WO2017007291A1 - 표면 증강 라만 산란 입자를 이용한 핵산 분자 검출 방법 - Google Patents

표면 증강 라만 산란 입자를 이용한 핵산 분자 검출 방법 Download PDF

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WO2017007291A1
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nucleic acid
acid molecule
raman
nanoparticles
molecule
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PCT/KR2016/007511
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정대홍
이윤식
이호영
이민우
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서울대학교산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering

Definitions

  • the technology disclosed herein relates to a nucleic acid molecule detection method, and more particularly, to a method for detecting nucleic acid molecules simply and accurately without introducing a labeling substance.
  • DNA detection methods are important techniques in the field of genetic disease diagnosis, drug screening and gene profiling.
  • the most common method is the PCR amplification method, which is the most competitive technology in many cases.
  • the optical method used as an alternative technique uses a labeled detection method that uses fluorescently labeled DNA that allows the target DNA to complementarily identify and confirm the probe DNA.
  • Optical-based DNA detection is a method of checking the presence or absence of DNA binding by introducing a substance that emits a specific signal to target DNA or a third DNA capable of complementary binding. There are disadvantages. Optical based RNA detection methods also have the same disadvantages.
  • the Raman reporter molecule may comprise at least a compound having an isocyanide (-NC) function or a cyanide (-CN) function.
  • the Raman band of the Raman reporter molecule moves in a lower energy direction, and the lower the zeta potential of the nanoparticle, the Raman The Raman band of the reporter molecule can move in the high energy direction.
  • the Raman band of the Raman reporter molecule may move in a high energy direction.
  • the nanoparticles may be mounted on the support beads.
  • the support bead is a polymer bead, silica beads or silica beads containing a magnetic material
  • the technology disclosed herein is based on nucleic acid based on surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) without the use of additional optical labeling material that exhibits binding of target DNA or target RNA. Molecules can be detected.
  • SERS surface enhanced Raman spectroscopy
  • FIG. 1 is a process flow diagram showing a method for detecting a nucleic acid molecule according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 2 shows two embodiments of the binding form between gold nanoparticles (AuNP) and probe DNA.
  • FIG 3 is a diagram showing the change in the SERS spectrum with the introduction of the Raman reporter molecule having an NC functional group.
  • FIG. 4 illustrates an embodiment of a process for detecting a target nucleic acid molecule using surface-enhanced Raman scattering particles having NC-SERS nanoparticles mounted on SERS beads.
  • NC-SERS particles 5 is a schematic diagram of the synthesis of bumpy gold nanoparticles used in NC-SERS particles.
  • TEM transmission electron microscope
  • SEM electron scanning microscope
  • a method of detecting a nucleic acid molecule is provided.
  • 1 is a process flow diagram showing a method for detecting a nucleic acid molecule according to an embodiment of the present invention.
  • step S1 surface enhanced Raman scattering particles containing nanoparticles into which a Raman reporter molecule and a probe nucleic acid molecule are introduced are provided.
  • step S2 the target nucleic acid molecule is hybridized to the probe nucleic acid molecule.
  • the hybridization in step S3 induces a change in the surface and ambient charge of the nanoparticles.
  • step S4 the shift of the surface-enhanced Raman scattering band of the Raman marker according to the change of the charge is observed.
  • step S5 it is determined whether the target nucleic acid molecule is present according to the movement of the surface enhanced Raman scattering band.
  • the nanoparticles used as probes are not particularly limited in shape, and are spherical particles, strawberry or sea urchin spherical particles having various types of nanoparticles on their surface, anisotropic particles, hollow particles, asymmetric particles, and cornered particles. It may be at least one selected from the group consisting of.
  • the nanoparticles can have, for example, nanospheres, nanorods, nanocubes, and many geometric and non-geometric forms.
  • Particularly anisotropic particles or cornered particles in the form of rods, triangles, prisms, cubes, etc. can provide a stronger signal compared to spherical particles in Raman scattering.
  • the shape as well as the size of the nanoparticles can be appropriately controlled. Methods of preparing the various types of nanoparticles described above are known in numerous literature.
  • the nanoparticles when the Raman scattered light is used as the optical detection signal, the nanoparticles may be metals such as gold, silver, palladium, platinum, aluminum, copper, or nanoparticles of oxide or semiconductor.
