EP0988536A1 - Vorrichtung und verfahren zur isolierung oder/und analyse geladener biomoleküle - Google Patents

Abstract

Eine Vorrichtung zur Isolierung oder/und Analyse von geladenen Biomolekülen, vorzugsweise Nukleinsäuren, umfassend: ein Gefäss aus einem im wesentlichen starren Kunststoff, welches einen Aufnahmeraum zur Aufnahme von Reagenzien umfasst, wobei der Aufnahmeraum durch eine Zugangsöffnung des Gefässes von aussen zugänglich ist, sowie zwei Elektroden, welche in dem Aufnahmeraum mit den Reagenzien in Kontakt bringbar sind, umfasst erfindungsgemäss ferner: eine aus elektrisch nicht leitfähigem Kunststoff gefertigte Rohreinheit, die derart bemessen oder/und ausgebildet oder/und anordenbar ist, dass wenigstens ein Teil ihrer Innenfläche mit im Aufnahmeraum enthaltenen Reagenzien oder/und Proben in Kontakt bringbar ist, wobei die Rohreinheit und eine der Elektroden derart ausgebildet sind, dass diese Elektrode in der Rohreinheit mit Reagenzien oder/und Proben in Kontakt bringbar ist. Die erfindungsgemässen Vorrichtungen eignen sich insbesondere zur Durchführung von Verfahren zur Isolierung oder/und Analyse von geladenen Biomolekülen.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung oder/und Analyse geladener Biomoleküle

Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung oder/und Analyse elektrisch geladener Biomoleküle, beispielsweise zur Isolierung oder/und Analyse von Nukleinsäuren, mit einem Gefäß aus einem im wesentlichen starren Kunststoff, welches einen Auf nahmeraum zur Auf nähme eines Reak- tionsgemischs aus Probe und Reagenzien umfaßt, wobei der Aufnahmeraum durch eine Zugangsöffnung des Gefäßes von außen zugänglich ist, sowie zwei Elektroden, welche in dem Aufnahmeraum mit dem Reaktionsgemisch in Kontakt bringbar sind.

Desweiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung oder/und Analyse von elektrisch geladenen Biomolekülen, vorzugsweise Nukleinsäuren durch Adsorbieren von in einer Lösung enthaltenen geladenen Biomolekülen an ein geeignetes Adsorptionsmittel, Abtrennen der verbleiben- den Lösung und ggf. Waschen des Adsorptionsmittels, Ablösen der Biomoleküle vom Adsorptionsmittel sowie Separation der Biomoleküle, sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung im erfindungsgemäßen Verfahren.

Gattungsgemäße Vorrichtungen finden im Bereich der biochemischen Analytik und im Umfeld der modernen pharmazeutischen Wirksubstanzidentifizierung (HPS - High Throughput Screening) auf verschiedensten Gebieten Anwendung, beispielsweise bei der Nukleinsäureanalytik. So ist aus der prioritätsälteren, jedoch nach dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlichten WO 97/34908 eine gattungsgemäße Vorrichtung bekannt, bei welcher das Gefäß neben einem Aufnahmeraum ferner einen Entnahmeraum aufweist, der mit dem Aufnahmeraum über einen Transferkanal verbunden ist. Zur Isolierung von Nukleinsäuren werden diese durch Elektrophorese aus dem Aufnahmeraum durch den Transferkanal in den Entnahmeraum bewegt und dort angereichert. Darüber hinaus weist das Gefäß einen sich an seine Bodenwandung anschließenden Rohrstutzen auf, durch welchen der Aufnahmeraum entleert werden kann. Insgesamt weist das vorstehend beschriebene Gefäß somit einen komplexen Aufbau auf, der wiederum hohe Herstellungskosten nach sich zieht. Insbesondere im Hinblick auf Anwendungsgebiete, in denen eine Wiederverwendung der Vorrichtung aus bestimmten Gründen nicht in Frage kommt bzw. nicht zulässig ist, besteht daher Bedarf nach einer einfacheren und kostengünstigeren Lösung.

Die nachfolgende Diskussion weiterer Druckschriften zeigt verschiedene weitere verbesserungswürdige Aspekte der Vorrichtungen sowie der damit durchgeführten Verfahren des Standes der Technik auf:

Bekannt sind beispielsweise auch Elektrophoreseapparaturen, bei welchen Platinelektroden verwendet werden. Platin besitzt eine hohe Resistenz gegen Redoxprozesse und stellt als inertes Elektrodenmaterial eine dauerhafte Lösung dar. Ein Nachteil sind dabei die entsprechend hohen Kosten des Materials, z. B. bei Applikationen mit beschichteten Elektroden, bei der die Elektrode nur einmalig verwendet werden kann. Dabei ist zu berücksichtigen, daß die Beschichtung von Platinoberflächen technisch aufwendig ist. Elektroden aus Kunsttoffen wie z.B. aus Synthetic-Carbon (BIO Forum Forschung und Entwicklung GIT-Verlag 1 9. Jahrgang Vol. 1 2; 1 996 S. 584) sind ebenfalls Stand der Technik. Solche Vorrichtungen sind jedoch auch nicht zum Einmalgebrauch geeignet, da sie nicht wirtschaftlich, z.B. über einen Spritzgußprozeß hergestellt werden können. Eine Übersicht über gelelektrophoretische Methoden ist beschrieben in "Electrophoresis Theorie, Technics; and Biochemical and Ciinical Applikations". Editor: A.T. Andrews, ISBN 0-1 9-854633-5, Clarendon Press, Oxford, 1 986. In dieser Arbeit sowie in einer Arbeit von Southern (GB 8810400, 1 988) werden neben den normalen gelelektrophoretischen Methoden auch sogenannte Plotting- techniken beschrieben, die entsprechende Plattenelektroden benötigen. Hierbei muß aus Kostengründen auf die Verwendung von Platinelektroden gänzlich verzichtet werden. In der Regel kann hier auch V2A-Stahl zur Verwendung gelangen.

In der WO 95/1 2808 und der US 5,605,662 werden Systeme zur Hybridisierung von Nukleinsäuren beschrieben, die ebenfalls eine spezielle Anordnung von Elektroden verwenden. Schwerpunkt dieser Schriften ist eine Vorrichtung - gefertigt im Mikromaßstab - in der Nukleinsäure- hybridisierungen durchgeführt werden können. Dabei wird eine spezielle Stringenzkontrolle durch entsprechende elektronische Interaktionen mit Mikroelektroden erzeugt. Die Oberflächen dieser Mikroelektroden bestehen aus einem Material, das einen freien Transport von Gegenionen ermöglicht. Eingesetzt wird diese Vorrichtung, um Nukleinsäuren zu konzentrieren und entsprechende Hybridisierungen durchzuführen. Durch entsprechende Umpolungen an der Elektrode können schlecht hybridisierende Nukleinsäureteile entfernt werden.

Die Elektrode ist mit Oligonukleotid beschichtet und kann durch Mikrolitho- grafietechniken hergestellt werden. Folgende Materialien für die Elektroden werden genannt: Aluminium, Gold, Silber, Zinn, Kupfer, Platin, Palladium, Kohlenstoff, Halbleitermaterialien und Kombinationen davon. Die Herstellung dieser Elektroden oder das Aufbringen der Elektroden auf gewisse Substrate, gemäß der WO 95/1 2807 bzw. US 5,605,662, erfolgt in der Regel durch Vakuumverdampfung bzw. Aufdampfprozesse. Durch entsprechende Nachbehandlung ist eine Beschichtung mit biologisch aktiven Komponenten wie z. B. Nukleinsäuren auf der Elektrodenoberfläche möglich.

Ein weiteres Verfahren, das den Einsatz von Elektroden benötigt, ist in der WO 96/1 5440 beschrieben. Dieses sogenannte Elektrochemilumineszenz- verfahren löst durch Anregung von Molekülen an der Oberfläche einer

Elektrode ein Lumineszenzsignal aus. Mittels Magnetfeldern werden z.B. Magnetpartikel, die geeignete Lumineszenzlabel tragen, an die Elektrodenoberfläche transportiert. Die spezielle Ausführungsform in der oben erwähnten Schrift ist eine wiederverwendbare Durchflußzelle. Sie umfaßt eine vorzugsweise aus Gold gefertigte Elektrode. Als Gegenelektrode wird eine entsprechende Referenzelektrode benutzt. Die Gegenelektrode besteht in der Regel aus einem Silber-Silberchloridsystem. All diese Verfahren haben den Nachteil, daß sie als Elektrodenmaterial teure Edelmetalle benutzen und dadurch z.B. für eine Vorrichtung zum einmaligen Gebrauch nicht geeignet sind.

Die WO 97/02487 beschreibt eine teststreifenartige planare Vorrichtung zur Messung von Elektrochemilumineszenz.

In "Methods in Enzymology 65" ( 1 980) Seite 371 - 380 wird ein Verfahren zur Elektroelution beschrieben. Zum Einsatz kommen dabei Platinelektroden.

Ein Verfahren zur Beschichtung von nicht leitfähigen Plastikoberflächen mittels Avidin oder Streptavidin ist in der US 4,656,252 und der US 4,478,91 4, Re. 31 ,71 2 beschrieben.

In der DE 1 95 20 398 A1 sind magnetische Partikel mit Glasoberfläche beschrieben, die sich für die Isolierung von Nukleinsäuren eignen und die in einer Vorrichtung nach der vorliegenden Anmeldung verwendet werden können. Ein vergleichbares Verfahren mit porösen Glasoberflächen und kova- lenter Bindung ist in der US 5,601 ,979 für die Nukleinsäurehybridisierung beschrieben.

Die WO 97/01 646 offenbart ein Verfahren für eine elektrochemische Detek- tion für Nukleinsäurehybridisierungen mit Elektroden aus metallischen Substraten, die sich auf einer Oberfläche befinden. Neben Nukleinsäuren können nach der WO 92/20702, der WO 92/20703, der EP 0 61 8 923 A1 und der WO 96/27679 auch sogenannte Peptidnukleinsäuren (PNA) mit Vorteil, gerade für Hybridisierungen, Verwendung finden.

Demgegenüber ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art bereitzustellen, welche einfach aufgebaut und kostengünstig herstellbar ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Vorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, welche darüber hinaus eine aus elektrisch nicht leitfähigem Kunststoff gefertigte Rohreinheit umfaßt, die derart bemessen oder/und ausgebildet oder/und angeordenbar ist, daß wenigstens ein Teil ihrer Innenfläche mit im Aufnahmeraum enthaltenem Reaktionsgemisch in Kontakt bringbar ist, während die Rohreinheit und eine der Elektroden derart ausgebildet sind, daß diese Elektrode in der Rohreinheit mit dem Reaktions- gemisch in Kontakt bringbar ist. Aufgrund des erfindungsgemäßen Vorsehens der Rohreinheit kann auf den Einsatz eines Gefäßes mit gesondert ausgebildeter Entnahmekammer verzichtet werden, so daß das Gefäß entsprechend einfacher aufgebaut sein und entsprechend kostengünstiger hergestellt werden kann. Erfindungsgemäß ist die Entnahmekammer im Innenraum der Rohreinheit vorgesehen, wobei die Rohreinheit als konstruktiv einfaches Bauteil nur unwesentlich zu den Herstellungskosten der Gesamtvorrichtung beiträgt.

Die Rohreinheit kann auf verschiedenste Art und Weise in dem Gefäß ange- ordnet werden:

Beispielsweise kann sie an einer der Elektroden befestigbar sein, vorzugsweise auf diese Elektrode aufsteckbar sein, und zusammen mit dieser in das Gefäß eingeführt werden. Dabei ist es ferner möglich, die zweite Elektrode an der Rohreinheit zu befestigen, vorzugsweise auf diese Elektrode aufzustecken. Diese Ausführungsvarianten sind insbesondere bei Vorrichtungen zur automatisierten Durchführung der Isolierung oder/und Analyse geladener Biomoleküle unter Verwendung eines programmiert bewegbaren Roboterarms interessant. Mit Hilfe dieses Roboterarms können die Elektrode bzw. die Elektroden und die Rohreinheit aus entsprechenden Magazinen geholt, wie gewünscht zusammengesteckt und in das Gefäß eingebracht werden.

Zusätzlich oder alternativ kann die Rohreinheit auf den Boden des Gefäßes aufgestellt werden. Um einen Reagenzienaustausch zwischen dem Gefäß und dem Innenraum der Rohreinheit ermöglichen zu können, wird dabei vorgeschlagen, daß die Rohreinheit an ihrem unterem Ende, vorzugsweise dem Gefäßboden benachbart oder/und an diesen anschließend, Durchbrechungen aufweist. Beispielsweise kann die Rohreinheit auf dem Gefäßboden aufstehende Standfüße aufweisen, die durch an den Boden anschließende Schlitze voneinander getrennt sind, wobei der Reagenzienaustausch durch diese Schlitze zwischen den Füßen hindurch stattfinden kann.

Ferner ist es möglich, daß die Rohreinheit am Rand der Zugangsöffnung zu befestigen, vorzugsweise einzuhängen.

Im Hinblick auf eine automatisierte Durchführung der Isolierung oder/und Analyse der Biomole küle, insbesondere unter Einsatz eines programmiert bewegbaren Roboterarms, wird vorgeschlagen, daß die Rohreinheit Positionierarme zur Stabilisierung ihrer Lage in dem Gefäß aufweist. Hierdurch kann sichergestellt werden, daß sich die Rohreinheit stets an der gleichen Relativposition bezüglich der Gefäßwandungen befindet, und so mittels einer programmierten Bewegung des Robotorarms zielgenau angefahren werden kann, beispielsweise um die Elektrode in den Innenraum der Rohreinheit einzuführen.

In einer einfachsten Ausführungsvariante bildet der gesamte Innenraum der Rohreinheit die Elektrodenkammer. Es ist jedoch ebenso möglich, daß im

Innenraum der Rohreinheit eine Elektrodenkammer abgeteilt ist, wobei ein

Verbindungsdurchgang zwischen Elektrodenkammer und dem restlichen Innenraum der Rohreinheit mittels einer semipermeabien Membran verschlossen ist. Durch diese Ausbildung kann verhindert werden, daß die im Rahmen der Elektrophorese zu der einen Elektrode, bei der Nukleinsäure- isolierung beispielsweise der Anode, hin bewegenden Biomoleküle mit dieser Elektrode in Kontakt gelangen und dort Redox-Reaktionen unterworfen werden. Um die im Innenraum der Rohreinheit angereicherten Nukleinsäuren dennoch in einfacher Weise entnehmen zu können, wird vorgeschlagen, daß am oberen Ende der Rohreinheit neben einem Zugang zu der Elektrodenkammer ferner einen Zugang zu einer der Elektrodenkammer benachbarten Entnahmekammer vorgesehen ist. Um bei der Isolierung oder/und Analyse von Biomolekülen nicht nur auf Flüssigkeits-Elektrophoreseverfahren beschränkt zu sein, wird vorgeschlagen, daß in der Rohreinheit eine Gelmasse angeordnet ist, die sich über deren gesamte lichte Weite erstreckt, so daß mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch Gel- Elektrophoreseverfahren durchgeführt werden können.

Um Biomoleküle, die sich als Ergebnis vorangegangener Verfahrensschritte am Gefäßboden angesammelt haben, effektiv isolieren zu können, wird vorgeschlagen, daß sich die Rohreinheit von der einen Elektrode zum Gefäßboden hin erweitert. Hierdurch kann das "Einzugsgebiet" für die elektrophoretische Isolierung der Biomoleküle in unmittelbarer Umgebung der einen Elektrode vergrößert werden.

Ein besonders einfach aufgebautes Gefäß kann beispielsweise dadurch bereitgestellt werden, daßdas Gefäßeinen durchbrechungsfreien Boden und eine durchbrechungsfreie Seitenwandung aufweist. Ein derartiges Gefäß ist besonders einfach und damit kostengünstig herzustellen und bietet in Verbindung mit zwei Elektroden eine einfache Möglichkeit zur Durchführung elektrophoretischer Prozesse, und dies auch ohne Vorsehen einer Rohr- einheit. Zwar ist die Effizienz einer elektrophoretischen Isolierung von Biomolekülen im Bereich einer Elektrode nicht so effektiv wie bei Einsatz der Rohreinheit, insbesondere dann nicht, wenn die Biomoleküle aus der Umge- bung der Elektrode abgesaugt werden sollen. Jedoch kann bei bestimmten Verfahren auch diese geringere Effektivität ausreichen. Daher wird für eine Vorrichtung, deren Gefäß einen durchbrechungsfreien Boden und eine durchbrechungsfreie Seitenwand aufweist, selbständiger Schutz bean- sprucht.

Wenn das Gefäß aus einem thermisch verformbaren Kunststoff gebildet ist, kann es besonders kostengünstig gefertigt, beispielsweise spritzgegossen werden.

Der Gefäßboden kann wenigstens einen Bereich geringerer Bodenwandstärke aufweisen. Dies ist insbesondere zu Detektionszwecken von Vorteil, beispielsweise dann, wenn dem Bereich geringerer Bodenwandstärke benachbart eine Detektionseinrichtung, vorzugsweise ein Photomultiplier, angeordnet ist.

