KR20060019700A - 모든 세균의 감별을 위한 세균 특이적, 속 특이적 및 종특이적 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 진단 키트, 및이를 이용한 검출 방법 - Google Patents
모든 세균의 감별을 위한 세균 특이적, 속 특이적 및 종특이적 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 진단 키트, 및이를 이용한 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세균의 검출 및 감별 진단을 위해 필요한 유전정보인 세균 특이적 뉴클레오티드(nucleotide), 속(genus) 특이적 뉴클레오티드, 종(species) 특이적 뉴클레오티드로 여러 형태의 샘플 또는 검체에서 세균을 동정하는, Bacterial Digitalcode System(BaDis) 라 불리 우는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로 본 발명은 병원성 감염질환 세균, 식중독 유발 세균, 생물의약품 오염 유발 세균 및 환경오염 세균 등 세균의 존재 유무 및 속과 종 감별을 위해 세균의 23S rDNA 유전자등의 표적 염기 서열로부터 고안된 세균 특이적(bacterial specific), 속 특이적(genus specific) 및 종 특이적(species specific) 올리고뉴클레오티드, 이를 프라이머로 이용하여 검출하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'이라 한다) 키트 및 이를 프로브로 포함하는 마이크로어레이, 그리고 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
Description
도 1은 본 발명의 전체 흐름도를 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 세균을 생물학적 시료에서 증폭하는데 사용되는 표적 부위와 일부 프라이머 및 프로브의 위치를 보여주는 도면이다.
도 3은 세균 특이적 프라이머 디자인을 위한 각 속의 23S rDNA 유전자에서의 보존적인 염기서열의 다중 서열 정렬 결과 중 일부 도면이다.
도 4는 세균 특이적 염기 서열을 이용하여 디자인한 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부를 확인한 도면이다.
도 5a는 마이코박테리아의 속 특이적 프라이머 디자인을 위한 마이코박테리아 각 종의 23S rDNA 유전자의 보존적인 염기서열의 다중 서열 정렬 도면이다.
도 5b는 스타필로코커스의 속 특이적 프라이머 디자인을 위한 스타필로코커스 각 종의 23S rDNA 유전자의 보존적인 염기서열의 다중 서열 정렬 도면이다.
도 6a부터 6d는 에어로모나스, 엔테로코커스, 마이코박테리아 및 스트렙토코커스의 속 특이적 염기 서열로 디자인한 각각의 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부 를 확인한 도면이다.
도 7a는 세균의 존재를 감별하기 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이고, 7b와 7c는 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응에 대한 화상 분석 결과와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과이다.
도 8a는 세균의 존재 유무 및 원인균 속을 감별하기 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이고, 8b는 스트렙토코커스 속 특이적 프로브의 혼성화 반응에 대한 화상 분석 결과와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과이다.
도 9a는 세균의 존재 유무 및 원인균 속과 종을 동시에 감별하기 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이고, 9b는 마이코박테리아 속 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스 종 특이적 프로브의 혼성화 반응에 대한 화상 분석 결과와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과이고, 9c는 마이코플라스마 속 및 마이코플라스마 뉴모니에 종 특이적 프로브의 혼성화 반응에 대한 화상 분석 결과와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과이다.
본 발명은 세균의 검출 및 감별 진단에 유용한 올리고뉴클레오티드와 이를 이용한 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 세균의 감별을 위해 23S rDNA 또는 ITS 유전자의 표적 염기 서열로부터 고안된 세균 특이적, 속 특이적 및 종 특이적인 올리고뉴클레오티드, 이를 프라이머로 이용하는 진단 키트, 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
배양법과 생화학적 분석법(biochemical method)등의 전통적인 세균 동정 방법은 소요되는 기간이 매우 길고 분석이 까다로우며 번거로운 조작을 요구한다(J Clin Microbiology, 12:3674-3679(1998)). 이에 최근 10년 동안 미생물의 검출을 위한 기술은 상당히 발전하여 항체(antibody)와 형광(fluorescence)을 이용한 방법, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 등 여러 가지 방법이 있으나 이는 미량의 세균인 경우는 검출이 어렵고, 많은 비용과 시간, 숙련된 노동력을 필요로 하는 단점이 있다. 이에 빠르고 신뢰성 있는 방법이 요구되는데 분자 생물학적 방법에 기초한 핵산 증폭 방법으로 매우 민감하고 특이적인 PCR과 DNA chip이 최근 들어 각광을 받고 있다. PCR(polymerase chain reaction)은 아주 적은 양의 DNA로 특정 영역을 기하급수적으로 증폭시키는 효율적인 방법으로, 검출효율이 높아서 미량의 미생물의 분자생물학적 검출에 광범위하게 적용되고 있다. DNA 칩은 프로브 혼성화 원리를 이용한 방법으로써 수십 개부터 수만개의 아주 적은 양의 유전물질을 고형지지체에 고밀도로 붙일 수 있게 되어 동시에 많은 유전자를 분석할 수 있고, 이는 유전자형 동정, 돌연변이 검출과 유전자 발현 등의 검사에 아주 유용한 기술로 알려져 있다. 이러한 분자생물학적 진단 기술을 이용한 유전자형 동정 방법은 증식 속도가 매우 느리거나 배양조건이 까다로운 세균 또는 알려져 있지 않은 세균 등을 한번에 임상 검체에서 빠르고 민감하게 검출할 수 있는 기술적으로 매우 진보적인 방법이다.
여러 문헌에서 감염질환의 원인균을 동정하기 위해 널리 사용되고 있는 유전자는 세균에서 매우 보존적인 공통서열로 나타나는 16S rDNA를 기초로 하고 있다(J Microbiol Methods, 55:541-555(2003), Pediatrics, 95:165-169(1995), Appl Environ Microbiol, 64:795-799(1998), J Clin Microbiol, 32:335-351(1994), Microbiol, 148:257-266(2002)). 이는 염기 서열 변이 영역이 작아서 일부 특정 세균의 감별이 어려운 한계가 있다. 최근에는 염기 서열 변이가 많은 과변이 영역(hypervariable region)을 보유한 ITS(internal transcribed spacer region, 내부전사지역)를 이용하거나(J Clin Microbiol, 38:4080-4085(2000), Microbiol, 142:3-16(1996), GENE, 238:241-252(1999), FEMS Microbiol Letters, 187:167-173(2000)), 아직 많은 염기서열이 밝혀지지 않은 23S rDNA(J Clin Microbiol, 38:781-788(2000), J Microbiol Methods, 53:245-252(2003)) 유전자를 기초로 세균을 검출하는 방법이 있으나, 현재까지로 기술로는 서로 다른 몇몇 세균을 검출하거나 한 속에서 몇 종의 원인균 만을 검출하는 방법이라는 한계가 있다. 한 예로 세포 조직이나 전혈 등으로 생산하는 생물의약품등에 오염을 유발하는 세균은 다양한 속(genus)에 의해 발생하므로 이러한 모든 세균을 검출할 수 있는 방법이 필요한데 이를 가능하게 할 수 있는 검출 방법 중 하나가 DNA chip이다.
세균을 검출 및 감별 진단하는 방법들의 한계는 임상 검체나 환경 등에서 분리한 검체에서 미지의 세균을 동정하거나 여러 종류를 동시에 검출하는 방법이라 이러한 문제점을 극복하기 위해 본 발명에서는 세균 특이적과 속 특이적 프라이머나 프로브 디자인이 용이한 23S rDNA와 종 특이적과 아종 특이적(subspecies specific) 프라이머나 프로브 디자인이 용이한 ITS에서 프라이머나 프로브를 디자인하였다. 1차적으로 모든 세균의 23S rDNA를 증폭 가능한 세균 특이적 프라이머 및 프로브를 고안하였다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 세균의 감별을 위해 1차 스크리닝에 의한 대부분의 세균의 존재 유무를 확인하기 위한 23S rDNA 유전자 유래의 세균 특이적 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 이후 2차 스크리닝에 의해 23S rDNA 유전자 유래의 원인균 속 특이적 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 3차 스크리닝에 의해 ITS 유래의 종 특이적과 아종 특이적 올리고뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 프라이머 및 프로브로 포함하는 세균의 감별 진단용 PCR 키트 및 마이크로어레이를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 PCR 키트 및 마이크로어레이를 이용한 세균의 감별 및 검출 방법을 제공하는데 있다. 이는 번거로운 조작 및 진단 비용의 절감과 배양이 어려워 검출 및 진단 방법이 없는 세균에 대해서도 진단 할 수 있으며, 추후 원인균 종의 정확한 검출을 더욱 쉽게 하고, 또한 진단의 지연 및 오진으로 인한 항생제의 오남용을 예방할 수 있는 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 세균의 감별을 위한 신규 올리고뉴클레오티드 의 고안을 위해, 아직 유전정보가 밝혀져 있지 않은 다수 세균의 23S rDNA 유전자의 염기 서열을 분석함으로써 상기 언급된 세균의 정확한 감별에 매우 특이적이고 민감한 검출 방법을 개발할 수 있는 근거가 되는, 표적 DNA 서열들을 제공하는데 있다.
Bacterial Digitalcode System(BaDis)이란 세균 특이적, 속 특이적, 종 특이적 및 아종 특이적 프라이머나 프로브를 모두 포함하거나 이 중 일부를 포함하는 세균 동정 및 감별 진단 시스템이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 37 중 어느 하나의 염기서열 및 그 중 일부를 포함하는 세균의 감별을 위한 23S rDNA 유전자의 표적 DNA를 제공한다.
본 발명에서 서열번호 1 내지 37은 임상적으로 중요하면서 아직 23S rDNA의 염기서열이 밝혀지지 않은 세균 중 37종의 염기서열을 밝힌 것이다. 본 발명의 23S rDNA 유전자는 세균의 감별을 위한 프라이머나 프로브를 고안하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 38 내지 135 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 세균의 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이로써 세균의 존재 유무를 감별할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 136 내지 1484 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 세균의 원인균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이로써 세균의 원인균 속 특이적 감별을 할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 새롭게 염기서열을 밝힌 37종의 유전정보를 포함한 세균의 23S rDNA 유전자의 다중 서열 정렬(multiple alignment)에 의거하여 고안하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 세균의 존재 유무와 원인균 속 특이적인 감별을 위한 특이적 핵산 분자 증폭 방법에 유용한 프라이머 서열로 사용될 수 있고, 또한 혼성화 방법에 유용한 프로브 서열로도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 세균의 세균 특이적 및 원인균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세균 증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 이러한 프라이머 세트는 본 발명의 PCR 키트는 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 세균 특이적 및 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세균 감별용 프로브 세트를 제공한다. 이러한 프로브 세트는 본 발명의 마이크로어레이를 만드는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 세균 특이적 및 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 방사성(radioactive) 또는 비방사성(non-radioactive) 표지될 수 있으며, 비방사성 표지는 통상의 바이오틴(biotin), Dig(digoxigenin), FRET(fluorescence resonance energy transfer), 형광(Cy5, Cy3 등) 표지 등을 포함한다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있으며, 별도의 표적 DNA 증폭을 위한 프라이머가 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 및 본 발명의 원인균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트를 제공한다.
본 발명의 PCR 키트에 있어서, 바람직하게는 원인균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서 원인균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드는 종래 당업계에서 원인균 종 특이적 프라이머로 사용되오던 어떤 올리고뉴클레오티드도 사용할 수 있다.
본 발명의 PCR 키트는 본 발명의 프라이머들외에 DNA 폴리머라제, 4 dNTPs(ATP, GTP, CTP, TTP) 혼합물, PCR 반응버퍼 및 사용설명서 등을 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 폴리머라제의 종류에 따라 taq DNA polymerase-based amplification, klenow fragment-based amplification, Phi29 polymerase-based amplification 또는 Helicase-dependent amplification 등 핵산증폭이 가능하다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 및 본 발명의 원인균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크 로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 바람직하게는 원인균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서 원인균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드는 종래 당업계에서 원인균 종 특이적 프로브로 사용되오던 어떤 올리고뉴클레오티드도 사용할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 프로브는 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA) 같은 전통적인 핵산뿐만아니라, 펩타이드뉴클레오티드(PNA), 락크드뉴클레오티드(LNA) 및 디-헥시톨뉴클레오티드(HNA)에서 선택된 핵산유사체도 될 수 있다. 상기 핵산 유사체는 핵산분해효소(nuclease)등 효소에 안정하고, 구조상으로 염기서열에 매우 특이적 결합을 하며, 열에 안정적인 장점이 있다.
