JP2011521651A - サルモネラの検出および/またはモニタリングのための組成物、キットおよび関連方法 - Google Patents
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Abstract
Description
T時間=(閾値−b)/m
本明細書で使用される場合、「相対蛍光単位」(「RFU」)という用語は、蛍光強度の尺度の任意単位である。RFUは測定のために使用される検出手段の特徴に伴って変化する。
特定の態様および実施形態において、本明細書は、サルモネラの同定、検出、および/または定量のための組成物、方法、およびキットに関する。このサルモネラは、試験のため、例えば、診断試験のため、血液製剤のスクリーニングのため、バイオプロセス、食物、水、工業サンプルまたは環境サンプルにおける微生物検出のため、および他の目的のために採取されたサンプル中で、単独で、または核酸の均一もしくは不均一な混合物の多いかもしくは少ない成分としてのいずれかで存在する可能性がある。本明細書に開示される特定の方法、組成物、およびキットは、増幅に基づくサルモネラの検出における検出の感度、特異性、または速度の改善を提供する。サルモネラリボソームRNAは、E.coli、Shigella sp.、Citrobacter sp.、Enterobacter sp.、および他の潜在的な腸内細菌と非常に密接に関連している。従って、本明細書の特定の実施形態において、サルモネラアッセイは、サルモネラ属のほぼすべての種、亜種、および血清型に共通なrRNA配列を同定し、他の腸内細菌からサルモネラを区別する。このような区別のために有用な領域は23S rRNAの350領域である。
標的核酸は、実行される増幅アッセイの目的に基づいて任意の数の供給源から単離されてもよい。標的核酸の供給源には、臨床試料、例えば、血液、尿、唾液、糞便、精液、または髄液、犯罪の証拠からの試料、環境サンプル、例えば、水もしくは土壌サンプルからの試料、食物からの試料、工業サンプルからの試料、cDNAライブラリーからの試料、または全細胞RNAからの試料が含まれるがこれらに限定されない。必要な場合、標的核酸は、種々のオリゴヌクレオチドとの相互作用のために利用可能にされる。これは、例えば、細胞から標的核酸を放出させるための細胞溶解または細胞透過を含んでもよく、これに、次いで、一連の単離工程および洗浄工程などの1つ以上の精製工程が続いてもよい。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Clarkら「Method for Extracting Nucleic Acids from a Wide Range of Organisms」米国特許第5,786,208号を参照のこと。これは、例えば、血液サンプルに存在するヘムなど、増幅反応と干渉する可能性がある成分をサンプルが含む可能性がある場合に特に重要である。その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Ryderら「Amplification of Nucleic Acids from Mononuclear Cells Using Iron Complexing and Other Agents」米国特許第5,639,599号を参照のこと。増幅のための種々の供給源から標的核酸を調製するための方法は当業者に周知である。標的核酸は、本明細書に記載される増幅反応の前にある程度まで精製されてもよいが、他の場合において、サンプルは、いかなるさらなる操作も伴うことなく、増幅反応に加えられる。
特定の実施形態において、核酸は、参照核酸の連続する塩基領域に対して少なくとも70%;または75%;または80%、または85%または90%、または95%;または100%同一である連続する塩基領域を含む。短い核酸については、「問い合わせ」核酸の塩基領域と参照核酸の塩基領域の間の同一性の程度は、手動のアラインメントによって決定可能である。「同一性」は、比較される核酸の糖領域およびバックボーン領域とは関係なく、窒素性塩基の配列のみを比較することによって決定される。従って、問い合わせ:参照塩基配列アラインメントは、DNA:DNA、RNA:RNA、DNA:RNA、RNA:DNA、またはその任意の組み合わせまたはアナログであってもよい。等価なRNAおよびDNAの塩基配列は、U(RNA中)をT(DNA中)に変換することによって比較可能である。
オリゴヌクレオチドは、実質的に任意の長さであり得、増幅反応におけるまたは増幅反応の増幅産物を検出する際のその特異的機能によってのみ限定される。しかし、特定の実施形態において、好ましいオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に対して相補的である、少なくとも約10個;または12個;または14個;または16個;または18個;または20個;または22個;または24個;または26個;または28個;または30個;または32個;または34個;または36個;または38個;または40個;または42個;または44個;または46個;または48個;または50個;または52個;または54個;または56個の連続する塩基を含む。これらの連続する塩基は、そのオリゴヌクレオチドが結合する標的配列に対して、好ましくは、少なくとも約80%相補的であり、より好ましくは、少なくとも約90%相補的であり、そして最も好ましくは、完全に相補的である。特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、一般的には、約10〜100の間;または12〜75の間;または14〜50の間;または15〜40の間の塩基長であり、任意に修飾ヌクレオチドを含むことができる。
ブロッキング部分は、小さな分子、例えば、リン酸またはアンモニウム基であってもよく、あるいはこれは、修飾ヌクレオチド、例えば、3’2’ジデオキシヌクレオチドもしくは3’デオキシアデノシン5’三リン酸(コルジセピン)または他の修飾ヌクレオチドであってもよい。さらなるブロッキング部分には、例えば、3’末端に遊離のヒドロキシル基が存在しないように、3’から5’の方向を有するヌクレオチドもしくは短いヌクレオチド配列の使用、3’アルキル基、3’非ヌクレオチド部分(例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Arnoldら、「Non−Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes」米国特許第6,031,091号を参照のこと)、ホスホロチオエート、アルカン−ジオール残基、ペプチド核酸(PNA)、3’末端に3’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド残基、または核酸結合タンパク質の使用が含まれる。好ましくは、3’ブロッキング部分は、3’から5’の方向または3’非ヌクレオチド部分を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含み、3’2’ジデオキシヌクレオチドまたは遊離のヒドロキシル基を有する3’末端を含まない。3’ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製するためのさらなる方法は当業者には周知である。
プライミングオリゴヌクレオチドは、その3’末端に共有結合されたヌクレオチド塩基の付加によって伸長され、その塩基は鋳型に対して相補的である。結果はプライマー伸長産物である。適切かつ好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは本明細書に記載されている。知られている実質的にすべてのDNAポリメラーゼ(逆転写酵素を含む)は、DNA合成を開始するために一本鎖鋳型(「プライミング」)へのオリゴヌクレオチドの複合体形成を必要とするのに対して、RNAの複製および転写は(DNAからのRNAのコピー作製)、一般的に、プライマーを必要としない。DNAポリメラーゼによって伸長されるまさしくその性質により、プライミングオリゴヌクレオチドは3’ブロッキング部分を含まない。
結合するために、このようなトランスクリプターゼは、伸長反応を経由してプロモーター配列を含む領域中で二本鎖にされたDNAを必要としたと一般的に考えられていた。しかし、RNAの効率的な転写は、二本鎖プロモーターが鋳型核酸との伸長反応を通して形成されない条件下でさえも起こり得ることが決定された。鋳型核酸(転写される配列)は二本鎖である必要はない。個々のDNA依存性RNAポリメラーゼは、種々の異なるプロモーター配列を認識し、これらは、転写を促進する際のそれらの効率が顕著に変化し得る。RNAポリメラーゼが転写を開始するためにプロモーター配列に結合するとき、そのプロモーター配列は転写される配列の一部ではない。従って、それによって産生されるRNA転写物は、その配列を含まない。
