DE10050416A1

DE10050416A1 - Durchflußmeßzelle zur selektiven, empfindlichen und langzeitstabilen Chemilumineszenzdetektion von Wasserstoffperoxid

Info

Publication number: DE10050416A1
Application number: DE2000150416
Authority: DE
Inventors: Bodo Fuhrmann; Uwe Spohn; Dirk Janasek
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-10-12
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2002-04-18

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Durchflußmeßzelle zur selektiven, empfindlichen und langzeitstabilen Chemilumineszenzdetektion von Wasserstoffperoxid, in der ein Sekundärelektronenvervielfacher, vorzugsweise in kompakter Anordnung mit einem Photonenzählsystem verbunden, in einer kompakten Detektoranordnung über ein Detektorfenster direkt mit der Akzeptorkammer einer thermostatierten und durch eine lichtdurchlässige Ummantelung oder durch ihr eigenes lichtundurchlässiges Material gegen Außenlicht abgeschirmten Zweikammerzelle in der Weise verbunden ist, daß die Fläche der die Akzeptorkammer von der Donorkammer trennenden, vorzugsweise gaspermeablen Membran vom Detektorfenster optisch weitgehend erfaßt wird, die Donorkammer eine dünne Flüssigkeitsschicht vorzugsweise mit einer Dicke von weniger als 0,2 mm ausbildet und für das Einfüllen und Entfernen des Reagenzes bzw. der Probenlösung jeweils mindestens eine Öffnung vorgesehen ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Durchflußmeßzelle zur selektiven, empfindlichen und lang zeitstabilen Chemilumineszenzdetektion von Wasserstoffperoxid.

Chemilumineszenzdetektoren zur Messung von durch chemische Reaktionen er zeugtem Licht sind bekannt und werden bei vielen analytischen und bioanalytischen Aufgabenstellungen eingesetzt. Durch Detektion des ausgesendeten Lichtes können insbesondere kleine Konzentrationen, vorzugsweise kleiner 1 mmoll^-1 in verschiede nen Analyt- und Probenlösungen bestimmt werden. Dazu wird einer Probenlösung je nach Eigenschaften des enthaltenen Analyten ein Oxydations- oder Reduktionsmittel, eine Indikatorsubstanz und gegebenenfalls ein Katalysator zugesetzt, wodurch die licht aussendende Bestimmungsreaktion gestartet und unterhalten wird. Das ausgesendete Licht kann bekanntermaßen durch einen oder mehrere Photomultiplier, Photodioden, Phototransistoren oder einen photographischen Film erfaßt werden. Bei bisher bekann ten Chemilumineszenzdetektoren wird die Selektivität durch die Selektivität der Be stimmungsreaktion begrenzt. Durch instabile, energiereiche und hochreaktive Zwi schenprodukte werden oft zu niedrige Selektivitäten verursacht, die den Anforderungen an eine quantitative Analyse realer Probenlösungen nicht genügen. Aufgrund der kom plexen und durch die Probenmatrix stark beeinflußten Kinetik von Chemilumineszenz reaktionen und oft auftretender Nebenreaktionen ist es sehr schwierig, eine über meh rere Größenordnungen reichende Linearität der Korrelation zwischen Detektorsignal und Analytkonzentration zu erreichen.

Bekannt sind Tauchsensoren, bei denen der das Chemilumineszenzlicht erfas sende Signaltransduktor, z. B. eine Faseroptik (M. Arnold, X. Zhou and R. S. Petsch, Talanta 41(1994) 783-788) durch eine Membran von der Probenlösung getrennt ist. Nachteilig ist zunächst das begrenzte und kleine Volumen des im Sensor vorliegenden Chemilumineszenzreagenzes, wodurch, verstärkt durch den Einsatz von insta biler Meerrettichperoxidase, eine ungenügende Signalstabilität resultiert. Eine relativ lange Ansprechzeit und die begrenzte Empfindlichkeit sind weitere Nachteile dieser An ordnung.

Bekannt sind ferner Versuche, Photodioden in den Akzeptorstrom einer Dünn schichtdialysezelle zu integrieren und das zu detektierende Wasserstoffperoxid dialy tisch aus dem Donorstrom in den Chemilumineszenzindikator enthaltenden Akzep torstrom abzutrennen (W. Frenzel et al., 2000, Poster und Abstract, 8^th International Conference on Flow Analysis, 25.06.-29.06.2000, Warschau, p. 87). Nachteilig ist die geringe Meßempfindlichkeit der vorgeschlagenen Meßanordnungen, die nur eine untere Bestimmungsgrenze von angegebenen 30 µM erlaubt. Die Anwendung der Dialyse als Trennschritt verbessert die Selektivität, ist jedoch nicht in der Lage, die Interferenz durch niedermolekulare, redoxaktive und komplexierende Substanzen auszuschalten. Höhere Meßempfindlichkeiten sind nur durch die Einstellung langer Verweilzeiten und erhöhter Temperaturen erreichbar.