Wie das Gefäß so können auch die Elektroden aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gefertigt sein. Aus Kostengründen ist es dabei bevorzugt, die Elektroden bzw. die wenigstens eine Elektrode aus einem elektrisch leit- fähige Zuschlagstoffe enthaltenden Kunststoff zu fertigen. Dabei können die Zuschlagstoffe Graphit, Eisen, Silber, Gold oder andere Metalle oder/und deren Mischungen oder/und Legierungen umfassen.

Im Hinblick auf gute elektrische Leitung wird vorgeschlagen, daß die wenigstens eine Elektrode einen elektrischen Widerstand von weniger als 1 00 MΩ, vorzugsweise von weniger als 1 MΩ, aufweist. Einfache Fertigung, beispielsweise durch Spritzguß, wird ermöglicht, wenn die Elektroden bzw. die wenigstens eine Elektrode aus thermisch verformbarem Kunststoff gefertigt sind.

Die Elektroden können in dem Gefäß in verschiedener Art und Weise angeordnet sein. Insbesondere die in der Rohreinheit angeordnete Elektrode kann als von dem Gefäß gesondertes Element ausgebildet sein. Ferner kann die Elektrode am Gefäß oder/und der Rohreinheit mittelbar oder unmittelbar befestigt werden, vorzugsweise festgeklemmt werden, um ihr eine definierte Lage relativ zu der jeweils anderen Elektrode geben zu können.

Beispielsweise für den Fall, daß angereicherte Biomoleküle zur weiteren Analyse aus dem Gefäß entnommen werden sollen, wird vorgeschlagen, daß wenigstens eine Elektrode als Pipettenspitze oder als Teil einer Pipettenspitze ausgebildet ist. Dabei kann die gesamte Pipettenspitze aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gefertigt sein. Es ist jedoch ebenso möglich, lediglich einen Teil der Pipettenspitze aus elektrisch leitfähigem Kunststoff zu bilden, beispielsweise indem man beim Spritzguß einer ersten Portion Kunststoff elektrische leitfähige Zuschlagstoffe beimengt, während man eine zweite Portion Kunststoff in reiner Form verarbeitet. Alternativ ist es ferner möglich, in einer Pipettenspitzen eine gesondert ausgebildete Elektrode anzuordnen.

Zur Vergrößerung der Reaktionsfläche der Elektrode wird vorgeschlagen, daß an der Außenseite der Elektrode Ansätze angeordnet oder ausgebildet sind.

Schließlich ist es auch möglich, daß wenigstens eine Elektrode mit der Gefäßwandung einstückig ausgebildet ist. Dabei kann beispielsweise das gesamte Gefäß aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gebildet sein, so daß das gesamte Gefäß diese Elektrode bildet. Es ist jedoch ebenso möglich, volumenmäßig begrenzten Teilbereichen des Kunststoffes bei der Fertigung elektrisch leitfähige Zuschlagstoffe beizumengen, so daß beispielsweise auf einer Seite des Gefäßes die Kathode und auf der anderen Seite des Gefäßes eine Anode gebildet wird. Diese Ausführungsvariante ist insbesondere für die rohreinheitsfreie Vorrichtung von Interesse, deren Gefäß einen durchbrechungsfreien Boden und eine durchbrechungsfreie Seitenwand aufweist. Um im Betrieb einen elektrischen Kurzschluß zuverlässig verhindern zu können, wird vorgeschlagen, daß ein Abstandshalter vorgesehen ist, der einen körperlichen Kontakt der Elektroden verhindert. Im Hinblick auf eine möglichst einfach Entnahme angereicherter Biomoleküle kann dieser Abstandshalter rohrförmig ausgebildet sein, vorzugsweise in Anpassung an die äußere Gestalt einer Pipettenspitze.

Um das Einbringen von Elektroden und Abstandshalter in das Gefäß in möglichst wenigen Verfahrensschritten bewerkstelligen zu können, kann vorgesehen sein, daß der Abstandshalter und wenigstens eine Elektrode als Einheit ausgebildet sind. Ferner kann der Abstandshalter als Pipettenspitze ausgebildet sein.

Wie bereits in der vorstehenden Diskussion mehrfach angeklungen ist, können die Elektroden mit einer äußeren Stromquelle verbunden sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist wenigstens eine der Elektroden oder/und die semipermeable Membran mit einer Beschichtung versehen. Eine derartige Beschichtung ermöglicht es, die zu isolierenden oder/und zu analysierenden Biomoleküle an die Elektrode bzw. die semipermeable Membran zu binden. Die Einwirkung des elektrischen Feldes unterstützt hierbei die Bindungsgeschwindigkeit und die räumliche Annäherung der Biomoleküle an die Elektrode oder/und semipermeable Membran. Allerdings ist es besonders bevorzugt, die Bindung an die semipermeable Membran zu bewirken, da weniger mit Beeinträchtigungen der Biomoleküle aufgrund der in der Nähe der Elektrode stattfindenden Redoxreaktionen oder dergleichen oder aufgrund von Wärmeentwicklung zu rechnen ist.

Durch diese Bindung mittels der Beschichtung können die Biomoleküle zum einen leicht isoliert werden, indem die Elektrode bzw. die Membran aus der Vorrichtung entfernt wird, zum anderen kann auch eine Detektion der gebundenen Biomoleküle in an sich bekannter Weise vorteilhaft erfolgen.

Handelt es sich bei dem Biomolekül um ein Protein, kann z.B. ein markierter Antikörper gegen dieses Protein zugesetzt werden, und die Bindung des Antikörpers an das Protein über die Markierung und damit das Vorhandensein des Proteins qualitativ oder/und quantitativ bestimmt we rd e n . H ie rbei ka n n z . B . a u c h ei n e D ete kti o n ü ber Elektrochemilumineszenz erfolgen, wie sie grundsätzlich unter anderem in der WO96/1 5440 beschrieben ist.

Zum anderen kann das Biomolekül auch eine Nukleinsäure sein, welche ebenfalls nach dem Fachmann an sich bekannten Methoden nachgewiesen werden kann.

Die Beschichtung der Elektrode oder/und der Membran ist vorzugsweise mehrlagig ausgebildet. Hierbei ist es bevorzugt, daß die Beschichtung ein oder mehrere biologische Polymere umfaßt. Als biologische Polymere sind insbesondere Moleküle geeignet, die sich leicht auf eine Elektroden- oder Membranoberfläche aufbringen lassen und zum anderen fähig sind, eine direkte oder indirekte, spezifische oder unspezifische Bindung von Biomolekülen zu vermitteln. Derartige biologische Polymere sind an sich bekannt. Als bevorzugte Polymere können Proteine genannt werden, wobei Rinderserumalbumin (RSA) wiederum ein bevorzugtes Protein darstellt. RSA ist allgemein in der Lage, unspezifische Bindungen zu ermöglichen, kann aber auch, z.B. nach entsprechender Vorbehandlung spezifische Bindungen vermitteln.

Eine derartige Vorbehandlung kann z. B. thermisch erfolgen. Derartig vorbehandeltes RSA kann dann vorzugsweise als Bindungsvermittler für Avidin oder Streptavidin zur Ausbildung einer weiteren Schicht von biologischen Polymeren dienen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das biologische Polymer ein spezifisch bindefähiges Protein. Derartige spezifisch bindefähige Proteine sind dem Fachmann bekannt, und es handelt sich dabei vorzugsweise im weitesten Sinne um einen Partner eines spezifischen Bindepaares. Das Vorliegen eines Partners eines spezifischen Bindepaares mindestens in einer Lage der Beschichtung ist eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung. Spezifische Bindepaare sind ebenfalls allgemein bekannt, beispielsweise Paare aus Ligand und Rezeptor, wobei es sich um eine sehr breite Definition handelt, welche auch weitere im folgenden genannte Bindepaare, wie Antigen/Antikörper oder Antikörperfragment, Hapten/Antikörper oder Antikörperfragment, und Biotin/(Strept-)Avidin umfassen kann.

Wenn in die erfindungsgemäße Beschichtung der Elektrode oder der Membran ein Partner eines spezifischen Bindepaares integriert ist, ist das zu isolierende oder/und analysierende Biomolekül entweder mit dem anderen Partner des Bindepaares konjugiert oder aber das Biomolekül stellt selbst den anderen Partner dar.

Eine besonders bevorzugte mehrlagige Beschichtung ist zusammengesetzt aus vorbehandeltem RSA an welches Streptavidin gebunden ist. An diese Beschichtung kann jegliches Molekül gebunden werden, welches mit Biotin konjugiert ist.

Zum anderen ist es besonders bevorzugt, zur Isolierung oder/und Analyse von Proteinen deren Rezeptoren oder spezifische gegen das Protein gerichtete Antikörper in die Beschichtung zu integrieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist in der Beschichtung als biologisches Polymer mindestens eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid vorhanden. Auch diese Moleküle können direkt adsorptiv an die Elektrode oder die Membran gebunden sein oder aber über ein spezifisches Bindepaar, ggf. noch in Kombination mit weiteren Beschichtungslagen, wie z.B. RSA.

Mittels einer in der Beschichtung vorhandenen Nukleinsäure oder einem Poly- oder Oligonukleotid können zu isolierende oder analysierende

Nukleinsäure, wie DNA oder RNA über Hybridisierung gebunden werden.

Auch andere Beschichtungen, die Nukleinsäuren binden können sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet. Hierzu sind bevorzugt Peptidnukleinsäuren zu nennen, auf welche bereits oben in Verbindung mit den Veröffentlichungen WO92/20702, WO92/20703, EP 0 61 8 923 A 1 und WO96/27679 hingewiesen wurde. Die dort beschriebenen PNAs sind prinzipiell auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar.

Neben den vorstehend erläuterten bevorzugten Ausführungsformen oder kombiniert mit diesen kann die Beschichtung vorzugsweise auch in wenigstens einer Lage reaktive Linkermoleküle enthalten. Derartige Linkermoleküle ermöglichen es, biologische Polymere mittels kovalenter Bindung an die Elektrode oder Membran zu koppeln. An die über Linker- moleküle gekoppelten biologischen Polymere können sich gewünschtenfalls auch weitere Schichten von vorzugsweise biologischen Polymeren anschließen.

In Weiterbildung der Erfindung wird vorgeschlagen, daß zum Abtrennen der Biomoleküle von anderen Substanzen geeignete Adsorptionsmittel in dem Gefäß vorgesehen bzw. in das Gefäß einbringbar sind. Dabei können die Adsorptionsmittel beispielsweise Silicagel oder/und Agarosegel oder/und Polyacrylamidgel oder/und lonenaustauschmaterial oder/und Glasfaservlies oder/und Glaspartikel, vorzugsweise in spezielles Adsorptionseigenschaften aufweisendes Glas eingeschlossene magnetische Partikel, umfassen. Eine hohe Effizienz bei der Isolierung der Biomoleküle durch Adsorption an einem geeigneten Adsorptionsmittel erreicht man dann, wenn dieses Adsorptionsmittel in dem Gefäß möglichst gleichmäßig verteilt ist. Bei der Entnahme der Biomoleküle aus dem Gefäß bzw. bei ihrer Analyse in dem Gefäß ist es hingegen erwünscht, diese an einer vorbestimmten Stelle zu konzentrieren. Daher wird in Weiterbildung der Erfindung vorgeschlagen, daß dem Gefäß eine Magnetfeldvorrichtung zugeordnet ist, die zwischen einem aktiven Zustand, in welchem sie auf in dem Gefäß vorhandene Magnetpartikel eine anziehende Kraft ausübt, und einem inaktiven Zustand, in welchem sie auf die Partikel keine bzw. im wesentlichen keine Kraft ausübt, überführbar ist. Die Magnetfeldvorrichtung kann dabei beispielsweise einen Körper aus permanentmagnetischem oder/und magnetisiertem Material umfassen. Es ist jedoch ebenso möglich, daß die Magnetfeldvorrichtung einen Elektromagneten umfaßt, wobei dieser Elektromagnet zur Überführung zwischen dem aktiven und dem inaktiven Zustand ein- und ausschaltbar sein kann. Sowohl dann, wenn die Magnetfeldvorrichtung einen Magnetkörper umfaßt, als auch dann, wenn sie einen Elektromagneten umfaßt, kann die Überführung zwischen dem aktiven und dem inaktiven Zustand auch dadurch erreicht werden, daß die Magnetfeldvorrichtung zwischen einer an das Gefäß angenäherten, dem aktiven Zustand entsprechenden Stellung und einer von dem Gefäß entfernten, dem inaktiven Zustand entsprechenden Stellung verlagerbar ist, beispielsweise verkippbar oder verschiebbar ist.

Ist der Vorrichtung ein programmiert bewegbarer Roboterarm zugeordnet, beispielsweise der Roboterarm eines Pipettier-Roboters, so können dieser Roboter und die Magnetfeldvorrichtung derart aufeinander abgestimmt ausgebildet sein, daß die Überführung der Magnetfeldvorrichtung zwischen dem aktiven Zustand und dem inaktiven Zustand allein von dem Pipettier- Roboter bewerkstelligbar ist. Beispielsweise kann der Roboterarm durch Anlage an einem Kippschalter, einem Verstellhebel oder einem Kipphebel die Überführung der Magnetfeldvorrichtung zwischen dem aktiven Zustand und dem inaktiven Zustand herbeiführen.

Um die Zusammenstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in ihren zahl- reichen Ausführungsvarianten stets in einfacher Weise sicherstellen zu können, wird vorgeschlagen, daß der Pipettier-Roboter neben dem Pipettier- Kolben ferner einen Greifer umfaßt.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Verbund von erfindungsgemäßen Vorrichtungen, bei welchen die Anoden der Vorrichtungen miteinander verbunden sind und die Kathoden der Vorrichtungen miteinander verbunden sind. Auch können die Rohreinheiten der erfindungsgemäßen Vorrichtungen zu einem Verbund zusammengefaßt sein, so daß alle Gefäße mittels einer einzigen Bewegung des Roboterarms mit einer zugehörigen Rohreinheit bestückt werden können. Eine derartige Verbundausführung eignet sich insbesondere zur Durchführung von Reihenuntersuchungen, beispielsweise einer Vielzahl von Nukleinsäureproben. Bei einem derartigen Verbund können die Gefäße zu einer Mikrotitrationsplatte zusammengefaßt sein.

Die Erfindung betrifft ferner eine Basiseinheit, welche wenigstens eine Aufnahme für eine erfindungsgemäße Vorrichtung oder/und für einen Verbund erfindungsgemäßer Vorrichtungen umfaßt. Diese Basiseinheit kann dabei vorgefertigte Aufnahmen für wenigstens einen Magnetkörper bzw. wenigstens einen Elektromagneten aufweisen. Sie kann aber auch bereits komplett mit wenigstens einer Magnetfeldvorrichtung bestückt sein. Ferner kann sie wenigstens eine elektrische Zuleitung zum Kontaktieren wenigstens einer Elektrode umfassen. Die Vielfalt der Einsatzmöglichkeiten kann dadurch weiter erhöht werden, daß die wenigstens eine Aufnahme kühlbar oder/und heizbar ist. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der eingangs genannten Art. Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Isolierung oder/und Analyse von geladenen Biomolekülen durch Adsorbieren von in einer Lösung enthaltenen geladenen Biomolekülen an ein geeignetes Adsorptionsmittel, Abtrennen der verbleibenden Lösung und ggf. Waschen des Adsorptionsmittels, Ablösen der Biomoleküle vom Adsorptionsmittel sowie Separation der Biomoleküle, wobei das Verfahren in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung oder einem Verbund von erfindungsgemäßen Vorrichtungen durchgeführt wird, wobei zumindest das Ablösen der Biomoleküle vom Adsorptionsmittel durch Elektroelution bewirkt wird.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen auch Verfahren umfaßt sein, bei denen ein Adsorptionsmaterial, welches bereits mit geladenen Biomolekülen belegt ist direkt in eine erfindungsgemäße Vorrichtung eingebracht wird, und also die Schritte Adsorbieren an ein Adsorptionsmittel und Abtrennen der verbleibenden Lösung sowie ggf. Waschen wegfallen. Da die vorliegende Erfindung in erster Linie die Elution und Separation der Biomoleküle betrifft, ist auch das Einbringen eines mit Biomolekülen belegten Adsorptionsmaterials als unter die Erfindung fallend anzusehen.

Elektroelution bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Ablösung der Biomoleküle vom Adsoprtionsmittel durch Einwirkung eines elektrischen Feldes, welches zwischen den in der Vorrichtung vorhandenen Elektroden erzeugt wird. Die geladenen Biomoleküle wandern im elektrischen Feld entsprechend ihrer elektrischen Ladung und können in der Umgebung der entgegengesetzt polarisierten Elektrode konzentriert werden. Biomoleküle können sowohl eine positive als auch negative Ladung aufweisen. Nukleinsäuren sind negativ geladen und wandern im elektrischen Feld zur Anode. Proteine können je nach ihrer Aminosäurezusammensetzung einen positiven oder negativen Ladungsüberschuß und damit eine entsprechende Ladung aufweisen. Je nach zu isolierendem oder/und analysierendem Biomolekül kann daher die Polarisierung der Elektroden in der erfindungsgemäßen Vorrichtung so erfolgen, daß die Isolierung oder/und Analyse in vorteilhafter Weise durchgeführt werden kann.