終結オリゴヌクレオチドまたは「ブロッカー」は、新生核酸鎖についての所望の3’末端を達成するために十分な位置において、標的核酸にハイブリダイズするように設計される。終結オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に依存して柔軟性がある。終結オリゴヌクレオチドは、修飾されているかまたは非修飾であり得る。特定の実施形態において、終結オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つ以上の2’−O−メチルリボヌクレオチドを用いて合成される。これらの修飾ヌクレオチドは、相補的二重鎖のより高い熱安定性を実証した。2’−O−メチルリボヌクレアーゼはまた、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を増加させるように機能し、それによって、修飾オリゴヌクレオチドの半減期を増加させる。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Majlessiら(1988)Nucleic Acids Res.26,2224−9を参照のこと。本明細書の他の箇所に記載されているような他の修飾は、2’−O−メチルリボヌクレオチドに加えて、またはその代わりに利用されてもよい。例えば、終結オリゴヌクレオチドは、PNAまたはLNAを含んでもよい。例えば、その内容がそれによって参照により本明細書に援用される、Petersenら(2000)J.Mol.Recognit.13,44−53を参照のこと。終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、伸長を妨害するために、その3’末端においてブロッキング部分を含む。終結オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによる新生核酸鎖の伸長をさらに終結させるように、オリゴヌクレオチドに連結されたタンパク質またはペプチドもまた含んでもよい。適切かつ好ましい終結オリゴヌクレオチドは本明細書に記載される。終結オリゴヌクレオチドは、典型的にはまたは必然的に3’ブロッキング部分を含むのに対し、「3’ブロックされた」オリゴヌクレオチドは、必ずしも終結オリゴヌクレオチドである必要はないことが注目される。本明細書に開示されるような他のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモーターオリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチドは、同様に、典型的にはまたは必然的に3’ブロックされている。
エクステンダーオリゴヌクレオチドは、プロモーターオリゴヌクレオチドの最初の領域の3’末端に隣接するかまたはその近傍のDNA鋳型にハイブリダイズする。エクステンダーオリゴヌクレオチドは、好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの5’末端塩基がプロモーターオリゴヌクレオチドの3’末端塩基の3塩基、2塩基、または1塩基以内にあるように、DNA鋳型にハイブリダイズする。最も好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの5’末端塩基は、エクステンダーオリゴヌクレオチドおよびプロモーターオリゴヌクレオチドがDNA鋳型にハイブリダイズされるときに、プロモーターオリゴヌクレオチドの3’末端塩基に隣接している。エクステンダーオリゴヌクレオチドの伸長を妨害するために、3’末端ブロッキング部分が典型的には含まれる。
当業者によって理解されるように、プローブは、ヒトの介入なしで天然には見い出されない型である(例えば、外因性核酸で組換えされ、単離され、またはある程度まで精製されている)、単離された核酸分子またはそのアナログを含む。プローブは、ヌクレオシドまたは核酸塩基がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションに実質的に影響を与えない限り、検出プローブの場合には、標的核酸への優先的なハイブリダイゼーションを妨害しない限り、標的とされる領域の外側のさらなるヌクレオシドまたは核酸塩基を有してもよい。標的捕捉配列(一般的には、ホモポリマートラクト、例えば、ポリA、ポリT、またはポリUテール)、プロモーター配列、RNA転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位などの非相補的配列もまた含められてもよく、または、プローブ上または標的核酸上またはその両方での触媒活性部位またはヘアピン構造などの所望の二次構造または三次構造を付与する配列を含んでもよい。
核酸ハイブリダイゼーションは、それによって、安定な二本鎖ハイブリッドを形成するための所定の反応条件下で、完全にまたは部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する2つの核酸鎖が一緒になるプロセスである。核酸鎖は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)またはそのアナログのいずれかであり得る。従って、ハイブリダイゼーションは、RNA:RNAハイブリッド、DNA:DNAハイブリッド、RNA:DNAハイブリッド、またはそのアナログを含むことができる。時折ハイブリッドと呼ばれる、この二本鎖構造の構成要素である2つの鎖は、水素結合によってまとめられている。これらの水素結合は、単一の核酸鎖上で塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル(AおよびTもしくはU)またはシトシンおよびグアニン(CおよびG)を含むヌクレオチド間で最も一般的には形成しているが、塩基対形成は、これらの「基準の」対合のメンバーではない塩基間でもまた形成し得る。基準ではない塩基対形成は当該分野において周知である(例えば、Roger L.P.Adamsら「The Biochemistry Of The Nucleic Acids」(第11版、1992))を参照のこと)。
核酸増幅の多くの周知の方法は、二本鎖核酸を変性させ、そしてプライマーをハイブリダイズすることを交互に行う熱サイクルを必要とする;しかし、核酸増幅の他の周知の方法は等温である。一般的にはPCRと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応(米国特許第4,683,195号;同第4,683,202号;同第4,800,159号;同第4,965,188号)は、変性、プライマー対の逆ストランドへのアニーリング、および標的配列のコピー数を指数関数的に増加させるためのプライマー伸長の複数のサイクルを使用する。RT−PCRと呼ばれるバリエーションでは、逆転写酵素(RT)が、mRNAから相補DNA(cDNA)を作製するために使用され、次いで、cDNAがPCRによって増幅されて、DNAの複数のコピーを生成する。LCRと一般的に呼ばれるリガーゼ連鎖反応(Weiss、R.1991、Science 254 1292)は、標的核酸の隣接する領域にハイブリダイズする相補的DNAオリゴヌクレオチドの2つのセットを使用する。DNAオリゴヌクレオチドは、熱変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションの反復サイクルにおいてDNAリガーゼによって共有結合され、検出可能な二本鎖のライゲーションされたオリゴヌクレオチド産物を生成する。別の方法は、SDAと一般的に呼ばれる鎖置換増幅であり(Walker、G.ら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392−396、米国特許第5,270,184号および同第5,455,166号)、これは、標的配列の逆ストランドへのプライマー配列の対のアニーリング、dNTPαSの存在下での二重鎖ヘミホスホロチオエート化プライマー伸長産物を生成するためのプライマー伸長、ヘミ修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介ニック形成、ならびに既存の鎖を置き換え、かつ次のラウンドのプライマーアニーリング、ニック形成、および鎖置き換えのための鎖を生成する、ニックの3’末端からのポリメラーゼ媒介プライマー伸長のサイクルを使用して、産物の幾何学的な増幅を生じる。好熱性SDA(tSDA)は、本質的に同じ方法において、より高い温度で好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼを使用する(ヨーロッパ特許第0 684 315号)。他の増幅方法には以下が含まれる:一般的にはNASBAと呼ばれる、核酸配列に基づく増幅(米国特許第5,130,238号);一般的にはQ−βレプリカーゼと呼ばれる、プローブ分子それ自体を増幅するためにRNAレプリカーゼを使用するもの(Lizardi、P.ら、1988、BioTechnol.6 1197−1202);転写に基づく増幅方法(Kwoh、D.ら、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173−1177);自律的な配列複製(Guatelli,J.ら、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874−1878);および一般的にはTMAと呼ばれる転写媒介増幅(米国特許第5,480,784号および同第5,399,491号)。公知の増幅方法のさらなる議論については、Persing,David H.、1993、「In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques」Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persingら編)所収、51−87頁(American Society for Microbiology、Washington、DC)を参照のこと。