본 발명의 PCR 키트와 마이크로어레이에서, 상기 프라이머 및 프로브는 센스(sense) 또한 안티센스(antisense)용으로 제작될 수 있다. 따라서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 서열번호들의 염기서열 또는 이에 상보적인 서열을 갖을 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘, 젤(gel), 나노(nano) 재료, 세라믹, 금속재료, 광섬유 또는 이들을 조합하여 만들어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 마이크로어레이는 당업계에 알려진 통상의 핀 마이크로어레이(pin microarray)(Microarray printing technology, Don Rose, Ph.D., Cartesian Technologies, Inc., Anal Biochem, 320(2):281-91(2003)), 잉크젯(ink jet)(Nat Biotech, 18;438-441(2000), Bioconjug Chem,13(1);97-103(2002)), 포토리소그래피(photolithography)(Cur Opinion Chem Biol, 2;404-410(1998), Nature genetics supplement, 21:20-24(1999)), 또는 전기어레이(electric array)(Ann Biomed Eng. 20(4):423-37(1992), Psychiatric Genetics, 12;181-192(2002)) 방법으로 제작될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이는 진단키트의 형태로 제공될 때, 본 발명의 마이크로어레이외에 혼성화 반응용액, 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및 사용설명서 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 제 6항에 따른 PCR 키트를 이용하여 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 DNA를 전기영동 장치에 의해 분석하는 단계를 포함하는 세균 감별 및 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 세균 감별 및 검출 방법에 있어서, 상기 핵산 증폭 단계는 일반적인 PCR 반응뿐만 아니라, Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응과 같은 변형된 PCR 반응을 이용할 수도 있다. 이러한 방법들은 검출 효율이 훨씬 높고, RT-PCR은 활성 감염의 표지로써 전사된 DNA의 검출이 가능하며, In-Situ PCR은 조 직내 미생물에 대한 실험이 가능하고, Micro PCR은 극소량의 DNA 또는 RNA를 튜브 또는 capillary 상에서 증폭과정을 거치고, Lab-on a chip PCR은 한번에 DNA 추출부터 PCR을 거쳐 전기영동 결과와 정량까지도 가능한 장점 등이 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 핵산증폭단계를 거치거나 또는 거치지 않고 타이라미드 신호 증폭(tyramide signal amplification)이나 금 나노입자 프로브(gold nanoparticle probe)와 라만-활성 염료(Raman-active dye)등을 이용한 신호 증폭(signal amplification) 반응을 시키는 단계, 상기 증폭된 DNA 및 RNA의 형광을 검출하는 단계를 포함하는 세균 감별 및 검출방법을 제공한다.
본 발명의 검출방법에서는 위의 핵산증폭단계를 거치거나 또는 거치지 않고 tyramide signal amplification(Nucleic Acids Res. 30;e4(2002))이나 gold nanoparticle probe와 Raman-active dye(Science, 297;1536-1540(2002))와 같은 signal amplification 반응을 이용할 수 있다. 이를 구체적으로 설명하면, 타이라미드 신호 증폭(tyramide signal amplification)은 조직 검체나 세포 등을 배양 후 조직 등에서 DNA 또는 RNA를 추출하고, PCR 반응을 시키고, 마이크로어레이에 혼성화시키고, 형광을 검출하는 단계를 거치며, 금 나노입자 프로브(gold nanoparticle probe)와 라만-활성 염료(Raman-active dye)등을 이용한 신호 증폭(signal amplification)은 DNA 또는 RNA를 추출하고, PCR 반응을 시키고, Raman-active 형광인 cy3 그룹으로 변형된 gold-nanoparticle을 프로브로 사용한 마이크로어레이에 혼성화하고, Raman spectrom에서 형광을 검출의 단계를 거친다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 제 8항에 따른 마이크로어레이상의 프로브와 혼성화시키는 단계, 및 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 세균 감별 및 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 세균 감별 및 검출 방법에서, 상기 시료는 혈액, 체액, 조직, 객담, 변, 뇨 또는 고름 등일 수 있으며, 핵산의 분리는 통상의 DNA 또는 RNA 분리방법이나 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, DNA 증폭은 통상의 PCR 방법으로 수행될 수 있으며, 검출 방법은 통상의 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동 분석 방법으로 수행하거나, 시그날 검출은 통상의 Cy5 또는 Cy3 등 형광 염료 결합 및 시그날 검출용 스캐너를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 아시네토박터 속(서열번호 136번에서 196번), 에어로모나스 속(서열번호 197번에서 216번), 바실러스 속(서열번호 217번에서 228번), 박테리오이드스 속(서열번호 229번에서 334번), 보데텔라 속(서열번호 335번에서 383번), 보렐리아 속(서열번호 384번에서 494번), 브루셀라 속(서열번호 495번에서 510번), 벌코데리아 속(서열번호 511번에서 527번), 켐필로박터 속(서열번호 528번에서 587번), 클라미디아 속(서열번호 588번에서 630번), 시트로박터 속(서열번호 631번에서 653번), 클로스트리디움 속(서열번호 654번에서 669번), 코리네박테리움 속(서열번호 670번에서 697번), 엔테로박터 속(서열번호 698번), 엔테로코커스 속(서열번호 699번에서 703번), 퓨조박테리움 속(서열번호 704번에서 725번), 헤모필 러스 속(서열번호 726번에서 730번), 헬리코박터 속(서열번호 731번에서 753번), 클렙시엘라 속(서열번호 754번에서 759번), 레지오넬라 속(서열번호 760번에서 819번), 리스테리아 속(서열번호 820번에서 853번), 모가넬라 속(서열번호 854번에서 871번), 마이코박테리움 속(서열번호 872번에서 880번), 마이코플라스마 속(서열번호 881번에서 891번), 네이세리아 속(서열번호 892번에서 963번), 펩토코커스 속(서열번호 964번에서 1082번), 플레시오모나스 속(서열번호 1083번에서 1130번), 폴피로모나스 속(서열번호 1131번에서 1220번), 프로피오니박테리움 속(서열번호 1221번에서 1224번), 프로비덴시아 속(서열번호 1225번에서 1237번), 슈도모나스 속(서열번호 1238번에서 1253번), 살모넬라 속(서열번호 1254번에서 1256번), 쉬겔라 속(서열번호 1257번에서 1267번), 스타필로코커스 속(서열번호 1268번에서 1286번), 스트렙토코커스 속(서열번호 1287번에서 1298번), 트리포네마 속(서열번호 1299번에서 1396번), 우레아플라스마 속(서열번호 1397번에서 1474번), 비브리오 속(서열번호 1475번에서 1478번) 및 예시니아 속(서열번호 1479번에서 1484번)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균을 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 세균 감별 및 검출방법을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 단일 검체로부터 여러 세균의 검출이 가능한 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 세균의 존재 유무를 감별하기 위한 세균 특이적 올리고뉴클레오티드, 원인균 속 특이적, 종 특이적 및 아종 특이적 감별을 위해 고안된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 하나의 염기서열 차이를 기본으로 하는 SBE(Single base extension), Sequencing, RFLP(Restriction fragment length polymorphism), REA(Restriction endonuclease analysis) 등을 이용한 세균의 감별 및 검출 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명은 세균의 존재 유무와 그 원인균 속을 정확하게 감별하는 방법에 관한 것으로, 세균의 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 이용한 유전자적 검출 방법으로 구성되며, 자세하게는 하기 단계로 구성된다 :
PCR 방법을 이용할 경우는
(ⅰ) 필요한 경우, 배양 또는 임상 검체 등에서 다중 핵산의 분리,
(ⅱ) 필요한 경우, 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 상기 세균의 표적 서열 또는 그 일부의 증폭 및 전기영동 분석,
마이크로어레이 방법을 이용할 경우는
(ⅰ) 필요한 경우, 배양 또는 임상 검체 등에서 다중 핵산의 분리,
(ⅱ) 필요한 경우, 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 상기 세균의 표적 서열 또는 그 일부의 증폭,
(ⅲ) 단계 (ⅰ) 및/또는 (ⅱ)에서 확보된 다중 핵산과, 표 2 내지 표 3에 나타낸 세균의 세균 특이적, 속 특이적 및 종 특이적 올리고뉴클레오티드 즉, 프로브 서열, 프로브 역서열 또는 프로브 상보 서열로 반응할 수 있는 하나 이상의 프로브의 혼성화,
(ⅳ) 단계 (ⅲ)에서 형성된 하이브리드의 검출,
(ⅴ) 단계 (ⅳ)에서 얻은 혼성화 시그날로부터, 상기 세균의 감염 가능성에 관한 추정.
본 발명자들은 세균의 존재 유무와 속 특이적, 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드의 고안을 위해, 세균의 23S rDNA 유전자와 ITS의 염기 서열을 분석함으로써 상기 언급된 세균의 존재 유무 및 속 특이적, 종 특이적 감별을 위한 매우 특이적이며 민감한 증폭 방법과 혼성화 검정법을 개발할 수 있는 근거가 되는 서열들을 획득할 수 있었다. 또한, 본 발명에서는 임상적으로 중요한 새로운 37종의 세균의 23S rDNA 유전자의 염기 서열을 분석함으로써 이전에 밝혀지지 않은 보다 많은 세균의 속 특이적 감별을 위한 매우 특이적이고 민감한 검출을 허용하는 프라이머 및 프로브의 고안이 더욱 가능해졌다.
도 1은 본 발명의 전체 흐름도를 간략하게 나타낸 도면이다. 도 1a는 본 발명의 세균 동정 시스템인 "BaDis" 를 이용하여 세균 특이적, 속 특이적 및 종 특이적 프라이머와 프로브를 디자인 한 후 배양 및 임상검체에서 DNA를 추출하여 PCR 등의 핵산증폭방법이나 마이크로어레이 방법으로 세균의 존재 유무뿐만 아니라 속과 종의 유전자형 동정(genotyping)이 순차적으로 또는 한번에 가능하도록 함을 보여주는 흐름도이다.
도 1b는 NCBI에서 추출한 유전체 데이터와 자체 보유한 유전자 데이터에서 대상 유전자 영역만을 추출하여 다중서열정열을 수행한다. ClustalW를 이용하여 다중서열정열을 수행하며, 유사성의 임계값을 95% 이상으로 설정하여 일치서열을 획득한다. 일치서열을 이용하여 미생물 전체 또는 속(genus)을 감별할 수 있는 보존된 영역을 추출하며, 보존된 영역은 GC의 비율과 열역학적인 문제점을 고려한 후 BLAST 검색을 통해 미생물 전체를 감별할 수 있는 포괄적인 프로브인지 또는 속(genus)을 감별할 수 있는 프로브인지 확인하며, 최종적으로 프로브 후보군으로 선정함을 보여주는 흐름도이다.
도 2는 세균을 생물학적 시료에서 증폭하는데 사용되는 표적 부위와 일부 프라이머 및 프로브의 위치를 보여주는 도면이다. 세균의 유전자 구조에서 거의 모든 세균에 공통적인 부위인 16S rDNA 이외에 아직 염기서열이 많이 밝혀져 있지 않은 23S rDNA 유전자에서 대부분의 세균 특이적 및 속 특이적 프라이머와 프로브를 디자인 하였고, 23S rDNA 유전자에서도 구분하기 어려운 세균은 과변이 영역인 ITS 유전자와의 조합으로 속 특이적 및 종 특이적 염기서열을 디자인하였다.
표 1은 세균 중 새로 분석한 37종의 23S rDNA 염기 서열로 서열 번호 1 내지 37에 해당한다. 또한, 본 발명의 세균의 존재 유무와 속 특이적 감별을 위한 구체적 프라이머 및 프로브 선정은 23S rDNA 염기 서열의 다중 서열 정렬에 의거하여 고안하였다. 공개적으로 사용가능한 clustalw를 사용하여 다중서열정렬을 수행하는데 일치서열은 다중서열에서 95% 이상이 되는 영역만을 추출하며, 95% 이하가 되는 영역은 'N'으로 표현하도록 하여 전체적인 일치서열을 구하였다. 도 3은 본 발명의 바람직한 실시예인 세균의 존재 유무를 감별하는 프라이머 선정을 위한 병원균의 23S rDNA 염기 서열의 다중 서열 정렬에 해당하는 도면으로, 본 발명의 세균 특이적 올리고뉴클레오티드 서열은 상자로 표시한 모든 세균들에 보존적인 염기 서열 지역에서 고안하였다. 도 4는 본 발명의 세균 특이적 염기 서열을 이용하여 디자인한 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부를 확인한 도면이다. 도 5는 본 발명의 바람 직한 실시예인 세균의 속 특이적 프라이머 선정을 위한 원인균 속의 본 발명에서 새로이 밝힌 23S rDNA 염기 서열과 알려져 있는 염기서열로 다중 서열 정렬한 도면으로, 도 5a는 마이코박테리아 속에만 특이적인 올리고뉴클레오티드 서열이고, 도 5b는 스타필로코커스 속에만 특이적인 올리고뉴클레오티드 서열로 프라이머 및 프로브를 고안하였다.
PCR 방법의 바람직한 구현 예에서 본 발명은, 단계 (ⅱ)에서 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 세균의 존재 유무 감별을 위해 PCR 증폭으로 확인하였다. 실시 예 3에 표기된 세균 증폭용 프라이머를 이용하여 표준 균주로 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조성은 100 mM KCl, 20 mM Tris HCl (pH 9.0), 1% Triton X-100, 10 mM deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dTTP, and dCTP), 1.5 mM MgCl2, 각 1쌍의 프라이머 (각각 10 pmole), 1 U Taq polymerase (QIAGEN, USA)와 주형 DNA 4 ㎕를 포함하여 전체 반응액 25 ㎕가 되도록 하고, PCR 반응 조건은 94℃에서 3분간 충분히 변성시킨 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 30초, 72℃에서 2분씩 30회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다.