Das Adsorptionsmittel, mit Hilfe dessen die geladenen Biomoleküle von anderen in der Lösung vorhandenen Stoffen abgetrennt wird, ist vorzugsweise ausgewählt aus einem Gel, einem lonenaustauschermaterial, einem Glasfaservlies und Glaspartikeln, insbesondere in Glas eingeschlossenen magnetischen Partikeln. Bei Gelen können allgemein bekannte Trenngele, wie Agarose- oder Polyacrylamidgele ebenso eingesetzt werden, wie Silicagele oder dgl. Bei Verwendung von Glaspartikeln ist es wiederum bevorzugt, wenn die Glasoberfläche für die Bindung von Biomolekülen entsprechend vorbehandeltbzw. modifiziert ist. Derartige Glaspartikel, meist Beads genannt, sind dem Fachmann bekannt und von vielen Firmen kommerziell erhältlich.

Darüber hinaus können erfindungsgemäße Vorrichtungen dazu benutzt werden, um geladene Biomoleküle aus einem Gel zu eluieren, indem sie zusammen mit Elektrophoresepuffer zwischen zwei erfindungsgemäße Elek- troden in einem Reaktionsgefäß angeordnet werden und durch den elektro- phoretischen Fluß eine Freisetzung aus dem Gel erfolgt.

Für die Elektroelution wird nach Bindung der geladenen Biomoleküle an das Adsorptionsmittel nötigenfalls eine Anpassung der lonenstärke der Lösung vorgenommen. Dies geschieht entweder durch Aufsalzen der vorhandenen Lösung, z.B. der letzten Waschlösung, oder aber vorzugsweise durch Zugabe eines Elektroelutionspuffers mit geeigneter lonenstärke.

Die Separation der Biomoleküle erfolgt bevorzugt in der Umgebung der im Verlgeich zu den Biomolekülen entgegengesetzt polarisierten Elektrode mittels des elektrischen Feldes. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die Biomoleküle aus dem Adsorptionsmittel heraus, bzw. werden von diesem abgelöst, und bewegen sich dann auf die entgegengesetzt polarisierte Elektrode zu.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ablösun überraschenderweise durch Erwärmung auf Temperaturen von 30°C bis 100°C, vorzugsweise 55 °C bis 80°C, erheblich verbessert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung geht man nicht von einer Lösung aus, welche die geladenen Biomoleküle in freier Form aufweist, sondern man verwendet eine Lösung mit Zellen, vorzugsweise intakten Zellen, in denen die Biomoleküle enthalten sind. Diese Zellen bindet man an ein Absorptionsmittel, wie z.B. magnetische Glaspartikel. Nach Adsorption der Zellen werden diese lysiert, und nachfolgend freigesetzte geladene Biomoleküle in der Umgebung der entgegengesetzt polarisierten Elektrode mit Hilfe eines elektrischen Feldes konzentriert. Die aus Zellen zu isolierenden Biomoleküle sind im Rahmen der Erfindung insbesondere Nukleinsäuren.

Es ist weiterhin bevorzugt, die aus den Zellen freigesetzten Biomoleküle nochmals einer Separation von anderen ebenfalls freigesetzten Molekülen durch erneute Bindung an ein Adsoprtionsmittel zu unterwerfen, wobei ein besseres Isolations- und Analyseergebnis erzielt wird. Die erneute Adsorption kann mit gleichen, oder auch verschiedenen Adsorptionsmitteln erfolgen, je nach Spezifität der Adsorptionsmittel.

Um beispielsweise nur aus Zellen einer bestimmten Art Biomoleküle zu isolieren, kann ein Adsortionsmittel verwendet werden, welches Rezeptoren für Oberflächenantigene bestimmter Zellen präsentiert. Hierbei mögliche Anwendungen und Varianten sind dem Fachmann im Hinblick auf die zu isolierenden Biomoleküle geläufig und können mit Hilfe der sonstigen erfindungsgemäßen Offenbarung leicht durchgeführt werden. Im Übrigen ändert sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht, d.h. Elution und Separation erfolgen wie bereits für die verhergehenden Ausgestaltungen beschrieben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als Adsorptionsmittel in Glas eingeschlossene magnetische Partikel verwendet und bei der Elution der Biomoleküle die Magnetpartikel mit Hilfe der Magnetfeldvorrichtung räumlich von den Biomolekülen getrennt gehalten. Dies geschieht insbesondere dadurch, daß nach Adsorption der Biomoleküle zur Elution und Separation gleichzeitig mittels der Magnetfeldvorrichtung und den Elektroden auf die magnetischen Partikel und die Biomoleküle in räumlich entgegengesetzter Weise eingewirkt wird. Die Biomoleküle werden hierbei in der Nähe der entgegengesetzt polarisierten Elektrode konzentriert, wogegen die Magnetpartikel vorzugsweise durch die Magnetfeldvorrichtung in größtmöglicher Entfernung gesammelt werden. Hierdurch können Beeinträchtigungen bei der Entnahme oder Analyse der Biomoleküle, welche durch die Magnetpartikel entstehen könnten, vermieden.

In einer Ausführungsform der Erfindung, nämlich bei der Isolierung der Biomoleküle, werden diese dann aus der Nähe der entgegengesetzt polarisierten Elektrode abgezogen, vorzugsweise abpipettiert. Man erhält eine Lösung des Elutionspuffers mit darin konzentrierten Biomolekülen. Wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet, bei der eine der Elektroden oder die semipermeable Membran eine Beschichtung aufweisen, welche eine Bin- düng der Biomoleküle vermittelt, so kann auch direkt die Elektrode oder/und die semipermeable Membran mit den daran gebundenen Biomolekülen entnommen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, ist dabei die Elektrode selbst eine Pipettenspitze und eventuell noch nicht vollständig gebundene Biomoleküle können noch mit abpipettiert werden.

Wenn es sich bei den zu isolierenden oder zu analysierenden geladenen Biomolekülen um Nukleinsäuren handelt, erfolgt die Bindung im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise an eine Beschichtung der Elektrode oder/und semipermeablen Membran, welche eine komplementäre Nukleinsäure umfaßt mittels Hybridisierung.

In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die geladenen Biomoleküle nicht nur isoliert, sondern in der erfindungsgemäßen Vorrichtung selbst analysiert. Diese Analyse kann zum einen durch Anbringung einer Markierung an die Biomoleküle und Detektion der Markierung in an sich bekannter Weise erfolgen, wobei auch wie oben bereits erwähnt, Chemilumineszenzmethoden angewandt werden können, die mit Hilfe eines Photomultipliers detektierbar sind. Auf entsprechende Veröffentlichungen, deren Methoden analog angewandt werden können, wurde oben bereits verwiesen.

Zum anderen kann aber auch gerade bei der Analyse von Nukleinsäuren ein Problem darin liegen, daß diese oft nur in sehr geringen Mengen vorhanden sind. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt darin, daß in ein und derselben Vorrichtung die Isolierung von Nukleinsäuren und weitere Reaktionen, hier vorzugsweise eine Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) stattfinden können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden daher nach Separation von Nukleinsäuren alle für die PCR-Reaktion notwendigen Reagenzien zugegeben und in an sich bekannter Weise die Amplifikation durchgeführt. Es ist hierbei besonders bevorzugt, erfindungsgemäße Vorrichtungen in einer Basiseinheit zu verwenden, die heiz- oder und kühlbare Aufnahmen aufweist. Damit können die notwendigen

Heiz- und Kühlphasen während PCR-Reaktionen besonders vorteilhaft gesteuert werden. Allerdings ist es ebenso möglich, einzelne Vorrichtungen zu verwenden und diese in anderer geeigneter Weise zu temperieren.

Nach der PCR-Reaktion werden vorzugsweise die amplifizierten Nukleinsäuren wiederum mit Hilfe des elektrischen Feldes konzentriert oder/und an Elektrode oder/und semipermeable Membran gebunden. Es ist dabei auch denkbar, nach der Amplifikation nochmals eine neue Rohreinheit in die erfindungsgemäße Vorrichtung einzubringen, welche ein Gel enthält, mit Hilfe dessen eine Größenauftrennung der erhaltenen Nukleinsäuren ermöglicht wird, indem durch das elektrische Feld eine Wanderung durch das Gel bewirkt wird.

Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung der beschriebenen Vorrichtungen ist eine vollautomatische Elektrophorese, die vor allem im Umfeld der modernen pharmazeutischen Wirksubstanzidentifizierung (High Throughput Screening) eingesetzt werden kann. Dabei sind Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die mit gelartigen Substanzen befüllt sind, von besonderem Interesse. Diese können mittels einer Greifvorrichtung eines XYZ-Roboters bewegt werden. Mittels der erfindungsgemäßen Elektrodensysteme kann dann eine Elektrophorese durchgeführt werden, und anschließend zur Untersuchung der nach Molekulargewicht getrennten Substanzgemische eine entsprechende Detektion erfolgen. Diese kann beispielsweise durch Anfärben der Banden in einem Färbebad oder durch eine entsprechende lichtoptische Detektionseinheit, beispielsweise einem Fluorimeter, erfolgen. Dazu können die entsprechenden Module mit der Greifvorrichtung auf der Arbeitsfläche in geeigneter Weise bewegt werden.

Eine Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht also in einem Verfahren zur Isolierung oder/und Analyse von Biomolekülen durch Aufbringen einer diese enthaltenden Probe auf ein Trenngel und elektrophoretischer Separation der Biomoleküle aufgrund unterschiedlicher Molekulargewichte, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung oder einem Verbund von Vorrichtungen durchgeführt wird. Die durch Elektrophorese getrennten Biomoleküle verbleiben dabei als einzelne Banden im Trenngel und können entweder bereits in der erfindungsgemäßen Apparatur, oder aber nach Entfernen des Gels oder Teilen davon aus der Apparatur detektiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, eines Verbundes von Vorrichtungen oder einer Vorrichtung in Verbindung mit einer erfindungsgemäßen Basiseinheit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der beigefügten Zeichnung an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es stellt dar:

Fig. 1 Eine perspektivische Ansicht einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit gesondert ausgebildeter Kathode; Fig. 1 a eine grobschematische, nicht maßstäbliche Seiten- schnittansicht einer Ausführungsform gemäß Fig. 1 ;

Fig. 1 b eine Ansicht analog Fig. 1 a, in welcher zusätzlich die

Pipettiereinheit eines Pipettier-Roboters eingezeichnet ist; Fig. 2 eine Ansicht ähnlich Figur 1 einer abgewandelten

Ausführungsform, welche ein elektrisch leitfähiges Reaktionsgefäß als Kathode aufweist;

Fig. 3 eine Ansicht ähnlich Fig. 1 a einer weiteren abgewandelten Ausführungsform; Fig. 4 bis 6 Perspektivansichten weiterer abgewandelter Ausführungsformen;

Fig. 7 bis 1 1 Seitenschnittansichten weiterer abgewandelter Ausführungsformen;

Fig. 1 2 eine Perspektivansicht einer weiteren abgewandelten Ausführungsform;

Fig. 1 3 eine Seitenschnittansicht einer weiteren abgewandelten

Ausführungsform; Fig. 13a eine grobschematische Draufsicht auf die Ausführungsform gemäß Fig. 13;

Fig. 14 und 15 Ansichten von Ausführungsvarianten von Elektroden;

Fig. 16 eine Draufsicht auf einen Verbund erfindungsgemäßer Vorrichtungen;

Fig. 16a eine Perspektivansicht des Verbunds gemäß Fig. 16;

Fig. 17 bis 19 Seitenschnittansichten weiterer Vorrichtungen zur

Erläuterung verschiedener Detektionsmöglichkeiten;

Fig.20 eine schematische Seitenansicht eines Systems zur Nukleinsäureisolierung, Amplifizierung und

Elektrochemilumineszenzdetektion;

Fig.21a und 21b graphische Darstellungen der Ergebnisse von Beispiel 4;

Fig.22 einen Netzplan einer Steuerung für eine vollständige

Nukleinsäureanalyse mit Glasvliestechnologie; und Fig.23 einen Netzplan einer Steuerung für eine vollständige

Nukleinsäureanalyse mit magnetischen Glaspartikeln.

In Fig. 1 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Isolierung oder/und Analyse von Nukleinsäuren allgemein mit 500 bezeichnet. Sie umfaßt ein aus Kunststoff gefertigtes Reaktionsgefäß 270, eine Kathode 20a, eine Anode 20b und ein Zwischenstück 280. Sowohl die Kathode 20a als auch die Anode 20b sind aus einem Kunststoff mit elektrisch leitfähigen Zuschlagstoffen, beispielsweise Graphit, gefertigt. Darüber hinaus ist die Anode 20b als Rohrelement 290 ausgebildet, welches gemäß Fig. 1b als Pipettenspitze 290 auf die Kolben/Zylinder-Einheit 300 eines Pipettier- Roboters 190 aufgesteckt werden kann. Über Zuleitungen 260 kann an die Elektroden 20a und 20b eine elektrische Spannung angelegt werden.

Das rohrförmige Zwischenstück 280 ist aus elektrisch nicht leitfähigem Kunststoff gefertigt. Der Innendurchmesser dieses Rohrelements 280 ist derart auf den Außendurchmesser der Anode 20b abgestimmt, daß diese beiden Teile, beispielsweise mittels einer entsprechenden programmierten Bewegung des Pipettier-Roboters 1 90 nach Entnahme aus jeweiligen Magazinen - vorzugsweise dichtend - ineinander gesteckt werden können. Entsprechendes gilt für den Außendurchmesser des Rohrelements 280 und den Innendurchmesser des Kathodenelements 250. Der Außendurchmesser des Kathodenelements 250 ist wiederum derart bemessen, daß er ohne Berührung von oben (bei 272) in den Aufnahmeraum 275 des Reaktionsgefäßes 270 eingeführt werden kann (s. Fig. 1 a) .

Das Rohrelement 280 hat in der Ausführungsform gemäß Fig. 1 , 1 a und 1 b diverse Funktionen. Zum einen dient es als Abstandshalter, der einen körperlichen Kontakt der Elektroden 20a und 20b und somit einen Kurzschluß verhindert. Darüber hinaus stellt sein Innenraum einen Transferkanal 1 50 dar, durch welchen Nukleinsäuren aufgrund ihrer negativen Ladung und der zwischen Kathode 20a und Anode 20b angelegten Spannung in die Pipettenspitzen-Anode 290 wandern können.

Nachzutragen ist noch, daß zur Erzielung eines Klemmsitzes der Rohrelemente 250, 280 und 290 beim Ineinanderstecken diese Elemente auch jeweils mit Paßkonus ausgebildet sein können. Dies stellt darüber hinaus die erforderlich Dichtigkeit der Anordnung an den Steckstelien sicher.

Zur Isolierung von Nukleinsäuren kann beispielsweise wie folgt vorgegangen werden: Zunächst entnimmt der Pipettier-Roboter 1 90 aus einem Pipettenspitzen-Magazin eine als Anode 20b ausgebildete Pipettenspitze 290 und dockt hierauf in einem entsprechenden weiteren Magazin das nicht leitfähige Rohrelement 280 über eine entsprechende Paßklemmung an. In einem weiteren Andock-Schritt kommt schließlich auch noch die Kathode 20a hinzu. Vor dem Zusammenstellen der Anoden/Zwischenstück/Kathoden-Einheit wurde das Reaktionsgefäß 270 mit Hilfe des Pipettier-Roboters 1 90 mit Probe und Reagenzien befüllt. In dieses Reaktionsgemisch wird nun die Anoden/Zwischenstück/Kathoden-Einheit zumindest mit der Kathode 20a/250 und gewünschtenfalls auch mit dem Zwischenstück 280 einge- taucht. Durch Betätigung der Zylinder-Kolben-Einheit 300 wird das Reaktionsgemisch aus dem Reaktionsgefäß bis in die Pipettenspitze 290 hineingesaugt, wobei jedoch sichergestellt wird, daß die Zylinder-Kolben- Einheit 300 nicht mit dem Reaktionsgemisch in Kontakt gelangt. Legt man nun an die Kathode 20a und die Anode 20b eine elektrische Spannung an, so wandern die in den Reagenzien enthaltenen Nukleinsäuren zur Anode 20b, d.h. in die Pipettenspitze 290. Nach Anreicherung der Nukleinsäuren in der Pipettenspitze 290 können diese durch kontrolliertes Ausstoßen der im Transferkanal 1 50 des Zwischenstücks 280 und der Kathode 250 enthaltenen Reagenzien isoliert und somit zur Abgabe in eine weitere Vorrichtung zur Analyse vorbereitet werden.

