DE4436215C2 - Optischer Bio- und Chemosensor - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Optischen Bio- und Chemosen­ sor nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Optische Bio- und Chemosensoren, bei denen durch biologi­ sche, biochemiche oder chemische Reaktion konzentrationsab­ hängige Lichtsignale erzeugt werden, die durch einen opti­ schen Detektor nachgewiesen werden, sind bekannt.

Ein optischer Bio- oder Chemosensor besteht aus einer Meßzo­ ne, in der eine biologische, biochemische oder chemische Bestimmungsreaktion abläuft, und einem Signaltransduktor, der das primäre Sensorsignal, in diesem Fall ein Lichtsi­ gnal, in ein elektrisches Meßsignal umwandelt. Bei diesen Sensoren können verschiedene optische Meßprinzipien angewen­ det werden. So wird z. B. bei chemiluminometrischen Sensoren das durch eine Bestimmungsreaktion erzeugte und konzentrati­ onsabhängige Lichtsignal gemessen, wobei die Lichtintensi­ tät mit der Konzentration eines Reaktionsteilnehmers, z. B. des Analyten korreliert. Auf diese Weise wird der Analyt durch den Sensor detektiert.

Es ist bekannt, daß solche Licht aussendenden Reaktionen zur Messung der Analytkonzentrationen eingesetzt werden können. Aus den Druckschriften
Analytica Chimica Acta, 280(1993) 185-189 Fresenius J. Anal. Chem. (1993) 346 : 924-929 und Anal. Chem. 1985, 57, 2552-2555
sind optische Bio- und Chemosensoren mit einer Meßzelle für die biologiche, biochemische oder chemische Reaktion einer zu bestimmenden Substanz mit einem Reagenz und mit einem Strahlungssensor zur Detektion der bei der Reaktion entstehenden Strahlung bekannt. Als Strahlungssensoren sind PhOtomultiplier vorgesehen. Bei optischen Bio- und Chemosen­ soren sind daneben als Strahlungssensoren auch viel weniger empfindliche Leuchtdioden eingesetzt worden. Dies erfordert aufwendige Sensorkonstruktionen, die bisher nicht zu kompak­ ten Sensoranordnungen führten. Photomultiplier erfordern eine stabilisierte Hochspannungsquelle und ein Nanoamperme­ ter zur Lichtmessung. Photodioden erfordern eine präzise Thermostatierung und sind für die Messung kleiner Konzentra­ tionen aufgrund ihrer begrenzten Empfindlichkeit ungeeig­ net. In beiden Fällen ist die Geometrie der zu verwendenden Meßzellen an den Lichtdetektor anzupassen. Auch die in vielen Anordnungen angewendete Übertragung des Lichtsi­ gnals, z. B. durch Lichtleitfasern, zwischen der optisch aktiven Schicht und dem Nachweissystem löst die genannten Probleme bei speziellen Anwendungen nicht.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, kompakte und robuste Anordnungen von optischen Bio- und Chemosensoren mit ausrei­ chender Meßempfindlichkeit und einfacher Signaltransduktion zu realisieren, wobei die Lichtdetektion leicht an die Geo­ metrie der verwendeten Meßzelle bzw. -zone angepaßt werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Bisher wurde in diesem Zusammenhang nicht verfolgt, die Lichtausbeute des Lichtempfängers durch eine geordnete An­ ordnung von lichtsensitiven Molekülen zu maximieren.

Bei einem optischen Bio- und Chemosensor mit einer Meßzelle für die biologische, biochemische oder chemische Reaktion einer zu bestimmenden Substanz mit einem Reagenz und mit einem Strahlungsensor zur Detektion der bei der Reaktion entstehenden Strahlung, ist erfindungsgemäß als Strahlungssensor mindestens eine im Bereich der Meßzelle an­ geordnete und mit Elektroden versehene Schicht vorgesehen, die lichtempfindliche biologische oder biochemische Materia­ lien enthält.

Als mögliche lichtempfindliche biologische Materialien können z. B. reines Bakteriorhodopsin, Bakteriorhodopsin enthaltende Purpurmembranen oder Bakteriorhodopsin enthal­ tende Mikroorganismen verwendet werden.

Als Meßzelle kann eine Reaktionskammer vorgesehen sein, die in Kontakt mit der lichtempfindlichen Schicht steht.

In einer ersten Ausführungsform ist zwischen der Meßzelle bzw. Reaktionskammer und der lichtempfindlichen Schicht eine optisch transparente Elektrode vorgesehen. Dabei erstreckt sich die lichtempfindliche Schicht zwischen die­ ser Elektrode und einer zweiten Elektrode.

Optisch transparente Elektroden sind in verschiedensten Ausführungsformen bekannt.