  • the nanoparticles may be gold nanoparticles or silver nanoparticles in terms of high Raman scattering strength, easy surface modification, and excellent biocompatibility.
  • a probe nucleic acid molecule for detecting a target nucleic acid molecule is fixed to the nanoparticle.
  • the probe nucleic acid molecule can, for example, have a single stranded DNA form and hybridize with the nucleic acid molecule of interest in another single stranded DNA form complementary thereto.
  • the nucleic acid molecule may be DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), PNA (peptide nucleic acid) or LNA (locked nucleic acid).
  • DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotide, and RNA may comprise genomic RNA, mRNA, oligonucleotide.
  • the nanoparticle surface and / or the probe nucleic acid molecule may be modified with specific functional groups such that the probe nucleic acid molecule may be immobilized on the nanoparticle surface.
  • the probe nucleic acid molecule is immobilized with an amine group, a thiol group, an aldehyde group, a carboxyl group, an alkyne group, a cyclic alkene group, an azide, or the like, and a carboxyl group or the like on the surface of the nanoparticle.
  • An amine group, maleimide group, alkyne group, cyclic alkene group, azide group, etc. may be introduced to chemically bond between them.
  • the fixing of the probe nucleic acid molecule may be performed by binding by electrostatic attraction with the surface of the nanoparticle.
  • activated amines such as poly (allylamine) hydrochloride (PAH) onto the surface of the nanoparticles to have positive charges
  • negatively charged DNA can be immobilized on the nanoparticles by electrostatic attraction.
  • FIG. 2 shows two embodiments of the binding form between gold nanoparticles (AuNP) and probe DNA.
  • A shows the electrostatic bond between the gold nanoparticles and the probe DNA
  • b shows the chemical bond between the gold nanoparticles and the probe DNA.
  • DI deionized water
  • (b) shows a process of reacting the aldehyde-modified probe DNA with NaCNBH 3 reducing agent under acetate buffer (pH 5.2) to chemically bind the probe DNA to the gold nanoparticles and then bind the target DNA.
  • the Raman signal from the Raman reporter molecule attached to the nanoparticles may be greatly increased by the surface-enhanced Raman scattering (SERS) phenomenon by the introduction of the nanoparticles.
  • SERS surface-enhanced Raman scattering
  • the kind of said Raman reporter molecule is not specifically limited, The compound which has a functional group with strong affinity with a nanoparticle at the terminal is preferable.
  • the Raman reporter molecule is for example 4,4'-dipyridyl (DP), crystal violet (CV), 4-mercapto toluene (4-MT), 3,5-dimethyl benzenethiol (3,5-DMT ), Thiophenol (TP), 4-amino thiophenol (4-ATP), benzenethiol (BT), 4-bromo benzenethiol (4-BBT), 2-bromobenzenethiol (2-BBT), 4 -Isopropyl benzenethiol (4-IBT), 2-naphthalene thiol (2-NT), 3,4-dichloro benzenethiol (3,4-DCT), 3,5-dichloro benzenethiol (3,5-DCT) , 4-chloro benzenethiol (4-CBT), 2-chloro benzenethiol (2-CBT), 2-fluoro benzenethiol (2-FBT), 4-fluoro benzenethio
  • Aromatic compounds containing various thiol groups, azide groups, cyano groups, isocyano groups, thiisocyano groups, etc. may be used as the Raman reporter molecules because they have strong affinity with nanoparticles and are easily analyzed by Raman spectroscopy. .
  • the Raman reporter molecule may be a compound having an isocyanide (-NC) functional group or a cyanide (-CN) functional group.
  • an isocyanide functional group or a cyanide functional group will be collectively referred to as an "NC functional group”.
  • surface-enhanced Raman scattering particles having a nanoparticle form in which a Raman reporter molecule having a NC functional group and a probe nucleic acid molecule are introduced together will be referred to as "NC-SERS particles”.
  • the Raman signal position of the Raman reporter molecule may shift depending on the charge change of the surface and surroundings of the metal nanoparticle.
  • a platform for detecting nucleic acid molecules such as DNA or RNA having a negative charge can be realized. That is, when the probe nucleic acid molecule is bound to the metal nanoparticle and hybridized by introducing the target nucleic acid molecule in order to detect the target nucleic acid molecule, a change in the surface and the surrounding charge of the metal nanoparticle may be induced by the hybridization.