Um sicherstellen zu können, daß sich die Nukleinsäuren ausschließlich im Innenraum der Pipettenspitze 290 anreichern, darf bei Anlegen der Span- nung an Kathode 20a/250 und Anode 20b/290 das Reaktionsgemisch lediglich im Innenraum der Pipettenspitze 290 anstehen. Daher darf zumindest die Pipettenspitze 290 nicht unter den Reagenzienpegel in dem Gefäß 270 eingetaucht werden. Da das Reaktionsgemisch vor dem Beginn des Elektrophorese-Prozesses bis zur Anode 20b/290 hin angesaugt wurde, braucht auch das Zwischenstück 280 nicht notwendigerweise mit seiner Außenfläche in das Reaktionsgemisch eintauchen.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung 500 ist es grundsätzlich auch möglich, eine Gelelektrophorese durchzuführen. Hierzu kann in dem Innenraum des nicht leitfähigen Rohrelements 280, d.h. in dem Transferkanal 1 50, ein elektrisch leitendes Gelmaterial 420 vorgesehen sein, welches sich über dessen gesamte lichte Weite erstreckt (s. Fig. 1 b) . Als Geimaterial kommt beispielsweise ein übliches Agarosegel oder ein Polyacrylamidgel zum Beispiel zum Zwecke einer präparativen oder/und analytischen Gelelektro- phorese in Frage. Erfindungsgemäß kann mit der Vorrichtung 500 aber auch eine Elektroelution durchgeführt werden, wobei im Reaktionsgefäß 270 beispielsweise ein mit Nukleinsäure beladener Adsorber angeordnet ist. Durch Überschichten mit entsprechendem Elektrophoresepuffer und Befüllen der gesamten Kathoden/Zwischenstück/Anoden-Einheit mit Elektrophoresepuffer kann dann nach Anlegen einer Spannung an die elektrischen Zuführungen 260 die Nukleinsäure von dem Adsorber in die Pipettenspitze 290 transferiert werden.

In Fig. 2 ist eine abgewandelte Ausführungsform dargestellt, bei welcher das Reaktionsgefäß 270 aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gefertigt ist, so daß es gleichzeitig die Funktion der Kathode 20a übernimmt. In dieses Reaktiongefäß 270 wird eine zusammengesteckte Anordnung einer als Pipettenspitze 290 ausgebildeten Anode 20b und eines aus nicht leitfähigem Kunststoff gebildeten Rohrelements 280 eingeführt. Wie bei der Ausführungsform gemäß Fig. 1 , 1 a und 1 b ist wiederum darauf zu achten, daß nach dem Ansaugen des Reaktionsgemischs aus dem Reaktiongefäß 270 dieses Reaktionsgemisch vor dem Anlegen der Spannung an die Anschlüsse 260 an der Pipettenspitze 290 lediglich von deren Innenraum her anstehen, um die Anreicherung von Nukleinsäure an der Außenseite der Anode 20b/290 zu verhindern. Wiederum kann in dem nicht leitfähigem Rohrelement 280 ein Gelmaterial zur Durchführung einer Gelelektrophorese vorgesehen sein.

Fig. 3 zeigt eine weitere Ausführungsform mit einem speziell gestalteten, elektrisch nicht leitfähigen Rohrelement 280. Dieses Rohrelement 280 umfaßt einen oberen, der Anode 20b benachbarten und im wesentlichen zylinderrohrförmig ausgebildeten Abschnitt 280a und einen sich daran anschließenden, unteren und sich zur Kathode 20b hin trichterartig erweiternden Abschnitt 280b. Diese Ausbildung ermöglicht eine besonders effektive Konzentration von Nukleinsäuren, die sich zum Beispiel zunächst im Bereich des Bodens des Reaktionsgefäßes 270 befinden, durch einen Trichtereffekt in einem sehr kleinen Volumen 1 50a unterhalb der Pipettenspitzen-Anode 290. Dieser Raum kann mittels der Pipettenspitze 290 nach oben entleert werden. Selbstverständlich ist auch bei dieser Ausführungsform wiederum die Durchführung einer Gelelektrophorese möglich.

Bei der in Fig. 4 dargestellten Ausführungform ist das elektrisch nicht leitfähige Zwischenstück 280 als Pipettenspitze 290 ausgebildet. Am oberen Ende dieser Pipettenspitze 290 ist in deren Innenraum 290c eine gesondert ausgebildete Anode 20b eingeführt. Obgleich in der dargestellten Ausfüh- rungsform das Reaktionsgefäß 270 aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gefertigt ist und somit gleichzeitig als Kathode 20a dient, versteht es sich, daß die das Zwischenstück 280 bildende Pipettenspitze 290 auch bei einem Reaktionsgefäß 270 mit darin angeordneter, gesondert ausgebildeter Kathode 20a eingesetzt werden kann. Infolge der Durchführung eines Elektrophoreseprozesses reichern sich bei der Ausführungsform gemäß Fig. 4 die Nukleinsäuren in der Pipettenspitze 290 an.

Die Ausführungsform gemäß Fig. 5 unterscheidet sich von jener gemäß Fig. 4 lediglich durch die Ausbildung von Pipettenspitze und Kathode. Gemäß Fig. 5 weist die Pipettenspitze 290 einen unteren Abschnitt 290a auf, der aus elektrisch nicht leitfähigem Kunststoff gebildet ist und das Zwischenstück 280 bildet, und weist ferner einen oberen Abschnitt 290b auf, der sich integral an den Abschnitt 290a anschließt, dessen Kunststoffmaterial jedoch zur Bildung der Anode 20b elektrisch leitfähige Zuschlagstoffe beigemengt sind. Ansonsten entspricht die Ausführungsform gemäß Fig. 5 jener gemäß Fig. 4.

Fig. 6 dient zur Illustration einer Ausführungsvariante des elektrischen Anschlusses 260 der Kathode 20a, wenn diese von einem Reaktionsgefäß aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gebildet ist. Dieser Anschluß 260 ist von einer Ausnehmung 440 in einer Basisplatte 51 0 gebildet, welche entweder vollständig oder zumindest im Bereich der Ausnehmung 440 aus elektrisch leitendem Material, beispielsweise Metall, gebildet ist. Dabei wird der elektrische Kontakt zwischen dem Anschluß 260/440 und der Kathode 20a durch den körperlichen Kontakt bei der Einbringung des Reaktionsgefäßes 270 in die Aufnahme 440 sichergestellt. Die Fertigung der Basis- platte 51 0 bzw. der Aufnahmen 440 aus Metall hat den Vorteil besseren elektrischen Kontakts sowie der Ermöglichung einer schnell ansprechenden Temperierung des Reaktionsgefäßes 270, was insbesondere für die Handhabung von Nukleinsäuren wichtig ist.

Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in Fig. 7 dargestellt. Bei dieser Ausführungsform steht das Zwischenstück 280 mit Füßen 280c auf dem Boden 270a des Reaktiongefäßes 270 auf. Zwischen den Füßen 280c sind Durchbrechungen 280d vorgesehen, welche einen Reagenzienaustausch zwischen dem Innenraum des Zwischenstücks 280 und dem Reaktionsgefäß 270 ermöglichen.

In dem Zwischenstück 280 ist ein Transferkanal 1 50 ausgebildet, oberhalb dessen sich der Innenraum des Zwischenstücks 280 verzweigt. Die lineare Fortführung des Transferkanals 1 50 ist als Anodenkammer 410 ausgebildet, in welcher eine gesondert ausgebildete Anode 20b angeordnet ist. Der Zugang zur Anodenkammer 41 0 vom Transferkanal 1 50 her ist mit einer semipermeablen Membran 360 abgedeckt, welche einen direkten Kontakt der Nukleinsäuren mit der Anode 20b verhindert. Unterhalb der Anodenkammer 41 0 steht mit dem Transferkanal 1 50 ferner eine Entnahmekammer 380 in Verbindung, in welche die Pipettenspitze 290 eines Pipettier- Roboters 1 90 eintaucht, um die vor der semipermeablen Membran 360 angereicherten Nukleinsäuren zu entnehmen.

Zur Fixierung der Lage des Zwischenstücks 280 im Reaktionsgefäß 270 kann das Zwischenstück 280 darüber hinaus Positionierarme 280e umfassen, welche sich beispielsweise an den Wandungen 270b des Reaktionsgefäßes 270 seitlich abstützen. Es ist jedoch ebenso möglich, das Zwischenstück 280 über diese Positionierarme 280e am oberen Rand der Seitenwandung des Reaktionsgefäßes 270 einzuhängen bzw. dort festzuklemmen, ohne daß das Zwischenstück mit Füßen 280c den Boden 270a des Reaktionsgefäßes 270 berührt. Ferner ist dem aus nicht leitfähigem Kunststoff gefertigten Reaktionsgefäßeine gesondert ausgebildete Kathode 20a zugeordnet.

Das Zwischenstück 280 in der Ausführung gemäß Fig. 7 kann beispielsweise von dem Pipettier-Roboter 1 90 mittels eines an diesem vorgesehenen Greifer 400 aus einem Magazin entnommen und in dem Reaktionsgefäß angeordnet werden. Nach Absetzen des elektrisch nicht leitenden Zwischenstücks 280 im Reaktionsgefäß 270 kann eine entsprechende Beschickung des Reaktiongefäßes 270 einschließlich des Transferkanals 1 50 und der Entnahmekammer 380 sowie davon getrennt eine Beschickung der Anoden- kammer 41 0, beispielsweise mit Elektrophorese-Pufferlösung, erfolgen.

Der Greifer 400 braucht nicht notwendigerweise ein Zangenelement umfassen, das zum Ergreifen eines Gegenstands eine Öffnungs- und Schließbewegung ausführen kann. Es ist ebenso möglich, daß der Greifer 400 eine starre gabelartige Aufnahme aufweist, mit welcher er einen entsprechenden Kragen des Gegenstands unterfährt, bevor er diesen anhebt und somit aufnimmt.

Wie vorstehend bereits erwähnt, ist die semipermeable Membran 360 als Schutz der Nukleinsäuren vor einem unmittelbaren Kontakt mit der Anode vorgesehen, so daß elektrische Entladungen der Nukleinsäuren im Umfeld der Elektrode vermieden werden können.

Die Ausführungsform gemäß Fig. 8 entspricht im wesentlichen jener gemäß Fig. 7 und unterscheidet sich von dieser lediglich dadurch, daß in dem Transferkanal 1 50 ein Gelmaterial 420 zur Durchführung von Gelelektrophorese angeordnet ist. Dieses Gelmaterial ragt aus dem Transferkanal 1 50 nach unten heraus und taucht so in das Reaktionsgemisch im Reaktionsgefäß 270 mit einer großen Oberfläche ein. Der Raum oberhalb des Gelmaterials 420 kann über die Entnahmekammer 380 mit Reaktionsgemisch beschickt werden. Um für den gesamten Innenraum des Zwischenstücks 280 sicherstellen zu können, daß sich nirgends Gasbläschen ansammeln können, ist es von Vorteil, wenn, wie dies in Fig. 9 dargestellt ist, die semipermeable Membran 360 nicht horizontal angeordnet ist, sondern mit einer vorbestimmten Neigung gegenüber der Horizontalen, so daß Gasbläschen durch die Entnahmekammer 380 ausperlen können.

Eine weitere Besonderheit der in Fig. 9 dargestellten Vorrichtung 500 besteht darin, daß eine aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gefertigte Pipettenspitze 290 als Anode 20b eingesetzt wird. Diese wird zur Durchführung der Elektrophorese zunächst in der Anodenkammer 410 angeordnet und nach abgeschlossener Anreicherung und Abschalten der elektrischen Spannung dann mittels des Pipettier-Roboters 1 90 in die Entnahmekammer 380 übergeführt zur Entnahme der zwischen der Membran 360 und dem Geimaterial 420 angesammelten Nukleinsäuren.

Ferner ist gemäß Fig. 9 das Reaktionsgefäß 270 aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gefertigt und in einer metallischen Aufnahme 440 angeordnet.

In Fig. 1 0 ist eine besonders einfache Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 500 dargestellt, bei welcher auf ein nicht leitfähiges Zwischenstück 280 verzichtet worden ist. In ein Reaktionsgefäß 270 mit durchbrechungsfreiem Boden 270a und durchbrechungsfreien Seitenwänden 270b sind eine Kathode 20a und eine Anode 20b mit jeweils daran integral angeformten Anschlußfahnen 260 eingehängt. Das Reaktionsgefäß 270 ist aus elektrisch nicht leitfähigem Kunststoff gefertigt, während die Elektroden 20a und 20b nebst Anschlußfahnen 260 aus mit elektrisch leitfähigen Zuschlagstoffen versetztem Kunststoff hergestellt sind. Die besonders kostengünstig erhältliche Vorrichtung 500 gemäß Fig. 1 0 eignet sich insbesondere zur Durchführung von Elektrophorese-Prozessen, bei denen eine geringere Effizienz des Prozesses ausreicht.

Fig. 1 1 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform der Vorrichtung 500 gemäß Fig. 1 0, bei welcher das Reaktionsgefäß 270 nach Art eines Reak- tionsröhrchens ausgebildet ist. Ferner wird mittels eines Abstandshalters 30 ein körperlicher Kontakt der Elektroden 20a und 20b verhindert. Der Abstandshalter 30 ist bevorzugt als Hohlzylinder ausgebildet, so daß das Reaktionsröhrchen 270 durch den Abstandshalter 30 hindurch mit Reak- tionsgemisch beschickt werden kann bzw. das Reaktionsergebnis mittels einer Pipettenspitze durch den Abstandshalter hindurch aus dem Reaktionsröhrchen entnommen werden kann.

Eine weitere abgewandelte Ausführungform ist in Fig. 1 2 dargestellt. Bei dieser Vorrichtung 500 sind der Abstandshalter 30 und die beiden Elektroden 20a und 20b sowie die elektrischen Anschlüsse 260 der Elektroden als Einheit gerfertigt. Ferner ist der hohlzylindrische Abstandshalter 30 derart ausgebildet, daß eine Pipettenspitze 290 zur Entnahme von Stoffen aus dem Reaktionsgefäß 270 durch ihn hindurchgeführt werden kann. In weiterer Abwandlung dieser Ausführungsform ist es darüber hinaus möglich, daß auch die Pipettenspitze 290 einen Teil der Elektroden-Abstandshalter-Einheit bildet, indem sie mit dem Abstandshalter einstückig hergestellt ist oder indem sie den Abstandshalter ersetzt.

Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 1 3 sind die Elektroden 20a und 20b in das aus nicht leitfähigem Kunststoff gefertigte Reaktionsgefäß 270 durch entsprechende örtlich begrenzte Zugabe von elektrisch leitfähigen Zuschlagstoffen einstückig mit eingeformt. In dem Reaktionsgefäß 270 sind Magnetpartikel 65 - genauer gesagt mit einem speziellen zur Adsorption von Nukleinsäuren und dergleichen geeigneten Glas überzogene Magnetpartikel 65 - angeordnet. Nach Adsorption der Nukleinsäuren oder dergleichen an den Magnetpartikeln 65 und gewünschtenfalls der Durchführung von Reini- gungsschritten können die an den Magnetpartikeln adsorbierten Stoffe wieder von den Magnetpartikel 65 abgelöst werden, indem man sie mittels Elektrophorese zur Anode 20b zieht, während man die Magnetpartikel 65 mittels eines Magneten 60 zur Kathode 20a zieht. Nach dem Ablösen der Stoffe können diese dann beispielsweise mittels eines Photomultipliers 50 oder einem anderem geeigneten Detektionsgerät untersucht werden.

In dem Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 1 3 ist der Magnet 60 von einem Körper aus permanentmagnetischem Material bzw. magnetisiertem Material gebildet. Ebensogut können jedoch auch Elektromagneten eingesetzt werden, wie dies in der Schnittansicht gemäß Fig. 1 3a grobschematisch bei 60' angedeutet ist. Der Permanentmagnet 60 ist Fig. 1 3 in seinem aktiven Zustand dargestellt, d.h. einem Zustand in welchem er an das Reaktionsgefäß 270 angenähert ist und somit auf die Magnetpartikel 65 eine Anzie- hungskraft ausüben kann. Zur Überführung in den inaktiven Zustand braucht der Magnet 60 lediglich vom Reaktionsgefäß 270 entfernt zu werden, beispielsweise durch Verlagern, Verschieben oder Verkippen. Dies kann beispielsweise mittels des Pipettier-Roboters 1 90 bewerkstelligt werden. Im Falle des Elektromagneten 60' kann die Überführung in den inaktiven Zustand durch Abschalten der Stromzufuhr zu dem Elektromagneten 60' erfolgen.

In Fig. 14 ist eine als Pipettenspitze 290 ausgebildeten Anode 20b dargestellt. Diese weist an ihrer Außenfläche Ansätze 450 auf, welche der Ver- größerung der Kontaktfläche mit dem Reaktionsgemisch und somit einer Verbesserung des Elektronenflußes dient. Gleichzeitig können diese Ansätze 450 auch zu Rühr- oder Mischzwecken benutzt werden.

In Fig. 1 5 ist eine beschichtete Elektrode 20 dargestellt, welche mit biologischen Polymeren überzogen ist. Die Beschichtung umfaßt mehrere

Lagen 34, 35 und 36, um eine entsprechende Haftung an der Oberfläche der Elektrode 20a bzw. 20b zu ermöglichen. Beispielsweise kann die Schicht 34 ein biotinyliertes Rinderserum Albumin umfassen, die Schicht 35 ein Streptavidin oder Polystreptavidin umfassen, und kann die Schicht 36 ein biotinyliertes Oligonukleotid umfassen. Die so erzeugte Bindung des Oligonukleotids an die Elektrode 20a bzw. 20b kann ausgenutzt werden, um mit Hilfe des zwischen den Elektroden 20a und 20b erzeugten elektrischen Feldes die Hybridisierung von Nukleinsäuren zu erleichtern oder entsprechende Elektrostringenz zu verbessern.