特定の実施形態において、例えば、標的捕捉アプローチを使用して、増幅の前にサンプルからの標的核酸を精製または富化することが好ましくあり得る。「標的捕捉」(TC)とは、一般的に、磁気的に引きつけることが可能な粒子などの固体支持体に標的ポリヌクレオチドを捕捉することをいい、ここでは、固体支持体が、標的ポリヌクレオチドの精製手順の1回以上の洗浄工程の間に標的ポリヌクレオチドを保持している。このやり方で、標的ポリヌクレオチドは、次の核酸増幅工程の前に実質的に精製される。多数の標的捕捉方法が公知であり、本明細書に記載される方法と併せての使用のために適切である。
特異的核酸ハイブリダイゼーションをモニタリングするために使用できる本質的に任意の標識および/または検出系が、サルモネラアンプリコンを検出することに連動して使用できる。このような多くの系が公知でありかつ当業者に利用可能であり、その説明的な例は以下で手短に議論される。
本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるようなサルモネラ核酸を増幅および検出するための好ましい部位は、サルモネラ23S rRNAの350領域に存在することが見い出されている。さらに、この領域中の特に好ましいオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドセットは、感度、選択性、および特異性の改善を伴ってサルモネラ23Sを増幅するために同定された。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、高度な特異性でサルモネラ標的配列にハイブリダイズ可能であり、結果として、サンプル中のサルモネラの存在および/またはレベルを検出し、かつ他の腸内細菌の存在からサルモネラを区別するために使用できる核酸増幅反応に加えることが可能であることが理解される。
例証的なアッセイ試薬およびプロトコールの説明
以下の実施例は、本明細書に記載されるリアルタイムTMA実験において使用される典型的なアッセイ試薬、プロトコール、条件などを説明する。反対のことが特定されない限り、試薬調製、設備の準備、およびアッセイプロトコールは、本質的に以下に示されるように実施した。
1.増幅試薬。「増幅試薬」または「Amp試薬」は、以下の成分のおよその濃度を含んだ:50mM HEPES緩衝液 pH 7.7中、0.5mM dATP、0.5mM dCTP、0.5mM dGTP、0.5mM dTTP、10mM ATP、2mM CTP、2mM GTP、12.7mM UTP、30mM MgCl2、および33mM KCl。プライマーおよび他のオリゴヌクレオチドは、Amp試薬に加えた。
・キングフィッシャー(KingFisher)(登録商標)96(Thermo Electron,Waltham,MA)
・FLUOstar(BMG LABTECH,Germany)
・エッペンドルフ(eppendorf)(登録商標)サーモミキサー(Thermomixer)R 022670565(Eppendorf Corporation,Westbury,NY)
・ハードシェルシンウォール96ウェルスカート付きPCRプレート(Hard−Shell Thin−Wall 96−Well Skirted PCR Plates)、着色シェル/白色ウェル、カタログ番号:HSP−9615、HSP−9625、HSP−9635)(BioRad Hercules,CA)
・キングフィッシャー(KingFisher)(登録商標)96チップコーム、DWマグネット用(カタログ番号:97002534)Thermo Electron,Waltham,MA)
・DW 96プレート、V底、ポリプロピレン、滅菌25pcs/ケース(Axygen カタログ番号:P−2ML−SQ−C−S;VWRカタログ番号47749−874)
・キングフィッシャー(KingFisher)(登録商標)96KFプレート(200マイクロリットル)(カタログ番号:97002540)
・PTI(登録商標)プレートリーダー
・Chromo4(商標)プレートリーダー
C.標的捕捉
サンプルは、標的を遊離させ、rRNAを安定化するために溶解試薬と混合した。標的捕捉試薬を加えた。キングフィッシャー96精製システムを使用して、リボソームRNA試薬を捕捉し、磁気粒子上で精製した。粒子は、分析物用にFAM標識されたトーチを、内部対照用にTAMRA標識されたトーチを含む増幅試薬中に再懸濁した。引き続く増幅のために核酸サンプルを精製および調製するための典型的な標的捕捉手順は、本質的に以下に記載されるように実施した。100μLの試験サンプル、標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む50μLのTCR、および1mL 溶解試薬を合わせ、60℃で15分間インキュベートした。洗浄溶液ならびに適切な磁気粒子洗浄および分離デバイス(例えば、磁気分離ラック、GEN−PROBE(登録商標)Target Capture System、Gen−Probeカタログ番号5207、またはThermo Labsystemsから利用可能であるキングフィッシャー(登録商標)磁気粒子プロセッサーシステム)を使用して、処理された反応混液からのTCR磁気粒子を捕捉および洗浄した。洗浄後、磁気粒子は100μLの増幅試薬に再懸濁した。
リアルタイムTMA増幅反応は、本質的に以下のように実施した。Amp試薬中の30μLのサンプル、増幅および検出オリゴヌクレオチド、または標的捕捉手順からのAmp試薬中30μLの再懸濁粒子を、60℃で10分間インキュベートした。次いで、エッペンドルフサーモミキサーインキュベーター上で温度を低下させ、反応混液を42℃まで15分間平衡化させた。10μLの酵素試薬を加えた。分析物および内部対照の同時の増幅および検出のために、反応混液を混合し、リアルタイム検出システム(例えば、Bio−Rad Laboratoriesから利用可能であるOpticon(商標)もしくはChromo4(商標)検出システム、またはPTI FluoDia(登録商標)T70機器)の中で、42℃にて75分間、インキュベートした。
サルモネラオリゴヌクレオチドセットの設計および初期試験
E.coli rRNA配列の350領域に対応する領域を使用して、いくつかのT7プロバイダー、ブロッカー、プライマー、およびトーチを設計した。この領域は他の非サルモネラ腸内細菌に対して独特であるミスマッチを含むので、この領域を選択した。
サルモネラ属研究課題のための設計は、16S rRNAの450領域において開始した(表7)。配列は、上記に議論した23S rRNAにおけるものと同じ様式でスクリーニングした。アッセイのための設計は、塩基450から490の間に示されるミスマッチに焦点を当てた。Citrobacter株およびEnterobacter株は、この領域においてサルモネラと同一ではないとしても、非常に近いことが示された。S.bongoriおよびS.arizonaeは、他のサルモネラよりもE.coliに類似しており、偽陰性生成のリスクをもたらすこともまた決定された。初期のスクリーニング結果は、試験したCitrobacter株およびEnterobacter株を区別することが16Sオリゴヌクレオチド系では不可能であることを示した。このデータは、この系に固有であった非常に高い偽陽性の割合を示した。初期のスクリーニング結果に基づいて、代替的な設計(23S−350領域)を用いて先に進めることを決定した。EnterobacterおよびCitrobacterが区別できなかったからである。
サルモネラオリゴヌクレオチドセットのさらなる同定
バックグラウンドシグナルをさらに減少させ、特異性および感度を改善するために、多数のさらなるオリゴヌクレオチドセットを設計し、試験した。
サルモネラオリゴヌクレオチドセットのさらなる特徴付けおよび最適化
セット番号9よりも良好な特異性を示すセット番号7の結果、およびセット番号7よりもより良好な感度を示すセット番号9の結果に基づいて、T7プロバイダーとプライマーの両方のオリゴヌクレオチドの新たなオリゴヌクレオチド再設計を準備した。
新たに再設計されたT7オリゴヌクレオチドプロバイダーは、配列番号59のブロッカー配列、配列番号49のプライマー配列、および配列番号66のトーチ配列と組み合わせて、試験し、もともとの配列番号1のT7プロバイダー配列と比較し、E.coliに対して最小限の交差反応性を提供した。増幅性能は、セット番号7と比較した、各セットのオリゴヌクレオチドについて評価した。標的はすべて、配列番号74の配列を使用して、標的捕捉工程を経由した。これらのデータおよび曲線の形状から、配列番号24および26のT7プロバイダー配列をさらに評価するために選択した。