Bei diesem optischen Bio- bzw. Chemosensor mit biologischer oder biochemischer Transduktion des Lichtsignals wird in der Reaktionskammer durch die Reaktion einer zu bestimmen­ den Substanz mit einem biologischen, biochemischen oder chemischen Material Licht ausgesendet und von der zwischen der optisch transparenten und der zweiten Elektrode einge­ schlossenen Schicht, die das lichtempfindliche biologische oder biochemische Material enthält, absorbiert.

Durch Wandlung des Lichtsignals in elektrochemische Energie in der Schicht zwischen den Elektroden können z. B. eine Spannungsdifferenz, eine Änderung der elektrischen Kapazi­ tät, der Leitfähigkeit und gegebenenfalls eine pH-Differenz zwischen den Elektroden erzeugt werden, die mit der zu bestimmenden Substanz korrelieren.

In einer weiteren Ausführungsform befinden sich in der das lichtempfindliche biologische Material enthaltenden Schicht zwei Edelmetallelektroden, die vorzugsweise an den Stirnsei­ ten der Reaktionskammer angeordnet sind und die das entste­ hende elektrochemische Signal abgreifen und einem elektri­ schen Meßsystem zur Auswertung zuführen.

In einer weiteren Ausführungsform ist zwischen der Meßzelle bzw. Reaktionskammer und der lichtempfindlichen Schicht eine optisch transparente Schicht vorgesehen, wobei sich die lichtempfindliche Schicht zwischen der optisch transparen­ ten Schicht und einer zweiten Elektrode erstreckt und eine pH-Elektrode aufweist, der eine Referenzelektrode zugeord­ net ist.

Bei dieser Ausführungsform wird das erzeugte Licht als Änderung des pH-Wertes gegen die Referenzelektrode detek­ tiert.

Das lichtempfindliche biologische Material kann prinzipiell in Form von reinen Proteinen, als Mikroorganismen oder in Zellorganellen oder in Gemischen aus diesen Komponenten vorgesehen sein.

Es ist zweckmäßig, bei Verwendung von Bakteriorhodopsin als lichtempfindliches biologisches Material dieses in einer Membran gerichtet anzuordnen, wobei die Membran aus flüssig­ kristallinen, vorzugsweise nematischen oder smektischen Pha­ sen, aus polymeren Schichten, Hydro- oder anderen Gelen besteht.

Bei den bisher genannten Ausführungsformen läuft die biolo­ gische, biochemische oder chemiche Bestimmungsreaktion in einer Reaktionskammer und in homogener Lösung der Reaktion­ spartner ab und die Reaktionsmischung ist durch eine op­ tisch transparente Schicht von der lichtempfindlichen Schicht räumlich getrennt.

Weiterhin ist es möglich, daß in der Reaktionskammer, in der die biologische, biochemische oder chemische Reaktion abläuft, gegenüber der optisch transparenten Elektrode eine dünne Schicht als Membran vorgesehen ist, auf der eine die lichterzeugende Reaktion auslösende Reagenz- oder Katalysa­ torschicht immobilisiert ist. Die lichterzeugende Reaktion läuft dann an der Sensormembran ab.

Dazu ist es zweckmäßig, daß diese Membran einen Biokatalysa­ tor, einen Biorezeptor oder einen chemischen Katalysator in immobilisierter Form enthält. Als Biokatalysator können ein Enzym, Enzymsystem, Mikroorganismen oder Organellen und als Biorezeptor Haptene, Antigene oder Antikörper vorgesehen sein.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß die lichtempfindliche Schicht zwischen zwei konzentrisch ange­ ordneten Röhren plaziert ist, wobei die innere Röhre als optisch transparente Elektrode und die äußere Röhre als lichtundurchlässige Gegenelektrode vorgesehen ist.

Die gesamte Meßanordnung ist in einem lichtundurchlässigen Gehäuse untergebracht.

Die Erfindung soll in Ausführungsbeispielen anhand von Zeichnungen erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 ein erstes Ausführungsbeispiel für die Detektion von in homogenen Lösungen ablaufenden lichterzeugen­ den Reaktionen, wobei eine Spannungdifferenz zwi­ schen zwei Elektroden gemessen wird;

Fig. 2 ein zweites Ausführungsbeispiel für die Detektion einer an einer immobilisierten Reagenz- oder Kata­ lysatorschicht ablaufenden und Licht aussendenden Reaktion;

Fig. 3 ein drittes Ausführungsbeispiel, bei der die licht­ empfindliche Schicht mit einer pH-Elektrode gekop­ pelt und gegen eine Referenzelektrode geschaltet ist;

Fig. 4 eine Durchflußanordnung zur kontinuierlichen Mes­ sung eines Analyten;

Fig. 5 eine Ausführung mit konzentrisch angeordneten Röh­ ren.

