal mit Flüssigkeitssperre und Membrane
Fig. 7a Vorrichtung zur Elektroelution mit formstabilisiertem Gel nach Variante A
Fig. 7b Vorrichtung zur Elektroelution mit formstabilisiertem Gel nach
Variante B Fig. 7c Vorrichtung mit drei Kammern Fig. 7d Vorrichtung mit zwei formstabilisierten Gelschichten
Fig. 7e Vorrichtung mit drei formstabilisierten Gelschichten Fig. 7f Perspektivische Sicht eines Flachbettgels mit
Reaktionskammern Fig. 7g Schnitt durch ein Flachbettgel mit Reaktionskammern
Fig. 8 Reaktionskanal mit Dauermagnet
Fig. 9a Vorrichtung für Elektroelution Fig. 9b Vorrichtung für Elektroelution mit Fritte
Fig. 9c Vorrichtung für Elektroelution mit Partikeln
Fig. 10a Agarosegelstückchen vor und nach Elektroelution Fig. 10b Agarosegel für Elektroelution mit Vorrichtung Fig. 9a Fig. 1 1 Agarosegel für Elektroelution mit Vorrichtung Fig. 9b Fig. 1 2 Agarosegel für Nukleinsäureisolierung aus Hefe mittels
Elektroelution in Fig. 9c Fig. 1 3 Standardagarosegel zur Analyse der Elektroelution nach
Beispiel 5 Fig.14 Standardagarosegel zur Analyse der Elektroelution nach Beispiel 7
FigJ 5 Standardagarosegel auf einem Träger aus gesintertem
Kunststoff (Beispiel 1 0) Fig.1 6 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische
DNA und RNA aus Hefe Beispiel 1 1 . Fig. 1 7 Standardagarosegel nach PCR mit verschiedenen
Elektroeluaten Fig. 1 8 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische
DNA aus Hefe vor Amplifikation. Fig. 1 9 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische
DNA aus Hefe nach Amplifikation. Fig. 20 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische
DNA aus Hefe vor Amplifikation mit Einsatz eines Detergensadsorbers. Fig. 21 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische
DNA und RNA aus Hefe nach Amplifikation mit Einsatz eines Detergensadsorber
Fig. 22 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische
DNA aus Hefe vor Amplifikation mit Einsatz eines
Zweikomponentenpuff ersystems.
Fig. 23 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische DNA und RNA aus Hefe nach Amplifikation mit Einsatz eines
Zweikomponentenpuff ersystems. Fig. 24 Standardagarosegel zur Analyse der Isolierung genomische
DNA aus Hefe nach Amplifikation in einer Kinetik. Fig. 25 Elektroelution eines Fluoreszenzfarbstoffs in einer Vorrichtung mit vier Kammern, wobei der geladene Farbstoff durch ein formstabilisiertes Gel wandert. Der Aufbau der verwendeten Vorrichtung ist wie folgt (von links nach rechts:)
Kathode, Kathodenraum, Membran, Probeeintragskammer, formstabilisiertes Gel, Probeentnahmekammer, formstabilisiertes Gel,
Anodenkammer, Anode.
Zu beachten ist, daß nach einer kurzen Zeit von 1 20 s der geladene Farbstoff bereits vollständig in die Probeentnahmekammer überführt ist, ohne daß ein Fluoreszenzfarbstoff in der Anodenkammer sichtbar wäre.
Fig. 26 Schematische Darstellung der Vorrichtung von Figur 25. Fig. 27 Ergebnisse eines Radioimmunoassays mittels Elektroelution.
Bezugszeichenliste:
1 ) Nach unten geschlossener Grundkörper
2) Nach oben offener Kanal
3) Elektrode A, z.B. Kathode
4) Elektrode B, z.B. Anode
5) Gewebe
6) Kathodenraum bzw. -kammer
7) Probenentnahmeraum bzw. -kammer
8) Anodenraum bzw.- kammer
9) Klemmkonus bzw.- kammer
1 0) Probeneintragsraum bzw.- kammer
1 1 ) Elektrophoresetrennstrecke
1 2) Führung in Grundkörper für Einbauelemente
1 3) Flüssigkeitssperre
1 4) Semipermeable Membran
1 5) Reaktionsraum bzw.- kammer (offen)
1 6) Rastnase
1 7) Dauermagnet
1 8) Mikrotitrationsplattenrahmen
1 9) Mikrotitrationsplattenstreifen
20) Paßfläche
21 ) Integriertes Verbindungselement
22) Festphase
23) Spannvorrichtung
24) Grundelement
25) Dichtelement
26) Aufnahme
27) Fritte
28) Zwischeneinbauten
29) Laminierfolie (30) Elektrische Zuleitung
(31 ) Öffnung zum Reaktionskanal
(32) Einschnürung
(33) Formstabilisiertes Gel (34) Gelschicht
(35) Reaktionskammer
(36) Agaroseflachbettgel
Beispiele 1 .) Messung des elektroosmotischen Flusses
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Abb. 9a mit zwei Geweben (5) [Nr. 07/5/1 Fa. SEFAR, Rüschlikon, Schweiz] und einer semipermeablen Membran ( 14) [Size 3; Fa.Medicell Int. Ltd., London, UK] eingesetzt, die dann einen Kathodenraum (6), einen Probeneintragsraum ( 10) und einen Anodenraum (8) abgrenzen. Dabei wurde die Vorrichtung aus einzelnen Grundelementen nach Fig. 1 c [Nr. : 01 1 1 1 20 005 05; J. Pützfeld B. V., Amsterdam, Niederlande] zusammengesetzt. Für Anoden- und Kathodenraum wurden jeweils 3 Elemente verklebt, das Gewebe (5) und die semipermeable Membran ( 14) wurden jeweils in eine gelochte Laminierfoiie [250 μm Dicke, Nr. 54x86; Fa. Böttcher, Jena] mit einem Laminiergerät [Fa.Lamirel MAXIPLAST 335 E] eingeschweißt und mit Silikondichtungen [ 1 mm Dicke Nr. 6084.0810, Fa. H. Wegener, Hamburg] zwischen die o.g. Grundelemente flüssigkeitsdicht mit einer Schraubklemmvorrichtung eingeklemmt. Als Elektroden (3,4) dienten Aluminiumplättchen und als Stromquelle wurde ein Elektrophoresetransformator [Fa. Hölzel] eingesetzt.