  • the surface charges of the metal nanoparticles have a larger negative charge than before hybridization, thereby causing a blue shift of the Raman band of the Raman reporter molecule having the isocyanide functional group. do. If no hybridization occurs, there is no change in this Raman band position.
  • FIG. 3 is a diagram showing the change in the SERS spectrum with the introduction of the Raman reporter molecule having an NC functional group.
  • the surface-enhanced Raman band of the Raman reporter molecule having the NC functional group is transferred according to the change of the surface charge of the gold nanoparticle.
  • Raman band shifts result in a change in the ligand ⁇ -back bonding electron density as the metal's charge distribution changes at the bond between the NC functional group and the metal atom, thereby changing the bond strength and This is because the vibration frequency is different.
  • isocyanide molecule It means a substance having a functional group.
  • the isocyanide molecules and the metal nanoparticles are chemically bonded through the coordinative bonds provided by providing the non-covalent electron pairs present in the C atom to the metal nanoparticles.
  • the metal may have a back donation toward the NC bond in the metal, thereby increasing the electron density of the NC ⁇ * orbital. This decreases the frequency caused by the NC functional group as opposed to increasing the positive charge.
  • the empirically said Raman reporter molecule is an aromatic compound having isocyanide functional groups.
  • the Raman reporter molecule are 1,3-phenylene diisocyanide, 1,4-phenylene diisocyanide 2,6-dimethylphenyl iso cyanide (2,6-dimethylphenyl isocyanide), 4- methoxyphenyl isocyanatomethyl cyanide (4-methoxyphenyl isocyanide), p - toluenesulfonyl methylisobutyl when cyanide (p -toluenesulfonylmethyl isocyanide), 2- naphthyl this SOCIETE cyanide ( 2-naphthyl isocyanide, 2-chloro-6-methylphenyl isocyanide, 2-chloro-6-methylphenyl isocyanide, benzyl isoyanide It may be at least one selected from the group consisting of cyanide (benzyl isocyanide),
  • the NC stretching bands of these molecules are observed between 2100 and 2200 cm -1 , and when they are fixed to metal nanoparticles, such as when surface is modified with a specific chemical or when nucleic acid molecules are introduced. If the surface potential of the metal nanoparticles changes according to the change of the surrounding environment, the original band may move by several to several tens of cm ⁇ 1 .
  • the Raman reporter molecule used for SERS particles for nucleic acid detection comprises at least a compound having an NC functional group.
  • SERS particles are provided that are capable of multiplexing.
  • the Raman reporter molecule may include a compound having an NC functional group for detecting hybridization of the target nucleic acid molecule and another compound for discriminating the type of the target nucleic acid molecule. In this case, hybridization of the target DNA can be confirmed by band shift of the NC functional group, and what kind of DNA can be read by another Raman band.
  • nucleic acid detection As described above, according to the method for detecting nucleic acid molecules using NC-SERS particles, unlike other Raman-based nucleic acid detection systems, there is no need for a separate labeling material to directly change physical properties due to nucleic acid binding. The detection enables label free nucleic acid detection.
  • the NC-SERS particles may be mounted on the support beads.
  • the support beads may be polymer beads, silica beads or silica beads containing a magnetic material.
  • FIG. 4 illustrates an embodiment of a process for detecting a target nucleic acid molecule using surface-enhanced Raman scattering particles having NC-SERS nanoparticles mounted on SERS beads.
  • FIG. 4 after mounting an NC-SERS probe on magnetic or nonmagnetic SERS beads encoded with various SERS markers, observing the shift of the NC-SERS band, it is possible to confirm the binding of DNA or RNA. It is possible to multiplex using the SERS band of the SERS marker introduced into the (magnetic) SERS beads.
  • the term "(magnetic) SERS beads” is meant to include SERS beads that contain magnetic material as well as SERS beads that do not contain the magnetic material discussed above. At this time, if the magnetic beads are used, the particles can be easily separated using magnetic.
  • the above-described nucleic acid molecule detection method can be utilized in an easy genome diagnosis system and various genome detection fields.
  • AuBP Bumpy-shaped gold nanoparticles
  • 0.2 mL of a 20 mM HAuCl4 solution was added to a solution containing 0.8 mL of a 100 mM HEPES solution adjusted to pH 7.4 using a NaOH 1 M solution and 19.2 mL of distilled water.