Auch die semipermeable Membran 360 kann mit einer entsprechenden Beschichtung versehen sein. Dies hat den Vorteil, daß aggressive chemische Substanzen, die an der Elektrodenoberfläche durch den Redoxprozeß der Elektrophorese entstehen, nicht mit der Beschichtung interagieren können, weil diese Membran räumlich ausreichend weit entfernt angeordnet ist. Der elektrophoretische Fluß bleibt jedoch auf die Membran gerichtet, so daß der gewünschte Konzentrationsprozeß stattfinden kann.

Fig. 1 6 und 1 6a zeigen grobschematische Drauf- bzw. Perspektivsichten eines Verbunds 550 erfindungsgemäßer Vorrichtungen 500. Die ebenfalls grobschematisch dargestellten Kathoden und Anoden dieser Vorrichtungen 500 sind über Sammelleitungen 80 einander parallelgeschaltet und gemeinsam mit entsprechenden elektrischen Zuleitungen 260 verbunden. Der Verbund 550 umfaßt eine Grundplatte 51 0, in welcher eine Mehrzahl von Aufnahmen 440 ausgebildet sind. Darüber hinaus sind in die Basisplatte 510 auch die Sammelleitungen 80 eingebettet.

Es sei darauf hingewiesen, daß sich die in Fig. 1 6 und 1 6a dargestellte Ausführungsform der Basisplatte 51 0 insbesondere zur Auf nähme von Reaktionsgefäßen mit integriert ausgebildeten Kathoden 20a und Anoden 20b in der Ausführung gemäß Fig. 1 3 eignet. Ein entsprechender Verbund 550 von Vorrichtungen 500 kann aber auch für den Fall vorgesehen sein, daß die Reaktionsgefäße 270 aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gebildet sind und somit lediglich eine der Elektroden, vorzugsweise die Kathode 20a, bilden. In diesem Fall kann die gesamte Basisplatte 510 aus Metall gefertigt sein, wie dies vorstehend bereits bei der Erläuterung von Fig. 6 angesprochen worden ist. Sind die Reaktionsgefäße 270 aus elektrisch nicht leitfähigem Kunststoff gebildet, so ist eine metallische Grundplatte 510 im Hinblick auf eine reaktionsschnelle Temperierung des in den Reaktionsgefäßen 270 enthaltenen Reaktiongemischs erwünscht.

Auch die Rohreinheiten 280 können in einem entsprechenden Verbund zusammengefaßt werden, vorzugsweise im "96 well"-Mikrotiterplatten- format oder in davon abgeleiteten Untereinheiten, beispielsweise Reihen zu je 8 oder zu je 2x8 Rohreinheiten. Dies hat neben einer kostengünstigen Fertigung den Vorteil schnellerer und einfacherer Handhabung bzw. Bewegung durch den Roboterarm hat, was zu einem höheren Probendurchsatz führt. Entsprechendes gilt auch für einen Pipetten- bzw. Pipettenspitzen- verbünd.

Gemäß Fig. 1 7 kann die Untersuchung der in dem Reaktionsgefäß 270 enthaltenen Stoffe mittels eines geeigneten Detektors 50, beispielsweise eines Photomultipliers, auch vom Boden 270a des Reaktionsgefäßes 270 her erfolgen. Gemäß Fig. 1 7 weist das Reaktionsgefäß 270 daher einen Bereich 270a 1 geringerer Bodenwandstärke auf. In diesem Bereich lassen sich die Detektionen besonders störungsfrei durchführen, insbesondere dann, wenn optische Detektionsverfahren eingesetzt werden.

In den Fig. 1 8 und 1 9 sind nicht erfindungsgemäße Ausführungsformen von Reaktionsgefäßen dargestellt. Jedoch können die dort vorgesehenen Schnappdeckel 90, beispielsweise Schnappdeckel 90 mit optischem Fenster 100 oder Schnappdeckel 90 mit einem Septum 1 10, das von einer Nadel 1 20 durchstochen werden kann, auch bei den erfindungsgemäßen Vorrich- tungen 500 bzw. den erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßen 270 eingesetzt werden. Fig. 20 zeigt ein komplettes System zur Durchführung einer Nukleinsäure- Analyse mit Elektroelution, -amplifikation und Elektrochemielumineszenz- detektion. Es umfaßt einen Pipettier-Roboter 1 90, eine Spannungsversorgung 1 80, einen oder mehrere bewegliche Permanentmagneten 60a und 60b, einen Photomultiplier 50, eine Aufnahme 200 für die erfindungsgemäßen Vorrichtungen 500, und eine schnelle Temperiervorrichtung zum Heizen bzw. Kühlen der Aufnahme 200, wie sie dem Fachmann beispielsweise von Thermocyclern her bekannt sind. Alle diese Elemente werden computergestützt angesteuert und ermöglichen eine vollständige und vollautomatische Nukleinsäure-Analyse einschließlich Nukleinsäureisolierung, -amplifikation und -detektion.

Obgleich in der Darstellung gemäß Fig. 20 eine nicht erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß Fig. 1 9 dargestellt ist, versteht es sich, daß anstelle dieser Vorrichtung gemäß Fig. 1 9 ohne weiteres die erfindungsgemäßen, vorstehend beschriebenen Vorrichtungen 500 in dem System verwendet werden können.

Fig. 21 a und 21 b zeigen Ergebnisse mit elektrisch leitfähigen Pipetten- spitzen als Elektroden. Im unteren Teil ist die Triggerspannung, in diesem Fall 50 Volt, im oberen Teil ist das Ausgangssignal eines Luminometers (LKB 1 250) zu sehen mit einer Ausgangsspannung von etwa 1 Volt. Fig. 21 b zeigt die Abhängigkeit der Lichtemission von der Triggerspannung bei Verwendung elektrisch leitfähiger Pipettenspitzen als Elektroden.

Als thermisch verformbarer Kunststoff kann beispielsweise Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol oder dergleichen verwendet werden.

Generell sind Ausführungsformen mit Volumina von 1 μ\ bis 100 μ\ sinnvoll. Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen, die ausgehend von Reaktionsvolumina von bis zu 1 00 ml ein Endvolumen von 5 μ\ bis SO μ\ und somit einen starken Konzentrationseffekt ergeben. Nachfolgend soll auf die verschiedenen, vorstehend diskutierten Ausführungsformen nochmals unter besonderer Beachtung verfahrenstechnischer Aspekte eingegangen werden:

Fig. 1 1 zeigt eine einfache Vorrichtung zur Durchführung von Elektro- chemilumineszenz-Messungen (vgl. Beispiel 3).

Fig. 1 1 zeigt eine vereinfachte Vorrichtung mit einem Reaktionsröhrchen (270) und zwei Elektroden (20a, 20b), die mittels Spritzguß hergestellt wurden. Das Reaktionsröhrchen besteht bevorzugt aus verformbarem Kunststoff wie Polyethylen, Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol oder ähnlichem und ist somit elektrisch nicht leitend. Der Formkörper (30) ist wie das Reaktionsröhrchen aus dem gleichen Material und somit auch ein Isolator. Er dient als Abstandshalter für die Elektroden (20a, b), so daß keine elektrische Leitfähigkeit zwischen den Elektroden entsteht, falls der Reaktionskörper keine leitfähige Flüssigkeit enthält. Der Formkörper (30) ist zylindrisch und innen hohl, so daß das Reaktionsröhrchen mit der Reaktionslösung z.B. für die Elektrochemilumineszenz beschickt werden kann. Die Elektroden sind ebenfalls aus diesem Material hergestellt, beinhalten jedoch zusätzlich elektrisch leitende Zuschlagsstoffe, die für partielle Bereiche der Vorrichtung eine Leitfähigkeit ergeben. Als Zuschlagsstoffe eignen sich bevorzugt Graphit, aber auch andere metallische und elektrisch leitfähige Partikel oder andere leitfähige Substanzen wie Eisen, Silber, Gold, Platin, sowie deren Mischungen oder Legierungen. Die Elektroden oder leitfähigen Bereiche haben typischerweise einen Widerstand von kleiner 1 00 Megaohm, bevorzugt jedoch kleiner 1 Megaohm. Der Widerstand kann sich erniedrigen, wenn eine Spannung angelegt wird ohne daß Beeinträchtigungen für den Prozeßführung auftreten. Durch Anlegen von einer Spannung an die Elektroden können biochemische Prozesse wie z.B. die Elektrochemilumineszenz ausgelöst werden. Eine Lichtemission kann mit geeigneten Meßeinrichtungen als Signal detektiert werden. In einer solchen Vorrichtung können auch andere biochemische Prozesse durchgeführt werden, wobei die hier beschriebene kostengünstige Herstellung sich vor allem bei Analyseprozessen anbietet, bei denen, der Verunreinigung wegen eine Wiederverwendung der Vorrichtung ausgeschlossen ist.

Fig. 1 5 zeigt den Aufbau einer Beschichtung von erfindungsgemäßen Elektroden (vgl. Beispiel 2).

Eine weitere bevorzugte Anwendung sind Hybridisierungen von Nuklein- säuren. Hierfür können mit Vorteil Elektroden eingesetzt werden, die mit biologischen Polymeren überzogen sind. Die Beschichtung kann bevorzugt aus mehreren Beschichtungslagen (34, 35, 36) bestehen, wie Fig. 1 5 zeigt, um eine entsprechend feste Haftung an die Oberfläche zu ermöglichen. So kann z.B. Schicht (34) ein biotinyliertes Rinderserum Albumin darstellen, Schicht (35) ein Streptavidin oder Polystreptavidin und Schicht (36) ein biotinyliertes Oligonukleotid.

Die so erzeugte Bindung des Oligonukleotids an die Elektrode (20) kann ausgenutzt werden, um mit Hilfe des durch 20a und 20b erzeugten elektrischen Feldes die Hybridisierung zu erleichtern oder durch entsprechende Elektrostringenz zu verbessern. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und beschrieben z.B. in US 4,478,91 4; EP 0 331 1 27; EP 0 344 578 oder US 5,605,662.

Fig. 1 3 zeigt eine Ausführungsform für eine Vorrichtung für die Elektro- chemilumineszenz-Messung als einfaches Spritzgußteil.

Fig. 1 3 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung eines Reaktionsgefäßes (270), bevorzugt als Spritzgußteil mit integrierten Elektroden (20a, 20b), einem Reaktionsraum (275) und einer Öffnung (272), über der sich z.B. auch ein Photomultiplier (50) zur Detektion der Lumineszenz befindet. An den gegenüberliegenden Seiten sind leitfähige Kunststoffe in Form von Elektroden (20a, 20b) integrativ, jedoch elektrisch isoliert eingearbeitet. In dieser Ausführungsform ist z. B. auch ein Permanentmagnet (60) so an die Elektroden herangebracht, daß Magnetpartikel, die z. B. zu detektierende Rutheniummoleküle tragen, an die Elektrodenoberfläche magnetisch herangezogen werden und, über einen elektrischen Trigger zur Lumineszenz angeregt, mit dem Photomultiplier detektierbar sind. Durch die integrative Bauweise kann dieses Spritzgußteil als Wegwerfteil zum einmaligen Gebrauch ausgeführt und kostengünstig hergestellt werden.

Fig. 1 3a zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung im Schnitt mit im Formkörper integrierten Elektroden, die durch nicht leitende Kunststoffteile elektrisch isoliert sind.

Eine solche Vorrichtung ist für eine Vielzahl von Applikationen einsetzbar. So können wie in DE 44 20 732 Beispiel 1 a, 1 b geschildert Magnetpartikel, beschichtet mit Zelloberflächenantigene zur Abtrennung einer speziellen Zellpopulation in dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform eingesetzt werden. Dazu wird über Öffnung (272) die Reagenzzufuhr, sowie der notwendige Waschprozeß ermöglicht. Anschließend werden Reagenzien zur Lyse eingesetzt, bevorzugt nach dem Verfahren geschildert in EP 0 389 063, die Nukleinsäuren aus Zellen freisetzen. Die Nukleinsäuren werden mit Hilfe elektrophoretischer Kräfte -ausgeübt über die integrierten Elektroden- von den Magnetpartikeln getrennt. Dazu ist es notwendig, daß wie in Fig. 1 3 und 1 3a dargestellt die Anode (20b) dem Permanentmagneten (60) gegenüber angeordnet ist, so daß sich die negativ geladenen Nukleinsäuren im Raum vor der Anode anreichern, während die Magnetpartikel sich an der gegenüberliegenden Seite abscheiden.

Eine vergleichbare Anwendung ergibt sich unter Verwendung von Magnet- partikeln gemäß DE 1 95 20 398. Die dort geschilderte Isolierung von

Nukleinsäuren läßt sich mit Vorteil in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung nach Fig. 1 3 und 1 3a durchführen. Nach Lyse mit chaotropen Salzen und Bindung an die Glasoberfläche dieser speziellen Magnetpartikeln, läßt sich erfindungsgemäß eine Ablösung von der Oberfläche und damit die Elution der Nukleinsäuren vornehmen, indem der Permanentmagnet angelegt wird und gleichzeitig die Elektroden unter Spannung gesetzt werden.

Dadurch reichern sich die Magnetpartikel an der entgegengesetzten Seite zur Anode an, während die Nukleinsäuren im Raum vor der Anode gehalten werden. Dieser Prozeß wird in Anlehnung an "Methods in Enzymoiogy 65" ( 1 980) Seite 371 - 380 als "Elektroelution" bezeichnet.

Fig. 1 6 und 1 6a zeigen eine Ausführungsform für eine Vorrichtung für die Elektrochemilumineszenz-Messung als einfaches Spritzgußteil im 96-well Mikrotitrationsplattenformat (Draufsicht bzw. Perspektivische Sicht) .

Fig. 1 6 und 1 6a zeigen eine Ausführungsform dieser Vorrichtungsart in Form einer Mikrotitrationsplatte, wobei die Elektroden der einzelnen Näpfe elektrisch leitend mit entsprechenden Kunststoffen verbunden sind, so daß an zwei Stellen der gesamten Mikrotiterplatte ein Anschluß für die Spannungsversorgung vorgesehen ist und die elektrischen Zuleitungen (80) im Spritzgußteil integriert sind. Fig. 1 6a zeigt die Anordnung von oben. Diese Vorrichtung hat den Vorteil, daß im Mikrotiterplattenformat die zuvor geschilderten Applikationen durchgeführt werden können.

Fig. 1 8 zeigt eine Ausführungsform für eine Vorrichtung für die Kombination von Elektroelution und Elektrochemilumineszenz-Messung als einfaches Spritzgußteil, insbesondere als kontaminationsreduziertes "Closed System" (Fig. 1 9) .

Fig. 1 8 und 1 9 zeigen Vorrichtungen, welche die Elektroelution in einer abgeleiteten Variante und die Elektrochemilumineszenz verbinden. Dies hat den erfindungsgemäßen Vorteil, daß beide wichtigen Prozesse " Isolierung von Nukleinsäure" und "Detektion von Nukleinsäure" in ein und derselben Vorrichtung durchgeführt werden können. Dies bedeutet, daß durch die Minimierung der Transferschritte von Reaktionsflüssigkeiten eine erhebliche Verminderung der Kontaminaton, d.h. der Eintrag von nicht gewünschter Nukleinsäure aus der Umgebung, die zu falschen Analysenergebnisse führen kann, ermöglicht wird.

Der Formkörper (270) entspricht in Fig. 1 8 demjenigen der Ausführung in Fig. 1 3. Er hat allerdings mehre Öffnungen (272, 1 30, 1 40) die zum Teil mit Schnappdeckel (90), Schraubdeckel oder ähnlichem verschlossen sind. Zum Verschluß der Öffnung (272) wird ein Schnappdeckel (90) mit einem optischen Fenster (100) verwendet. Dagegen hat die Öffnung (1 30) einen Schnappdeckel (90), der mit einem Septum ( 1 1 0) versehen ist, das mit einer entsprechenden Nadel ( 1 20) durchstochen werden kann. Die Öffnung (272) dient bevorzugt zum Beschicken des Reaktionsraumes (275) mit Reagen- zien, die Öffnung ( 1 30) zur Beschickung des Reaktionsraumes ( 1 60) und die Öffnung ( 1 40) zum Absaugen aus beiden Reaktionsräumen (275 und 1 60) .

In der Vorrichtung gemäß Fig. 1 8 können bevorzugt Magnetpartikel zur Isolierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Die Magnetpartikel können durch den Permanentmagneten (60) an die Elektrode (20a) herangeführt werden. Anschließend läßt sich die Elektroelution anwenden, um die Nukleinsäure von diesen Magnetpartikeln entsprechend zu entfernen. Die Nukleinsäure wandert durch Kanal ( 1 50) in Richtung Elektrode (20b) . Durch die Nadel ( 1 20) kann dann eine entsprechende Zufuhr von Reagenzien, z.B. für die Amplifikation, stattfinden, während über Kanal ( 1 40) wahrscheinlich zu verwerfende Lösungen entsprechend abgesaugt werden können. Die gesamte Vorrichtung muß zyklisch erhitzt und abgekühlt werden, um eine Amplifikation, z.B. nach dem Polymerase-Chain-Reaction-Verfahren (US 46831 95) , zu erreichen.