도 4의 (a)부터 (r)은 세균의 존재 유무를 확인하기 위해 16S rDNA에서 고안된 순방향의 프라이머인 16S-1387F와 도면 순서대로 본 발명의 23S rDNA에서 고안한 역방향의 프라이머(서열 번호 42, 46, 48, 49, 54, 64, 70, 90, 91, 93, 94, 99, 105, 115, 117, 120, 122, 132)에 의한 세균의 23S rDNA 표적 서열의 증폭 여부를 확인한 도면으로, 모든 도면의 검체 1은 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 2는 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 3은 박테로이즈 폴시투스(Bacteroides forsythus), 4는 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 5는 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophilia), 6은 모가넬라 모가니(Morganella morganii), 7은 폴피로모나스 아삭카로리티카(Porphyromanas asaccharolytica), 8은 프로테우스 미라비리스(Proteus mirabilis), 9는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 10은 마이코플라스마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)에 대한 각각의 PCR 증폭 산물을 확인한 도면이다.
또한, 바람직한 구현 예에서 본 발명은, 단계 (ⅱ)에서 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 세균의 원인균 속 별 PCR 증폭 산물을 확인하였다. 실시 예 3에 표기된 각 세균의 속 특이적 증폭용 프라이머를 이용하여 표준 균주로 PCR을 수행하였다. PCR 반응 조성은 100 mM KCl, 20 mM Tris HCl (pH 9.0), 1% Triton X-100, 10 mM deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dTTP, and dCTP), 1.5 mM MgCl2, 각 1쌍의 프라이머 (각각 10 pmole), 1 U Taq polymerase (QIAGEN, USA)와 주형 DNA 4 ㎕를 포함하여 전체 반응액 25 ㎕가 되도록 하고, PCR 반응 조건은 94℃에서 3분간 충분히 변성시킨 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 30초, 72℃에서 2분씩 30회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다.
도 6a는 에어로모나스 속 특이적 프라이머인 서열번호 199과 207의 프라이머 쌍에 의한 에어로모나스 속의 23S rDNA 표적 서열의 증폭 여부를 확인한 도면으로, 1번은 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 2번은 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 3번은 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi), 4번은 마이코플라스마 팔코니스(Mycobacterium falconis), 5번은 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 6번은 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis), 7번은 Human blood DNA이고 8번은 Hepatitis B virus DNA를 주형으로 하여 에어로모나스 속 특이적인 752bp 크기의 PCR 증폭 산물 확인 도면이다. 도 6b는 엔테로코커스 속 특이적 프라이머인 서열번호 699과 701의 프라이머 쌍에 의한 엔테로코커스 속의 23S rDNA 표적 서열의 증폭 여부를 확인한 도면으로, 1번은 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis), 2번은 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 3번은 엔테로코커스 히레(Enterococcus hirae), 4번은 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 5번은 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi), 6번은 마이코플라스마 팔코니스(Mycobacterium falconis), 7번은 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 8번은 Human blood DNA이고 9번은 Hepatitis B virus DNA를 주형으로 하여 엔테로코커스 속 특이적인 599bp 크기의 PCR 증폭 산물 확인 도면이다. 도 6c는 마이코박테리아 속 특이적 프라이머인 서열번호 875과 880의 프라이머 쌍에 의한 마이코박테리아 속의 23S rDNA 표적 서열의 증폭 여부를 확인한 도면으로, 1번은 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi), 2번은 마이코박테리움 플라비센스(Mycobacterium flavescence), 3번은 마이코박테리움 시미에(Mycobacterium simiae), 4번은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 5번은 에어로모나스 하이 드로필라(Aeromonas hydrophila), 6번은 마이코플라스마 팔코니스(Mycobacterium falconis), 7번은 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 8번은 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis), 9번은 Human blood DNA이고 10번은 Hepatitis B virus DNA를 주형으로 하여 마이코박테리아 속 특이적인 962bp 크기의 PCR 증폭 산물 확인 도면이다. 도 6d는 스트렙토코커스 속 특이적 프라이머인 서열번호 1289과 1291의 프라이머 쌍에 의한 스트렙토코커스 속의 23S rDNA 표적 서열의 증폭 여부를 확인한 도면으로, 1번은 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 2번은 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 3번은 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 4번은 마이코플라스마 팔코니스(Mycobacterium falconis), 5번은 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi), 6번은 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis), 7번은 Human blood DNA이고 8번은 Hepatitis B virus DNA를 주형으로 하여 마이코박테리아 속 특이적인 804bp 크기의 PCR 증폭 산물 확인 도면이다.
마이크로어레이의 바람직한 구현 예에서 본 발명은, 단계 (ⅲ)에서 지지체를 구성하고 있는 프로브 구성의 다양성과 하나 이상의 프로브들의 조합인 것을 특징으로 한다. 보다 자세하게는, 동시에 세균의 존재 유무 및 원인균 속을 검출할 수 있는 동일한 혼성화 및 세척 조건하에서, 상기 프로브들이 그들의 표적 부위들에 동시에 혼성화하도록 최적화된 것을 특징으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 지지체에 부착된 세균의 존재 유무와 원인균 속 및 종의 감별을 위한 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이는 단 1 회의 실험으로 하나의 검체로부터 동시에 세균의 존재 유무와 원인균 속 및 종의 감별이 가능한 신속하고 정확한 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에서 사용된 '프로브' 라는 용어는 세균의 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 말한다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 두 가닥 중 어느 하나와 혼성화되어야 하므로 상기 서열번호들의 센스(sense), 안티센스(antisense), 그리고 상보적(complement) 염기서열을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 프로브로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 RNA, DNA, PNA, LNA, HNA 및 이노신과 같은 변형된 뉴클레오티드와 같이 그들의 혼성화 특징을 본질적으로 변화시키지 않는 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 세균의 세균 특이적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 서열번호 38 내지 135의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 원칙으로 한다. 또한, 세균의 속 특이적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 서열번호 136 내지 1484의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 원칙으로 한다.
본 발명에서 사용된 '세균'이라는 용어는 병원성 감염질환의 원인이 되는 박테리아와 그 외 환경오염 박테리아 등 모두를 포함한다.
본 발명에서 세균의 존재 유무 감별 및 속 특이적 감별을 위한 표적 서열 중, 새로 분석한 37종의 23S rDNA 유전자의 염기 서열은 표 1과 같으며, 본 발명에서 개발한 세균의 존재 유무와 속 특이적 감별을 위한 프라이머 및 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 2 및 표 3과 같다.
[표 1]
새로 분석한 37종의 23S rDNA 유전자의 염기 서열
[표 2]
세균의 세균 특이적(Bacterial specific) 신규 프라이머/프로브
※ 표적위치 기준균주 : E. coli (GenBank Accession No. : AJ278710) 염기서열 기준
※ Mixed Base의 Code Name
M : A + C, W : A + T, Y : C + T, R : A + G
K : G + T, S : G + C, V : G + A + C, N : A + G + C + T
[표 3]
세균의 속 특이적(genus-specific) 감별을 위한 신규 프라이머 및 프로브
※ 표적위치 기준균주 : Acinetobacter (GenBank Accession No. : X87280), Actinomyces (본 발명의 서열번호 2번), Aeromonas (GenBank Accession No. : AF508056), Bacillus (GenBank Accession No. : D11459), Bacteroides (GenBank Accession No. : NC_004663), Bordetella (GenBank Accession No. : X68323), Borrelia (GenBank Accession No. : NC_001318), Brucella (GenBank Accession No. : NC_004311), Burkhoderia (GenBank Accession No. : Y17182), Campylobacter (GenBank Accession No. : U09611), Chlamydia (GenBank Accession No. : NC_000117), Citrobacter (GenBank Accession No. : U77928), Clostridium (GenBank Accession No. : M94260), Corynebacterium (GenBank Accession No. : NC_004369), Enterbacter (본 발명의 서열번호 6번), Enterococcus (GenBank Accession No. : AJ295298), Fusobacterium (GenBank Accession No. : AJ307974), Haemophilus (GenBank Accession No. : NC_002940), Helicobacter (GenBank Accession No. : AB088050), Klebsiella (본 발명의 서열번호 10번), Legionella (본 발명의 서열번호 12번), Listeria (GenBank Accession No. : X92948), Morganella (본 발명의 서열번호 13번), Mycobacteria (GenBank Accession No. : Z17212), Mycoplasma (GenBank Accession No. : X68422), Neisseria (GenBank Accession No.: NC_003112), Peptococcus (GenBank Accession No. : X68428), Plesiomonas (GenBank Accession No. : X65487), Porphyromonas (GenBank Accession No. : NC_002950), Propionibacterium (본 발명의 서열번호 29번), Providencia (본 발명의 서열번호 30번), Pseudomonas (GenBank Accession No. : Y00432), Salmonella (GenBank Accession No. : U77921), Shigella (GenBank Accession No. : NC_004741), Staphylococcus (GenBank Accession No. : X68425), Streptococcus (GenBank Accession No. : AB096740), Treponema (GenBank Accession No. : NC_000919), Ureaplasma (GenBank Accession No. : NC_002162), Vibrio (GenBank Accession No. : AJ310649), Yersinia (GenBank Accession No. : U77925) 염기서열 기준
이하, 실시 예를 기초로 하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니 다.
실시 예 1: 세균의 배양 및 게놈 DNA 분리
본 연구에 사용된 약 100여종 균주는 ATCC(American Type Culture Collection, U.S.A)와 KCTC(Korean Collection for Type Cultures , Korea)에서 구입하였다. 각 세균의 배양을 위한 배지와 배양 조건은 ATCC와 KCTC에서 제공하는 각 매뉴얼에 따라 선택하였다. 배양된 균주는 집락을 백금이로 따서 1.5㎖ 튜브에 넣고 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad, USA)를 100㎕ 가한 후, 항온 수조에서 56℃로 30분간 반응하였다. 10초 진탕 후 100℃로 8분간 열처리하고 다시 10초 진탕 후, 12,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 모아진 상층액을 사용하였다. 아래 실시 예에서는 세균 증폭 시 음성대조군으로 3차 증류수(도면에 'N'으로 표시), human DNA와 virus DNA를 사용하였다.
염기 서열 분석 및 실험에 사용된 균주는 다음과 같다:
[표 4]
실시 예 2: 세균의 감별을 위한 프라이머 고안
1. 세균의 세균 특이적 감별을 위한 프라이머 고안
본 발명에 사용된 세균의 존재 유무를 감별하기 위한 프라이머 선정은 세균의 23S rDNA 염기 서열의 다중 서열 정렬 및 blast 결과에 의거하였다. 선정한 세균에는 높은 유사성을 나타내고 다른 유기체에서는 유사성이 없거나 낮은 염기 서열에서 표 2의 서열 번호 38에서 135에 해당하는 프라이머를 고안하였다. 이 프라이머는 표 2의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포함한 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브로 고안하여 이용할 수 있다.
2. 세균의 속 특이적 감별을 위한 프라이머 고안
이 프라이머는 표 3의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포함한 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브로 고안하여 이용할 수 있다.
① 에어로모나스 속 특이적 감별을 위한 프라이머 제작
모든 에어로모나스 속에서만 특이적으로 증폭반응이 일어나도록 에어로모나스의 23S rDNA 유전자를 표적으로 하여 에어로모나스 속 특이적이며, 다른 유기 체에서는 유사성이 거의 없는 염기서열로 표 3의 서열 번호 197에서 216에 해당하는 프라이머를 고안하였다.
② 엔테로코커스 속 특이적 감별을 위한 프라이머 제작
모든 엔테로코커스 속에서만 특이적으로 증폭반응이 일어나도록 엔테로코커스의 23S rDNA 유전자를 표적으로 하여 엔테로코커스 속 특이적이며, 다른 유기체에서는 유사성이 거의 없는 염기서열로 표 3의 서열 번호 699에서 703에 해당하는 프라이머를 고안하였다.
③ 마이코박테리아 속 특이적 감별을 위한 프라이머 제작
모든 마이코박테리아 속에서만 특이적으로 증폭반응이 일어나도록 마이코박테리아의 23S rDNA 유전자를 표적으로 하여 마이코박테리아 속 특이적이며, 다른 유기체에서는 유사성이 거의 없는 염기서열로 표 3의 서열 번호 872에서 880에 해당하는 프라이머를 고안하였다.
④ 스트렙토코커스 속 특이적 감별을 위한 프라이머 제작
모든 스트렙토코커스 속에서만 특이적으로 증폭반응이 일어나도록 스트렙토코커스의 23S rDNA 유전자를 표적으로 하여 스트렙토코커스 속 특이적이며, 다른 유기체에서는 유사성이 거의 없는 염기서열로 표 3의 서열 번호 1287에서 1298에 해당하는 프라이머를 고안하였다.
실시 예 3: 표적 DNA 증폭
세균의 존재 유무와 각 원인균 속을 감별하기 위한 DNA 증폭용 프라이머는 아래와 같다.
[표 5]
※ 16S-1387F primer : 이미 밝혀져 있는 16S rDNA를 기초로 고안된 대부분의 세균 검출용 primer(Applied and Environmental Microbiology, 64(2), p.795-799, 1998).