Den mit einem Dialyse- bzw. Gasdiffusionsschritt arbeitenden Sensoren bzw. Bestimmungsverfahren gemeinsam ist die hohe Temperaturabhängigkeit des Meßsig nals und die Störanfälligkeit gegenüber dem Umgebungslicht. Durch lange Ansprech zeiten oder Verweilzeiten, verbunden mit einer relativ großen Dispersion injizierter Probenlösungszonen wird der Einsatz als Detektor in Durchflußmeßanordnungen ein geschränkt.

Deshalb ist es sinnvoll, einen empfindlicheren Lichtdetektor in einer thermo statierten Dünnschichtgasdialysezelle geringer hydrodynamischer Dispersion so zu in tegrieren, daß eine vom Umgebungslicht und Temperaturschwankungen nicht beein flußte Detektoranordnung resultiert.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, eine Durchflußmeßzelle zur selek tiven, empfindlichen und langzeitstabilen Chemilumineszenzdetektion von Wasser stoffperoxid zu schaffen, der in einer kompakten Anordnung einen empfindlichen Licht detektor, wie z. B. einen Sekundärelektronenvervielfacher mit einer miniaturisierten Dünnschichtgasdialysezelle so verbindet, daß weitgehende Abschirmung gegenüber dem Außenlicht und eine stabile Thermostatierung der gesamten Detektoranordnung re sultiert.

Erfindungsgemäß wird das gemäß den Merkmalen des Anspruches 1 erreicht.

Eine Durchflußmeßzelle zur selektiven, empfindlichen und langzeitstabilen Che milumineszenzdetektion von Wasserstoffperoxid, in der ein Sekundärelektronenver vielfacher, vorzugsweise in kompakter Anordnung mit einem Photonenzählsystem ver bunden, in einer kompakten Detektoranordnung über ein Detektorfenster direkt mit der Akzeptorkammer einer thermostatierten und durch eine lichtundurchlässige Ummantel ung oder durch ihr eigenes lichtundurchlässiges Material gegen Außenlicht abge schirmten Zweikammerzelle in der Weise verbunden ist, daß die Fläche der die Akzep torkammer von der Donorkammer trennenden, vorzugsweise gaspermeablen Membran vom Detektorfenster optisch weitgehend erfaßt wird, die Donorkammer eine dünne Flüssigkeitsschicht vorzugsweise mit einer Dicke von weniger als 0.2 mm ausbildet und für das Einfüllen und Entfernen des Reagenzes bzw. der Probenlösung jeweils mindes tens eine Öffnung vorgesehen ist.

Eine weitere Ausführungsform sieht vor, an Stelle des Sekundärelektronenver vielfachers ein Lichtleitkabel über das Detektorfenster mit der Akzeptorkammer zu ver binden und so die optische Verbindung zu einem weiter entfernten Sekundärelektronen vervielfacher herzustellen.

Es ist zweckmäßig, daß die Ummantelung auch wärmeleitend ist und ein Pel tierelement in der Weise enthält, daß die durchströmten Teile der Anordnung auf eine konstante Temperatur einstellbar sind.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß von einer hohlen und wärmeleitende Ummantelung durch zwei Anschlußöffnungen für den Zufluß und den Ausfluß einer Thermostatierflüssigkeit über einen Flüssigkeitsstrom die Verbindung zu einem Umlaufthermostaten hergestellt ist.

Für die selektive Wasserstoffperoxiddetektion ist es zweckmäßig, durch dünne Membranen, vorzugsweise aus mikroporösen und ausreichend hydrophoben Schichten oder aus einer mit einem geeigneten Lösungsmittel gefüllten Porenstruktur Donor- und Akzeptorkammer voneinander zu trennen.

Eine andere Ausführungsform sieht für die Zu- und Abführung von Proben- und Reagenzlösungen vorzugsweise dispersionsarme Zu- und Abläufe zu Donor- und zur Akzeptorkammer vor.