Die Vorrichtung wurde mit Elektrophoresepuffer ( 1 0 mM Tris/Acetat [Fa. Roth, Karlsruhe], 1 mM EDTA [Fa. Sigma], pH 8,0) befüllt und an die Elektroden (3,4) eine Spannung von 40 - 80 V bei konstant 10 mA für 10 min angelegt. Nachfolgende Tabelle zeigt die Volumina in den einzelnen Kammern vor und nach Elektroelution.
Figure imgf000039_0001
Diese Experiment zeigt die Verringerung des Puffervolumens im Probenentnahmeraum (7) . Für alle nachfolgenden Beispiele wurden Materialien wie Beispiel 1 .) verwendet, falls nicht anders angegeben.
2.) Elektroelution von DNA aus Agarosegelen
2,5 μg DNA (λ Hind IM) [Nr. #SM01 01 ; MBI Fermentas,St. Leon-Roth] wurde in ein Standard-Flachbettagarosegel (0,8 % Agarose [Fa. Sigma, München]) in einem Elektrophoresepuffer (s.o.) mit Laufzeit von 10 min. (ca. 3 V/cm) in das Gel überführt und die Bande nach Standardvorschrift mit SYBR^-Gold [S-1 1 494; Fa. Mo Bi Tee, Göttingen] angefärbt. Das korrespondierende, die DNA enthaltende Gelstückche i wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten und ist in Abb. 1 0 a vor und nach Elektroelution dargestellt.
Das ausgeschnittene Agarosegel wurde in den Probeneintragsraum gebracht und die gesamte Vorrichtung nach Abb. 9 a wurde mit 1 ,9 ml Elektrophoresepuffer (s.o.) gefüllt. An die Elektroden wurde mit einem Elektrophoresetransformator eine Spannung zwischen 40 - 60 V bei konstant 1 0 A für 7 bzw. 1 0 min. angelegt.
Fig. 1 0 b zeigt das Ergebnis der Elektroelution in einem Standardagarosegel (s.o.):
Figure imgf000040_0001
3) Elektroelution mit einer Vorrichtung nach Abb. 9b
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Abb. 9b mit einem Gewebe (5), einer Fritte aus gesintertem Kunststoff [Nr. XS-561 6, Fa. Porex. Technologies GmbH, Singwitz] und einer semipermeablen Membran ( 1 4) eingesetzt, die dann einen Kathodenraum (6) , einen Probeneintragsraum ( 1 0) und einen Anodenraum (8) abgrenzen. Dabei wurde die Vorrichtung zusammengesetzt wie in Beispiel 1 beschrieben.
2,5 μg DNA (λ Hind IM) wurde direkt in den Probeneintragsraum gebracht und die gesamte Vorrichtung nach Abb. 9 b wurde mit 1 ,75 ml Elektrophoresepuffer (siehe Beispiel 1 ) gefüllt. An die Elektroden wurde mit einem Elektrophoresetransformator eine Spannung von 70 V bei konstant 1 0 mA für 1 0 min. angelegt.
Fig. 1 1 zeigt das Ergebnis der Elektroelution in einem Standardagarosegel (s.o.) mit Entnahmen aus Probeneintragsraum und unmittelbar daneben Probenentnahmeraum in einer Kinetik von 0 - 1 0 min. M bezeichnet die Spur des Markers wie in Beispiel 1 . 4.) Isolierung von Nukleinsäure aus Hefe mittels Magnetpartikeln und Elektroelution
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung mit einem Gewebe (5) [Fa. SEFAR siehe Beispiel 1 ] und einer Dialysemembran [Fa. Medicell siehe Beispiel 1 ] wie in Fig. 9c verwendet.
1 x 1 010 Hefezellen pro ml (Saccharomyces cereviciae) wurden in Lyticasepuffer ( 1 M Sorbit [Fa.AppliChem, Darmstadt], 1 00 mM Natriumeitrat [ Fa. ICN, Aurora, USA], 60 mM EDTA [Fa. Sigma], 50 mM Dithioerythrit [Fa. Roth], pH 7,5) aufgenommen und 1 0 μl ( 1 08 Zellen) davon mit 1 μl Lyticase [Nr. 1 372 467, Röche Diagnostics, Mannheim] versetzt und 1 5 min bei 37 °C inkubiert.
Die Lyse sowie die Bindung und das Waschen der Magnetpartikel erfolgten nach US 5 705 628. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Magnetpartikel abgetrennt, die Waschlösung sorgfältig entfernt und die Partikel in 1 50 μl Elutionspuffer (Elektrophoresepuffer siehe Beispiel 1 ) aufgenommen. Anschließend wurde die Suspension in die Probeneintragskammer (in diesem Falle identisch mit dem Kathodenraum (6)) einer bereits mit Elutionspuffer befüllten Vorrichtung nach Fig. 9 c gefüllt. Die Elektroelution erfolgte durch Anlegen einer Spannung von 40 - 70 V bei 1 0 mA Stromfluß für 5 min. Die Nukleinsäure wurde aus der Entnahmekammer pipettiert und einer Agarosegelelektrophorese wie in Beispiel 1 unterworfen. Fig. 1 2 zeigt das dazugehörige Gelbild.
Figure imgf000041_0001
5.) Elektroelution mit einer Vorrichtung nach Fig. 7a
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7a mit einem Gewebe (5) [Nr. 07/5/1 Fa. SEFAR, Rüschlikon , Schweiz] und einer semipermeablen Membran (14) [Size 3; Fa.Medicell Int. Ltd., London, UK] eingesetzt, die zunächst einen Kathodenraum (6) und einen Anodenraum (8) abgrenzen. Darüber hinaus ist zwischen diesen beiden Einbauten ein formstabilisiertes Gel (33) eingebracht, das einen Probeneintragsraum ( 10) und einen Probenentnahmeraum (7) mit jeweils ca. 250 μl Volumen abgrenzt. Dabei wurde die Vorrichtung aus einzelnen Grundelemente [Nr. : 01 1 1 1 20 005 05 J. Pützfeld B:V., Amsterdam, Niederlande] zusammengesetzt. Für Anoden- (8) und Kathodenraum (6) wurden jeweils 3 Elemente mit einem Volumen von ca. 750 μl verklebt, das Gewebe (5) und die semipermeable Membran ( 14) wurden jeweils in eine gelochte Laminierfolie [250μm Dicke, Nr. 54x86; Fa. Böttcher, Jena] eingeschweißt mit einem Laminiergerät [Fa.Lamirel MAXIPLAST 335 E] und mit Silikondichtungen [ 1 mm Dicke Nr. 6084.081 0, Fa. H. Wegener, Hamburg] zwi sc hen d ie o . g . Elemente f l üssig keitsd icht mit ei ner Schraubklemmvorrichtung eingeklemmt.