  • the mixed solution was reacted for 3 hours in an incubator at a temperature of 25 °C.
  • the reaction solution was centrifuged three times for 15 minutes at 5000 rpm using a centrifuge. Finally, the obtained gold nanoparticles were dispersed again in 20 mL of distilled water.
  • Figure 5 is a schematic diagram of the synthesis process of bumpy gold nanoparticles used in NC-SERS particles
  • Figure 6 is a transmission electron microscope (TEM) image and electron scanning microscope (SEM) of the synthesized bumpy gold nanoparticles
  • 7 is a UV / Vis absorption spectrum of the synthesized bumpy gold nanoparticles.
  • FIG. 8 shows Raman spectra results of bumpy gold nanoparticles (AuBP) and spherical gold nanoparticles (AuNP).
  • AuBP bumpy gold nanoparticles
  • AuNP spherical gold nanoparticles
  • the Raman spectrum of the bumpy gold nanoparticle-based NC-SERS particles shows that the bumpy gold nanoparticle-based NC-SERS particles have a much higher signal than the spherical gold nanoparticle-based NC-SERS particles.
  • Spherical gold nanoparticles (AuNP) used for signal contrast were synthesized using Gold (III) chloride trihydrate (product number 520918) and sodium citrate tribasic dihydrate (product number S4641) obtained from Sigma Aldrich. 50 mL of 0.01% Gold (III) chloride trihydrate solution was heated to 100 ° C.
  • PAH polyallylamine hydrochloride, average molecular weight 45000 g / mol
  • the mixture was stirred at 500 rpm, stirred for about 12 hours, and centrifuged three times for 15 minutes at 5000 rpm using a centrifuge. Finally, 1 mL of distilled water was added to disperse AuBP again.
  • Probe nucleic acid molecule binding (Surf DNA): Disperse 1 mL of AuBP solution introduced up to PAH in a solution with sodium chloride concentration of 0.3 M, add probe nucleic acid molecules (100 ⁇ M, 10 ⁇ L) and react with shaker for 12 hours. I was. Thereafter, the reaction solution was centrifuged three times for 15 minutes at 5000 rpm using a centrifuge, and the obtained particles were dispersed in distilled water again.
  • Bind DNA of Probe Nucleic Acids 1 mL of AuNP solution or AuBP solution introduced up to PAH is dispersed again in acetate buffer of 100 mM concentration in pH 5.2 with sodium chloride concentration of 0.3 M, followed by aldehyde modified probe nucleic acid molecule (100 ⁇ M, 10 ⁇ L) and then 100 ⁇ L of 100 mM NaCNBH3 was added for binding between amine and aldehyde. After reacting for 12 hours using a shaker, the mixture was centrifuged three times for 15 minutes at 5000 rpm using a centrifuge and then dispersed in distilled water.
  • 9 shows the change in zeta potential of bumpy gold nanoparticles according to surface modification.
  • 9 (a) and 9 (b) show changes in NC-SERS probe (Surf DNA) and NC-SERS probe (Bind DNA) zeta potential, respectively.
  • the zeta potential of the bumpy nanoparticles without any treatment on the surface is -18.05 mV
  • the zeta potential when the Raman reporter having the NC functional group is treated is -11.0 mV, and has a positive charge.
  • the zeta potential when PAH was introduced was 9.43 mV.
  • Zeta potential after introduction of probe DNA was -13.2 mV (Surf DNA) and -16.9 mV (Bind DNA).
  • FIG 10 is a result showing the shift of the SERS signal of the bump-type gold nanoparticle-based NC-SERS probe according to the surface modification.
  • the Raman shift which produces the maximum signal of the NC-SERS probe before surface modification, appears at 2180.5 cm -1 , and the treatment of the positively charged PAH on the surface causes the Raman band to move and become negatively charged in the lower energy direction than before treatment.
  • the Raman band can be observed to move significantly in a higher energy direction than before DNA binding.

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Abstract

라만 리포터 분자 및 탐침 핵산 분자가 도입된 나노입자를 함유한 표면 증강 라만 산란 입자를 제공하는 단계; 상기 탐침 핵산 분자에 목적 핵산 분자를 혼성화하는 단계; 상기 혼성화에 따라 상기 나노입자의 표면 및 주변 전하의 변화가 유도되는 단계; 상기 전하의 변화에 따른 상기 라만 리포터 분자의 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동을 관찰하는 단계; 및 상기 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동 여부에 따라 목적 핵산 분자의 존재 여부를 판단하는 단계를 포함하는 핵산 분자의 검출방법이 제공된다.