Dies kann bevorzugt an den Längsseiten der Vorrichtung erfolgen, um einen hohen Wärmeaustausch zu erreichen. Anschließend kann über Nadel ( 1 20) eine zweite Art von Magnetpartikel zugegeben werden, die die amplifizierten Nukleinsäuren binden können. Darüber hinaus sind entsprechende Puffer einsetzbar, um anschließend eine Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren, z.B. mittels Elektrochemilumineszenz zu ermöglichen. Dazu wird der Magnet (60) an den entsprechenden Reaktionsraum ( 1 60) gebracht, wodurch diese Magnetpartikel in Richtung Elektrode (20a) gezogen werden. Dort kann nun ein entsprechender elektrischer Trigger über die integrierten Elektroden gesetzt werden, um die Elektrochemilumineszenz auszulösen.

Erfindungsgemäß läßt sich eine solche Vorrichtung (Fig. 1 8) in einem 2-Komponenten-Spritzgußverfahren einfach und kostengünstig herstellen und wird in der Regel nur einmalig verwendet.

In Fig. 1 9 ist eine vergleichbare Variante beschrieben. Hier sitzt der Photomultiplier unter einem optischen Fenster ( 100), das den Bereich des Reaktionsraumes ( 1 60) um die Elektrode (20b) abdeckt. An dieser Elektrode befindet sich ein erster beweglicher Dauermagnet (60b) . Im Gegensatz zu Fig. 1 8 befindet sich ein zweiter Dauermagnet (60a) für den Reaktionsraum (275) an der Elektrode (20a) . Die Öffnung ( 1 40), die zu einer Vakuumpumpe führt, dient zum Absaugen verbrauchter Reagenzien und als Zufuhr von Waschlösungen. Die Öffnung ( 1 30) ist, wie zuvor geschildert, mit einem Schnappdeckel (90) oder ähnlichem versehen, ebenso die Öffnung (272) . Mit dieser Vorrichtung kann, wie in zuvor geschilderter Weise, Nukleinsäure isoliert werden. Werden geeignete Magnetpartikel verwendet, so bindet die Nukleinsäure an diese; durch Öffnen des Schnappdeckel (90) an der Öffnung (80) kann Elektroelutionspuffer zugegeben werden. Nach Anlegen des Permamnentmagnets werden die Magnetpartikel zu den Elektroden (20a) gezogen und durch Anlegen von entsprechender Spannung an die Elektroden (20) kann die Nukleinsäure von einer entsprechenden Partikeloberfläche abgelöst und in den Reaktionsraum ( 1 60) überführt werden. Statt magnetischen Partikeln können auch andere Festphasen wie Membranen bevorzugt aus Nylon, Nitrozellulose o.a., verschiedenste Papiere oder Vliese vor allem mit Glasfaseranteilen, Vliese aus 1 00% Glasfasern oder Materialien mit ionenaustauch-aktiven Oberflächen zum Einsatz gelangen. Im Reaktionsraum ( 1 60) im Bereich um die Elektrode (20b) kann dann durch entsprechend geeignete Maßnahmen eine Amplifikation durchgeführt werden. Die entstehenden Amplikons können dann durch Zugabe von einer geeigneten zweiten Art von Magnetpartikel durch Öffnung ( 1 30), bei geöffnetem Schnappdeckel (90), gebunden werden. Durch Anlegen des Dauermagneten (60) an den Reaktionsraum ( 1 60) werden die Magnetpartikel an die Elektrode gezogen. Durch Öffnung (140) kann jeweils ein Pufferaustausch bei geöffnetem Schnappdeckel (90) stattfinden. Zum Schluß muß ein spezieller Elektrochemilumineszenzpuffer zugegeben werden, um die Elektrochemilumineszenz anschließend durch Anlegen einer Spannung an die Elektroden (20) durchzuführen.

Das entsprechend ausgesendete Licht wird durch den Photomultiplier (50) detektiert, wie bei Fig. 1 8 geschildert. Vorteil dieser Ausführung ist, daß durch die beiden Dauermagnete eine einfache Reaktionsführung gewährleistet wird. Außerdem können auch andere Festphasen Verwendung finden, wobei der zweite Dauermagnet am Reaktionsraum (275) entfallen kann.

Fig. 20 zeigt ein komplettes System zur Durchführung von einer Nukleinsäureanalyse mit Elektroelution, Amplifikation und Elektrochemilumines- zenzdetektion. Es besteht aus einem XYZ-Arm eines Pipettierroboters ( 1 90) (z. B. Fa. TECAN), einer Spannungsversorgung ( 1 80), einer Pumpe ( 1 70) zur Entsorgung von zuverwerfenden Lösungen, einem oder mehreren beweglichen Permanentmagneten (60 bzw. 60a und 60b), einem Photomultiplier (50), einer Aufnahme (200) für die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, wie z. B. in Fig. 1 8 oder 1 9 beschrieben und einer schnellen Heizung bzw. Abkühlung der Aufnahme (200), wie sie dem Fachmann vor allem von Thermocyclern her bekannt sind (vgl. EPA 0 488 769). Alle Gerätemodule werden über eine entsprechende computergestützte Steuerung geschaltet und ermöglichen eine vollständige Nukleinsäureanalyse bestehend aus Nukleinsäureisolierung, -amplifikation und -detektion, vollautomatisch abzuarbeiten. Es können dabei wie in Fig. 1 8 eine Nadel zum Durchstechen von Septen, oder aber auch Prozesse zum automatischen Öffnen und Schließen von Gefäßen, wie beschrieben in DE 44 1 22 86 und Vorrichtun- gen analog zu Fig. 1 9, eingesetzt werden. Typische Prozesse sind in den Bespielen 4a und 4b mit den Netzplänen in Fig. 22 und 23 dargestellt. Dabei zeigt Fig. 22 einen Netzplan einer Steuerung für eine vollständige Nukleinsäureanalyse mit Glasvliestechnologie, während Fig. 23 einen Netzplan einer Steuerung für eine vollständige Nukleinsäureanalyse mit magnetischen Glaspartikeln zeigt.

Fig. 21 a und 21 b zeigen Ergebnisse mit elektrisch leitenden Pipettenspitzen als Elektroden (20) aus Beispiel 4. Im unteren Teil ist die Triggerspannung in diesem Fall 50 V, im oberen Teil ist der Output eines Luminometers (LKB 1 250) zu sehen mit einem Output von ca. 1 V. Fig. 21 b zeigt die Abhängigkeit der Lichtemission von der Triggerspannung mit elektrisch leitfähigen Pipettenspitzen als Elektroden.

Die folgenden Ausführungsformen haben alle das gemeinsame Merkmal, daß sie sich durch eine karthesische Bewegung in XYZ-Richtung zusammenstecken lassen.

Fig. 1 zeigt eine perspektivische Sicht einer Ausführungsform mit zusammensteckbaren Elektroden in Form einer Pipette.

Als Übersichtsabbildung ist in Fig. 1 eine prinzipielle Zusammenstellung zusammengefaßt. Sie besteht aus einem Reaktionsgefäß (270), einer leitfähigen, zylindrischen Elektrode (250) mit entsprechenden elektrischen Zuführungen (260) . Diese bestehen erfindungsgemäß aus Kunststoff mit elektrisch leitfähigen Zusatzstoffen. Der Durchmesser von Element (250) ist so ausgelegt, daß er ohne Berührung in ein Reaktionsgefäß (270) eingeführt werden kann. Das Element (280) stellt ein nicht leitendes Verbindungsstück oder einen Transferkanal dar. Dieses kann über eine Klemmung in das Element (260) eingefügt werden. Am oberen Ende des Elements (280) wird ein weiteres Element (290) eingeklemmt, dieses besteht aus Kunststoffen mit elektrisch leitfähigen Zusatzstoffen sowie einer entsprechend elektrischen Zuführungsfahne (260) . Die zylindrischen Elemente können auch mit einem Passkonus versehen werden, damit eine entsprechende Klemmung ermöglicht wird. Überraschenderweise wurde gefunden, daß mit einem herkömmlichen XYZ-Pipettierautomat ein integriertes Elektrodensystem zusammengestellt werden kann, indem zunächst das Element (290) aufgenommen wird, danach das Element (280) über eine entsprechende Klemmung angedockt wird und anschließend das Element (250) mit Element (280) angesteckt werden kann. Damit kann eine Vorrichtung mit einem XYZ-Roboter erstellt werden, die elektrophoretische Prozesse durchführen kann. Nach Eintauchen dieser zusammengesteckten Vorrichtung aus (290), (280) und (250) in das Reaktionsgefäß (270) kann zum Beispiel eine Elektrophorese durchgeführt werden, bei der das flüssige Material aus (270) durch den Zylinder (280) in Richtung der Elektrode (290) bewegt wird. Das elektrisch nicht leitende Zylinderstück (280) wiederum kann eine Flüssigkeit beinhalten oder aber auch ein elektrisch leitendes Gel, so daß auf diese Art und Weise auch eine Gelelektrophorese möglich sein kann. Erfindungsgemäß kann mit dieser Vorrichtung eine Elektroelution durchgeführt werden, wobei im Reaktionsgefäß (270) zum Beispiel sich ein Adsorber, der mit Nukleinsäure beladen ist, befindet. Durch Überschichten mit entsprechendem Elektrophoresepuffer und Befüllung der gesamten Vorrichtung (250), (280) und (290) mit Elektrophoresepuffer kann dann nach Anlegen einer Spannung an die elektrischen Zuführungen (260) die Nukleinsäure von dem Adsorber über die drei Elemente im oberen Bereich (280) transferiert werden.

Im Folgenden werden Varianten dieser Vorrichtung beschrieben: Fig. 2 zeigt eine perspektivische Sicht einer Ausführungsform mit elektrisch leitfähigem Reaktionsgefäß als Katode.

In Fig. 2 wird ein Reaktionsgefäß (270) verwendet mit elektrischen Zuleitungen (260), das per se aus einem Kunststoff mit elektrisch leitenden Zuschlagstoffen besteht. Diese stellen dann eine Kathode dar. Ein entsprechendes elektrisch nicht leitendes Zylinderstück (280) kann an eine katodische Elektrode (290) mit einem XYZ-Roboter zum Beispiel angesteckt werden und in das Reaktionsgefäß (270) eingetaucht werden. Auf diese Art und Weise kann eine Elektrophorese aus Flüssigkeiten im Reaktionsgefäß (270) dadurch bewerkstelligt werden, daß nach Anlegen einer entsprechenden Spannung zwischen die Anoden und Kathoden ein Transfer von Molekülen durch den Transferkanal (280) stattfindet und am oberen Ende von (280) ein entsprechend gereinigtes Material entnommen werden kann.

Fig. 1 a zeigt im Schnitt eine solche Vorrichtung zur Verdeutlichung. Am unteren Ende befindet sich das Reaktionsgefäß (270), in das ein elektrisch leitendes Zylinderstück (250) eingebracht werden kann, das dann als Kathode zum Beispiel dient. In dieses Stück wird ein entsprechendes elektrisch nicht leitendes Zylinderstück (280) angeklemmt, das wiederum über ein elektrisch leitendes Zylinderstück (290) in direkter Verbindung steht. Auf diese Art und Weise kann nun ein elektrophoretischer Fluß von der Kathode (250) durch den Transferkanal ( 1 50) an die Anode (290) durchgeführt werden. Der Transferkanal kann mit entsprechenden Flüssig- keiten gefüllt sein oder auch mit entsprechendem Gelmaterial. Unter Gelmaterial ist zu verstehen, ein übliches Agarosegel oder entsprechende Polyacrylamidgele zum Beispiel zum Zwecke einer präparativen Gelelektrophorese.

In Fig. 1 b ist dargestellt eine Vorrichtung mit einer entsprechenden Pipette. Die Pipette ist in der Lage, den Hohlraum des Zylinderstücks (250) zu beschicken sowie den Transferkanal (1 50), falls hier eine Flüssigkeit vorgehalten wird. Darüber hinaus hat diese Pipette entsprechende Aufnahmen für Stromzuführungen, die in der Lage sind, eine elektrophoretische Spannung an die Stromzuführungselemente (260) entsprechend zu transferieren.

Fig. 3 zeigt eine Schnittzeichnung mit Details einer Ausführungsform als Konzentrator.

Fig. 3 zeigt eine spezielle Ausführungsform des elektrisch nicht leitenden Zylinderstücks (280) . Es hat eine nach oben trichterförmig zulaufende Form. Auf diese Art und Weise kann eine entsprechende Konzentration erreicht werden. Nukleinsäuren, die sich zum Beispiel im Reaktionsgefäß (270) am Boden befinden, können durch den Trichtereffekt in ein sehr kleines Volumen unterhalb der Anode (290) gesammelt werden. Dieser Raum kann mittels zuvor geschilderter Pipette und der entsprechenden Durchführung nach oben entleert werden.

Fig. 1 0 zeigt eine Schnittzeichnung einer weiteren Ausführungsform als Elektroden, die an ein Reaktionsgefäß angeklemmt werden. Hier handelt es sich um ein elektrisch nicht leitendes Reaktionsgefäß (270) sowie zwei in dieses Reaktionsgefäß hineinragende Elektroden (20a, 20b) mit entsprechenden Fahnen für elektrische Zuleitung (260) . Die beiden Elektroden sind aus Kunststoff mit elektrisch leitenden Zuschlagstoffen und können an das Reaktionsgefäß angeklemmt werden. Auf diese Art und Weise kann ein Reaktionsgefäß jederzeit in die Lage versetzt werden, elektrophoretische Prozesse im Innern zu bewerkstelligen.

Fig. 1 2 zeigt nun eine weitere Ausführungsform mit einem elektrisch nicht leitenden Reaktionsgefäß (270) und einer Vorrichtung, bestehend aus zwei elektrisch leitfähigen Elektroden (20a, 20b) mit entsprechenden Zuführungen (260) und einem zylindrischen Element (30), das elektrisch nicht leitend ist und den beiden Elektroden als entsprechende Halterung dient. Dieses zylindrische Element (30) ist so ausgelegt, daß zum Beispiel eine Pipettenspitze (290) in diesem Element angeklemmt werden kann. Dazu kann die zylindrische Form durch eine entsprechende Kegelstumpfform ersetzt werden. Diese Vorrichtung kann dann zum Beispiel mit einem XYZ-Roboter in das Reaktionsgefäß (270) eingebracht werden. Nach Anlegung einer Spannung an die beiden Elektroden kann eine örtliche Auftrennung des Reaktionsgemisches erfolgen und mit Hilfe der Pipettenspitze (290) kann dann in unmittelbarer Umgebung der entsprechenden Elektrode biologisches Material entnommen werden.

Fig. 5 zeigt eine Vorrichtung mit leitfähigem Reaktionsgefäß und Pipettenspitze mit integrierter Elektrode.

Eine vergleichbare Ausführungsform zeigt Fig. 5. Hier besteht das Reak- tionsgefäß (270) aus einem Kunststoff mit elektrisch leitfähigen Zuschlagstoffen, so daß die Wandungen entsprechend als Kathode dienen können. Dazu ist eine elektrische Zuführung (260) vorgesehen. In dieses Reaktionsgefäß taucht eine spezielle Pipettenspitze (290), in die im oberen Teil ein Kunststoff mit elektrisch leitfähigen Zusatzstoffen integriert ist, die als Anode (20b) zum Beispiel dienen kann. In diesem Falle kann die entsprechende Aufnahme der Pipette in metallischer Ausführung als elektrische Zuleitung (260) dienen. Mit dieser Vorrichtung kann nach Befüllung der Pipettenspitze mit Elektrophoresepuffer und Eintauchen der Spitze in die Lösung des Reaktionsgefäßes (270) ein elektrophoretischer Prozeß dadurch ausgelöst werden, daß eine Spannung zwischen der Kathode über die Zuleitung des Reaktionsgefäßes (270) und der Anode (20b) über die Zuleitung (260) der Pipettenspitzenaufnahme bewerkstelligt wird. Nach entsprechender Auftrennung des biologischen Materials wird die Pipettenspitze aus dem Reaktionsgefäß herausgefahren und beherbergt in ihrem inneren Teil das gewünschte biologische Material. Fig. 6 zeigt eine Vorrichtung mit leitfähigem Reaktionsgefäß und Aufnahme sowie mit Pipettenspitze mit integrierter Elektrode.

Fig. 6 illustriert ein weiteres erfindungsgemäßes Ausführungsdetail, bei dem das Reaktionsgefäß selbst aus elektrischleitfähigem Kunststoff besteht und per se als E^'ektrode dient. Die Stromzuführung wird über eine elektrisch leitfähige Aufnahme (440), bevorzugt aus Metall bewerkstelligt. Die metallische Ausführung hat den erfindungsgemäßen Vorteil, daß auch eine schnelle Temperierung des Reaktionsgefäßes erfolgen kann, was für die Handhabung von Nukleinsäuren wichtig ist.

Fig. 7 zeigt eine Vorrichtung mit Element 280, leitfähigem Reaktionsgefäß und Pipettenspitze mit angesteckter Elektrode.