Nach Variante A wurde das Gel wie folgt formstabilisiert: Ein gesinterter Kunststoff [Porenweite 45 - 90 μm, Nr. X-4899, Fa. Porex., Singwitz] wurde in einer erwärmten Mischung aus Agarose (0,4 % - 3 %) [Fa. Sigma, München] und Elektrophoresepuffer 1 0 mM Tris/Acetat [Fa. Roth, Karlsruhe] mit 1 mM EDTA [Fa. Sigma] pH 8,0) gelegt, die Agarose wurde fest werden lassen und das so formstabilisierte Gel (33) wurde in die Vorrichtung nach Fig. 7a eingebracht.
2,5 μg DNA (λ Hind IM) [Nr. #SM01 01 ; MBI Fermentas,St. Leon-Rot] wurde direkt in den Probeneintragsraum gebracht und die gesamte Vorrichtung wurde mit 1 ,75 ml Elektrophoresepuffer (siehe zuvor) gefüllt. An die
Elektroden wurde mit einem Elektrophoresetransformator [Fa. Hölzel, Dorfen] eine Spannung von 50 - 500 V bei konstant 10 mA für 10 min. angelegt.
Fig. 13 zeigt das Ergebnis der Elektroelution mit verschiedenen Agarosekonzentrationen im formstabilisierten Gel, wobei ineiner Kinetikvon 0 - 10 min sowohl Entnahmen aus Probeneintragsraum (10) als auch aus dem Probenentnahmeraum (7) mittels einem 0,8 % Standardagarosegel (s.o.) analysiert wurden. Unter der Überschrift "Gelspuren" ist die Zeit angegeben, nach der DNA auf einem Gel nachweisbar war. Agarose-konz Gelspuren in formstabil. Gel (33)
Marker (Λ-Hindlll): 23,1 j 9,416,614,412,312,01 0,56 KB 0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 0 min. 0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 0 min
0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 1 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 1 min
0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 2 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 2 min 0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 3 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 3 min
0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 4 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 4 min
0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 5 min. 0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 5 min
0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 7 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 7 min
0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 10 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 10 min Marker (Λ-Hindlll): 23,1 |9,4|6,6|4,4|2,3| 2,0|0,56KB ,8 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 0 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 0 min ,8 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 1 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 1 min ,8 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 2 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 2 min ,8 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 3 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 3 min ,8 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 4 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 4 min ,8 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 5 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 5 min ,8 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 7 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 7 min ,8 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 10 min. ,8 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 1 0 min Marker (Λ-Hindlll): 23, 1 | 9,4 | 6,6 | 4,4| 2,3 | 2,0 | 0, 56KB ,2 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 0 min. ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 0 min ,2 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 1 min. ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 1 min ,2 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 2 min. ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 2 min ,2 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 3 min. ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 3 min ,2 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 4 min. ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 4 min ,2 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 5 min. ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 5 min ,2 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 7 min. ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 7 min 1 ,2 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 10 min.
1 ,2 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 10 min
Marker (Λ-Hindlll): 23, 1 | 9,4 | 6,6 | 4,4| 2,3 | 2,0 | 0,56KB 3,0 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 0 min. 3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 0 min
3,0 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 1 min.
3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 1 min
3,0 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 2 min.
3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 2 min 3,0 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 3 min.
3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 3 min
3,0 % Probeneintragsraum ( 10) vor Elektroelution 4 min.
3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 4 min
3,0 % Probeneintragsraum ( 10) vor Elektroelution 5 min. 3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 5 min
3,0 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 7 min.
3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 7 min
3,0 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 1 0 min.
3,0 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 10 min
Man erkennt die Abnahme der Menge an DNA (Λ Hind III) im Probeneintragsraum ( 1 0) und die Zunahme im Probenentnahmeraum (7) . Darüber hinaus werden die Banden mit kleinerem Molekulargewicht bei höheren Agarosekonzentrationen zurückgehalten, so daß auf diese Art und Weise mit einem formstabilisiertem Gel eine Selektionierung von bestimmten Nukleinsäuren erreicht werden kann. 6.) Messung des elektroosmotischen Flusses mit einer Vorrichtung nach Fig. 7a
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7a und mit einem formstabilisierten Gel der Variante A mit 0,8 % Agarose betrieben. Alle weiteren experimentellen Bedingungen sind wie Beispiel 1 . Die Endvolumina des Probeneintragsraums ( 1 0) und des Probenentnahmeraums (7) sind in einer Kinetik von 2 - 1 0 min. in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
Figure imgf000046_0001
Durch Einsatz eines formstabilisierten Gels verringert sich das Volumen in dem Probenentnahmeraums (7), so daß die eluierte Nukleinsäure entsprechend aufkonzentriert wird.
7.) Elektroelution mit einer Vorrichtung nach Fig. 7b
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7b eingesetzt, die ein formstabilisiertes Gel nach Variante B enthält. Die Herstellung wurde wie folgt durchgeführt: Zwei Lagen Gewebe (5) in einem Abstand von ca. 2 mm in die Vorrichtung gebracht und der Zwischenraum wurde mit einer erwärmten Mischung aus Agarose (0,4 %) und Elektrophoresepuffer befülit. Die Agarose wurde erkalten und somit fest werden lassen.
2,5 μg DNA (Λ Hind III) wurde direkt in den Probeneintragsraum ( 10) gebracht und die gesamte Vorrichtung wurde wie Beispiel 5 betrieben und das Resultat aus der Probenentnahmekammer (7) entnommen und analysiert. Fig. 1 4 zeigt das Ergebnis der Elektroelution, wobei sowohl Entnahmen aus Probeneintragsraum ( 10) als auch aus dem Probenentnahmekammer (7) mittels einem 0,8 % Standardagarosegel (s.o.) in einer Elutions-Kinetik von 0 - 1 0 min analysiert wurden. Agarose-konz Gelspuren in formstabil.