Description

표면 증강 라만 산란 입자를 이용한 핵산 분자 검출 방법
본 명세서에 개시된 기술은 핵산 분자 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 표지 물질의 도입이 없이 간편하고 정확하게 핵산 분자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
DNA 검출 방법은 유전병 진단, 약물 스크리닝 및 유전자 프로파일링 분야에 있어 중요한 기술이다. 다양한 DNA 검출 방법 중 가장 보편적인 방법은 PCR 증폭 방법으로 많은 경우 가장 경쟁력있는 기술이지만 노이즈 신호가 함께 증폭되므로 극미량의 DNA 분석에 한계가 있다. 이에 대한 대안 기술로 사용되는 광학적 방법은 탐침 DNA에 표적 DNA가 상보적으로 결합하고 이를 확인하게 하는 형광 표지된 DNA를 사용하는 표지화 탐지(labeled detection) 방식을 사용한다. 광학 기반의 DNA 검출법은 타깃 DNA 혹은 상보결합을 할 수 있는 제3의 DNA에 특정 신호를 내는 물질을 도입하여 DNA 결합 유무를 확인하는 방식에 해당하는 것으로, 별도의 광신호 물질을 반드시 필요로 하는 단점이 있다. 광학 기반의 RNA 검출법 또한 동일한 단점을 갖는다.
이에 보다 간편하고 효율적으로 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 검출할 수 있는 기술 개발이 요구된다.
본 명세서에 개시된 기술은 유전병 진단, 약물 스크리닝 및 유전자 검사와 같은 응용분야에서 별도의 표지 물질 없이 DNA 또는 RNA와 같은 목적 핵산 분자를 용이하게 검출하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 라만 리포터 분자 및 탐침 핵산 분자가 도입된 나노입자를 함유한 표면 증강 라만 산란 입자를 제공하는 단계; 상기 탐침 핵산 분자에 목적 핵산 분자를 혼성화하는 단계; 상기 혼성화에 따라 상기 나노입자의 표면 및 주변 전하의 변화가 유도되는 단계; 상기 전하의 변화에 따른 상기 라만 리포터 분자의 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동을 관찰하는 단계; 및 상기 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동 여부에 따라 목적 핵산 분자의 존재 여부를 판단하는 단계를 포함하는 핵산 분자의 검출방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 라만 리포터 분자는 이소시아나이드 (-NC) 관능기 또는 시아나이드 (-CN) 관능기를 갖는 화합물을 적어도 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 나노입자의 표면 및 주변 전하의 변화시 상기 나노입자의 제타전위가 높아질수록 상기 라만 리포터 분자의 라만 밴드가 낮은 에너지 방향으로 이동하고 상기 나노입자의 제타전위가 낮아질수록 상기 라만 리포터 분자의 라만 밴드가 높은 에너지 방향으로 이동할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 탐침 핵산 분자에 상기 목적 핵산 분자가 혼성화될 경우, 상기 라만 리포터 분자의 라만 밴드가 높은 에너지 방향으로 이동할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 나노입자가 지지체 비드 위에 탑재된 것일 수 있다. 상기 지지체 비드는 고분자 비드, 실리카 비드 또는 자성 물질이 포함된 실리카 비드인
본 명세서에 개시된 기술은 목적 DNA (target DNA) 또는 목적 RNA (target RNA)의 결합을 나타내는 추가적인 광 표지 물질을 사용하지 않고 표면 증강 라만 산란(surface enhanced Raman spectroscopy, 이하 SERS라 한다.) 기반으로 핵산 분자를 검출할 수 있다.
그 결과 간편하면서 고감도의 라만 기반의 비표지 핵산 검출 방법을 제공할 뿐 아니라, 이를 통해 손쉬운 유전체 진단 시스템을 구축할 수 있으며 다양한 유전체 검출 분야에 신속하고 경제적인 방법으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 분자의 검출방법을 나타낸 공정흐름도이다.
도 2는 금 나노입자(AuNP)와 탐침자 DNA 간의 결합형태의 두 가지 구현예를 나타낸다.