E.coliへの他の可能なミスマッチを利用するように、およびE.coliへの配列番号49の配列の交差反応性を減少させるために、配列番号50および51のプライマーオリゴヌクレオチドを配列番号49の配列から再設計した。試験は、ベースライン性能測定を確立するために、標的捕捉なしで行った。
標的捕捉組み込みおよび内部対照(IC)組み込みの評価
7種のサルモネラ23S標的捕捉オリゴヌクレオチド(配列番号71〜77)を、2つのセットの増幅オリゴヌクレオチド:セット番号7およびセット番号9を使用して試験した。標的捕捉手順は、様々な量のS.Enteritidis GP60 rRNAで、1E+7コピーのE.coli GP88 rRNAに対して実施した。2種の潜在的に有用な標的捕捉オリゴヌクレオチド(TCO)配列を同定した(配列番号71および74)。全体として、観察されたT時間は、純粋な系よりも約8〜10分遅かった。配列番号74の標的捕捉オリゴヌクレオチドは、すべての引き続く実験における使用のために選択した。
感度、特異性、干渉、検出限界、交差反応性、および結果までの時間
ステージI
感度
Salmonella Enteritidis、ATCC 13076を1E+5コピー/反応でアッセイした。溶解緩衝液を陰性対照として使用した。標的捕捉のためにキングフィッシャー96機器を、検出のためにPTIリーダーを使用して、20の陽性(105コピーのrRNA/アッセイ)を試験した。20の陰性(溶解緩衝液)を対照として使用した。標的捕捉のためのインプットは1mLであり、標的捕捉のためのアウトプットは100μLであり、そのうちの30μLを増幅において使用した。陽性判断基準は1,000RFUであった。20の複製のうち19は、>95%陽性比率で検出されるべきものであった。初期のラウンドの試験後に、19未満の複製が陽性であった場合、40のさらなる複製が試験されるべきであった。ステージI−感度の試験は、1E+5コピー/反応でSalmonella Enteritidisについての100%比率の陽性を生じ、0コピーで0%偽陽性を生じた。
標的生物に密接に関連しているが、rRNA分析によって遺伝子型が区別される生物を陰性として選択した。標的捕捉のためにキングフィッシャー96機器を、プライマーのアニーリングおよび酵素添加のためにエッペンドルフサーモミキサーを、および検出のためにPTIリーダーを使用して、8例のチャレンジ生物を1E+7コピー/rxnで試験した。すべてのチャレンジ生物(8)の20回の反応を、増幅した各反応の1つの複製とともに試験した(105コピーのrRNA、約100CFU/アッセイ)。S.Enteritidis、ATCC 13076を、1E+5コピー/rxnで陽性対照として使用し、溶解溶液を陰性対照として使用した。陽性判断基準は1,000RFUであった。160反応のうちの8反応以下は、≦5%の合わせた偽陽性比率の目的に合致するべきものであった(105コピーの非標的rRNAを区別し、検出しない)。8例の生物にわたるいかなる偽陽性の分散も考慮されるべきものであった。集団化した偽陽性を有する生物≧4は、再試験され、さらに調べられるべきものであった。ステージI特異性試験は、試験したチャレンジ生物のいずれに対しても0%陽性を示し、陽性対照では100%陽性であった。
目的は、サンプル濃縮デバイスから得られることが予想される、一定量の溶解緩衝液に混入された10〜100CFU rRNAにほぼ等価であるrRNAの反復可能な検出であった。試験は、低コピー数の所望のrRNAおよび107コピーrRNA(約10,000CFU)の最も近い近隣生物を含めることであった。S.Enteritidis、ATCC 13076は、ベースライン標的として使用し、1E+5コピーrRNA/反応で試験した(約100CFU)。8例のチャレンジ生物は、0(溶解溶液のみ)または1E+7コピー(約10,000CFU)の濃度でサンプルに混入した。キングフィッシャー96およびPTIリーダーを使用してアッセイを実施した。すべての条件は、12の複製で、1,000RFUの陽性判断基準で試験した。結果は、最も近い近隣生物の存在下での陽性の再現性を報告するものであった。試験した生物にわたる干渉の分散は考慮されるべきものであった。干渉を示す生物は、再試験され、さらに調査されるべきものであった。ステージI干渉試験は、すべてのチャレンジサンプルおよび陽性対照において100%陽性を示した。
20例の家禽洗浄液をGen−Probeで分析して、家禽洗浄液に関連する通常フローラの見積もりを提供した。20例の洗浄液のうちの18例が、Gen−Probeの外部の供給源から受容した1バッチの一部であった。その他の2例のサンプルが、2箇所の地方の食料品店で購入したニワトリからGen−Probeで導き出された。TSAプレート上での総好気性菌数のための希釈プレーティングを行った。各家禽洗浄液サンプルの1E+1〜1E+4の希釈は、1×リン酸緩衝化生理食塩水中で調製した。100μLの非希釈、1E+1〜1E+4の洗浄液希釈液を、トリプシン処理ダイズ寒天(TSA)プレート上でプレーティングした。
ステージII性能試験は、緩衝化ペプトン水(BPW)中での予備増幅アッセイを評価した。この評価は純粋な培養溶解物を使用した。サンプル調製装置は含まれなかった。すべての陽性対照(1E+5コピー/アッセイ)は、S.enterica ssp.enterica sv.Enteritidis ATCC 13076から単離した精製RNAを使用し、陰性対照は溶解溶液:BPW(7:3)であった。300μL BPWおよび700μL 溶解緩衝液(サンプルありまたはサンプルなし)を使用して、標的捕捉のための1mL インプットを作製した。標的捕捉のためのインプットは1mLであり、標的捕捉のためのアウトプットは100μLであり、その30μLを増幅のために使用した。
S.enterica ssp.enterica sv.Choleraesuis (ATCC 10708)、S.enterica ssp.enterica sv.Typhi(ATCC 19430)、およびS.enterica ssp.enterica sv.Typhimurium(ATCC 13311)を、1E4−5E4コピーRNA/アッセイ(約10〜50 CFU)のレベルで試験した。3つすべての種および陰性対照(混入していないBPW)は20の複製で試験した。標的捕捉はキングフィッシャー96機器上で実施し、エッペンドルフサーモサイクラー上での酵素添加を用い、続いてPTIリーダー上での検出を行った。感度についての陽性判断基準パラメーターは1,000RFUであった。20の複製のうちの19が陽性であるべきであった。20のうちの19未満が陽性であるならば、40の複製のさらなる試験が必要であった。感度について試験したすべての生物はステージIIの要件を通過した。
目的は、アッセイインプット量あたり103〜104の等価なコピーrRNA(約1〜10CFU)の反復可能な検出であった。反復可能な検出は≧95%陽性として定義した。S.enterica ssp.enterica sv.Choleraesuis(ATCC 10708)、S.enterica ssp.enterica sv.Typhi(ATCC 19430)、S.enterica ssp.enterica sv.Typhimurium(ATCC 13311)、S.enterica ssp.enterica sv.Enteritidis(ATCC 13076)、S.enterica ssp.enterica sv.Gallinarum(ATCC 9184)、およびS.enterica ssp.arizonae(ATCC 29933)は、1E3−1E4コピーRNA/アッセイのレベルで試験した(約1〜10 CFU)。標的捕捉はキングフィッシャー96機器上で実施し、エッペンドルフサーモミキサー上での酵素添加を用い、そしてPTIリーダー上での検出を行った。各種について、20の複製物で試験した。溶解物は、CFU中で定量した純粋な培養標的生物から調製し、溶解して約1〜10CFUに等価なレベルの核酸標的を提供した。陽性判断基準は1,000RFUであった。S.Enteritidis、ATCC 13076は、陽性対照ならびに試験のために必要とされる株の両方で考慮した。LOD試験のために、陽性対照RNAは1E+4コピー/アッセイで使用した。判断基準は、試験した種のすべてについて≧95%陽性であった。20のうちの19未満が陽性である場合、さらなる40の複製のさらなる試験が必要であった。すべての生物がステージII要件を通過した。
22例の包括的生物および22例の排他的生物を、1E+5コピー/アッセイ(約100CFU)で試験した。試験は、標的捕捉のためにキングフィッシャー96機器上で実施し、エッペンドルフサーモミキサー上で酵素添加を行い、そして検出のためにPTIリーダーを用いた。包括的種については4つの複製、排他的種については8つの複製ですべてを試験した。
ステージIIのための各アッセイ実行の時間は、サンプルを深いウェルプレートに加えた時点からPTIリーダープロトコールの最後まで追跡した。サンプルローディングからPTIリーダーの開始までの平均時間は、96サンプルについて2時間18分であった。PTIリーダー時間は75分で不変であった。従って、開始から終了までの全体のアッセイは、96サンプルについて平均で3時間33分であった。