Gel (33)
Marker (Λ-Hindlll): 23, 1 | 9,4 | 6,61 4,4 } 2,3 j 2,01 0,56KB 0,4 % Probeneintragsraum ( 10) vor Elektroelution 0 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 0 min 0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 1 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 1 min
0,4 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 2 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 2 min
0,4 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 3 min. 0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 3 min
0,4 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 4 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 4 min
0,4 % Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution 5 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 5 min 0,4 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 7 min.
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 7 min
0,4 % Probeneintragsraum ( 1 0) vor Elektroelution 10 min
0,4 % Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution 1 0 min
Das Ergebnis entspricht den Daten in Beispiel 5.
8.) Messung des elektroosmotischen Flusses mit einer Vorrichtung nach Fig. 7b
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7b und Beispiel 7 mit einem formstabilisierten Gel der Variante B mit 0,4 % Agarose eingesetzt. Die gesamte Vorrichtung nach Fig. 7b wurde wie Beispiel 1 betrieben.
Die Endvolumina des Probeneintragsraums ( 1 0) und des Probenentnahmekammer (7) sind nach 10 min. in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
Figure imgf000048_0001
Durch Einsatz eines formstabilisierten Gels verringert sich das Volumen in dem Probenentnahmekammer (7), so daß die eluierte Nukleinsäure entsprechend aufkonzentriert wird.
9.) Elektroelution mit einer Vorrichtung nach Fig. 7c mit geringeren Stromspannungen
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7c und Beispiel 5 mit einem formstabilisierten Gel (33) der Variante A mit 0,8 % Agarose eingesetzt. Die gesamte Vorrichtung im Gegensatz zu Beispiel 5 betrieben mit eine 10 fach konzentrierten Elektrophoresepuffer im Anodenraum (6) . 1 0 mA wurden bei dieser Anordnung mit einer Spannung von 20 - 25 V erreicht. Die Volumina wurden vor uns nach Elektroelution wie folgt bestimmt:
Figure imgf000048_0002
Dieses Beispiel zeigt bei niedrigem Spannungsbereich für die Elektroelution ein Minimum an elektroosmotischen Fluß, was für einige Anwendungen auch von Vorteil sein kann.
Dieses Ergebnis zeigt, daß mit erheblich geringerer Stromspannung eine Elektroelution durchgeführt werden kann, was bei einer entsprechenden Automatisierung eine erhebliche Vereinfachung darstellt, da für diese Stromspannungen anderen Sicherheitsrichtlinien gelten. Werden Anodenraum und Kathodenraum wie in Beispiel 1 1 mit Puffer höherer Konzentration beschickt, so erniedrigt sich die Spannung auf unter 1 0 V.
10.) Einsatz eines Agarosegels auf einem Träger aus gesintertem Kunststoff
Ein Standardagarosegel (0,8 %) wurde auf einen gesinterten Kunststoff [X 4588, Fa. Porex, Singwitz] gegossen und erkalten lassen. Mit diesem Gel wurde DNA (Λ Hind IM) aufgetragen, eine Elektrophorese durchgeführt und angefärbt (s.o.). Fig. 1 5 zeigt das Ergebnis.
1 1 .) Elektroelution mit einer Vorrichtung nach Fig. 7f in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS)
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7f mit einer Diaiysemembran ( 1 4) [Fa. Medicell siehe Beispiel 1 ] und zwei formstabilisierten Gelen (33 und 33a) verwendet. Dabei war die Agarose-Konzentration in (33) 0,2 % und in (33a) 2 % mit Formstabilisierung nach Variante A.
30 μl ( 1 08 Zellen) einer Hefezellsuspenion (Saccharomyces cereviciae) wurden mit 1 1 5 μl BILATEST-Lysepuffer I bestehend aus 5 % Natriumdodecylsulfat [L4390 Fa. Sigma, München], 1 00 mM Tris/HCI [T2584 L4390 Fa. Sigma, München], 10mM EDTA [E51 34 Fa. Sigma, München] und 5 μl einer Proteinase K-Lösung [ 1 373 1 96, Fa. Röche, Mannheim] 1 Stunde bei 55 °C inkubiert und in die Probeneintragskammer ( 1 0) überführt. Anoden-(8) und Kathodenraum (6) wurden jeweils beide mit 600 μl eines 1 0fach konzentrierten Elektrophoresepuffers wie Beispiel 1 und die übrige Kammern (7) mit 1 50 μl eines 1 fach Konzentrats befüllt. Die Elektroelution erfolgte durch Anlegen einer Spannung von 7,5 V bei 10 mA Stromfluß für 5 min bzw. 10 min durchgeführt. Die Nukleinsäure wurde aus der Entnahmekammer (7) pipettiert und einer Agarosegelelektrophorese wie in Beispiel 1 unterworfen. Fig. 1 6 zeigt das dazugehörige Gelbild.
Spur Inhalt M Marker (Λ-Hindlll): 23, 1 1 9,4 j 6,614,4't 2,31 2,0 | 0,56 KB
0- Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution
5- Probeneintragsraum ( 1 0) nach Elektroelution für 5 min.
5 + Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 5 min.
1 0- Probeneintragsraum ( 1 0) nach Elektroelution für 1 0 min. 1 0 + Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 1 0 min.
M Marker (Λ-Hindlll): 23, 1 | 9,4| 6,6 | 4,4| 2,3 | 2,0 | 0,56 KB
Das Gelbild zeigt die genomische DNA sowie RNA.
12) Abreicherung von Natriumdodecylsulfat mittels Elektroelution
Bei diesem Experiment wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7f mit einem analogen Aufbau wie Beispiel 1 1 eingesetzt. Formstabilisiertes Gel (33) wurde mit 0,4 % Agarose und (33a) mit 4 % Agarose hergestellt. In die Probeneintragskammer ( 1 0) wurde eine Natriumdodecylsulfatlösung in Elektrophoresepuffer (siehe zuvor) in einer Konzentration von 0, 1 % bzw. 1 % eingesetzt und einer Elektroelution wie in Beispiel 1 1 unterworfen. Danach wurden 1 μl der Lösungen aus Probeneintragskammer ( 1 0), Probenentnahmekammer (7) und der Anodenkammer (8) zu einer Standard- PCR des BCY-Gens der Hefe geben, wie in Beispiel 1 3 näher beschrieben. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegel analysiert und Fig. 1 7 zeigt das Ergebnis.