Die erfindungsgemäße Anordnung der Fig. 1 besteht aus einer Reaktionskammer 1 und einer zwischen einer optisch transpa­ renten Elektrode 2 und einer Ableitelektrode 3 befindli­ chen, das lichtempfindliche biologische Material enthalten­ den Schicht 4. Die Reaktionskammer 1 und die lichtempfindli­ che Schicht 4 sind durch ein lichtundurchlässiges Gehäuse 5 vom Umgebungslicht abgeschirmt. Durch eine dünne Maske oder mehrere dünne Masken wird die Dicke der lichtempfindli­ chen Schicht und die der Reaktionskammer festgelegt. Zwi­ schen den Elektroden 2 und 3 ist ein einpfindlicher Span­ nungsmesser, z. B. ein Galvanometer oder ein Digitalvoltme­ ter 6 geschaltet. Die Reaktionskammer weist einen Eingang 7 und einen Ausgang 8 auf.

Bei der in Fig. 2 dargestellten Ausführungsart, befindet sich in der Reaktionskammer gegenüberliegend zur optisch transparenten Elektrode 2 eine dünne Schicht, auf der eine die Lichtreaktion auslösende Reagenz- oder Katalysator­ schicht immobilisiert ist.

So wird in der als Reagenzschicht ausgebildeten Schicht 9 z. B. Luciferase aus Photinus pyralis auf einer Enzymmembran immobilisiert. Wird eine ATP (Adenosintriphosphat)- hal­ tige Probenlösung kontinuierlich mit einer Mg(II)-Ionen und Luciferin enthaltenden Reagenzlösung vermischt, läuft an der Enzymmembran die Reaktion

ATP + Luciferin + O₂ - AMP + Oxyluciferin + hf

ab, bei der Licht ausgesendet wird. Das Licht wird wiederum in der lichtempfindlichen Schich 4 Fabsorbiert, wobei die auf­ genommene Energie zur Ausbildung z. B. einer Spannungsdiffe­ renz zwischen den Elektroden umgesetzt wird. Das gemessene Spannungssignal korreliert mit der zu messenden ATP-Kon­ zentration. hf ist die bei der Bestimmungsreaktion freige­ setzte Lichtintensität.

Bei dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 3 wird die lichtemp­ findliche Schicht 10 in Kontakt mit einer pH-Elektrode 11 gebracht und das erzeugte Licht als Änderung des pH-Wertes gegen eine Referenzelektrode 14 mittels eines pH-Meters l3 detektiert. So vermischt man z. B. Wasserstoffperoxid und Lüminol in Gegenwart von einer Enzymmembran 12 mit immobili­ sierter mikrobieller Peroxidase, um das Wasserstoffperoxid zu messen. Die Enzymmembran ist dabei, wie in Fig. 3 gezeigt, zur lichtempfindlichen Schicht 4 gegenüberliegend angeordnet.

Entsprechend der in Fig. 4 gezeigten Meßanordnung wird eine Wasserstoffperoxid enthaltende Probenlösung A kontinu­ ierlich mit einer Luminol und Mikroperoxidase enthaltenden Reagenzlösung B unmittelbar vor dem Fenster des in Fig. 1 ge­ zeigten optischen Sensors vermischt, so daß bei Ausbildung eines genügend hohen pH-Wertes von < 8 Luminol unter Aussendung von Licht oxydiert wird, das seinerseits von der hinter dem optischen Fenster immobilisierten lichtempfindli­ chen Schicht absorbiert wird. Zwischen den Elektroden 2 und 3 bildet sich eine Spannung aus, die mit dem Digitalvoltmeter 6 gemessen wird (Fig. 1). Die gemessene Spannung korre­ liert mit der zu bestimmenden Analytkonzentration.

Die Probenlösung A und die Reagenzlösung B werden durch die Pumpen 18 bzw. 19 zum Detektor 20 transportiert.

Nach diesem Prinzip arbeitende optische Bio- und Chemosenso­ ren können an Fließinjektionssysteme, Flüssigchromatogra­ phiesysteme oder andere Durchflußsysteme angekoppelt sein.

An Stelle von Mikroperoxidase lassen sich z. B. Glucoseoxida­ se, Lactatoxidase, Aminosäureoxidasen und Oxalatoxidase einsetzen, um ihre Substrate mit hoher Empfindlichkeit zu messen.

In dem in Fig. 1 gezeigten optischen Bio- bzw. Chemosensor kann das bei einer Bestimmungsreaktion ausgesendete und von der lichtempfindlichen Schicht absorbierte Licht, z. B. auch als Änderung der Dielektrizitätskonstante über die elektrische Kapazitätsänderung gemessen werden. Dabei wird vorzugsweise eine hochfrequente Wechselspannung angewendet. Die Messung des Sensorsignals erfolgt in einer Wechselspan­ nungs-Meßbrücke für die Messung kleiner Kapazitätsänderun­ gen.