Eine weitere Ausführungsform sieht vor, den Sekundärelektronenvervielfacher mit einer thermoelektrische Kühlung oder einer Umlaufkühlung mit verschiedenen Kühlmedien zu versehen, um eine weitere Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnis ses erzielen.

Die Erfindung soll in Ausführungsbeispielen anhand von Zeichnungen erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 eine Durchflußmeßzelle zur selektiven, empfindlichen und langzeitsta bilen Chemilumineszenzdetektion von Wasserstoffperoxid;

Fig. 2 eine Durchflußmeßzelle mit einem über ein Lichtleitkabel angekoppelten Sekundärelektronenvervielfacher;

Fig. 3 eine Durchflußmeßzelle mit einem in die Ummantelung eingelassenen Peltierelement;

Fig. 4 eine Durchflußmeßzelle mit externer Thermostatierung;

Fig. 5 eine Durchflußmeßzelle mit kleinen Kammervolumen und dispersions armen Zu- und Abläufen.

Die in Fig. 1 gezeigte Durchflußmeßzelle besteht aus einer gegen Außenlicht abge schirmten Zweikammerzelle ZKZ, die durch thermostatierte und lichtundurchlässige Ummantelung UM umgeben ist. Die Akzeptorkammer A und die Donorkammer D sind durch eine Membran M, z. B. eine gaspermeable Membran voneinander getrennt. Die Akzeptorkammer ist über ein lichtdurchlässiges Detektorfenster F mit einem Sekun därelektronenvervielfacher SEV so verbunden, daß die mit Donorlösung kontak tierte gaspermeable Membran optisch weitgehend erfasst wird. Der Sekundärelektro nenvervielfacher ist in kompakter Weise mit einem Photonenzählsystem PhZ, das einen Meßverstärker V mit einschließt, verbunden. Das Photonenzählsystem ermöglicht den direkten Zugang zu einem über mehrere, bis zu 6 Größenordnungen gehenden Meßbe reich. Für das Einfüllen und Entfernen des als Akzeptorlösung dienenden Reagenzes dient die Öffnung RÖ. Weitere Öffnungen PÖ1 und PÖ2 dienen der Zu- und Abfüh rung der Probenlösung. Die Donorkammer bildet eine dünne Schicht von vorzugsweise kleiner 0,2 mm aus, um das Detektorvolumen und die Ausspülzeiten ausreichend klein, vorzugsweise kleiner 50 µl zu halten, so daß sich die Durchflußmeßzelle für den Einsatz, z. B. in Durchflußanalysensystemen, wie z. B. zur Fließinjektionsanalyse (Flow Injection Analysis) oder der Flüssigchromatographie eignet. Die Probenlösung fließt über die Eingangsöffnung PÖ1 in die Donorkammer D und entweder sofort durch die Ausgangsöffnung wieder nach außen oder wird in der Donorkammer für eine definierte Zeit angehalten. Das in der Probenlösung enthaltene Wasserstoffperoxid diffundiert zum Beispiel durch die gaspermeable Membran direkt in die in der Akzeptorkammer enthaltene Reagenzlösung, die für die Auslösung und Aufrechterhaltung einer Lichtemission geeignete, in wäßrigem Medium gelöste Substanzen enthält. Donor- und Akzeptorkammer sind in einem inerten Material, vorzugsweise einem geeigneten Kunststoff, wie z. B. Polytetrafluorethylen, KelF oder Plexiglas eingearbeitet.

Im Ausführungsbeispiel der Fig. 2 ist der Sekundärelektronenvervielfacher über ein einem Lichtleitkabel LLK und das Detektorfenster F mit der Akzeptorkammer ver bunden. Das vorzugsweise an die Geometrie der Akzeptorkammer A angepaßte Licht leitkabel leitet das durch eine Indikatorreaktion erzeugte Chemilumineszenzlicht zum Sekundärelektronenvervielfacher SEV. In dieser Ausführungsform der Durchflußmeß zelle ist es deshalb möglich, die bei der Chemilumineszenzreaktion emittierten Licht quanten in größerer Entfernung vom Meßort zu detektieren.

Auch im Ausführungsbeispiel der Fig. 3 weißt die Durchflußmeßzelle prinzipiell den gleichen Aufbau wie in Fig. 1 auf. In dieser Ausführungsform wird durch den Ein bau eines geregelten und mit einem Temperaturfühler kombinierten Peltierelementes PE in die Ummantelung UM und das Material der Donorkammer D die Einstellung der Temperatur in der Donor- und in der Akzeptorkammer thermoelektrisch eingestellt.