Figure imgf000051_0001
Kontrolle Zugabe von 1 μl einer 0, 1 % SDS-Lösung zur PCR Zugabe 10 μl einer 0, 1 % SDS-Lösung zur PCR Zugabe von 1 μl einer 1 % SDS-Lösung zur PCR Zugabe von 1 0 μl einer 1 % SDS-Lösung zur PCR
Das Ergebnis zeigt, daß 1 μl einer 0, 1 %igen SDS-Lösung die PCR nicht stört (Kontrolle), während alle höheren SDS-Mengen kein PCR-Produkt mehr zulassen. Dagegen können in diesem Beispiel nach Elektroelution aus der Probenentnahmekammer infolge der SDS-Abreicherung 1 μl einer 1 % SDS- Lösung ohne Störung auf die PCR eingesetzt werden.
13.) Einfache Isolierung von DNA aus Hefe mit anschließender Amplifikation Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7f mit einer Dialysemembran ( 14) [Fa. Medicell siehe Beispiel 1 ] und zwei formstabilisierten Gelen (33 und 33a) verwendet.
Dabei war die Agarose-Konzentration jeweils 0, 1 5 % in (33) und in (33a) mit Formstabilisierung nach Variante A.
30 μl ( 1 08 Zellen) einer Hefezellsuspenion (Saccharomyces cereviciae) wurden mit 1 1 5 μl BILATEST-Lysepuffer I bestehend aus 2 % Natriumdodecylsulfat [L4390 Fa. Sigma, München], 1 00 mM Tris/HCI [T2584 L4390 Fa. Sigma, München], 1 0mM EDTA [E51 34 Fa. Sigma, München] und 5 μl einer Proteinase K-Lösung [ 1 373 1 96, Fa. Röche, Mannheim] 1 Stunde bei 55 °C inkubiert und in die Probeneintragskammer ( 10) überführt.
Anoden-(8) und Kathodenraum (6) wurden jeweils beide mit 600 μl eines 10fach konzentrierten Elektrophoresepuffers wie Beispiel 1 und die übrige Kammern (7) mit 1 50 μl eines 1 fach Konzentrats befüllt.
Die Elektroelution erfolgte durch Anlegen einer Spannung von 7,5 V bei 1 0 mA Stromfluß für 2 min durchgeführt. Die Nukleinsäure wurde aus der Entnahmekammer (7) pipettiert und einer Agarosegelelektrophorese wie in Beispiel 1 unterworfen. Fig. 1 8 zeigt das dazugehörige Gelbild. Spur Inhalt
M Marker (Λ-Hindlll): 23, 1 | 9,4| 6,6 | 4,4| 2,3 | 2,0 | 0,56 KB
1 Probeneintragsraum (10) vor Elektroelution
2 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 2 min. 3 Anodenraum (8) nach Elektroelution für 2 min.
M Marker (Λ-Hindlll): 23, 1 1 9,4j 6,6 j 4,4| 2,31 2,O | 0,56 KB
Es sei bei diesem Ergebnis daraufhingewiesen, daß keine DNA in der Anodenkammer (8) zu beobachten ist. Überraschenderweise stellt ein formstabilisiertes Gel (33a) zusammen mit einer Anodenkammer (8), befüllt mit einer 1 0fach höheren Pufferkonzentration wie in der Probenentnahmekammer ( 1 0), eine Barriere für die Nukleinsäure dar, vergleichbar zu einer semipermeablen Membran.
Mit dieser isolierten Hefe-DNA wird eine PCR (US 4 683 1 95) mit den Primem KV80 : 5 ' -GCG GAT CCT TAA GTC CAA TCG TCA AAA TT- 3 ' KV102 : 5 " -GCG AAT TCG TAT CTT CTT TGC CCA AGG AA- 3 ' [Fa. MWG Biotech AG, Ebersberg bei München] durchgeführt. Mit diesen Primern wird ein 496bp-Fragment aus dem BCY -Gen der Hefe amplifiziert. Die PCR-Ansätze enthalten die folgenden Bestandteile:
0,5 μL Primer-Lösung 1 (50pmol μL"1 in H2O bidest)
0,5 μL Primer-Lösung 2 (50pmol μL"1 in H2O bidest)
2 μL dNTP-Lösung, Konzentration der Nukleotide je
5mM (Eurogentec, Seraing, Belgien)
4 μL MgCI2-Lösung 25mM (Eurogentec)
5 μL 1 0x PCR-Puffer (Eurogentec) 0,5 u Taq-Polymerase (Eurogentec) bis zu 30 μL DNA- oder Probenlösung
in einem Gesamtvolumen von 50 μL. Während des Ansatzes wird die PCR- Platte auf 4°C gekühlt. Nach Zugeben der letzten Lösung werden die Proben einmal mit einer Pipette gemischt. Die PCR wird in Thermosprint- Platten [Fa. Innova GmbH, Mannheim) im Primus 96 Plus [MWG Biotech AG, München] durchgeführt. Das Programm umfasst die folgenden Schritte:
Deckelheizung auf 1 1 0 °C
3 min 94 °C
27 Zyklen mit
30 s 94 °C 30 s 50 °C 2 min 72 °C
5 min 72 °C
Kühlung auf 4 °C Nach der PCR werden die Proben mit 1 5 - 20% Gel-Ladepuffer mit EDTA [Sigma, München] versetzt. Die Amplifikate wurde auf einem Standardagarosegel (1 ,6%) analysiert. Fig. 1 9 zeigt das Ergebnis.
Figure imgf000054_0001
Es wurde in diesem Experiment ohne Waschschritt genomische Hefe-DNA aus einer SDS-haltigen Lysemischung mit Elektroelution gewonnen, die im Anschluß direkt in eine PCR eingesetzt wurde.