위의 각 프라이머 세트를 이용하여 실시 예 1에 따라 분리된 각 표준균주 게놈 DNA를 대상으로 PCR 기법을 실시하였다.
1) PCR 반응 조성(전체 반응액 25 ㎕)
100 mM KCl, 20 mM Tris HCl (pH 9.0), 1% Triton X-100, 10 mM deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dTTP, and dCTP), 1.5 mM MgCl2, 각 1쌍의 프라이머 (각각 10 pmole), 1 U Taq polymerase (QIAGEN, USA), 주형 DNA 4 ㎕.
2) PCR 반응 조건
94℃에서 3분간 충분히 변성시킨 후 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 30초, 72 ℃에서 2분씩 30회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다.
실시 예 4: 증폭산물의 확인
상기 실시 예 3 과정을 통해 증폭된 PCR 산물은 전기영동하여 각기 다른 size로서 확인하였다.
도 4는 세균의 세균 특이적 감별을 위한 23S rDNA 표적 서열 증폭이 가능한 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부를 확인한 도면으로 이미 널리 알려져 있는 16S rDNA에서 고안된 순방향의 프라이머인 16S-1387F와 본 발명의 23S rDNA에서 고안한 역방향의 프라이머(서열 번호 42, 46, 48, 49, 54, 64, 70, 90, 91, 93, 94, 99, 105, 115, 117, 120, 122, 132)를 각각의 쌍으로 조합하여 증폭시킨 후 전기영동하고 약 800bp에서 2,500bp 크기의 PCR 증폭 산물을 확인한 도면이다. 도 4의 (a)에서 (r)의 M은 분자량 표지로 100bp Plus DNA ladder: N은 음성대조군: 1에서 10은 각각의 세균으로 1은 아시네토박터 바우마니, 2는 에어로모나스 살모니시다, 3은 박테로이즈 폴시투스, 4는 클로스트리디움 디피실, 5는 레지오넬라 뉴모필라,
6은 모가넬라 모가니, 7은 폴피로모나스 아삭카로리티카, 8은 프로테우스 미라빌리스, 9는 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 10은 마이코플라스마 뉴모니에를 나타낸다. 이 결과에서 보여주듯이 세균 특이적 각 프라이머 쌍에 의한 증폭산물에 의해 1차적으로 세균과 human DNA, virus DNA 등의 다른 유기체와의 감별이 가능하였고 이로써 신속하고 정확한 진단과 함께 비용 절감효과도 얻게 된다.
도 6은 세균의 속 특이적 감별을 위한 23S rDNA 표적 서열 증폭이 가능한 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부를 확인한 도면이다.
도 6a는 에어로모나스 속에 특이적으로 반응하는 프라이머(서열 번호 199과 207)로 증폭시킨 후 전기영동하여 752bp 크기의 PCR 증폭 산물을 확인한 도면이고, 도 6b는 엔테로코커스 속에 특이적으로 반응하는 프라이머(서열 번호 699과 701)로 증폭시킨 후 전기영동하여 599bp 크기의 PCR 증폭 산물을 확인한 도면이다. 도 6c는 마이코박테리아 속에 특이적으로 반응하는 프라이머(서열 번호 875과 880)로 증폭시킨 후 전기영동하여 962bp 크기의 PCR 증폭 산물을 확인한 도면이고, 도 6d는 스트렙토코커스 속에 특이적으로 반응하는 프라이머(서열 번호 1289과 1291)로 증폭시킨 후 전기영동하여 804bp 크기의 PCR 증폭 산물을 확인한 도면이다. 이 결과에서 보여주듯이 각 세균의 속 특이적 프라이머 쌍에 의해 속 특이적 증폭이 됨으로써 정확한 세균의 속 동정으로 신속하고 정확한 진단과 함께 비용 절감효과 및 적절한 치료가 가능하도록 하고, 이에 따라 항생제의 오남용도 예방할 수 있게 된다.
실시 예 5: 세균의 감별을 위한 프로브 고안
본 발명에 사용된 세균의 존재 유무를 감별하기 위한 프로브 선정은 본 발명에서 처음 염기서열 분석을 통하여 23S rDNA 유전 정보를 분석한 아시네토박터 바우마니, 엑티노마이세츠 보비스, 에어로모나스 살모니시다, 박테로이즈 우레올리티쿠스, 클로스트리디움 디피실, 엔테로박터 에어로겐스, 엔테로코커스 페시움, 유박테리움 리모숨, 퓨조박테리움 몰티페룸, 클렙시엘라 옥시토카, 클렙시엘라 뉴모니에, 레지오넬라 뉴모필리아, 모가넬라 모가니, 마이코박테리움 고도네, 마이코박테리움 마리눔, 마이코박테리움 제노피, 마이코박테리움 플라브센스, 마이코박테리움 스크로플라시움, 마이코박테리움 시미에, 마이코박테리움 스즈가이, 마이코플라스마 피룸, 마이코플라스마 클로아콜레, 마이코플라스마 오팔레센스, 마이코플라스마 살리바리움, 마이코플라스마 스펄마토피, 네이세리아 고노로헤, 펩토코커스 메그너스, 프로피오니박테리움 에비둠, 프로피오니박테리움 그레뉼로숨, 프로비덴시아 스투아티, 살모넬라 봉고리, 쉬겔라 보이디, 쉬겔라 디센트리에, 쉬겔라 손네이, 스타필로코커스 사프로피티쿠스, 스트렙토코커스 보비스와 옐시니아 슈도투베르쿨로시스를 포함한 23S rDNA 염기 서열의 다중 서열 정렬 결과에 의거하였다. 다른 유기체를 제외한 본 발명의 45속의 세균에만 혼성화 반응을 하도록 세균의 23S rDNA 유전자에서 높은 유사성을 나타내는 보존적인 염기서열로 표 2의 서열 번호 38에서 135의 프로브를 고안하였다. 본 발명에 사용된 세균 감별, 원인균 속 및 종 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 5ㅄ 말단에 15개의 염기를 갖는 길이의 dT 스페이서 및 15-25개의 염기서열을 갖는 프로브를 합성하여 고안하였다. 세균 특이적 및 원인균 속 특이적 프로브는 표 2와 표 3의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포함한 염기 서열로 이루어진 프라이머 및 프로브로 고안하여 이용할 수 있다. 본 발명의 실시 예에서 종 특이적 검출을 위해 사용한 두가지 프로브는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 TGCATGACAACAAAG 염기서열과 마이코플라스마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)의 GTAAATTAAACCCAAATCCC 염기서열을 이용하였다.
실시 예 6: 표적 DNA 준비
1. 세균의 세균 특이적, 속 특이적 및 종 특이적 감별을 위한 표적 DNA 준비
세균의 세균 특이적 및 속 특이적 감별을 위한 표적 DNA의 증폭을 위해 각각 바이오틴이 표지화된 5'-biotin-TANGGCGGGACACGTGAAAT-3'(bio-389F)와 5'-biotin-GATGGCTGCTTCTAAGCCAAC-3' (bio-1075R), 그리고 5'-biotin-CCVGTAAACGGCGGCCG-3' (bio-1906F)과 5'-biotin-GGACCGAACTGTCTCACGAC-3' (bio-2607R)를 사용하여 각 689bp와 701bp 크기의 23S rDNA 부위를 선택적으로 증폭하였다. 종 특이적 감별을 위해서는 16S rDNA 뒷부분(16S-1387F)과 23S rDNA 맨 앞부분(서열번호 42)을 이용하여 약 700bp의 ITS 부위를 증폭하였다. 실시 예 1에서 분리된 각 세균의 표준 균주를 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 3분간 열변성 시킨 후 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 35회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다.
실시 예 7: 지지체에 프로브 부착
실시 예 5에서 고안된 프로브중 세균 특이적 및 각 원인균 속과 종에 대해 대표적인 한 종류의 프로브를 선정하고 spotting 용액을 첨가하여 50 pmole로 희석하였다. 슬라이드글라스의 지지체에 프로브를 마이크로어레이어(Cartesian Technologies, PLXSYS 7500 SQXL Microarryer, USA)를 이용하여 부착시켰다. 이를 실온의 슬라이드 박스에서 24시간 정도 정치 또는 50℃의 건조기(dry oven)에 약 5시간 방치하여 지지체 위의 표면에 고정시켰다.
실시 예 8: 고정되지 않은 프로브의 세척
지지체 표면에 부착되지 않은 프로브를 제거하기 위해 실온에서 0.2% SDS(Sodium dodecyl sulfate) 용액에 세척한 후, 증류수로 세척하였다. Sodium borohydride 용액으로 세척하고 다시 끓는 증류수에 세척하였다. 실온에서 0.2% SDS와 증류수를 이용하여 세척한 후 원심분리기를 이용하여 지지체 표면을 완전하게 건조시켜 마이크로어레이 제작을 완료하였다.
실시 예 9: 염료 결합 및 혼성화 반응(Hybridization)
실시 예 6에서 제조된 바이오틴으로 표지화된 표적 DNA를 단일 가닥으로 사용하기 위해 95℃ 이상 열을 가한 후 4℃로 냉각시켰다. PCR 산물과 프로브와의 결합유무를 확인하기 위해, Cy5-streptavidin 또는 Cy3-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 포함하는 반응용액과 1∼5 ㎕의 표적 DNA를 포함하는 혼성화 반응용액 10 ㎕를 제조하였다. 프로브 부착과 세척을 마친 슬라이드에 혼성화 반응용액을 분주하고 커버 글라스를 덮고 40℃에서 30분간 반응시켰다.
실시 예 10: 결합되지 않은 DNA의 세척
혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 DNA를 세척하기 위해 2× SSC(300mM NaCl, 30mM Na-Citrate, pH 7.0) 용액을 이용하여 커버 글라스를 제거한 후에 2× SSC와 0.2× SSC 용액 순으로 슬라이드를 세척한 후 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.
실시 예 11: 결과 분석
실험을 마친 후 결과의 분석을 위해 비공초점 레이져 스캐너(non-confocal laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, USA)를 이용하여 결과를 분석하였다.
도 7에서 도 9는 본 발명의 바람직한 실시예인 마이크로어레이의 도면이다. 도 7a는 세균의 존재를 감별하기 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다. No. 2에서 19는 표 2의 세균 특이적 신규 프로브 서열번호(2 ; 42, 3 ; 46, 4 ; 48, 5 ; 49, 6 ; 54, 7 ; 64, 8 ; 90, 9 ; 91, 10 ; 93, 11 ; 94, 12 ; 70, 13 ; 99, 14 ; 105, 15 ; 115, 16 ; 117, 17 ; 120, 18 ; 122, 19 ; 132)이고, No. 1, 20은 positive 프로브(위 모든 프로브 혼합액). 도 7b 와 도 7c는 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응에 대한 화상 분석 후 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 그림이다. 도 7b는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 존재 유무를 감별하기 위해 bio-389F와 bio-1075R 프라이머로 23S rDNA 앞부분에서부터 약 680bp 증폭시킨 후 세균 특이적 프로브에 혼성화한 결과(프로브 번호 ; 서열 번호로 표기 - 2 ; 42, 3 ; 46, 4 ; 48, 5 ; 49, 6 ; 54, 7 ; 64, 12 ; 70)와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과를 나타냈고, 도 7c는 스트렙토코커스 안지노수스(Streptococcus anginosus)의 존재 유무를 감별하기 위해 bio-1906F와 bio-2607R 프라이머로 23S rDNA의 뒷부분 약 700bp를 증폭시킨 후 세균 특이적 프로브에 혼성화한 결과(프로브 번호 ; 서열 번호로 표기 - 8 ; 90, 9 ; 91, 10 ; 93, 11 ; 94, 13 ; 99, 14 ; 105, 15 ; 115, 16 ; 117, 17 ; 120, 18 ; 122, 19 ; 132)와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과를 나타냈다. 그 결과 화소세기의 차이는 있었지만 세균 특이적 프로브 모두에서 positive signal을 나타내었다.
도 8a는 세균의 존재 유무 및 원인균 속을 감별하기 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다. No. 1, 3, 5, 7, 9은 표 2의 세균 특이적 신규 프로브 서열번호(1 ; 42, 3 ; 46, 5 ; 48, 7 ; 64, 9 ; 90)이고, No. 2, 4, 6, 8, 10은 표 3의 원인균 속 특이적 신규 프로브 서열번호(2 ; 199, 4 ; 875, 6 ; 883, 8 ; 1288, 10 ; 702). 8b는 스트렙토코커스 속 특이적 프로브에 혼성화한 결과(서열 번호 42, 46, 49, 64, 91, 1288)와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과를 나타냈다. 혼성화 결과 세균 특이적 프로브 1, 3, 5, 7, 9에서 positive signal을, 속 특이적 프로브 중 스트렙토코커스 속 프로브인 8(서열번호 1288)에서 positive signal을 나타내었다.