混入した牛ひき肉およびアイスクリームの食品試験
日常生活サンプルを用いるプロトタイプサルモネラアッセイの機能性を試験するために、牛ひき肉およびアイスクリームを地方のスーパーマーケットから購入し、既知量のS.Enteritidis GP60を混入させ、そしてStomacher(登録商標)サンプリングバッグ中の緩衝化ペプトン水中で増殖させた。様々な時点で、サンプルを取り出し、XLD寒天選択培地を使用するコロニー係数のために、およびプロトタイプサルモネラアッセイを使用するリアルタイムTMAのために処理した。本研究において続く種々の工程は以下に記載される。S.Enteritidis GP60のMcFarland 1を作製した。TSAプレート(無菌PBS中で1E+6まで希釈した)中のCFU計数の確認を実施した。25gの食品を秤量し、Stomacherバッグ中に無菌的に配置した。20CFUを225mLの緩衝化ペプトン水に直接接種した。混入させた培地は、食品を含有するStomacherバッグに注ぎ、2分間、200rpmで処理した。サンプルは35℃でインキュベートした。1mLアリコート(プレート計数における使用のために1アリコート)を0、4、6、8、および24時間の時点で取り出した。サンプルは、CFU計数のために、選択的寒天、XLDプレート上、3希釈、1プレート/希釈でプレートし、35℃でインキュベートした。24時間の時間内にサンプリングした残りの5アリコートは、12,000×gで30秒間遠心分離した。上清を除去し、500μLの50mM コハク酸緩衝液(0.6M LiCl、1% LiLS、pH 4.8)をペレットに加え、次いで、20秒間激しくボルテックスした。サンプルを少なくとも15分間、>95℃に加熱した。次いで、これを、12,000×gで1分間遠心分離した。上清を新しい標識したチューブに移した。サンプルを−70℃で凍結させた。食物対照は以下を含んだ:牛ひき肉については2つの陽性および2つの陰性、プレーンバニラアイスクリームについては2つの陽性および2つの陰性、ならびに培地のみの純粋系については2つの陽性および1つの陰性。
225mlの培地あたり12CFU周辺の接種材料を使用して、牛ひき肉に混入させたサルモネラは、緩衝化ペプトン水(BPW)中での4時間のインキュベーション後に約280CFU/mlまで増殖した。混入させたアイスクリーム中では、BPW中での6時間のインキュベーション後に20CFU/mlを観察した。牛ひき肉は、アイスクリームよりも他の腸内細菌で実質的に多く汚染されており、4時間のインキュベーション後に1,000CFU/mlを超えた。いかなる食品サンプルも有さない混入させた培地は、4時間のインキュベーション後に約20CFU/mlであった。24時間までに、BPW中のすべての混入させた食品サンプルおよび混入させていない食品サンプルは>1.5E+7 CFU/mlを有した。すべての陰性の混入させていない培地対照はいかなる増殖も示さなかった。これらの結果は、CFUタイミングに関するリアルタイムTMAから得られたデータおよびリアルタイムTMAを使用する陽性検出可能シグナルの初期の出現を裏付ける。
サルモネラ核酸の2つの領域、E.coli 16S rRNAの約380〜約630ヌクレオチド塩基位置に対応する「450領域」およびE.coli 23s rRNAの約150〜約425ヌクレオチド塩基位置に対応する「350領域」を標的とする増幅オリゴヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチドを設計し、評価のために合成した。16S−450領域における設計は、サルモネラ属アッセイのための良好なオリゴヌクレオチド候補を生じなかった。これらのオリゴヌクレオチドは、CitrobacterおよびEnterobacterと交差反応した。
Claims (145)
- T7プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物であって、該T7プロバイダーオリゴヌクレオチドがE.coli 23S rRNAの塩基約268〜320に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドがサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該T7オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、組成物。 - 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基268〜302に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜310に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜309に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜306に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜302に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約338〜395に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜374に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜370に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜366に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- T7プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物であって、該T7プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはE.coli 23S rRNAの塩基約338〜395に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該T7オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、組成物。 - 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜374に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項11に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜370に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項11に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜366に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項11に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1、3、4、5、11、12、13、または14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1、3、4、11、12、13、または14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1、3、11、12、13、または14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1、2、11、12、13、または14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1、11、12、13、または14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項1〜8、11、または12のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが配列番号17またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号50またはその相補物の配列である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーが配列番号26またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号49またはその相補物の配列である、請求項1、3、4、5、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、または23のいずれか1項に記載の組成物。
- 検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項26に記載の組成物。