14.) Einfache Isolierung von DNA aus Hefe mit anschließender Amplifikation und Verwendung eines Detergensadsorbers
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7f nach Beispiel 1 3 durchgeführt. Im Gegensatz zu Beispiel 1 3 wurde nach Lyse 50 μl Detergens-Adsorber [Röche Diagnostics Mannheim, Kat. Nr. 1 500 678] zugegeben und die resultierende Mischung in die Probeneintragskammer gegeben. Die Elektroelution wurde bei einer Spannung von 1 0, 1 V und 1 0 mA Strom für 1 0 min durchgeführt.
Zur Analyse der Amplifikation wurde eine Standardagarosegel durchgeführt (Fig. 20) :
Figure imgf000055_0001
Anschließende wurde mit den Eluaten eine PCR nach Beispiel 1 3 durchgeführt und wie oben analysiert (Fig. 21 ) .
Figure imgf000055_0002
1 5.) Einfache Isolierung von DNA aus Hefe mit anschließender Amplifikation und Verwendung eines Zweikomponentenpuffersystems (Tris/HCI- und Phosphatpuffer)
Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7f nach Beispiel 1 3 durchgeführt. Im Gegensatz zu Beispiel 1 3 wurde nach Lyse 50 μl eines Phosphatpuffers (250 mM pH 7,0) bestehend aus Na2HPO4 und NaH2PO4 [Merck, Darmstadt, Kat. Nr. 1 .06580J 000 bzw. 1 .06346J 000] zugegeben und die resultierende Mischung in die Probeneintragskammer gegeben. Die Elektroelution wurde bei einer Spannung von 8,6 V und 1 0 mA Strom für 1 0 min durchgeführt.
Zur Analyse vor Amplifikation wurde eine Standardagarosegel durchgeführt (Fig. 22) :
Figure imgf000056_0001
Anschließende wurde mit den Eluaten eine PCR nach Beispiel 1 3 durchgeführt und wie oben analysiert (Fig. 23) .
Figure imgf000056_0002
16.) Einfache Isolierung von DNA aus Hefe mit anschließender Amplifikation und Verwendung eines Zweikomponentenpuffersystems (Tris/HCI- und Citratpuffer) Für diese Anwendung wurde eine Vorrichtung nach Fig. 7f nach Beispiel 1 3 durchgeführt. Im Gegensatz zu Beispiel 1 3 wurde nach Lyse 1 5 μl eines Citratpuffers ( 1 M pH 4,5) [Applichem, Darmstadt, Kat. Nr.A 2337] zugegeben und die resultierende Mischung in die Probeneintragskammer gegeben. Die Elektroelution wurde bei einer Spannung von 8,5 V und 10 mA Strom mit Probenentnahmen von 0 - 6 min durchgeführt.
Anschließend wurde mit den Entnahmen eine PCR nach Beispiel 13 durchgeführt und wie oben analysiert (Fig.24).
Spur Inhalt
M Marker (Λ-Hindlll): 23,1 |9,4| 6,614,4 j 2,312,01 0,56 KB
1 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 0 min. nach PCR
2 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 0 min. nach PCR 3 Anodenraum (8) nach Elektroelution für 0 min. nach PCR
M Marker (Λ-Hindlll): 23,119,416,614,4 j 2,3 j 2,01 0,56 KB
1 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 2 min. nach PCR
2 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 2 min. nach PCR
3 Anodenraum (8) nach Elektroelution für 2 min. nach PCR M Marker (Λ-Hindlll): 23,1 |9,4|6,6|4,4|2,3|2,0| 0,56 KB
1 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 4 min. nach PCR
2 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 4 min. nach PCR
3 Anodenraum (8) nach Elektroelution für 4 min. nach PCR M Marker (Λ-Hindlll): 23,1 j 9,416,6 j 4,412,3|2,0| 0,56 KB 1 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 6 min. nach
PCR
2 Probenentnahmekammer (7) nach Elektroelution für 6 min. nach PCR
3 Anodenraum (8) nach Elektroelution für 6 min. nach PCR M Marker (Λ-Hindlll): 23,1 |9,4|6,6|4,4|2,3|2,0| 0,56 KB Dieser Versuch zeigt, daß amplifiziertes Material nur in der Probenentnahmekammer (7) nachgewiesen wurde.
17.) Herstellung von formstabilisierten Gelen Nach Variante A wurde das Gel wie folgt formstabilisiert: Ein gesinterter Kunststoff [Porenweite 45 - 90 μm, Nr. X-4899, Fa. Porex., Singwitz] wurde in einer erwärmten Mischung aus Agarose (0,4 % - 3 %) [Fa. Sigma, München] und Elektrophoresepuffer 10 mM Tris/Acetat [Fa. Roth, Karlsruhe] mit 1 mM EDTA [Fa. Sigma] pH 8,0) gelegt, die Agarose wurde fest werden lassen und das so formstabilisierte Gel (33) wurde in die Vorrichtung nach Fig. 7a eingebracht.
Nach Variante B wurde die Herstellung eines formstabilisierten Gesl wie folgt durchgeführt: Zwei Lagen Gewebe (5) in einem Abstand von ca. 2 mm in die Vorrichtung gebracht und der Zwischenraum wurde mit einer erwärmten Mischung aus Agarose (0,4 %) und Elektrophoresepuffer befüllt. Die Agarose wurde erkalten und somit fest werden lassen. Variante C mit Acrylamid:
18.) Einsatz von formstabilisierten Gelen zur Abtrennung eines immunologisch aktiven Fluoreszenzfarbstoffes
In einer Vorrichtung nach Fig. 25, 26 bestehend aus zwei Elektrodenkammern von je 600 μl Volumen, einer Eintragskammer ( 1 0) [ 1 60μl] und einer Entnahmekammer [ 1 60μl], mit den Zwischeneinbauten Dialysemebran ( 1 4), und zwei formstabilisierten Gelen (33, 33a) nach Variante A mit 0,2 % Agarose wurden die Elektrodenkammern mit je zweimal 600μl 1 0fach konzentrierter Elektrophorese-Puffer aus Beispiel 1 7, die Entnahmekammer (7) mit 1 50μl Elektrophorese-Puffer (siehe zuvor) und die Eintragskammer ( 10) mit einer Lösung aus Cascade®-Blue-Biocytin (0,067 mg/ml) [Molecular Probes, Eugene, USA; Best. Nr. : C-6949] in Elektrophorese-Puffer wie Beispiel 1 befüllt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung wurde auf einem UV-Leuchttisch [Fa. Vilbert Lourmat, Marne la Vallee, Frankreich; Best. Nr. : TFX-20M] gestellt und mit einem Geldetektionssystem [EDAS 1 20, Fa. Kodak, Rochester USA] versehen. Fig. 25a zeigt die Anordnung zum Zeitpunkt 0 sec. als Ausgangspunkt. In der Eintragskammer (10) ist eine fluoreszierende Bande des Farbstoffes zu sehen. Anschließend wurde eine Spannung von ca. 7,5 V bei konstant 1 5 mA Stromfluß für 1 20 sec appliziert. Fig. 25b zeigt eine Bande des Farbstoffe in der Probenentnahmekammer.