Entsprechend Fig. 5 kann die lichtempfindliche Schicht 4 zwischen zwei konzentrisch angeordneten Röhren plaziert werden, wobei die innere Röhre 15 als optisch transparente Elektrode und die äußere Röhre 16 als lichtundurchlässige Gegenelektrode fungiert. Die Vermischung der zu detektieren­ den Substanz (Probenlösung) mit den die Chemilumineszenz bewirkenden Substanzen (Reagenzlösung) erfolgt in einer Mischzone 17, die fließend in die innere Röhre 15 als Reak­ tionszone übergeht.

Claims (13)

1. Optischer Bio- und Chemosensor mit einer Meßzelle für die biologische, biochemische oder chemische Reaktion einer zu bestimmenden Substanz mit einem Reagenz und mit einem Strahlungssensor zur Detektion der bei der Reaktion entstehenden Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß als Strahlungssensor mindestens eine im Bereich der Meßzelle angeordnete und mit Elektroden versehene Schicht (4) vorgesehen ist, die lichteinpfindliche biolo­ gische oder biochemische Materialien enthält.

2. Optischer Bio- und Chemosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Meßzelle eine Reaktionskammer (1) vorgesehen ist und daß die lichtempfindliche Schicht (4) in Kontakt mit der Reaktionskammer (1) steht.

3. Optischer Bio- und Chemosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Meßzelle bzw. Reakti­ onskammer (1) und der lichtempfindlichen Schicht (4) eine optisch transparente Elektrode (2) vorgesehen ist und daß sich die lichtempfindliche Schicht (4) zwischen dieser Elektrode (2) und einer zweiten Elektrode (3) er­ streckt.

4. Optischer Bio- und Chemosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Meßzelle bzw. Reakti­ onskammer (1) und der lichtempfindlichen Schicht (4) eine optisch transparente Schicht (10) vorgesehen ist, wobei sich die lichtempfindliche Schicht zwischen der optisch transparenten Schicht und einer zweiten Elektro­ de erstreckt, und daß in der lichtempfindlichen Schicht (4) eine pH- Elektrode vorgesehen ist, der eine Refe­ renzelektrode (14) zugeordnet ist.

5. Optischer Bio- und Chemosensor nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in der Reaktionskammer (1) gegenüber der optisch transparenten Elektrode (2) eine dünne Schicht als Mem­ bran (12) vorgesehen ist, auf der eine die lichterzeu­ gende Reaktion auslösende Reagenz- oder Katalysator­ schicht immobilisiert ist.

6. Optischer Bio- und Chemosensor, nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtempfindliche Schicht (4) zwischen zwei konzentrisch angeordneten Röhren (15, 16) plaziert ist, wobei die innere Röhre (15) als optisch transparente Elektrode und die äußere Röhre (16) als lichtundurchläs­ sige Gegenelektrode vorgesehen ist.

7. Optischer Bio- und Chemosensor nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als lichtempfindliche biologische Materialien rei­ nes Bakteriorhodopsin, Bakteriorhodopsin enthaltende Purpurmembranen oder Bakteriorhodopsin enthaltende Mikroorganismen verwendet werden.

8. Optischer Bio- und Chemosensor nach mindestens einem der vor hergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, sich in der das lichtempfindliche biologische Material enthaltenden Schicht zwei Edelmetallelektroden befin­ den.

9. Optischer Bio- und Chemosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Edelmetallelektroden an den Stirnseiten der Reaktionskammer angeordnet sind.

10. Optischer Bio- und Chemosensor nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das lichtempfindliche biologische Material in Form von reinen Proteinen, als Mikroorganismen oder in Zel­ lorganellen oder in Gemischen aus diesen Komponenten vorgesehen ist.

11. Optischer Bio- und Chemosensor nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als lichtempfindliches Material Bakteriorhodopsin in einer Membran gerichtet angeordnet ist, wobei die Membran aus flüssigkristallinen, vorzugsweise nemati­ schen oder smektischen Phasen, aus polymeren Schichten, Hydro- oder anderen Gelen besteht.

12. Optischer Bio- und Chemosensor nach Anspruch 11, da­ durch gekennzeichnet, daß die Membran einen Biokatalysa­ tor, einen Biorezeptor oder einen chemischen Katalysa­ tor in immobilisierter Form enthält.

13. Optischer Bio- und Chemosensor nach Anspruch 12, da­ durch gekennzeichnet, daß als Biokatalysator ein Enzym, Enzymsystein, Mikroorganimen oder Organellen und als Bio­ rezeptor Haptene, Antigene oder Antikörper vorgesehen sind.