Gemäß Fig. 7 ragt die Kathode (20a) in ein Reaktionsgefäß aus nicht leitendem Kunststoff (270) hinein und kann analog zu Fig. 1 0 an die Wandung angeklemmt werden. In dieses Reaktionsgefäß ragt und auf dem Boden steht durch entsprechende fußartige Elemente z.B. in Form eines Dreibeins ein elektrisch nicht leitendes Zylinderstück (280), das eine entsprechende Y-Verzweigung aufweist. Die lineare Fortführung des Transferkanals ( 1 50) ist mit einer semipermeablen Membran (360) abgedeckt. Oberhalb der semipermeablen Membran befindet sich ein Raum (410) , in den eine Elektrode (20b) als Anode zum Beispiel hineinragt. Diese Elektrode besteht erfindungsgemäß aus Kunststoff mit elektrisch leitfähigen Zusatzstoffen. Eine Pipettenspitze (290) ragt in einen Entnahmeraum (380), aus dem dann entsprechende Materialien durch den Transferkanal ( 1 50) aus dem Innenvolumen des Reaktionsgefäßes (270) entnommen werden können.

Das Element (280) kann mit einem XYZ-Arm durch eine entsprechende Vorrichtung (400) aus einem Vorratsmagazin entnommen und in das Reaktionsgefäß transportiert werden. Das Vorrichtungselement (400) besteht aus einem gabelförmigen Element, das das Y-Stück entsprechend aufnehmen kann. Nach Absetzen des elektrisch nicht leitenden Zylinderstücks (280) im Reaktionsgefäß kann eine entsprechende Beschickung sowohl über die Zuführung (380) als auch über die Zuführung (410) erfolgen, die einen entsprechenden Reaktionsraum (41 0) oberhalb einer semipermeablen Membran (360) darstellt. Die semipermeable Membran (360) ist als entsprechender Schutz vor der Elektrode angeordnet, so daß elektrische Entladungen von zu analysierenden Molekülen im Umfeld der Elektrode vermieden werden können. Die Elektrode aus elektrisch leitfähigem Kunststoff (20b) kann beispielsweise über eine entsprechende Aufnahme an eine elektrisch leitfähige Pipettenspitze angeklemmt, so daß die Aufnahme der Pipettenspitze (290) als elektrische Zuführung für die Elektrode dient.

Fig. 8 zeigt eine Vorrichtung mit Elementen wie Fig. 7, jedoch mit präparativem Gel.

Fig. 8 zeigt, daß der entsprechende Transferkanal ( 1 50) mit Gelmaterial befüllt werden kann und man auf diese Art und Weise eine Gelelektro- phorese durchführen kann. Dabei ist es entscheidend, daß das Gel aus dem Transferkanal herausragt, um ein optimales Eintauchen in die zu analysierende Flüssigkeit im Reaktionsgefäß zu erhalten. Dieses Herausragen ist durch das Element (420) in Fig. 8 dargestellt. Die Füße des elektrisch nicht leitenden Zyiinderstücks (280) verstehen sich nicht um Laufen, sondern zum Beispiel als Dreibein, so daß die Luft eine entsprechende Verdrängung erfahren kann. Der Luftraum oberhalb des Gels (420) kann über den Entnahmeraum (380) befüllt werden, wobei die Ausführung entsprechend so gestaltet wird, daß keine Luftblasen unter der semipermeablen Membran (360) erzeugt werden. Dies wird erfindungsgemüß erreicht, indem die Mem- bran (360) nicht horizontal, sondern in einer Neigung gegen die Horizonale angeordnet ist. Der Raum (41 0) oberhalb der Membran (360) kann entsprechend mit Elektrophoresepuffer befüllt werden und anschließend kann eine Elektrode zum Beispiel (20b), d.h. als Anode, eingetaucht werden. Nach Anlegung einer Spannung an die entsprechenden Stromzuführungen (260) erfolgt ein elektrophoretischer Austausch zwischen dem Volumen des Reaktionsgefäßes und dem Volumen (410) oberhalb der Membran. Dadurch reichert sich biologisch zu analysierendes Material zwischen dem Gelmaterial (420) und der Membran (360) an, das anschließend über eine entsprechende Pipette (290) entnommen werden kann.

Fig. 9 zeigt eine Vorrichtung wie Fig. 7 jedoch mit leitfähigem Reaktionsgefäß und Aufnahme sowie mit Pipettenspitze mit integrierter Elektrode.

Fig. 9 zeigt eine besonders einfache, erfindungsgemäße Vorrichtung, bei der ein elektrisch leitfähiges Reaktionsgefäß (270) zum Beispiel als Kathode eingesetzt wird. Mit dem entsprechenden Transferelement (400) am XYZ-Arm kann dann ein Element (280) als elektrisch nicht leitendes Zylinderstück mit einer entsprechenden Y-Verzweigung von einem Magazin in das Reaktionsgefäß eingeführt werden. Die semipermeable Membran (360) ist in diesem Falle durch eine nicht-horizontale Integration der semipermeablen Membran (360), daß Luftblasen unterhalb dieser Membran vermieden werden. Der Entnahmeraum (380) kann mit der Pipettenspitze, wie zuvor geschildert, beschickt werden, ebenso wie der Raum oberhalb der Elektrode (410) . In dem Transferkanal ( 1 50) befindet sich ein entsprechendes Gel mit einem Behang (420), so daß ein Eintauchen in die ent- sprechende Reaktionsflüssigkeit luftblasenfrei ermöglicht wird. In diesem Falle wird eine elektrisch leitfähige Pipettenspitze gleichzeitig als Elektrode benutzt, die dann in den Raum oberhalb der semipermeablen Membran (41 0) eingetaucht wird. Die Aufnahme für die Pipettenspitze (290) ist aus elektrisch leitfähigem Material und kann so die Stromversorgung der Elektrode übernehmen. Eine entsprechende Aufnahme des Reaktionsgefäßes (440) kann entsprechend vorgesehen werden, um die Gegenelektrode mit Strom zu versorgen. Mit dieser erfindungsgemäßen Vorrichtung kann der folgende Prozeß in einem entsprechenden XYZ-Roboter einfach durchgeführt werden:

Ausgang Gelelement (280) magaziniert in Rack

Step 1 Transferiere Gelelement von Rack in Tube mit

Transfervorrichtung (400)

Step 2 Hole leitende Pipettenspitze (290)

Step 3 Pipettiere Elektrophoresepuffer auf Membrane (360)

Step 4 Pipettiere Elektrophoresepuffer unter Membrane (360) über Öffnung (380)

Step 5 Tauche Pipettenspitze über Membrane als Elektrode in den

Raum (410) ein

Step 6 Führe Elektrophorese durch Anlegen einer Spannung an die

Elektroden (20a) und (20b) S Stteepp 77 Pipettiere Eluat aus Raum (380) ab

Fig. 1 4 zeigt eine erfindungsgemäße Ausführung einer leitfähigen Pipettenspitze, bei der durch eine Verbreiterung (450) an der äußeren Pipettenspitzenwand eine Verbesserung des Elektronenflußes erreicht wird. Gleichzeitig kann diese Verbreiterung auch zu Rühr- oder Mischzwecken benutzt werden.

Folgende Beispiele sollen die Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren weiter erläutern:

Beispiel 1

Messung der Leitfähigkeit von erfindungsgemäßen Elektroden

Die elektrische Leitfähigkeit wurde am Beispiel von leitfähigen Pipettenspitzen (Fa. Canberra Packard, Dreieich Nr. 600 0604) oder an Rohlingen von Spritzgußmaterial aus PRE-ELEC TP 4474 (Premix Oy, Finnland) mit Hilfe eines Digital-Multimeters (DT-890, Fa. Völkner Elektronik, Braunschweig, Nr.063-823-314) gemessen.

Ergebnis

Beispiel 2

Beschichtung von elektrisch leitfähigem Kunststoff

2a Herstellung von biotinyliertem Rinder-Immunglobulin G (R-IgG)

0,5 ml einer R-lgG-Lösung [2mg R-IgG (Boehringer Mannheim Cat.No. 1293621103 in 1 ml PBS ( NaH₂P0₄*1 H₂O 2,76 g/l; Na₂HP0₄*2H₂03,56 g/l; NaCI 8 g/l; pH 7,25)] werden mit 6 μ I D-Biotinoyl-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimid-ester-lösung in PBS und DMSO (Ansatz laut Biotin Labeling Kit von Boehringer Mannheim Best. Nr. 1418165) vermischt und 2,5 h bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührer gerührt und anschließend über Nacht stehen lassen. Das molare Verhältnis von Biotin: R-IgG beträgt 20:1 bei diesem Ansatz.

2b Beschichtung von elektrisch leitfähigem Kunststoff mit biotinyliertem R-IgG

Aus einem Rohling, hergestellt im Spritzgußverfahren aus PRE-ELEC TP 4474 (Premix Oy, Finnland), werden Scheiben von 4 mm Durchmesser ausgeschnitten, in einen Napf einer unbeschichteten Mikrotiterplatte gelegt und in einer Lösung von 0, 2 ml Beschichtungspuffer (NaHCO₃ 4,2 g/l pH 9,6) dreimal gewaschen. Die Beschichtung erfolgt über Nacht, indem 0,2 ml Beschichtungspuffer und 6 μ\ R-lgG-Biotin-Lösung (2a) hinzugefügt werden.

Anschlief end werden die Scheiben 3 x mit je 0,25 ml Milli-Q-Wasser gewaschen und direkt für die nachfolgende Austestung eingesetzt.

Zur Kontrolle wird ein Ansatz mit R-IgG unter identischen Konzentrationsbedingungen durchgeführt, jedoch ohne die Biotinylierung 2a) .

2c Austesten der Bindefähigkeit

Zum Austesten der Bindefähigkeit werden die Scheiben aus 2b) mit 200 μ\ einer Streptavidin-Peroxidase-Konjugatlösung (Boehringer Mannheim Catalog Nr. : 1 089 1 53; 1 :20 000 Verdünnung in PBS) gemischt und unter Schütteln 45 min. inkubiert. Anschließend werden mittels Magnetseparator (Boehringer Mannheim Best. Nr. 1 641 794) die Scheiben abgetrennt und der Überstand verworfen. Dies wird wiederholt. Anschließend werden 200 μ\ ABTS-Lösung (Boehringer Mannheim Cat. Nr. 1 204 530 und 1 1 1 2 422) und 1 5 min. inkubiert. Die Scheiben werden entfernt, die Lösung in eine Mikrotitrationsplatte (Innova GmbH) überführt und bei 405 nm gemessen.

Ergebnis

Beispiel 3

Durchführung einer Elektrochemilumineszenz-Messung

In einer Vorrichtung nach Fig. 1 1 bei der der Plastikformkörper (10) einem transparenten Polystyrolröhrchen (37 mm lang; φ 1 2 mm) und der Abstandshalter (30) einem Röhrchen aus Polypropylen (z. B. ein Filtertube aus "High Pure PCR Template Preparation Kit" der Fa. Boehringer Mannheim Best. Nr. 1 796 828, bei dem die Vliese entfernt wurden) entspricht, wurden als Elektroden (20 a,b) verschiedene Materialien verwendet. Zum einen wurden Elektroden aus Draht einer Platin/Ruthenium-Legierung (φ 0,5 mm) verwendet, zum anderen Elektroden (ca. 3 mm x 50 mm), die aus leitfähigen Pipettenspitzen (Fa. Packard Best. Nr. 6000604) mit einem Messer geschnitten wurden

1 ml eines Tripropylamin-haltigen Puffers, wie Boehringer Mannheim ProCell Puffer für die Elecsys-Produktlinie (Best. Nr. 1 66 2988), wurden mit 5 μ\ einer gesättigten Lösung von Tris-(2,2'-bipyridyl)-Ruthenium(ll)-chlorid Hexahydrat (Sigma-Aldrich Nr. 93307 Fluka) versetzt und in (1 ) überführt. Die Vorrichtung wurde in den Probenraum eines LKB 1 250 Luminometer plaziert, wobei zwei elektrische Zuführungen in den Probenraum durch vorhandene Öffnungen durchgezogen wurden. Das Gerät wurde weiterhin dahingehend modifiziert, daß die letzte Verstärkerstufe (IC 7) überbrückt wurde, was zu kleineren Meßsignalen führt. Die Meßsignale wurden mit einem Digital-Multimeter (DT-890, Fa. Völkner Elektronik, Braunschweig, Nr. 063-823-314) detektiert. Als Spannungsquelle für die Elektroden diente ein Elektrophoresetransformator ( Fa. Hölzel, Dorfen Nr. 0 628/ 1 985) . Das Luminometer wurde mit dem internen Standard laut Manual geeicht. Die Reagenzmischung bei der Platinelektrode hatte besonders stark aufgeschäumt. Ergebnisse:

In einer Variante wurden als Spannungsquelle für die Kunststoffelektroden der Elektrophoresetransformator ( Fa. Hölzel, Dorfen Nr. 0 628/ 1 985) wie oben und für die Platinelektroden, ein Netzteil der Fa. Voltcraft (NG-500 Best. Nr. : B51 8034) mit einer Spannungsteiiung und einem Vorwiderstand von 480 Ω, um das Aufschäumen zu verhindern. Das Luminometer wurde mit dem internen Standard laut Manual geeicht, die entsprechenden Messwerte sind jeweils angegeben.

Ergebnisse:

In einer dritten Detektionsvariante wurde das Luminometer dahingehend modifiziert, daß die letzte Verstärkerstufe (IC 7) überbrückt wurde, was zu kleineren (ca. Faktor 1 0) Meßsignalen führt. Die Meßsignale wurden mit einem/-/M-4-Meßmodul (Analogwandler der Fa. BMC Systeme GMBH Bezug über Fa. Conrad Elektronic Best. Nr. : 1 0 75 57-99) direkt in einem Computer aufgezeichnet, wobei die Triggerspannung und Lichtemission in Form des Luminometerausgangs gleichzeitig aufgezeichnet wurden. Als Spannungsquelle für die Kunststofflektroden d iente ein Elektrophoresetransformator ( Fa. Hölzel, Dorfen Nr. 0 628/ 1 985) und für die Platinelektroden, ein Netzteil der Fa. Voltcraft (NG-500 Best. Nr. : B51 8034) mit einer Spannungsteilung und einem Vorwiderstand von 480 Ω, um das Aufschäumen zu verhindern. Das Luminometer wurde mit dem internen Standard laut Manual geeicht. Bei Verwendung des Elektrophoresetransformators wurde über eine Widerstandsspannungsteilung eine Eingangsspannung 10 V für den Analogwandler erzeugt.

In Fig. 21 a ist das Messignal des Luminometers und die Triggerspannung aufgetragen. In Fig.21 b die Abhängigkeit des Messignals von der Triggerspannung gezeigt.

Beispiel 4a

Du rchfüh rung einer vollständ igen Nu klei nsäureanalyse mit Probenvorbereitung, Amplifikation und Elektrochemilumineszenz-Messung mittels Glasvlies-technologie am Beispiel eines Nachweises von Hepatitis C Virus

Grundlage ist eine Vorrichtung gem. Fig. 1 9 jedoch nur mit einem

Permanentmagneten (60b) in unmittelbarer Nähe des Photomultiplier (50) und das Ablaufschema für die Steuerung Fig. 22. Über der Öffnung ( 1 40) befindet sich ein Glasvlies, das aus dem QIAampBlood Kit (Kat.Nr. 291 04) der Fa. Qiagen (Hilden) entnommen wurde. Alle dazugehörigen Reagenzien für die Probenvorbereitung wurden aus diesem Kit wie folgt benutzt.

Es wurden 200 μl Plasma laut beiliegender Arbeitsanweisung lysiert und an das Glasvlies gebunden, wobei alle Zentrifugationsschritte durch Absaugen mit einer Membranpumpe der Fa. Eppendorf , 41 51 über Öffnung ( 1 40) ersetzt wurden. Zur Elektroelution wurden 300 /I eines Elektrophoresepuffer nach Andrews A.T. (Electrophoresis, Clarendon Press, Oxford, 1 986, S. 1 60) verwendet. Als Elektroden (20a, b) wurden Drähte mit 0,3 mm Durchmesser einer Platin-Ruthenium-Legierung verwendet und als Spannungsgeber der Elektrophoresespannungsgeber der Fa. Hölzel, Dorfen.

Für die Amplifikation wurden alle Reagenzien des HCV-Amplicore-Kits der Fa. Hoffmann La Röche (Art. Nr. 075 391 2, 075 3890, 075 3904) verwendet. Dieser benutzt einen biotinylierten Primer. Methodisch wurde der Ansatz beschrieben von K.K.Y. Young et al. in Journal of Microbiology 1 993 Seite 882 - 886 entsprechend adaptiert.

Danach werden 50μl eines entprechenden Amplifikationsmixes mit HCV-spezifischen Primern über Öffnung ( 1 30) zupipettiert, wobei eine entsprechende 7fache Aufkonzentriereung durch das Restvolumen von ca. 300 μ\ für die einzelnen Konzentrationen berücksichtigt wurde. Anschließend wurde das in der Arbeitsanleitung beschriebene Thermocyclerprotokoll für die RT-PCR angewendet.