도 9a는 세균의 존재 유무 및 원인균 속과 종을 동시에 감별하기 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다. No. 1, 7, 13, 19, 25는 표 2의 세균 특이적 신규 프로브 서열번호(1 ; 42, 7 ; 46, 13 ; 48, 19 ; 64, 25 ; 90)이고, No. 2, 8, 14, 20, 26은 표 3의 원인균 속 특이적 신규 프로브 서열번호(2 ; 199, 8 ; 875, 14 ; 883, 20 ; 1288, 26 ; 702)이고, No. 9에서 12는 마이코박테리아 종 특이적 프로브이고, No. 15에서 18은 마이코플라스마 종 특이적 프로브이며, No. 3에서 6, 21에서 24, 27에서 30은 공란. 9b는 세균 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 속 및 종 특이적 프로브에 혼성화한 결과(서열 번호 42, 46, 49, 64, 91, 875)와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과로, 혼성화 결과 세균 특이적 프로브 1, 7, 13, 19, 25에서 positive signal을, 속 특이적 프로브 중 마이코박테리움 속 프로브인 8(서열번호 875)에서 positive signal을, 또한 동시에 종 특이적 프로브로 심은 마이코박테리움 투베르쿨로시스에 positive signal을 나타내었고, 9c는 세균 마이코플라스마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae)의 속 및 종 특이적 프로브에 혼성 화한 결과(서열 번호 42, 46, 49, 64, 91, 883)와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과로, 혼성화 결과 세균 특이적 프로브 1, 7, 13, 19, 25에서 positive signal을, 속 특이적 프로브 중 마이코플라스마 속 프로브인 14(서열번호 883)에서 positive signal을, 또한 동시에 종 특이적 프로브로 심은 마마이코플라스마 뉴모니에에 positive signal을 나타내었다. 이로써 한번에 세균 특이적, 속 특이적 및 종 특이적 프로브에 반응시킴으로써 세균의 존재 유무가 감별됨과 동시에 정확한 속에 해당하는 종까지 동정이 모두 이루어져 신속한 진단과 더불어 비용의 절감과 적절한 처방 및 치료가 가능할 수 있게 되었다.
이것은 본 발명에서 고안한 신규 올리고뉴클레오티드 중 대표적인 프로브 구획의 한 예에 불과하므로 각 프로브 구성 및 구획의 위치(layout)는 변동될 수 있다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명은 병원성 세균을 포함하여 식중독 유발 세균, 생물의약품 오염 유발 세균 및 환경오염 세균 등에 해당하는 모든 세균의 검출 및 감별을 위해 세균의 23S rDNA 유전자의 표적 염기 서열로부터 고안된 세균 특이적 및 속 특이적인 올리고뉴클레오티드, 이를 프라이머로 포함하여 검출하는 PCR과, 또한 이를 프로브로 포함하는 마이크로어레이를 제공한다. 또한 23S rDNA 영역과 조합하여 존재하는 ITS로부터 종 특이적과 아종 특이적 프라이머와 프로브를 디자인하여 조합하여 진단 키트를 개발하였다. 즉, 본 발명은 세균의 존재 유무를 먼저 1차 스크리닝한 후 세균의 존재가 밝혀지면 각 원인균 속의 정확한 감별을 위해 2차 스크리닝을 실시함으로써 진단 비용의 절감과 함께 항생제 오남용의 예방 및 적절한 치료가 이루어 질 수 있는 신속하고 민감한 진단 방법을 제공한다. 또한, 세균의 감별을 위한 신규 올리고뉴클레오티드의 고안을 위해, 아직 밝혀져 있지 않은 다수 세균의 23S rDNA 유전자의 염기 서열을 분석함으로써 상기 언급된 세균의 정확한 감별을 위한 매우 특이적이고 민감한 검출 방법을 개발할 수 있는 근거가 되는, 표적 서열들의 프라이머와 프로브, 이를 포함한 PCR과 마이크로어레이등의 진단 키트를 제공한다.
<110> GENEIN CO., LTD.
KIM, CHEOL-MIN
PARK, HEE-KYUNG
<120> Oligonucleotide for detection of pathogenic microbial, diagnostic
kits and methods for detection of pathogenic microbial using the
oligonucleotide
<130> PN057057
<160> 37
<170> KopatentIn 1.71
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<211> 2481
<212> DNA
<213> Acinetobacter baumannii
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gacgtgatag cctgcgaaaa gctccgggag gcggcaaata tcctttgatc cggagatgtc 120
tgaatggggg aacccaccta ctttaaggta ggtattgcaa catgaataca tagtgttgca 180
aggcgaacga ggggaagtga aacatctcag tacccttagg aaaagaaatc aattgagatt 240
ccctcagtag cggcgagcga acggggatca gcccattaag ttatgtgtgt tttagtggaa 300
cgctctggga agtgcgaacg tagagggtga tattcccgta cacgaaaggg cacacataat 360
gatgacgagt agggcgaggc acgtgaaacc ttgtctgaat atggggggac catcctccaa 420
ggctaaatac tcctgactga ccgatagtga accagtaccg tgagggaaag gcgaaaagaa 480
cccctgtgag gggagtgaaa tagatcctga aaccgcatgc atacaagcag tgggagcacc 540
tttgtggtgt gactgcgtac cttttgtata atgggtcagc gacttatatt cagtagcgag 600
gttaaccgta taggggagcc gtagagaaat cgagtcttaa tagggcgttt agttgctggg 660
tatagacccg aaaccaggcg atctatccat gagcaggttg aaggttgggt aacactaact 720
ggaggaccga acccactgtc gttgaaaagc caggggatga cttgtggata ggggtgaaag 780
gctaatcaag cctggtgata gctggttctc cccgaaagct atttaggtag cgcctcggac 840
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gtagtcaaga ggaaaacaat ccagaccgcc agctaaggcc ccaaaatcat agttaagtgg 1020
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agaaagcgta atagctcact agtcgagtcg gcctgcgcgg aagatgtaac ggggctaaaa 1140
ctatgtgccg aagctgcgga tgtatacttt gtatacgtgg taggggagcg ttctgtaagc 1200
cgatgaaggt gtgttgagaa gcatgctgga ggtatcagaa gtgcgaatgc tgacgtgagt 1260
aacgacaaaa cgggtgaaaa acccgttcgc cgaaagacca agggttccag tccaacgtta 1320
atcggggctg ggtgagtcga cccctaaggc gaggccgaaa ggcgtagtcg atgggaaaat 1380
ggttaatatt ccattacttc tgtgtaatgc gatgagagga cggagaaggc taaatcagcc 1440
tggcgttggt tgtccaggtg aaaggatgta ggcatgtatc ttaggcaaat ccggggtact 1500
ctatgctgag atctgatagc aagctgtact tgtacagcga agtggttgat gccatgcttc 1560
caggaaaagt ctctaagctt cagttacaca ggaatcgtac ccgaaaccga cacaggtggt 1620
caggtcgagt agaccaaggc gcttgagaga actctgctga aggaactagg caaaatggta 1680
ccgtaacttc gggagaaggt acgctgttgt tggtgatgga actcgcttcc tgagctgacg 1740
acagccgcag aaaccaggcc gctgcaactg tttattaaaa acatagcact ctgcaaacac 1800
gaaagtggac gtatagggtg tgatgcctgc ccggtgctgg aaggttaatt gatggggtta 1860
gcgtaagcga agctcttgat cgaagcccca gtaaacggcg gccgtaacta taacggtcct 1920
aaggtagcga aattccttgt cgggtaagtt ccgacctgca cgaatggcat aatgatggcg 1980
gcgctgtctc cagcagaggc tcagtgaaat cgaaatcgct gtgaagatgc agtgtacccg 2040
cggctagacg gaaagacccc gtgaaccttt actgcagctt gacactgaac tttgacctta 2100
cttgtgtagg ataggtggga ggctttgaag ctggaacgct agttccagtg gagctgccct 2160
ggacacaccg ccctggtaat gttgaggttc taactctgtc ccgtgatccg ggacgaggac 2220
cgtgtctggt gggtagtttg actggggcgg tctcctccta aagagtaacg gaggagtacg 2280
aaggtgcgct cagcgtggtc ggaaatcacg cgtagagtat aaaggcaaaa gcgcgcttaa 2340
ctgcgagacc cacaagtcga gcaggtacga aagtaggtct tagtgatccg gtggttctgt 2400
atggaagggc catcgctcaa cggataaaag gtactctggg gataacaggc tgataccgcc 2460
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tcgtgtgatt actcggcagg ggttgcggtt gtggggttgt ggggcatgct tttctgccat 180
ctgccggtgg taggcgcggt gataaacctg gttggtagcc gaatctcctg ggaaggggag 240
ccgtagtggg tgagagcccc gtaggttaaa ctgtctgggc cgtgtgggtg tgttcccgag 300
tagccacggg gctcgtggaa tcctgtgtga atctgccaag accacttggt tgcctgaata 360
cttcctgatg accgatagcg gattagtacc gtgagggaat ggtgaaaagt accccgggag 420
gggagtgaaa tagtacctga aaccgggcgc ttacaagccg tcagggccct tcggggtgat 480
ggcgtgcctt ttgaagaatg agcctgcgag tcagtgctgt gtcgcgaggt taacccgtgt 540
tgggggagtc gtagcgaaag cgagtctgaa agggcgtttt agtggcacgg tctggacccg 600
aagcggggtg atctacccat ggccaggttg aagcacgtgt aagagcgtgt ggaggaccga 660
acccacttca gttgaaaatg gaggggatga gctgtgggta ggggtgaaag gccaatcaaa 720
ctccgtgata gctggttctc cccgaaatgc atttaggtgc agcgtctcgt gttgcccggc 780
ggaggtagag ctactgggtg gctgatgggc cccacagggt tactgacgtc aaccaaactc 840
cgaatgccgt cgggttgtag cggggcagtg agaccgcggg ggataagctc cgtggtcgag 900
agggaaacag cccagatcgc cggataaggc ccctaagcgt gtgctaagtg ggaaaggatg 960
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gtggatggtg tgggagtgag aatgcaggca tgagtagcga tactagggtg agaaacccta 1260
gcgccgaatg accaagggtt ccagggctag gctagtccgc cctgggtgag tcgggtccta 1320
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accgcccatg ctgacgcgcg ggtgctaacc cacgcctggg ctcacagtca tgccctggtg 1440
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aggcaagcgt attaacaggg gtgacgcaca gtggtagccc ggcggtccta atggcttgga 1560
ctgttcaagc gcgcggcccg tcctccaggt aaatccgggg ggctgtcttc gatgacgggg 1620
gtgaggcgtg atggtggccc tgcttttcag tgggggatat cagggtgatc ctgtggtgcc 1680
tagaaaagcc tcgacgcgat ggtgccagcc gcccgtaccc taaaccgaca caggtggtcg 1740
ggcagagtat gcctaggcgc acgagataat catggtgaag gaactcggca aaatgccccc 1800
gtaacttcgg gagaaggggg gcccgagcct tgaagcccca cgcgggctag gggtgagggc 1860
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cattgggggt gaagcggtga atttaagccc cagtaaacgg cggtggtaac tataaccatc 2040
ctaaggtagc gaaattcctt gtcgggtaag ttccgacctg cacgaatggc gtaacgactt 2100
ctctactgtc tccaccatga actcggcgaa attgcattac gagtaaagat gctcgttacg 2160
cgcagaagga cggaaagacc ccgggacctt tactatagct tggtattggc gcccgctgtg 2220
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<211> 2544
<212> DNA
<213> Enterobacter aerogenes
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2544)
<223> 23S rDNA gene
<400> 6
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<213> Enterococcus faecium
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2579)
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<400> 7
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ccctgagtaa gccgggacct aagccgaggc tatagtgcgt aggcgaatgg aaaacagatt 1440
aatatttctg tgccagtcat attttgtgat ggagggacgt agaagggtat gtacgcggaa 1500
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<211> 2633
<212> DNA
<213> Klebsiella oxytoca
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2633)
<223> 23S rDNA gene
<400> 10
atctcaaaac tcatcttcgg gtgacgtttg agatatttgc tctttaaaaa tctggatcaa 60
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<210> 11
<211> 2631
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2631)
<223> 23S rDNA gene
<400> 11
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<210> 12
<211> 2389
<212> DNA
<213> Legionella pneumophila
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2389)
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<400> 12
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<210> 13
<211> 2459
<212> DNA
<213> Morganella morganii
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2459)
<223> 23S rDNA gene
<400> 13
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<213> Mycobacterium gordonae
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2699)
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<210> 15
<211> 2691
<212> DNA
<213> Mycobacterium marinum
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2691)
<223> 23S rDNA gene
<400> 15
ttataagtgt ctaagggcgc atggtggatg ccttggcatc gagagccgat gaaggacgtg 60
ggaggctgcg atatgcctcg gggagctgtc aacctagcgt ggatccgagg atttccgaat 120
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<211> 2922
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<213> Mycoplasma pirum
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<222> (1)..(2922)
<223> 23S rDNA gene
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<220>
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aggccaatca aaccgggaga tagctggttc tccccgaaag ctatttaggt agcgcctcgt 840