도 3은 NC 관능기를 갖는 라만 리포터 분자가 도입에 따른 SERS 스펙트럼의 변화를 나타낸 도면이다.
도 4는 SERS 비드에 NC-SERS 나노입자를 탑재한 표면 증강 라만 산란 입자를 이용하여 목적 핵산 분자를 검출하는 과정의 일 구현예를 나타낸다.
도 5는 NC-SERS 입자에 사용된 범피형(bumpy) 금 나노입자의 합성과정의 개략도이다.
도 6은 합성한 범피형 금 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지 및 전자주사현미경(SEM) 이미지이다.
도 7은 합성한 범피형 금 나노입자의 UV/Vis 흡수 스펙트럼이다.
도 8은 범피형 금 나노입자(AuBP)와 구형 금 나노입자(AuNP)의 라만 스펙트럼 결과이다.
도 9는 표면 개질에 따른 범피형 금 나노입자의 제타 전위의 변화를 나타낸 결과이다.
도 10은 표면개질에 따른 범피형 금 나노입자 기반의 NC-SERS 탐침자의 SERS 신호의 이동을 나타낸 결과이다.
이하, 첨부 도면을 활용하여 본 명세서에 개시된 기술을 상세히 설명하고자 한다.
본 명세서의 일 구현예에 따르면 핵산 분자의 검출방법이 제공된다. 도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 핵산 분자의 검출방법을 나타낸 공정흐름도이다. 도 1을 참조하면, 단계 S1에서 라만 리포터 분자 및 탐침 핵산 분자가 도입된 나노입자를 함유한 표면 증강 라만 산란 입자를 제공한다. 단계 S2에서 상기 탐침 핵산 분자에 목적 핵산 분자를 혼성화한다. 단계 S3에서 상기 혼성화에 따라 상기 나노입자의 표면 및 주변 전하의 변화가 유도된다. 단계 S4에서 상기 전하의 변화에 따른 상기 라만 표지물질의 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동을 관찰한다. 단계 S5에서 상기 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동 여부에 따라 목적 핵산 분자의 존재 여부를 판단한다.
통상적인 표면 증강 라만 산란 입자의 제조방법은 대한민국 공개특허 10-2009-0030775, 대한민국 공개특허 10-2008-0111950, 10-2009-0017434 등에 상세히 기술되어 있다. 탐침자로 사용되는 나노입자는 그 형상이 특별히 제한되지 않으며, 구형 입자, 표면에 다양한 형태의 나노입자가 올라간 딸기형 또는 성게형의 구형 입자, 이방성 입자, 중공 입자, 비대칭형 입자 및 모서리가 있는 입자로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 나노입자는 예를 들어 나노 구체, 나노 로드, 나노 큐브 및 다수의 기하학적 및 비기하학적 형태를 가질 수 있다. 특히 막대형, 삼각형, 프리즘, 정육면체와 같은 형태의 이방성 입자나 모서리가 있는 입자의 경우 라만 산란에 있어서 구형 입자와 비교하여 보다 강화된 신호를 제공할 수 있다. 표면 플라즈몬의 극대화를 위해 상기 나노입자의 모양뿐 아니라 크기도 적절히 제어될 수 있다. 상술한 다양한 형태의 나노입자들의 제조방법은 다수의 문헌에 공지되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 광학 검출 신호로서 라만 산란광을 이용할 경우 나노입자는 금, 은, 팔라듐, 백금, 알루미늄, 구리와 같은 금속이나, 산화물 또는 반도체의 나노입자들이 될 수 있다. 이중 라만 산란 강도가 크고 표면 개질이 용이하며 생체적합성이 뛰어난 점에서 바람직하게는 상기 나노입자는 금 나노입자 또는 은 나노입자일 수 있다.
한편 상기 나노입자에는 목적 핵산 분자(target nucleic acid molecule)를 검출하기 위한 탐침 핵산 분자(probe nucleic acid molecule)가 고정되어 있다. 상기 탐침 핵산 분자는 예를 들어 단일 가닥 DNA 형태를 가져, 이와 상보적인 또 다른 단일 가닥 DNA 형태의 목적 핵산 분자와 혼성화될 수 있다.