Anschließend wurde eine HCV spezifische Sonde (nt 251 - 275) nach K. K.Y. Young et al. (s.o.), die mit dem Amplifikat hybridisieren kann, über Öffnung ( 1 40) zupipettiert, wobei die Sonde mit einer Ruthenium zuvor markiert wurde. Für das Aufschmelzen des Doppelstranges und die Hybridisierung mit den Sonden wird eine Erhitzung auf 45 °C und eine Abkühlung auf Raumtemperatur vorgenommen. Anschließend werden 50 μ\ Streptavidin beschichtete Magnetpartikel zugegeben (Boehringer Mannheim Best.Nr. 1 641 778) und bei 37 °C 1 5 min. inkubiert. Anschließend wurde der Permanentmagnet (60b) aktiviert und die gesamte Reaktionslösung über Öffnung ( 140) abgesaugt. Danach wurden 300 /I eines Tripropylamin-haltigen Puffers (Boehringer Mannheim ProCell Puffer für die Elecsys-Produktlinie Best. Nr. 1 66 2988) durch Öffnung ( 1 30) zupipettiert und eine Triggerspannung von 3, 5 V an die Elektroden (20 a oder b) angelegt. Das emitierte Licht wurde über eine Photomultiplier wie in Beispiel 3 gemessen.

Beispiel 4b

Du rc hf ü hru ng ei ner vollständigen N u klei nsäureanalyse mit Probenvorbereitung, Amplifikation und Elektrochemilumineszenz-Messung mittels magnetischen Glaspartikeln am Beispiel eines Nachweises von Hepatitis C Virus

Grundlage ist eine Vorrichtung gem. Fig. 1 9 mit zwei Permanentmagnete (60a, b) und das Ablaufschema für die Steuerung Fig. 23.

Alle Reagenzien sind dem "High Pure PCR Template Preparation Kit" der Fa. Boehringer Mannheim (Best. Nr. 1 796 828) entnommen. Die Glasmagnetpartikel sind von Fa. Merck Darmstadt (Best.Nr.1 .01 1 93.0001 ) . Es wurden 200 μl Plasma laut beiliegender Arbeitsanweisung lysiert und an 50 μ\ Glasmagnetpartikelsuspension gebunden. Anschließend wurde Magnet (60a) aktiviert und die Lysemischung durch Absaugen mit einer Membranpumpe der Fa. Eppendorf , 41 51 über Öffnung ( 1 40) entfernt. Die anschließenden Waschschritte wurden analog durchgeführt.

Die anschließende Elektroeleution und alle anderen Schritte der Weiterverarbeitung inklusive Detektion erfolgten wie in Beispiel 4a.

Claims

Patentansprüche

. Vorrichtung (500) zur Isolierung oder/und Analyse von geladenen Biomolekülen, vorzugsweise Nukleinsäuren, umfassend: ein Gefäß (270) aus einem im wesentlichen starren Kunststoff, welches einen Aufnahmeraum (275) zur Aufnahme eines Reak- tionsgemischs aus Probe oder/und Reagenzien umfaßt, wobei der Aufnahmeraum (275) durch eine Zugangsöffnung (272) des Gefäßes (270) von außen zugänglich ist, sowie zwei Elektroden (20a, 20b), welche in dem Aufnahmeraum (275) mit dem Reaktionsgemisch in Kontakt bringbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner umfaßt: eine aus elektrisch nicht leitfähigem Kunststoff gefertigte Rohreinheit (280), die derart bemessen oder/und ausgebildet oder/und anordenbar ist, daß wenigstens ein Teil ihrer Innenfläche mit im Aufnahmeraum (275) enthaltenem Reaktionsgemisch in Kontakt bringbar ist, wobei die Rohreinheit (280) und eine der Elektroden (20b) derart ausgebildet sind, daß diese Elektrode (20b) in der Rohreinheit (280) mit

Reaktionsgemisch in Kontakt bringbar ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Rohreinheit (280) an einer der Elektroden (20b) befestigbar ist, vorzugsweise auf diese Elektrode aufsteckbar ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Elektrode (20a) an der Rohr- einheit (280) befestigbar ist, vorzugsweise auf diese Elektrode aufsteckbar ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohreinheit (280) auf den Boden (270a) des Gefäßes (270) aufstellbar ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohreinheit (280) im Bereich ihres unteren Endes, vorzugsweise dem Gefäßboden (270a) benachbart oder/und an diesen anschließend, Durchbrechungen (270d) aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohreinheit (280) am Rand der Zugangsöffnung (272) befestigbar, vorzugsweise einhängbar, ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohreinheit (280) Positionierarme

(280e) zur Stabilisierung ihrer Lage im Gefäß (270) aufweist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß im Innenraum der Rohreinheit (280) eine Elektrodenkammer (41 0) abgeteilt ist, wobei ein Verbindungsdurchgang zwischen Elektrodenkammer (41 0) und dem restlichen Innenraum ( 1 50) der Rohreinheit (280) mittels einer semipermeablen Membran (360) verschlossen ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß am oberen Ende der Rohreinheit (280) neben einem Zugang zu der Elektrodenkammer (410) ferner einen Zugang zu einer der Elektrodenkammer (410) benachbarten Entnahmekammer (380) vorgesehen ist.

0. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der Rohreinheit (280) eine Gelmasse (420) angeordnet ist, die sich über deren gesamte lichte Weite erstreckt.

1 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Rohreinheit (280) von der einen Elektrode (20b) zum Gefäßboden (270a) hin erweitert.

1 2. Vorrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und gewünschtenfalls dem Kennzeichen eines der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daßdas Gefäß (270) einen durchbrechungsfreien Boden (270a) und eine durchbrechungsfreie Seitenwandung (270b) aufweist.

1 3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß (270) aus thermisch verformbarem Kunststoff gefertigt ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Gefäßboden (270a) wenigstens einen Bereich (270a 1 ) geringerer Bodenwandstärke aufweist.

1 5. Vorrichtung nach Anspruch 1 4, dadurch gekennzeichnet, daß dem Bereich (270a 1 ) geringerer

Bodenwandstärke benachbart eine Detektionseinrichtung (50) , vorzugsweise ein Photomultiplier, angeordnet ist.

1 6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Elektroden (20a,

20b) aus elektrisch leitfähigem Kunststoff gefertigt ist.

1 7. Vorrichtung nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wenigstens eine Elektrode (20a, 20b) aus elektrisch leitfähige Zuschlagstoffe enthaltendem Kunststoff gefertigt ist.

1 8. Vorrichtung nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuschlagstoffe Graphit, Eisen, Silber, Gold oder andere Metalle oder/und deren Mischungen oder/und deren Legierungen umfassen.

1 9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wenigstens eine Elektrode (20a, 20b) einen elektrischen Widerstand von weniger als 1 00 MΩ, vorzugsweise von weniger als 1 MΩ, aufweist.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Elektrode (20a, 20b) aus thermisch verformbarem Kunststoff gefertigt ist.

21 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Elektrode (20a, 20b) als von dem Gefäß (270) gesondertes Element ausgebildet ist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode (20a, 20b) am Gefäß

(270) befestigbar, vorzugsweise festklemmbar, ist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Elektrode (20b) als Pipettenspitze (290) oder als Teil einer Pipettenspitze (290) ausgebildet ist.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Elektrode (20b) in einer Pipettenspitze (290) angeordnet ist.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß an der Außenseite der Elektrode (20b) Ansätze (450) angeordnet oder ausgebildet sind.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Elektrode (20a, 20b) mit der Gefäßwandung (270b) einstückig ausgebildet ist.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß ein Abstandshalter (30) vorgesehen ist, der einen körperlichen Kontakt der Elektroden (20a, 20b) verhindert.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandhalter (30) rohrförmig ausgebildet ist, vorzugsweise in Anpassung an die äußere Gestalt einer Pipettenspitze (290) .

29. Vorrichtung nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandshalter (30) und wenigstens eine Elektrode (20b) als Einheit ausgebildet sind.

30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandshalter (30) als Pipettenspitze (290) ausgebildet ist.

31 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (20a, 20b) mit einer äußeren Stromquelle ( 1 80) verbunden sind.

32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Elektroden (20a, 20b) oder/und die semipermeable Membran (360) eine Beschichtung (34, 35, 36) aufweist.

33. Vorrichtung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung (34, 35, 36) mehrlagig ausgebildet ist.

34. Vorrichtung nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung ein oder mehrere biologische Polymere umfaßt.

35. Vorrichtung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisches Polymer mindestens ein Protein vorhanden ist.

36. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin ist.

37. Vorrichtung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein spezifisch bindefähiges Protein ist.

38. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 33 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Lage der Beschichtung einen Partner eines spezifischen Bindepaares umfaßt.

39. Vorrichtung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Bindepaar ausgewählt ist aus Ligand/Rezeptor, Antigen/Antikörper oder Antikörperfragment, Hapten/Antikörper oder Antikörperfragment, und Biotin/(Strept-)Avidin.

40. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 34 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Polymer zur Bindung einer Nukleinsäure fähig ist.

41. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisches Polymer mindestens eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid vorhanden ist.

42. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisches Polymer mindestens eine PNA vorhanden ist.

43. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 33 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Lage der Beschichtung chemisch reaktive Linkermoleküle umfaßt.

44. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß zum Abtrennen von Biomolekülen Adsorptionsmittel (65) in dem Gefäß (270) vorgesehen bzw. in das Gefäß (270) einbringbar sind.

45. Vorrichtung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorptionsmittel Silicagel oder/und Agarosegel oder/und Poly acry lamidgel oder/und lonenaustauschmaterial oder/und Glasfaservlies oder/und Glaspartikel, vorzugsweise in Glas eingeschlossene magnetische Partikel (65), umfassen.

46. Vorrichtung nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß dem Gefäß eine Magnetfeldvorrichtung (60, 60') zugeordnet ist, die zwischen einem aktiven Zustand, in welchem sie auf in dem Gefäß (270) vorhandene Magnetpartikel (65) eine anziehende Kraft ausübt, und einem inaktiven Zustand, in welchem sie auf die Partikel (65) keine bzw. im wesentlichen keine Kraft ausübt, überführbar ist.

47. Vorrichtung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnetfeldvorrichtung einen Körper

(60) aus permanentmagnetischem oder/und magnetisiertem Material umfaßt.

48. Vorrichtung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnetfeldvorrichtung einen

Elektromagneten (60') umfaßt.

49. Vorrichtung nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektromagnet (60') ein- und ausschaltbar ist.

50. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 46 bis 49, dadurch gekennzeichnet, daß die Magnetfeldvorrichtung (60) zwischen einer an das Gefäß (270) angenäherten, dem aktiven Zustand entsprechenden Stellung und einer von dem Gefäß (270) entfernten, dem inaktiven Zustand entsprechenden Stellung verlagerbar ist, beispielsweise verkippbar oder verschiebbar ist.

51 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß ihr ein Pipettier-Roboter ( 1 90) zugeordnet ist.

52. Vorrichtung nach den Ansprüchen 50 und 51 , dadurch gekennzeichnet, daß der Pipettier-Roboter ( 1 90) und die Magnetfeldvorrichtung (60, 60') derart aufeinander abgestimmt ausgebildet sind, daß die Überführung der Magnetfeldvorrichtung (60, 60') zwischen dem aktiven Zustand und dem inaktiven Zustand allein von dem Pipettier-Roboter ( 1 90) bewerkstelligbar ist.

53. Vorrichtung nach Anspruch 51 oder 52, dadurch gekennzeichnet, daß der Pipettier-Roboter ( 1 90) einen Greifer (400) umfaßt.

54. Verbund (550) von Vorrichtungen nach einem der Ansprüche 1 - 53, dadurch gekennzeichnet, daß die Anoden (20b) der Vorrichtungen (500) miteinander verbunden sind und daß die Kathoden (20a) der Vorrichtungen (500) miteinander verbunden sind.

55. Verbund nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß die Gefäße (270) zu einer Mikrotitrationsplatte (51 0) zusammengefaßt sind.

56. Basiseinheit (510), umfassend wenigstens eine Aufnahme (440) für eine Vorrichtung (500) nach einem der Ansprüche 1 bis 53 oder/und für einen Verbund (550) von Vorrichtungen nach Anspruch 54 oder 55.

57. Basiseinheit nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner wenigstens eine Magnetfeldvorrichtung (60, 60') umfaßt.

58. Basiseinheit nach Anspruch 56 oder 57, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner wenigstens eine elektrische Zuleitung (80) zum Kontaktieren wenigstens einer Elektrode (20a, 20b) umfaßt.

59. Basiseinheit nach einem der Ansprüche 56 bis 58, dadurch gekennzeichnet, daß die wenigstens eine Aufnahme (440) kühlbar oder/und heizbar ist.

60. Verfahren zur Isolierung oder/und An . se von geladenen Biomolekülen, vorzugsweise Nukleinsäuren durch Adsorbieren von in einer Lösung enthaltenen geladenen Biomolekülen an ein geeignetes Adsorptionsmittel, Abtrennen der verbleibenden Lösung und ggf. Waschen des Adsorptionsmittels, Ablösen der Biomoleküle vom

Adsorptionsmittel sowie Separation der Biomoleküle, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 53 oder einem Verbund von Vorrichtungen nach Anspruch 54 oder 55 durchgeführt wird, wobei zumindest das Ablösen der Biomoleküle vom Adsorptionsmittel durch

Elektroelution bewirkt wird.

61 . Verfahren nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsportionsmittel ausgewählt ist aus einem Gel, einem lonenaustauschermaterial, einem Glasfaservlies und Glaspartikeln, insbesondere in Glas eingeschlossenen magnetiscnen Partikeln.

62. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 oder 61 , dadurch gekennzeichnet, daß zum Ablösen der Biomoleküle vom

Adsorptionsmittel ein Elektroelutionspuffer zugesetzt wird.

63. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 bis 62, dadurch gekennzeichnet, daß während der Elektroelution dei Temperatur in der Vorrichtung auf 30 bis 1 00°, vorzugsweise 55 bis 80°C, eingestellt wird.

64. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 bis 63, dadurch gekennzeichnet, daß die Separation der Biomoleküle durch Konzentration derselben in der Umgebung der entgegengesetzt polarisierten Elektrode mittels eines elektrischen Feldes erfolgt.

65. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 bis 64, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung verwendet, welche Zellen enthält, diese an ein Adsorptionsmittel binden läßt, nach Abtrennung der Lösung eine Lyse der Zellen bewirkt und nachfolgend freigesetzte geladene Biomoleküle, und insbesondere Nukleinsäuren in der Umgebung der entgegengesetzt polarisierten Elektrode mit Hilfe eines elektrischen Feldes konzentriert.

66. Verfahren nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorptionsmittel in Glas eingeschlossene magnetische Partikel verwendet werden, welche mit Hilfe der Magnetfeldvorrichtung räumlich getrennt von den in der Umgebung der Elektrode konzentrierten Biomolekülen gehalten werden.

67. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 bis 66, dadurch gekennzeichnet, daß nach Adsorption der Biomoleküle an die magnetischen Partikel zur Elution und Separation gleichzeitig mittels der Magnetfeldvorrichtung und den Elektroden auf die magnetischen Partikel und die Biomoleküle in räumlich entgegengesetzter Weise eingewirkt wird.

68. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 bis 67, dadurch gekennzeichnet, daß zur Isolierung die mit Biomolekülen, vorzugsweise Nukleinsäuren konzentrierte Lösung in der Nähe einer der Elektroden, vorzugsweise der Anode abgezogen wird.

69. Verfahren nach Anspruch 68, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung abpipettiert wird.

70. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 bis 69, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorrichtung nach einem der

Ansprüche 32 bis 43 verwendet wird, wobei die Biomoleküle an die Beschichtung binden.

71 . Verfahren nach Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung von Nukleinsäuren durch

Hybridisierung mit in der Beschichtung vorliegenden komplementären Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden erfolgt.

72. Verfahren nach einem der Ansprüche 60 bis 71 , dadurch gekennzeichnet, daß zur Analyse von Nukleinsäuren innerhalb der Vorrichtung eine Amplifikation mittels Polymerase- chain-reaction durchgeführt wird.

73. Verfahren nach Anspruch 72, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierten Nukleinsäuren ebenfalls durch Stromeinwirkung in der Umgebung der Anode konzentriert werden.

74. Verfahren nach Anspruch einem der Ansprüche 60 bis 73, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion von Biomolekülen mittels

Elektrochemolumineszenz erfolgt.

75. Verfahren zur Isolierung oder/und Analyse von geladenen Biomolekülen durch Aufbringen einer diese enthaltenden Probe auf ein Trenngel und elektrophoretischer Separation der Biomoleküle aufgrund unterschiedlicher Molekulargewichte, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 53 oder einem Verbund von Vorrichtungen nach Anspruch 54 oder 55 durchgeführt wird, wobei die Vorrichtung ein Trenngel umfaßt oder dieses vor Aufbringen der Probe in die Vorrichtung eingebracht wird.

76. Verfahren nach Anspruch 75, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren in einer Vorrichtung gemäß Anspruch 1 0 durchführt.

77. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Anspürch 1 bis 53 oder eines Verbundes von Vorrichtungen nach Anspruch 54 oder 55 zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 60 bis 76.