- 前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号66、67、68、69、70、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項27に記載の組成物。
- ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号59、60、61、62、63、64、65、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項29に記載の組成物。
- 配列番号17またはその相補物の配列のT7プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号50またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号66またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号59またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号74またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物。
- 配列番号26またはその相補物の配列のT7プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号49またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号66またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号59またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号74またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための組成物。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも90%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して100%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、1個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、2個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、3個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、4個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、5個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも90%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して100%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、1個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、2個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、3個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、4個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、5個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項1、11、31、または32のいずれか1項に記載の組成物。
- T7プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキットであって、ここで、該T7プロバイダーオリゴヌクレオチドはE.coli 23S rRNAの塩基約268〜320に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該T7オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、キット。 - 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基268〜302に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜310に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜309に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜306に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜302に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約338〜395に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47〜52のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜374に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47〜52のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜370に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47〜53のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜366に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項47〜52のいずれか1項に記載のキット。
- T7プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキットであって、該T7プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはE.coli 23S rRNAの塩基約338〜395に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該T7オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、キット。 - 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜374に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項57に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜370に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項57に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜366に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項57に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47〜60に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47、49、50、51、57、58、59、または60のいずれか1項に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47、49、50、57、58、59、または60のいずれか1項に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47、49、57、58、59、または60のいずれか1項に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47、48、57、58、59、または60のいずれか1項に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47、57、58、59、または60のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47〜60のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47〜59のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項47、48、49、50、51、52、53、54、57、または58のいずれか1項に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが配列番号17またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号50またはその相補物の配列である、請求項47〜69のいずれか1項に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーが配列番号26またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号49またはその相補物の配列である、請求項47、49、50、51、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、または69のいずれか1項に記載のキット。