본 명세서에서 핵산 분자는 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(ribonucleic acid), PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)일 수 있다. 여기서 DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 탐침 핵산 분자가 상기 나노입자 표면에 고정될 수 있도록 상기 나노입자 표면 및/또는 상기 탐침 핵산 분자는 특정 관능기로 개질될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 탐침 핵산 분자의 고정은 상기 탐침 핵산 분자에 아민기, 티올기, 알데히드기, 카르복실기, 알킨기, 고리형 알켄기, 아지드 등을 도입하고, 상기 나노입자의 표면에 카르복실기나 아민기, 말레이미드기, 알킨기, 고리형 알켄기, 아지드기 등을 도입하여 이들 사이에 화학적 결합시키는 방식일 수 있다. 또는 다른 구현예에서, 상기 탐침 핵산 분자의 고정은 상기 나노입자 표면과의 정전기적 인력에 의하여 결합시키는 방식일 수 있다. 예를 들어 상기 나노입자 표면에 폴리(알릴아민)하이드로클로라이드(PAH)와 같은 활성화된 아민을 도입하여 양전하를 갖게 함으로써, 음전하로 대전되어 있는 DNA가 상기 나노입자에 정전기적 인력에 의해 고정될 수 있다.
도 2는 금 나노입자(AuNP)와 탐침자 DNA 간의 결합형태의 두 가지 구현예를 나타낸다. 이중 (a)는 금 나노입자와 탐침자 DNA 간의 정전기력에 의한 결합을 나타내고, (b)는 금 나노입자와 탐침자 DNA 간의 화학적 결합을 나타낸다. 도 2를 참조하면, 탈이온수(DI) 조건에서 PAH로 금 나노입자를 코팅하여 아민 개질한 후 탐침자 DNA와 타깃 DNA를 결합시키는 과정을 나타낸다. 이중 (a)는 DNA의 음전하와 PAH의 양전하 간의 정전기적인 결합 후 타깃 DNA를 결합시키는 과정을 나타낸다. 그리고 (b)는 알데히드 개질된 탐침자 DNA를 NaCNBH3 환원제로 아세테이트 버퍼 (pH 5.2) 조건에서 반응시켜 탐침자 DNA를 금 나노입자에 화학적으로 결합시킨 후 타깃 DNA를 결합시키는 과정을 나타낸다.
한편, 상기 나노입자의 도입에 의해 표면 증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) 현상에 의해 나노입자에 부착된 라만 리포터 분자로부터의 라만 신호가 크게 증가될 수 있다. 상기 라만 리포터 분자의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 말단에 나노입자와 친화력이 강한 기능기가 있는 화합물이 바람직하다. 상기 라만 리포터 분자는 예를 들어 4,4'-디피리딜(DP), 크리스탈 바이올렛(CV), 4-머캅토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머캅토 피리미딘(2-MPY), 2-머캅토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 그 외 다양한 티올기, 아지드기, 시아노기, 이소시아노기, 티오이소시아노기 등을 포함하는 방향족 화합물이면 나노입자와 강한 친화력이 있고 라만 분광법에 의한 분석이 용이하므로 상기 라만 리포터 분자로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 라만 리포터 분자는 이소시아나이드 (-NC) 관능기 또는 시아나이드 (-CN) 관능기를 갖는 화합물일 수 있다. 본 명세서에서 이소시아나이드 관능기 또는 시아나이드 관능기를 통칭하여 "NC 관능기"로 명명하기로 한다. 또한 NC 관능기를 갖는 라만 리포터 분자와 탐침 핵산 분자가 함께 도입된 나노입자 형태를 갖는 표면 증강 라만 산란 입자를 "NC-SERS 입자"라고 명명하기로 한다.
NC 관능기를 갖는 라만 리포터 분자가 금 또는 은과 같은 금속 나노입자에 결합시 금속 나노입자의 표면 및 주변의 전하 변화에 따라 라만 리포터 분자의 라만 신호 위치가 이동할 수 있다. 이와 같은 성질을 이용하면, 음전하를 띄는 DNA나 RNA 등의 핵산 분자를 검출하기 위한 플랫폼이 구현할 수 있다. 즉 목적 핵산 분자를 검출하기 위하여 탐침 핵산 분자를 금속 나노입자에 결합시키고 목적 핵산 분자를 도입하여 혼성화시키면, 상기 혼성화에 따라 상기 금속 나노입자의 표면 및 주변 전하의 변화가 유도될 수 있다. 핵산 분자가 통상 음전하를 가지므로 금속 나노입자의 표면전하는 혼성화 이전보다 절대값이 더 큰 음전하를 띄게 되며, 이에 따라 상기 이소시아나이드 관능기를 갖는 라만 리포터 분자의 라만 밴드가 청색 전이(blue shift)하게 된다. 혼성화가 일어나지 않을 경우에는 이러한 라만 밴드 위치의 변화가 없게 된다.