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gtcagccggg cgacggttgt cccggtttaa gcatgtaggc ggaggttcca ggtaaatccg 1500
gtacctttta acgctgaggt gtgatgacga ggcactacgg tgctgaagtg ataaatgccc 1560
tgcttccagg aaaagcctct aagcatcagg taacacgaaa tcgtacccca aaccgacaca 1620
ggtggtcagg tagagaatac caaggcgctt gagagaactc gggtgaagga actaggcaaa 1680
atggtgccgt aacttcggga gaaggcacgc tgatgtgtag gtgaagcccc tgcgggtgga 1740
gctgaaatca gtcgaagata ccagctggct gcaactgttt attaaaaaca cagcactgtg 1800
caaacacgaa agtggacgta tacggtgtga cgcctgcccg gtgccggaag gttaattgat 1860
ggggttagcg gcaacgcgaa gctcttgatc gaaaccccgg taaacggcgg ccgtaactat 1920
aacggtccta aggtagcgaa attccttgtc gggtaagttc cgacctgcac gaatggcgta 1980
atgatggcca ggctgtctcc acccgagact cagtgaaatt gaactcgctg tgaagatgca 2040
gtgtacccgc ggcaagacgg aaagaccccg tgaaccttta ctatagcttg acactgaaca 2100
ctggtccttg atgtgtagga taggtgggag gctttgaagc gtggacgcca gtctgcgtgg 2160
agcctacctt gaaataccac cctttaatgg ctggtgttct aacgtagtcc ctattccggt 2220
gcgac 2225
<210> 26
<211> 2671
<212> DNA
<213> Neisseria gonorrhoeae
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2671)
<223> 23S rDNA gene
<400> 26
tctttgcaaa ggataaaaaa tctctcgcaa gagagaagaa aacaaacata gtatttgggt 60
gatgattgta tcgacttaat cctgaaacac aaaaggcagg attaggacac aacaaagcag 120
taagctttat caaagtaggg atttcaagtt tgcttactta gtcaacgggt aggtaaacga 180
agtcaaagaa gttcttgaaa tgatagagtc aagtgaataa gtgcatcagg cggatgcctt 240
ggcgatgata ggcgacgaag gacgtgtaag cctgcgaaaa gcgcggggga gctggcaata 300
aagctatgat tccgcgatgt ccgaatgggg aaacccactg cattctgtgc agtatcctaa 360
gttgaataca taggcttaga gaagcgaacc cggagaactg aaccatctaa gtacccggag 420
gaaaagaaat caaccgagat tccgcaagta gtggcgagcg aacgcggagg agcctgtacg 480
taataactgt cgagatagaa gaacaagctg ggaagcttga ccatagcggg tgacagtccc 540
gtattcgaaa tctcaacagc ggtactaagc gtacgaaaag tagggcggga cacgtgaaat 600
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ccccgaaaac tatttaggta gtgcctcgag caagacactg atgggggtaa agcactgtta 1080
tggctagggg gttattgcaa cttaccaacc catggcaaac tcagaatacc atcaagtggt 1140
tcctcgggag acagacagcg ggtgctaacg tccgttgtca agagggaaac aacccagacc 1200
gccggctaag gtcccaaatg atagattaag tggtaaacga agtgggaagg cacagacagc 1260
caggatgttg gcttagaagc agccatcatt taaagaaagc gtaatagctc actggtcgag 1320
tcgtcctgcg cggaagatgt aacggggctc aaatctataa ccgaagctgc ggatgccggt 1380
ttaccggcat ggtaggggag cgttctgtag gctgatgaag gtgcattgta aagtgtgctg 1440
gaggtatcag aagtgcgaat gttgacatga gtagcgataa agcgggtgaa aagcccgctc 1500
gccgaaagcc caaggtttcc tancgcaacg ttcatcggcg tagggtaagt cggcccctaa 1560
ggcgaggcag aaatgcgtag tcgatgggaa acaggttaat attcctgtac ttgattcaaa 1620
tgcgatgtgg ggacggagaa ggttaggttg gcaagctgtt ggaatagctt gtttaagccg 1680
gtaggtggaa gacttaggca aatccgggtt ttcttaacac cgagaagtga tgacgagtgt 1740
ctacggacac gaagcaaccg ataccacgct tccaggaaaa gccactaagc ttcagtttga 1800
atcgaaccgt accgcaaacc gacacaggtg ggcaggatga gaattctaag gcgcttgaga 1860
gaactcggga gaaggaactc ggcaaattga taccgtaact tcgggagaag gtatgccctc 1920
taaggttaag gacttgctcc gtaagccccg gagggtcgca gagaataggt ggctgcgact 1980
gtttattaaa aacacagcac tctgccaaca cgaaagtgga cgtatagggt gtgacgcctg 2040
cccggtgccg gaaggttaat tgaagatgtg caagcatcgg atcgaagccc cggtaaacgg 2100
cggccgtaac tataacggtc ctaaggtagc gaaattcctt gtcgggtaag ttccgacccg 2160
cacgaatggc gtaacgatgg ccacactgtc tcctcccgag actcagcgaa gttgaagtgg 2220
ttgtgaagat gcaatctacc cgctgctaga cggaaagacc ccgtgaacct ttactgtagc 2280
tttgcattgg actttgaagt cacttgtgta ggataggtgg gaggcttgga agcagagacg 2340
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gggataacag gctgatccgc ccaagagtca a 2671
<210> 27
<211> 2624
<212> DNA
<213> Peptococcus magnus
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2624)
<223> 23S rDNA gene
<400> 27
ggtcaacaga acattgaaaa tcgaataaca gtatatattt ccggtcaaga aactaagggc 60
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gagtaggagc aaatatccag tgactcgggg gaatccgaat ggggaaacct actagacaca 180
ctctagtatc catacgtaaa tacatagcgt atggaagcga atgttctgaa ctgaaacatc 240
taagtaggaa caagaaaaga aagaaaactc gattctccaa gtagcggcga gcgaacagag 300
aacagcccat taaagtaaga ctaaactgat agacaaatct tatggaaaga agaaccaaag 360
aaagtaacag tcttgtagtc gaaatcagaa tagagacact ttaagaagag taccacggag 420
cacgtgaaat tctgtgggaa gataggggga ccacccccta aggctaaata ctacctggtg 480
accgatagcg aatagtaccg tgagggaaag gtgaaaagaa ccccgggagg ggagtgaaat 540
acaacctgaa accttgcgcc tacaagcaga cagaggaaga agacttctaa tgtcgtactt 600
tttgtagaac gggccagcga gttacgatac atagcaagat taatcattta agatgtgaag 660
tcgtaaggaa atcgagtctt aatagggcaa aatttgcttg ttgtagaccc taaaccgggt 720
gatctatcca tgggcagagt gaaggtaaag taaaatttac tggaggctcg aaccgggtag 780
cgtttaaaag ctatcggatg acctgtggat aggggtgaaa agccaatcga actctgatat 840
agctggttct cctcgaaata gctttagggc tagccttgtt ttagattaca ggaggtagag 900
cactgaatag tctaggggaa gtaattctac cgaaacttat caaactccga atgcctaaaa 960
tcgagaacag gatcagacca gagatattaa gcttcaatag tcaaaagggg aaacagccga 1020
gaccaccagt ttaggtccca aaaatacaga ataagtggga aaggatgtaa tactactcag 1080
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gtcaagtggt atgcgccgaa gatgaacggg gctaaatctg ataccgaaac tgtgggatag 1200
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atttctaaaa cacttaacaa catacaactg gcataatagc ttttctatcg gtagaggagc 1380
gttgtatatg agaagaagca aaaagcgtaa gcaattgtgg attatataca agtgagaatg 1440
ctggcatgag tagcgaaaag ggatgtgaga atcatccccg tcgaaagccc aaggattcct 1500
gagcaaggct cgtcctctca gggtaagtcg ggacctaagg cgaggccgaa aggcgtagtc 1560
gatggacaac aggtagaaat tcctgtacta caagattgtg attgagagaa gtactgacgc 1620
acaaggaaaa gtcgagcgtg cgaatggttg tgcacgtcca aataacaagc cagaatatac 1680
aggcgaatcc gtatattcgt caacgtaagt tatgatgggg agcagaaaga tgcgaagcga 1740
cagattcaaa ctgccaagaa aaggtgctat cgaataatct tgtacccgta ccgcacaccg 1800
acacaggtag gcaagaagag aattctaaga cgcgcggaag aacctttgtt aaggaactcg 1860
gcaaaataat cccgtaagtt agcgagaagg gatgcctaag aaattaggtc gcagagaata 1920
ggcccaagcg actgtttacc aaaaacacaa gtatctgcta aatcgaaaga tgaagtatag 1980
gtgctgacac ctgcccggtg ctggaaggtc aaggggactt gttagagcaa tcgaagcaac 2040
gaacttaagc cccagtaaac ggcggccgta actataacgg tcctaaggta gcgaatattc 2100
cttgtcgggt aagttccgac ccgcacgaaa ggtgtaacga tttgggcgct gtctcaacaa 2160
aggatccggt gaaattgtag tagtcgtgaa gatgcgactt acccacggta ggacggaaag 2220
actcccgtgg agctttatct gcaggttgac attgaatttt gggattaaat gtacaggata 2280
ggtgggagac gaagaagcaa gctcgccaga gtttgcagag tcatctgttg ggataccacc 2340
cttttaattc taaagttcta actagttacc atgaagctgg taataggaca ctgtcagtcg 2400
ggccagtttg actggggcgg tcgcctccaa aaaagtaacg gaggcgttca aaggttcgct 2460
cagaatggtt ggaaatcatt caaagagtac aaaggcaaaa gcgagcttaa ctgcgagaca 2520
tacaggtcga gcagagacga aagtcggact tagtgatccg gtggtaccga gtggaagggc 2580
catcgctcaa cggataaaag ctaccccggg gataacaggc ttat 2624
<210> 28
<211> 2292
<212> DNA
<213> Propionibacterium avidum
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2292)
<223> 23S rDNA gene
<400> 28
tgttgcgtga aggtgaagcg tctgggaagg cgtaccggag tgggtgagag tcccgtaact 60
gtaagcgtgg cactggtgag ggttgcccca agtagcgtgg aactcgtgga atttcgcgtg 120
aatctggcgg gaccacccgt caagcctaaa tactccttgg tgaccgatag tgtattagta 180
ccgtgaggga atggtgaaaa gtaccccggg aggggagtga aatagtacct gaaaccggtc 240
gcatacaagc cgtcagagcc ttgtggggtg atggcgtgcc ttttgaagaa tgagcctgcg 300
agttagtgat gcgtggcgag gttaacctgt gtgggggagt cgtagcgaaa gcgagtctga 360
taagggcgtg agtcgcgtgt tctagacccg aagcggtgtg atctatccat ggccaggatg 420
aagcgtcggt aagacgtcat ggaggtccga acccacttca gttgaaaatg gaggggatga 480
gctgtggata ggggtgaaag gccaatcaaa caccgtgata gctggttctc cccgaaatgc 540
atttaggtgc agcgttgcgt ggttcttgtc ggaggtagag cactggatgg tctagggggc 600
ctatcagctt accgaaatca gccaaactcc gaatgccggc aagtggagcg tagcagtgag 660
acggcggggg ataagcttcg tgttggggag cgaatcagtc cagatcatca gctaaggccc 720
ctaagtggta gctcagtgga aaaggatgtg gagttgcgca gacagccagg aggttggctt 780
ggaagcagcc atccttgaaa gagtgcgtaa tagctcactg gtcaagtgat tccgcgccga 840
caatgtagcg gggcttaagt tatccgccga agctgtggcc aaacccgttt tgcgggtttg 900
ggtaggggag cgtcctgtac gaggtgaagc tgccgggtga ccgtgtggtg gattgtgcgg 960
gagtgagaat gcaggcatga gtagcgaatg acgggtggga aacccgtccg ccgattatcc 1020
aagggttcca gggtcaagtt aatctgccct gggtgagtcg ggacctaagg cgaggccgac 1080
aggcgtagtc gatggataac cagttgatat tctggtaccg gcttgtcacc gtccgtgtcg 1140
aggtgtgtga tgctaagcgt gcgagcctgc cattgtgatg tctttgatgt tgtggtggtg 1200
tggtgagtgt gtgaaccgat catgtagtag gcaagctgcg gagggacgca gtgaggtagc 1260
tcatccccgg cgatggttgt ccggggctaa atgtgtggac cgtctggtag gtaaatccgc 1320
tgggcatatg gttgaggcat gatggcgagc ccacgtgtgt gggtgagtga gtgatcctgt 1380
actgtcgaga aaagcttcgt gagcgaggtg gctggtccgc ccgtacccta atccgacact 1440
ggtggatagg tagagtatac cgaggcgatc gagatcatca tggtgaagga actcggcaaa 1500
atgcccccgt aacttcggga taagggggac ctgaactgtc aaggcctgta cggctggtag 1560
cagtgagggg cgcagagacc agggggaaac gactgtttac caaaaacaca ggtccgtgcg 1620
aagtcgtaag acgatgtata cggactgact cctgcccggt gctggaaggt taaggggaac 1680
tgttagcgtt ggcgaagcgg tgaacttaag ccccagtaaa cggcggtggt aactataacc 1740
atcctaaggt agcgaaattc cttgtcgggt aagttccgac ctgcacgaat ggagtaacga 1800
tttccctact gtctccacca tgaactcggt gaaattgcag tacgagtaaa gatgctcgtt 1860
acgcgcagca ggacggaaag accccgggac ctttactata gtttggtatt ggtgattggg 1920
acgacttgtg taggataggt gggagactgt gaagtggcca cgctagtggt tgtggagtca 1980
ttgttgaaat accactctgg tcgttctggt tatctaactt tgggccgtga tccggttcag 2040
ggacagtgcc tgatgggtag tttgactggg gcggtcgcct cctaaaaggt aacggaggcg 2100
cccaaaggtt ccctcatcct ggttggtaat caggtgtcga gtgtaagtgc acaagggggc 2160
ttgactgtga gactgacagg tcgagcaggg acgaaagtcg ggactagtga tctgacggtg 2220
gcttgtggac gcgccgtcac tcaacggata aaaggtaccc cggggataac aggctgatct 2280
gcccgagcgt at 2292
<210> 29
<211> 2261
<212> DNA
<213> Propionibacterium granulosum
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2261)