- 検出オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項47〜71のいずれか1項に記載のキット。
- 前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項72に記載のキット。
- 前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号66、67、68、69、70、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項73に記載のキット。
- ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項47〜71のいずれか1項に記載のキット。
- 前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号59、60、61、62、63、64、65、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項75に記載のキット。
- 配列番号17またはその相補物の配列のT7プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号50またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号66またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号59またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号74またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキット。
- 配列番号26またはその相補物の配列のT7プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号49またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号66またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号59またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号74またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のためのキット。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも90%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して100%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、1個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、2個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、3個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、4個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、5個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも90%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して100%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、1個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、2個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、3個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、4個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、5個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項47、57、77、または78のいずれか1項に記載のキット。
- サンプル中のサルモネラを検出するための方法であって、該方法はT7プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実行する工程を包含し、該T7プロバイダーオリゴヌクレオチドはE.coli 23S rRNAの塩基約268〜320に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該T7オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドは増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、方法。 - 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基268〜302に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜310に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜309に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜306に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基279〜302に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約338〜395に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93〜98のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜374に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93〜98のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜370に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93〜98のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基約349〜366に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項93〜98のいずれか1項に記載の方法。
- サンプル中のサルモネラを検出するための方法であって、該方法は、T7プロバイダーオリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実施する工程を包含し、該T7プロバイダーオリゴヌクレオチドはサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、そして該プライマーオリゴヌクレオチドはE.coli 23S rRNAの塩基約338〜395に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とし、