Darüber hinaus wurde jeweils 1 50 μl der Ausgangslösung und der Lösung der Probenentnahmekammer nach Elektroelution in eine Mikrotitrationsplatte [Fa. NUNC, Wiesbaden; Maxisorb] überführt und entsprechend erfaßt.
19.) Einsatz von formstabilisierten Gelen zur Abtrennung eines immunologischen Gemisches aus Fluoreszenzfarbstoffes und Antikörper Eine Anti-Biotin-Antikörper [Fa. Sigma, St. Louis, USA; Best. Nr.: B 7653] wurde 1 : 1 00 in Elektrophorese-Puffer aus Beispiel 2 verdünnt; 1 0Oμl davon wurden mit 1 00μl der Cascade®-Blue-Biocytin-Lösung aus Beispiel 1 8 bei Raumtemperatur 30 min inkubiert und anschließend in einer Anordnung wie Beipiel 1 8 einer Elektroelution unterworfen. Nach Elektroelution von 1 20 sec. kann kaum Fluoreszenz in der Entnahmekammer nachgewiesen werden, da der Farbstoff an dem Antikörper bindet und durch das somit vergrößerte Molekulargewicht nicht durch das formstabilisierte Gel unter den angegebenen Bedingungen wandern kann. Da die fluoreszierende Eigenschaft des Farbstoffes in Folge der Antikörperbindung gequencht wird und nur der ungebundene Farbstoff nachweisbar ist, wurde zum Nachweis eine Proteinbestimmung nach Bradford mit einem Testkit [Fa. BioRad, München Best. Nr. : 300 0006] in einem Photometer [BioPhotometer; Fa. Eppendorf, Hamburg; Best. Nr.: 61 31 000 42] durchgeführt. Danach waren die Proteinkonzentrationen wie folgt:
Figure imgf000060_0001
Der Versuch wurde mit einem formstabilisierten Gel mit 2% Agaroseanteil wiederholt:
Figure imgf000060_0002
Diese Experimente zeigen, daß der freie Fluoreszenzfarbstoff das formstabilisierte Gel passiert und der Komplex aus Antikörper und Fluoreszenzfarbstoff im formstabiliserten Gel nach Elektroelution verbleibt
20.) Einsatz von formstabilisierten Gelen zur Durchführung eines Radioimmunoassays mittels Elektroelution
Ein Testbesteck zum Nachweis von Trijodthyronin (T3) [Fa. Medipan, Selchow; T3-RIA magnum] wurde wie folgt angewandt: 50 μl Probe bzw. Standard wurden mit 50 μl Anti-T3-Antiserum und 50 μl T3-Tracer jeweils aus o.g. Testbesteck für 1 ,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 80 μl der Inkubationsmischung und 80μl Elektrophoresepuffer (siehe zuvor) gemischt und in den Probeneintragsraum ( 1 0) einer 4-Kammer-Vorrichtung wie Fig. 26 mit Anoden-(8) und Kathodenraum (6) jeweils 1 ,2 ml Volumen befüllt mit 10 fach konzentriertem Elektrophoresepuffer und einer Probenentnahmekammer (7) befüllt mit 1 60 μl Elektrophoresepuffer. Es wurden zwei Agarosefilter mit 0, 2 % Agarose und eine Dialysemembran eingesetzt. Die Elektroelutionsbedingungen waren 30 mA bei 20 V und einer Lufzeit von 1 80 sec. Danach wurden 10 μl aus dem Probeneintragsraum ( 1 0) entnommen und in einem Gamma-counter (Fa. Berthold Wildbad; LB 21 1 1 ) für 2 min. gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 27 dargestellt.
Da der T3-Tracer dieses Testbestecks an der Carboxylgruppe chemisch modifiziert und das Molekül deswegen ungeladen ist, wandert die gebundene Phase mit dem negativ geladenen Antikörper in das formstabiiisierte Gel. Bei Standard "0" wird Tracer gebunden und aus dem Probeneintragsraum ( 10) entfernt, während bei Standard 4 z.B. Tracer vom Antikörper durch kaltes T3 verdrängt wird und eine größere Menge im Probeneintragsraum ( 1 0) verbleibt.

Claims

Patentansprüche
1 . Vorrichtung zur Isolierung von elektrisch geladenen Molekülen bestehend aus einem nach unten geschlossenen Grundkörper ( 1 ) mit einem nach oben offenen Kanal (2) und zwei Elektroden (3, 4) als rechte und linke äußere Begrenzungen des Kanals (2), dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Elektroden (3,4) im Kanal (2) ein oder mehrere Zwischeneinbau(ten) (28) angeordnet sind, die den Kanal in zwei oder mehr Kammern teilen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der und insbesondere alle Zwischeneinbauten (28) einerseits eine Flüssigkeitssperre darstellt, andererseits für elektrisch geladene Moleküle durchlässig ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der und insbesondere alle Zwischeneinbauten (28) durch ihre Beschaffenheit den elektroosmotische Fluß so begrenzt, daß eine Elektroelution von geladenen Molekülen möglich ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Zwischeneinbau um ein formstabilisiertes Gel
(33) handelt.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Zwischeneinbau um ein Gewebe handelt.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß durch das Gewebe (5) ein elektroosmotischer Fluß von der Anode zur Kathode erzeugt wird.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe (5) eine Maschenweite von 0, 1 bis 50 μm, bevorzugt von 0,5 bis 5 μm besitzt.
8. Vorrichtung nach nach Anspruch 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe (5) in seiner Maschenweite so abgestimmt ist, daß biologisch aktive Partikel definierter Größe nicht durch das Gewebe dringen können.