<223> 23S rDNA gene
<400> 29
ctgggaaggc ggaccgtagt gggtgagagt cccgtagacg tgagtgtcat gtgaggtttc 60
aggttgcccc aagtagcgcg gtactcgtgg aatgtcgcgt gaatctggcg ggaccacccg 120
ttaagcctaa atacttcttg gtgaccgata gtgtatcagt accgtgaggg aatggtgaaa 180
agtaccccgg gaggggagtg aaatagtacc tgaaaccggt cgcatacaag ccgtcggagc 240
cttgcggggt gacggcgtgc ctattgaaaa atgagcctgc gagttagtgg tgtgtggcga 300
ggttaacctg tgtggggtag tcgtagcgaa agcgagtccg ataagggcgt cagtcgcatg 360
ctctagacct gaagcggtgt gatctatcca tggccaggat gaagcgtcgg taagacgtcg 420
tggaggtccg aacccacttc agttgaaaat ggaggggatg agctgtggat aggggtgaaa 480
ggccaatcaa acaccgtgat agctggttct ccccgaaatg catttaggtg cagcgttgtg 540
tggttcgtgt cggaggtaga gcactggatg gtctaggggg cctatcagct taccgaaacc 600
agccaaactc cgaatgccgg cacgtggagc gcagcagtga gacggcgggg gataagcttc 660
gttgtcgaga gggaaacagc ccagatcatc agctaaggcc cctaagtgat agctaagtgg 720
aaaaggatgt ggagttgcgt agacaaccag gaggttggct tggaagcagc catccttgaa 780
agagtgcgta ctgacacact atggtcaatg attccgcgcc gacatgtagc ggggctcaag 840
ttatccgccg aagctgtggc aacttttttt tgagttgggt acggcagcgt cgtgttcctg 900
gtgaaccacc ctggtgatgg gttgtgaatt ggattcgagt gagaatgcct gccttactat 960
gtaatgacgg gtgggaaacc cgtccgccga atatcctagg gttccagggt caagttattc 1020
tgccctgggt gagtcggcac ccaaagcgag gcccacatgc gtcttctatg gacgaccagt 1080
ttatattctg gtccccgtgt acaaccgtcc gtgtctaggt gtgtgatgct aaccatgcga 1140
ctgtcctggt gatcccttca gggtgatctt gtggcgtgag tgtgtgaacc gatcatgtag 1200
tagacaagct gcggagggac acagtgaggt agctcgtccc cggcgatggt tgtccggggc 1260
taaatgtgtg gactgtctgg taggtaaatc cgtcaggcgt gtggttgagg catgatggcg 1320
agccatgttt gtgtggtgag cgagtgatcc tgtgctgtcg agaaaagctt cgtgagcgag 1380
gtgtgagccg cccgtaccct aaaccgacac tggtggattg gtagagtata ccgaggcgat 1440
cgagagaatc atggtgaagg aactcggcaa aatgcccccg taactttgga agaaggggga 1500
cctgagctgt tgccgccacg tgctggtggt tgcggtgagg ggcgcagaga attgggggaa 1560
gcgactgttt accaaaaaca caggtccgtg cgaagtcgta agacgatgta tacggactga 1620
ctcctgcccg gtgctggaag gttaagggga actgttagct ttggcgacgc ggtgaactta 1680
agccccagta aacggcggtg gtaactataa ccatcctaag gtagcgaaat tccttgtcgg 1740
gtaagttccg acctgcacga atggagtaac gacttcccta ctgtctccac catgaactcg 1800
gtgaaattgc attacgagta aagatgctcg ttacgcgcag caggacggaa agaccccggg 1860
accttcacta tagtttggta ttggtgatcg gttcgacttg tgtaggatag gtgggagact 1920
gtgaagctgt cacgctagtg gtggtggagt cgttggtgaa ataccactct ggtcgttctg 1980
gttatctaac gttgggccat gatctggttc acggacagtg cctgatgggt agtttgactg 2040
gggcggtcgc ctcctaaaag gtaacggagg cgcccaaagg ttccctcatc ctggttggta 2100
atcaggtgtc gagtgtaagt gcacaaggga gcttgactgt gagacagaca tgtcgagcag 2160
ggacgaaagt cgggactagt gatctgacgg tggcttgtgg aagtgccgtc actcaacgga 2220
taaaaggtac cccggggata acaggcgatc tgcccgagcg t 2261
<210> 30
<211> 2756
<212> DNA
<213> Providencia stuarti
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2756)
<223> 23S rDNA gene
<400> 30
caattatgct ctttaacaat atgggacaag ctgaaaattg aaacaacgca cattgtttat 60
cgcttaaaca atgtgagagt ctttcaaaat ttcaaacctg aaattttcgg tcattcaaac 120
gagtggcatg agcgagcagg gtgaaattca aggcggacag cgcgccgcaa acgcagcgta 180
caggagtacg tgagcattgc gagcactgcc caacgcagaa gttcaccacg cacagccatg 240
acagtcaggt gatcgttgaa acaatttcgg gttgtgaggt taagcgacta agcgtacacg 300
gtggatgcct aggcattcag aggcgatgaa ggacgtgcta atctgcgaaa agcgtcggta 360
aggtgatatg aaccgttata accgacgatg tccgaatggg gaaacccagt gcaattcgtt 420
gcactatcgt ttgatgaatc catagtcaaa cgaggcgaac cgggggaact gaaacatctc 480
agtaccccga ggaaaagaaa tcaaccgaga ttcccctagt agcggcgagc gaacggggag 540
cagcccagag tcttaatcag catcagcatc aggagaacgg tctggaaagg ccggcaataa 600
agggtgatag ccccgtatcc gaaggtgttg gtgttgtgaa ctcgacgagt agggcgggac 660
acgtgttatc ctgtctgaat atggggggac catcctccaa ggctaaatac tcctgattga 720
ccgatagtga accagtaccg tgagggaaag gcgaaaagaa ccccggcgag gggagtgaaa 780
tagaacctga aaccgtgtac gtacaagcag tgggagcctt gatttatcag ggtgactgcg 840
taccttttgt ataatgggtc agcgacttat attctgtagc aaggttaacc gaatagggga 900
gccgtaggga aaccgagtct taactgggcg aatgagttgc agggtataga cccgaaaccc 960
ggtgatctag ccatgggcag gttgaaggtt gggtaacact aactggagga ccgaaccgac 1020
taatgttgaa aaattagcgg atgacttgtg gctgggggtg aaaggccaat caaaccggga 1080
gatagctggt tctccccgaa agctatttag gtagcgcctc gtgaactcat cttcgggggt 1140
agagcactgt ttcggctagg gggtcatccc gacttaccaa cccgatgcaa actacgaata 1200
ccgaagaatg ttatcacggg agacacacgg cgggtgctaa cgttcgtcgt gaagagggaa 1260
acaacccaga ccgccagcta aggtcccaaa gtcatggtta agtgggaaac gaagtgggaa 1320
ggctcagaca gccaggatgt tggcttagaa gcagccatca tttaaagaaa gcgtaatagc 1380
tcactggtcg agtcggcctg cgcggaagat gtaacggggc taaaccatgc accgaagctg 1440
cggcagcgac atgtaaatgt tgttgggtag gggagcgttc tgtaagcctg tgaaggtgtg 1500
ctgcgaggcc atgctggagg tatcagaagt gcgaatgctg acataagtaa cgataatgcg 1560
ggtgaaaaac ccgcacgccg gaagaccaag ggttcctgtc caacgttaat cggggcaggg 1620
tgagtcgacc cctaaggcga ggcagaaatg cgtagtcgat gggaaacagg ttaatattcc 1680
tgtactggtg ataattgcga tggggggacg gagaaggcta ggctggccgg gcgacggttg 1740
tcccggttta aggatgtagg tgggtgaatt aggcaaatcc ggttcgctat acactgaggt 1800
ctgatgacga gtcactacgg tggcgaagta gctcatgccc cgcttccagg aaaagcctct 1860
aagctctaga ttatcattaa tcgtacccca aaccgacaca ggtggtcagg tagagaatac 1920
tcaggcgctt gagagaactc gggtgaagga actaggcaaa atggtgccgt aacttcggga 1980
gaaggcacgc tggcattagg tgaagtggtt tacccatgga gctgaagcca gtcgcagata 2040
ccagctggct gcaactgttt attaaaaaca cagcactgtg caaacacgaa agtggacgta 2100
tacggtgtga cgcctgcccg gtgctggaag gttaattgat ggggttatcc gtaaggagaa 2160
gctcttgatc gaagccccag taaacggcgg ccgtaactat aacggtccta aggtagcgaa 2220
attccttgtc gggtaagttc cgacctgcac gaatggcgta atgatggcca ggctgtctcc 2280
acccgagact cagtgaaatt gaactcgctg tgaagatgca gtgtacccgc ggcaagacgg 2340
aaagaccccg tgaaccttta ctatagcttg acactgaaca ttgagccttg atgtgtagga 2400
taggtgggag gctttgaagt gtggacgcca gtttgcatgg agccaacctt gaaataccac 2460
cctttaatgt ttgatgttct aacgtagccc cataatttgg ggtgcggaca gtgtttggtg 2520
ggtagtttga ctggggcggt ctcctcccaa agcgtaacgg aggagcacga aggttggcta 2580
agcatggtcg gacatcatgc ggttagtgca aaggcataag ccagcttgac tgcgagagtg 2640
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atcgctcaac ggataaaagg tactccgggg ataacaggct gataccgccc aagagt 2756
<210> 31
<211> 2718
<212> DNA
<213> Salmonella bongori
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2718)
<223> 23S rDNA gene
<400> 31
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cgtttgagat attttctctt taaaaatttg ggtcaagctg aaaattggaa cacagaacaa 180
cgaaagttgt tcgtgagtct ttcaattatc gcaatctgaa gagaaacatt tttgggttgt 240
gaggttaagc gaccaagcgt acacggtgga tgccctggca gtcagaggcg atgaaggacg 300
tgctaatctg cgaaaagcgc cggcgaggtg atatgaaccc ttgacccggc gatgtccgaa 360
tggggaaacc cagtgtgact cgtcacacta tcattaactg aatccatagg ttaatgaggc 420
gaaccggggg aactgaaaca tctaagtacc ccgaggaaaa gaaatcaacc gagattcccc 480
cagtagcggc gagcgaacgg ggaggagccc agagcctgaa tcagcaggtg tgttagtgga 540
agcgtctgga aaggcacgcg atacagggtg agagccccgt acacgaaaat gcacctggtg 600
tgagctcgat gagtagggcg ggacacgtgg tatcctgtct gaatatgggg ggaccatcct 660
ccaaggctaa atactcctga ctgaccgata gtgaaccagt accgtgaggg aaaggcgaaa 720
agaaccccgg cgaggggagt gaaaaagaac ctgaaaccgt gtacgtacaa gcagtgggag 780
cacaggttta cctgtgtgac tgcgtacctt ttgtataatg ggtcagcgac ttatattctg 840
tagcaaggtt aaccgaatag gggagccgga gggaaaccga gtcttaaccg ggcgttaagt 900
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ctcgtgaact catctccggg ggtagagcac tgtttcggct agggggccat cccggcttac 1140
caacccgatg caaactgcga ataccggaga atgttatcac gggagacaca cggcgggtgc 1200
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tgcttccagg aaaagcctct aagcgtcagg taacatcaaa tcgtacccca aaccgacaca 1860
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atggtgccgt aacttcggga gaaggcacgc tgacatgtag gtgaagcggt ttacccgtgg 1980
agctgaagtc agtcgaagat accagctggc tgcaactgtt tattaaaaac acagcactgt 2040
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tggggtcagc gcaagcgaag ctcctgatcg aagccccggt aaacggcggc cgtaactata 2160
acggtcctaa ggtagcgaaa ttccttgtcg ggtaagttcc gacctgcacg aatggcgtaa 2220
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tggtccttga tgtgcaggat aggtgggagg ctttgaagcg tggacgccag tttgcgtgga 2400
gccgtccttg aaataccacc ctttaatggc tggtgttcta acgtgggccc ctgaccgggg 2460
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ataccgccca agagtcaa 2718
<210> 32
<211> 2543
<212> DNA
<213> Shigella boydii
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2543)
<223> 23S rDNA gene
<400> 32
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gacgtgctaa tctgcgataa gcgtcggtaa ggtgatatga accattataa ccggcgattt 180
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tattgtgagc tcgatgagta gggcgggaca cgtggtatcc tgtctgaata tggggggacc 480
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cgaaaagaac cccggcgagg ggagtgaaaa agaacctgaa accgtgtacg tacaagcagt 600
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ctgtccaacg ttaatcgggg cagggtgagt cgacccctaa ggcgaggccg aaaggcgtag 1440
tcgatgggaa acaggttaat attcctgtac ttggtgttac tgcgaagggg ggacggagaa 1500
ggctatgttg gccgggcgac ggttgtcccg gtttaagcgt gtaggctggt tttccaggca 1560
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caaaatggtg ccgtaacttc gggagaaggc acgctgatat gtaggtgaag tccctcgcgg 1800
atggagctga aatcagtcga agataccagc tggctgcaac tgtttattaa aaacacagca 1860
ctgtgcaaac acgaaagtgg acgtatacgg tgtgacgcct gcccggtgcc ggaaggttaa 1920
ttgatggggt cagcgcaagc gaagctcttg atcgaagccc cggtaaacgg cggccgtaac 1980
tataacggtc ctaaggtagc gaaattcctt gtcgggtaag ttccgacctg cacgaatggc 2040
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cgggttgcgg accagtgtct ggtgggtagt ttgactgggg cggtctcctc ctaaagagta 2340
acggaggagc acgaaggttg gctaatcctg gtcggacatc aggaggttag tgcaatggca 2400
taagccagct tgactgcgag cgtgacggcg cgagcaggtg cgaaagcagg tcatagtgat 2460