ここで、該増幅アッセイにおいて使用される該T7オリゴヌクレオチドおよび該プライマーオリゴヌクレオチドが、増幅される該サルモネラ核酸配列の逆ストランドを標的とする、方法。 - 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜374に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項103に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜370に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項103に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、E.coli 23S rRNAの塩基349〜366に対応するサルモネラ核酸の領域中の配列を標的とする、請求項103に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93〜106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93、95、96、97、103、104、105、または106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93、95、96、103、104、105、または106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93、95、103、104、105、または106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93、94、103、104、105、または106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93、103、104、105、または106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93〜106のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、48、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93、94、95、96、97、98、99、100、101、103、104、または105のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項93、94、95、96、97、98、99、100、103、または104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが配列番号17またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号50またはその相補物の配列である、請求項93〜115のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーが配列番号26またはその相補物の配列であり、前記プライマーオリゴヌクレオチドが配列番号49またはその相補物の配列である、請求項93、95、96、97、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、または115のいずれか1項に記載の方法。
- 検出オリゴヌクレオチドを用いて増幅された核酸を検出する工程をさらに含む、請求項93〜117のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出オリゴヌクレオチドがトーチオリゴヌクレオチドまたは分子ビーコンである、請求項118に記載の方法。
- 前記トーチオリゴヌクレオチドが配列番号66、67、68、69、70、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項119に記載の方法。
- ブロッカーオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項93〜120のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ブロッカーオリゴヌクレオチドが配列番号59、60、61、62、63、64、65、およびそれらの相補物の配列から選択される、請求項121に記載の組成物。
- 配列番号17またはその相補物の配列のT7プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号50またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号66またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号59またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号74またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための方法。
- 配列番号26またはその相補物の配列のT7プロバイダーオリゴヌクレオチド、配列番号49またはその相補物の配列のプライマーオリゴヌクレオチド、配列番号66またはその相補物の配列の検出オリゴヌクレオチド、配列番号59またはその相補物の配列のブロッカーオリゴヌクレオチド、および配列番号74またはその相補物の配列の標的捕捉オリゴヌクレオチドを含む、サルモネラ核酸増幅アッセイにおける使用のための方法。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも90%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記T7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、標的とされるサルモネラ核酸配列に対して100%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、1個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、2個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、3個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、4個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるT7プロバイダーオリゴヌクレオチドが、5個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して少なくとも90%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プライマーオリゴヌクレオチドが、前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して100%相補的である15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、1個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、2個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、3個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマーオリゴヌクレオチドが、4個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的とされるサルモネラ核酸配列に対して相補的であるプライマープロバイダーオリゴヌクレオチドが、5個のミスマッチを有する15〜35ヌクレオチドを含む、請求項93、103、123、または124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅された核酸を検出する工程がリアルタイムで行われる、請求項119に記載の方法。
- 密接に関連する腸内細菌の存在下でサルモネラ核酸が特異的に検出される、請求項139に記載の方法。
- サルモネラ核酸が、E.coli、Enterobacter、Citrobacter、Shigella、Psuedomonas、およびListeriaのうちの少なくとも1種の存在下で特異的に検出される、請求項139に記載の方法。
- サルモネラ核酸が、E.coli、E.vulneris、E.hermannii、E.cloacae、E.aerogenes、E.hoshinae、P.mirabilis、C.brakii、P.fluorescens、S.flexneri、C.freundii、C.koseri/diversus、K.pneumoniae、S.marcescens、L.innocua、E.faecalis、C.jejuni、C.coli、S.pneumoniaeのうちの少なくとも1種の存在下で特異的に検出される、請求項139に記載の方法。
- サルモネラ23Sリボソーム核酸の350領域のフラグメントを増幅するように設計された2つ以上の増幅オリゴヌクレオチドを含む、サンプル中のサルモネラを検出するための組成物。
- サルモネラ23Sリボソーム核酸を検出するための1種以上のプローブをさらに含む、請求項143に記載の組成物。
- 請求項143に記載の増幅オリゴヌクレオチドを使用して核酸増幅アッセイを実施する工程、および増幅された核酸を請求項144に記載の1種以上のプローブを用いて検出する工程を包含する、サンプル中のサルモネラの存在を検出するための方法。
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