9. Vorrichtung nach Anspruch 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorption der elektrisch geladenen Moleküle an das Gewebe (5) kleiner 40 %, bevorzugt jedoch kleiner 1 0 % ist.
1 0. Vorrichtung nach Anspruch 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe (5) durch Kalandrieren behandelt wurde.
1 1 . Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet. daß es sich bei dem Zwischeneinbau um eine Flüssigkeitssperre ( 1 3) handelt, die sich öffnen und schließen läßt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß durch elektroosmotischen Fluß das Volumen eines Probenentnahmeraums ( 10) verringert wird.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Anodenraum (8) und im Kathodenraum (6) ein Puffer mit höherer Konzentration verwendet wird als in den übrigen Kammern.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß Puffer mit unterschiedlichem pH-Wert in den Kammern vorgehalten werden.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 1 4, dadurch gekennzeichnet, daß in den Kammern eine enzymatische Reaktion oder eine Rezeptor/Liganden-Bindung stattfindet.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion oder eine Rezeptor/Liganden-Bindung während des elektrophoretischen Transfers von geladenen Molekülen stattfindet.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 1 6, dadurch gekennzeichnet. daß ein elektroosmotischer Fluß von der Anode zur Kathode erzeugt wird, der zu einer Aufkonzentration im Probenentnahmeraum (7) führt.
1 8. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Umgebung mindestens einer Elektrode reversibel einem magnetischen Feld ausgesetzt werden kann.
1 9. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, daß der nach oben offene Kanal eine Verjüngung in der Mitte aufweist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des nach oben offenen Kanals (2) 0,01 - 5 ml beträgt, bevorzugt von 0,2 - 2 ml.
21 . Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der nach oben offene Kanal rechteckig oder zylindrisch ist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mehreren Grundelementen flüssigkeitsdicht zusammengesetzt ist.
23. Formstabilisiertes Gel für elektrophoretische Zwecke, dadurch gekennzeichnet, daß die Formstabilisierung durch einen Stützelement erreicht wird.
24. Formstabilisiertes Gel nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Stützelement aus einem gesinterten Kunststoff besteht.
25. Formstabilisiertes Gel nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß der gesinterte Kunststoff aus Polypropylen oder -äthylen besteht.
26. Formstabilisiertes Gel nach nach Anspruch 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß der gesinterte Kunststoff eine Porenweite von 1 - 200 μm, bevorzugt von 20 - 120 μm besitzt.
27. Formstabilisiertes Gel nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Stützelement aus einem oder mehreren Gewebe(n) besteht.
28. Formstabilisiertes Gel nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe aus einem Kunststoff, insbesondere aus Polyester oder -amid besteht.
29. Formstabilisiertes Gel nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe eine Maschenweite von 0, 1 - 500 μm, bevorzugt von 0,5 - 1 0 μm besitzt.
30. Verwendung eines formstabilisierten Gels nach Anspruch 23 bis 29 für das Separieren der freien von der gebundenen Phase bei
Immunoassays.
31 . Verwendung des formstabilisierten Gels nach Anspruch 23 bis 29 für das Gelblotting.
32. Verwendung eines formstabilisierten Gels nach Anspruch 23 bis 29 in Vorrichtungen nach Anspruch 1 bis 4.
33. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 22 für das Separieren der freien von der gebundenen Phase bei Rezeptor- Liganden-Assays.
34. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 22 zur Isolierung von Nukleinsäuren.
35. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 22 zur Isolierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNA) ohne Kontamination durch
Ribonukleinsäuren (RNA).
36. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 22 zur Isolierung von Ribonukleinsäuren (RNA) ohne Kontamination durch Desoxyribonukleinsäuren (DNA) .
37. Verfahren zur Isolierung von geladenen Molekülen in Gemischen mit elektrophoretischen Mitteln in einem Reaktionskanal, insbesondere in einer Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch in flüssiger Form in einen Reaktionskanal eingebracht wird, einer Elektrophorese im Reaktionskanal unterworfen wird, bei dieser Elektrophorese im Reaktionskanal weiter prozessiert wird und nach dieser Prozessierung die isolierten geladenen Moleküle in löslicher Form aus dem Reaktionskanal entnommen werden.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß als Gemisch eine lysierte biologische Probe eingesetzt wird.
39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere formstabilisierte Gele den Reaktionskanal in verschiedene Kammern unterteilen.
40. Verfahren nach Anspruch 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Elektrophorese im Reaktionskanal eine Liganden-Rezeptor- Bindung stattfindet.
41 . Verfahren nach Anspruch 37 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Elektrophorese im Reaktionskanal eine enzymatische Reaktion stattfindet.
42. Verfahren nach Anspruch 37 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, daß bei der Elektrophorese im Reaktionskanal eine Aufkonzentration stattfindet.
43. Verfahren nach Anspruch 37 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Elektrophorese der elektroosmotische Fluß so reduziert wird, daß eine Elektroelution von geladenen Molekülen möglich ist.
44. Verfahren nach Anspruch 37 bis 43, dadurch gekennzeichnet. daß die freie und die gebundene Phase bei einem Liganden-Rezeptor- Assay, insbesondere bei einem Immunoassay getrennt wird und dadurch eine quantitative Bestimmung ermöglicht wird.
45. Verfahren nach Anspruch 37 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß durch Abtrennen von Komponenten mit einer Markierung aus einem Gemisch eine quantitative Bestimmung durchgeführt wird.
46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung aus einem radioaktiven Isotop, einem Enzym, einer fluoreszierenden oder lumineszierenden Substanz besteht.
47. Verfahren nach Anspruch 37 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Detergens in der entnommenen Lösung mit den isolierten geladenen Molekülen kleiner ist als die Konzentration der ursprünglich in den Reaktionskanal eingebrachten Lösung der lysierten Probe.
48. Verfahren nach Anspruch 37 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daßzur Lysemischung eine zweite Pufferkomponente zugegeben wird und danach eine Elektroelution stattfindet.
49. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 37 bis 48 zur Isolierung von Desoxyribonukleinsäuren (DNA) ohne Kontamination durch Ribonukleinsäuren (RNA) .
0. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 37 bis 48 zur Isolierung von Ribonukleinsäuren (RNA) ohne Kontamination durch Desoxyribonukleinsäuren (DNA) .
1 . Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 37 bis 48 zur Durchführung von Immunoassays.
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