Die Fig. 4 verdeutlicht ein Ausführungsbeispiel, bei dem die Ummmantelung miteinander verbundene Hohlräume HR enthält, die über die Anschlußstutzen TE und TA und entsprechende, vorzugsweise als Schlauch ausgeführte Flüssigkeitsleitungen mit einem Umlaufthermostaten verbunden sind, über die eine geeignete Wärmeaustauscher flüssigkeit mit transportiert wird.

Auch im Ausführungsbeispiel der Fig. 5 weist die Durchflußzelle prinzipiell den gleichen Aufbau wie die Fig. 1 gezeigte auf. Der Unterschied besteht darin, daß durch die Anschlußstutzen ZA und AA das Reagenz zu und abgeführt sowie kontinuierlich durch die Akzeptorkammer transportiert wird und dadurch ständig erneuert wird, wodurch die Reproduzierbarkeit und Stabilität der Chemilumineszenzerzeugung und damit Meßsignalstabilität der Durchflußmeßzelle wesentlich verbessert wird.

Liste der Bezugszeichen

ZKZ Zweikammerzelle
UM Ummantelung
A Akzeptorkammer
D Donorkammer
M Membran
F Detektorfenster
SEV Sekundärelektronenvervielfacher
PhZ Photonenzählsystem
V Meßverstärker
RÖ Öffnung zur Akzeptorkammer
PÖ1, PÖ2 Öffnungen zur Donorkammer
LLK Lichtleitkammer
PE Peltierelement
HR Hohlräume in der Ummantelung
TE, TA Anschlußstutzen für Thermostatierflüssigkeit
ZA, AA Anschlußstutzen zur Zu- und Abführung des Reagenzes

Claims

1. Durchflußmeßzelle zur selektiven, empfindlichen und langzeitstabilen Chemilumineszenzdetektion von Wasserstoffperoxid, in der ein Sekundär elektronenvervielfacher, vorzugsweise in kompakter Anordnung mit einem Photonenzählsystem verbunden, in einer kompakten Detektoranordnung über ein Detektorfenster direkt mit der Akzeptorkammer einer thermostatierten und durch eine lichtundurchlässige Ummantelung oder durch ihr eigenes lichtun durchlässiges Material gegen Außenlicht abgeschirmten Zweikammerzelle in der Weise verbunden ist, daß die Fläche der die Akzeptorkammer von der Donorkammer trennenden, vorzugsweise gaspermeablen Membran vom Detektorfenster optisch weitgehend erfaßt wird, die Donorkammer eine dünne Flüssigkeitsschicht vorzugsweise mit einer Dicke von weniger als 0.2 mm ausbildet und für das Einfüllen und Entfernen des Reagenzes und der Probenlösung jeweils mindestens eine Öffnung vorgesehen ist.

2. Durchflußmeßzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an Stelle des Sekundärelektronenvervielfachers ein Lichtleitkabel über das De tektorfenster mit der Akzeptorkammer verbunden und so die Verbindung zu einem weiter entfernten Sekundärelektronenvervielfacher hergestellt ist.

3. Durchflußmeßzelle nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtundurchlässige Ummantelung auch wärme leitend ist und vorzugsweise ein geregeltes Peltierelement in der Weise enthält, daß die durchströmten Teile der Anordnung auf eine konstante Temperatur einstellbar sind.

4. Durchflußmeßzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß von einer hohl und wärmeleitend ausgeführten Ummantelung durch zwei Anschlußöffnungen für den Zufluß und den Ausfluß einer Ther mostatierflüssigkeit über einen Flüssigkeitsstrom die Verbindung zu einem Umlaufthermostaten hergestellt ist.

5. Durchflußmeßzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß für die selektive Wasserstoffperoxiddetektion Donor- und Ak zeptorkammer durch eine Membran, vorzugsweise aus dünnen mikroporösen und ausreichend hydrophoben Schichten oder aus einer mit einem geeigneten Lösungsmittel gefüllten Porenstruktur voneinander getrennt sind.

6. Durchflußmeßzelle nach einem der Ansprüche 1 bis S. dadurch gekenn zeichnet, daß für die Zu- und Abführung von Proben- und Reagenzlösungen vorzugsweise dispersionsarme Zu- und Abläufe zu Donor- und zur Akzep torkammer vorgesehen sind.

7. Durchflußmeßzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß der Sekundärelektronenvervielfacher SEV mit einer thermo elektrische Kühlung oder einer Umlaufkühlung mit verschiedenen Kühlme dien versehen ist.