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ggctgatacc gcccaagagt caa 2543
<210> 33
<211> 2477
<212> DNA
<213> Shigella dysentriae
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2477)
<223> 23S rDNA gene
<400> 33
tcgggttgtg aggttaagcg actaagcgta cacggtggat gccctggcag tcagaggcga 60
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gttaagttgc agggtataga cccgaaaccc ggtgatctag ccatgggcag gttgaaggtt 720
gggtaacact aactggagga ccgaaccgac taatgttgaa aaattagcgg atgacttgtg 780
gctgggggtg aaaggccaat caaaccggga gatagctggt tctccccgaa agctatttag 840
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gacttaccaa cccgatgcaa actgcgaata ccggagaatg ttatcacggg agacacacgg 960
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ggagcgttct gtaagcctgt gaaggtgtac tgtgaggtat gctggaggta tcaaaagtgc 1260
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gcaaatccgg aaaatcaagg ctgaggtgtg atgacgaggc actacggtgc tgaagcaaca 1560
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cgacacaggt ggtcaggtag agaataccaa ggcgcttgag agaactcggg tgaaggaact 1680
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gatgcagtgt acccgcggca agacggaaag accccgtgaa cctttactat agcttgacac 2100
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atccgggttg cggaccagtg tctggtgggt agtttgactg gggcggtctc ctcctaaaga 2280
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gatccggtgg ttctgaatgg aagggccatc gctcaacgga taaaaggtac tccggggata 2460
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<210> 34
<211> 2543
<212> DNA
<213> Shigella sonnei
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2543)
<223> 23S rDNA gene
<400> 34
gttcgtgagt ctctcaaatt ttcgcaacac gatgatgaat cgaaagaaac atcttcgggt 60
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cgaatgggga aacccagtgt gattcgtcac actatcatta actgaatcca taggttaatg 240
aggcgaaccg ggggaactga aacatctaag taccccgagg aaaagaaatc aaccgagatt 300
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attgtgagct cgatgagtag ggcgggacac gtggtatcct gtctgaatat ggggggacca 480
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gttgcagggt atagacccga aacccggtga tctagccatg ggcaggttga aggttgggta 780
acactaactg gaggaccgaa ccgactaatg ttgaaaaatt agcggatgac ttgtggctgg 840
gggtgaaagg ccaatcaaac cgggagatag ctggttctcc ccgaaagcta tttaggtagc 900
gcctcgtgaa ttcatctccg ggggtagagc actgtttcgg caagggggtc atcccgactt 960
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gcagtgtacc cgcggcaaga cggaaagacc ccgtgaacct ttactatagc ttgacactga 2160
acattgagcc ttgatgtgta ggataggtgg gaggctttga agtgtggacg ccagtctgca 2220
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cgggttgcgg accagtgtct ggtgggtagt ttgactgggg cggtctcctc ctaaagagta 2340
acggaggagc acgaaggttg gctaatcctg gtcggacatc aggaggttag tgcaatggca 2400
taagccagct tgactgcgag cgtgacggcg cgagcaggtg cgaaagcagg tcatagtgat 2460
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<210> 35
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<212> DNA
<213> Staphylococcus saprophyticus
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2366)
<223> 23S rDNA gene
<400> 35
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ccgacttacg ttgaaaagtg agcggatgag ttgtgggtag cggagaaatt ccaatcgaac 840
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tgtggattgt ccgtaaggac aatggtagga gagcgttcta agggcgttga agcatgatcg 1260
caaggacatg tggagcgctt agaagtgaga atgccggtgt gagtagcgaa agacgggtga 1320
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taaggtgagc gaccgaactc tcgttaagga actcggcaaa atgaccccgt atcttcggga 1740
gaaggggtgc tctttagggt taacgcccag gagagccgca gtgaataggc ccaagcgact 1800
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tcctacccgc acgaaaggcg taacgatttg ggcactgtct caacgagagc ctcggtgaaa 2040
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tactgtagtc tgatattgaa attcggcaca gcttgtacag gataggtagg agcctgagat 2160
acgtgagcgc tagcttacgt ggaggcgttg gtgggatact accctcgctg tgttggattt 2220
ctaacccgcc accatttatc atggtgggag acagtgtcag atgggcagtt tgacaggggc 2280
ggtcgcctcc taaagagtaa cggaggcgct caaaggcttc ctcagaaggg ttggaaatca 2340
ttcatagagt gtaaagtcat aaggaa 2366
<210> 36
<211> 2843
<212> DNA
<213> Streptococcus bovis
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2843)
<223> 23S rDNA gene
<400> 36
cccgaagtcg gtgaggtaac cttttggagc cagccgccta aggtgggata gatgattggg 60
gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga aggtgcggct ggatcacctc ctttctaagg 120
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gagaaagcaa acgcgattgc cttagtagcg gcgagcgaaa aggtaagagg gcaaaccgat 660
gtgtttacac atcggggttg taggactgcg ttgtgggacg acaagattat agaagaatta 720
cctgggaagg taagccaaag agagtaacag cctcgtattc gaaatagtct ttaaccctag 780
cagtatcctg agtacggcga gacacgagaa atctcgtcgg aatctgggag gaccatctcc 840
taaccctaaa tactctctag tgaccgatag tgaaccagta ccgtgaggga aaggtgaaaa 900
gcaccccggg aggggagtga aatagaacct gaaaccgtgt gcctacaaca agttcgagcc 960
cgttaatggg tgagagcgtg ccttttgtag aatgaaccgg cgagttacga tatgatgcga 1020
ggttaagttg aagagacgga gccgtaggga aaccgagtct taatagggcg acttagtatc 1080
atgtcgtaga cccgaaacca tgtgacctac ccatgagcag ggtgaaggtg aggtaaaact 1140
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aaattccaaa cgaacttgga gatagctggt tctctccgaa atagctttag ggctagcgtc 1260
gatgttaagt ctcttggagg tagagcactg tttgattgag gggtccatcc cggattacca 1320
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attcaaagag tgcgtaatag ctcactagtc gagtgaccct gcgccgaaaa tgtaccgggg 1560
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ggttgatatt cctgtactag agtatatagt gatggaggga cgcagtaggc taactaaagc 1860
gtgcgattgg aagtgcacgt ctaagcagtg aggtgtgata tgagtcaaat gcttatatct 1920
ataacattga gctgtgatgg ggagcgaagt taagtagcga agttagtgat gtcacactgc 1980
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ctaacccaga taggttatcc ctatcggaga cagtgtttga cgggcagttt gactggggcg 2640
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<210> 37
<211> 2486
<212> DNA
<213> Yersinia pseudotuberculosis
<220>
<221> rRNA
<222> (1)..(2486)
<223> 23S rDNA gene
<400> 37
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Claims (17)
- 서열번호 1 내지 37 중 어느 하나의 염기서열 및 그 중 일부를 포함하는 세균의 감별을 위한 23S rDNA 유전자의 표적 DNA.
- 서열번호 38 내지 135 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 세균의 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
- 서열번호 136 내지 1484 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 세균의 원인균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
- 제 2항 또는 제 3항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세균 증폭용 프라이머 세트.
- 제 2항 또는 제 3항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 세균 감별용 프로브 세트.
- 제 2항 또는 제 3항에 따른 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 키트.
- 제 2항에 따른 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 및 제 3항에 따른 원인균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 한 세트의 프라이머로 포함하는 PCR 키트.
- 제 7항에 있어서, 원인균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 키트.
- 제 2항에 따른 세균 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 및 제 3항에 따른 원인균 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 이용하여 이를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
- 제 9항에 있어서, 원인균 종 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 프로브로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제 9항에 있어서, 상기 프로브는 데옥시뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 또는 펩타이드뉴클레오티드(PNA), 락크드뉴클레오티드(LNA) 및 디-헥시톨뉴클레오티드(HNA)에서 선택된 핵산유사체인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 제 9에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘, 젤(gel), 나노(nano) 재료, 세라믹, 금속재료, 광섬유 또는 이들을 조합하여 만들어지는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
- 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 제 6항에 따른 PCR 키트를 이용하여 증폭하는 단계, 및 상기 증폭된 DNA를 전기영동 장치에 의해 분석하는 단계를 포함하는 세균 감별 및 검출 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 핵산 증폭 단계는 Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, RT-PCR(reverse transcriptase PCR), DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 반응을 이용하는 것을 특징으로 하는 세균 감별 및 검출 방법.
- 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 핵산증폭단계를 거치거나 또는 거치 지 않고 타이라미드 신호 증폭(tyramide signal amplification)이나 금 나노입자 프로브(gold nanoparticle probe)와 라만-활성 염료(Raman-active dye)등을 이용한 신호 증폭(signal amplification) 반응을 시키는 단계, 상기 증폭된 DNA 및 RNA의 형광을 검출하는 단계를 포함하는 세균 감별 및 검출방법.
- 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 제 9항에 따른 마이크로어레이상의 프로브와 혼성화시키는 단계, 및 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 세균 감별 및 검출 방법.
- 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 아시네토박터 속(서열번호 136번에서 196번), 에어로모나스 속(서열번호 197번에서 216번), 바실러스 속(서열번호 217번에서 228번), 박테로이즈 속(서열번호 229번에서 334번), 보데텔라 속(서열번호 335번에서 383번), 보렐리아 속(서열번호 384번에서 494번), 브루셀라 속(서열번호 495번에서 510번), 벌코데리아 속(서열번호 511번에서 527번), 켐필로박터 속(서열번호 528번에서 587번), 클라미디아 속(서열번호 588번에서 630번), 시트로박터 속(서열번호 631번에서 653번), 클로스트리디움 속(서열번호 654번에서 669번), 코리네박테리움 속(서열번호 670번에서 697번), 엔테로박터 속(서열번호 698번), 엔테로코커스 속(서열번호 699번에서 703번), 퓨조박테리움 속(서열번호 704번에서 725번), 헤모필러스 속(서열번호 726번에서 730번), 헬리코박터 속(서열 번호 731번에서 753번), 클렙시엘라 속(서열번호 754번에서 759번), 레지오넬라 속(서열번호 760번에서 819번), 리스테리아 속(서열번호 820번에서 853번), 모가넬라 속(서열번호 854번에서 871번), 마이코박테리움 속(서열번호 872번에서 880번), 마이코플라스마 속(서열번호 881번에서 891번), 네이세리아 속(서열번호 892번에서 963번), 펩토코커스 속(서열번호 964번에서 1082번), 플레시오모나스 속(서열번호 1083번에서 1130번), 폴피로모나스 속(서열번호 1131번에서 1220번), 프로피오니박테리움 속(서열번호 1221번에서 1224번), 프로비덴시아 속(서열번호 1225번에서 1237번), 슈도모나스 속(서열번호 1238번에서 1253번), 살모넬라 속(서열번호 1254번에서 1256번), 쉬겔라 속(서열번호 1257번에서 1267번), 스타필로코커스 속(서열번호 1268번에서 1286번), 스트렙토코커스 속(서열번호 1287번에서 1298번), 트리포네마 속(서열번호 1299번에서 1396번), 우레아플라스마 속(서열번호 1397번에서 1474번), 비브리오 속(서열번호 1475번에서 1478번) 및 예시니아 속(서열번호 1479번에서 1484번)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균을 동시에 탐지하는 것을 특징으로 하는 세균 감별 및 검출방법.
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