따라서 상기 전하의 변화에 따른 상기 라만 리포터 분자의 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동을 관찰함으로써, 상기 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동 여부에 따라 목적 핵산 분자의 존재 여부를 판단할 수 있다.
도 3은 NC 관능기를 갖는 라만 리포터 분자가 도입에 따른 SERS 스펙트럼의 변화를 나타낸 도면이다. 도 3을 참조하면, 탐침자 DNA가 결합된 금 나노입자에 타깃 DNA가 결합됨에 따라 금 나노입자 표면 전하의 변화에 따라 NC 관능기를 갖는 라만 리포터 분자의 표면 증강 라만 밴드가 전이됨을 나타낸다.
특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, 이러한 라만 밴드의 이동은 NC 관능기와 금속 원자 사이의 결합에서 금속의 전하 분포가 달라지면서 리간드 π-백본딩(π-back bonding) 전자 밀도가 변하고 이에 따라 결합세기와 진동 주파수가 달라지기 때문이라고 볼 수 있다. 좀더 구체적으로 금속 나노입자와 결합한 이소시아나이드 분자를 예로 들어 설명하면, 이소시아나이드 분자는
Figure PCTKR2016007511-appb-I000001
작용기를 갖는 물질을 의미한다. 이때 C 원자에 존재하는 비공유 전자쌍을 금속 나노입자에 제공하면서 나타나는 배위결합을 통해 이소시아나이드 분자와 금속 나노입자가 화학 결합하게 된다. 이에 따라 금속 나노입자 주변의 전하가 더 양전하를 가지게 되고, C 원자에서 금속에 전달하는 결합인 σ 결합에서 C 원자에 의한 기여(donation)가 점차 증가한다. 이로 인해 NC 결합에서 전자 밀도가 N 원자에서 C 원자쪽으로 이동하게 되고 그 결과 NC 작용기에 의한 진동수가 증가하게 된다.
한편 다른 상황에서 금속 나노입자의 표면 전하가 음전하로 되는 경우에는 금속에서 NC 결합 쪽으로 역 기여(back donation)를 하게 되고 이로 인해 NC π* 오비탈의 전자 밀도가 증가하게 된다. 이로 인해 양전하가 증가하는 경우와는 반대로 NC 작용기에 의한 진동수가 감소하게 된다.
바람직하게는 경험적으로 상기 라만 리포터 분자는 이소시아나이드 관능기를 갖는 방향족 화합물이다. 상기 라만 리포터 분자의 구체적인 예는 1,3-페닐렌 디이소시아나이드(1,3-phenylene diisocyanide), 1,4-페닐렌 디이소시아나이드(1,4-phenylene diisocyanide) 2,6-디메틸페닐 이소시아나이드(2,6-dimethylphenyl isocyanide), 4-메톡시페닐 이소시아나이드(4-methoxyphenyl isocyanide), p-톨루엔술포닐메틸 이소시아나이드(p-toluenesulfonylmethyl isocyanide), 2-나프틸이소시아나이드(2-naphthyl isocyanide), 2-클로로-6-메틸페닐 이소시아나이드(2-chloro-6-methylphenyl isocyanide), 2-클로로-6-메틸페닐 이소시아나이드(2-chloro-6-methylphenyl isocyanide), 벤질 이소시아나이드(benzyl isocyanide), 4-니트로페닐 이소시아나이드(4-nitrophenyl isocyanide) 및 4-메톡시페닐 이소시아나이드(4-methoxyphenyl isocyanide)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 라만 리포터 분자는 단일 라만 리포터 분자 내에 복수의 이소시아나이드 관능기를 갖는 덴드리머 구조를 가지는 화합물일 수도 있다.
예를 들어 이들 분자의 NC 스트레칭 밴드는 2100 - 2200 cm-1 사이에서 관찰되며, 이들을 금속 나노입자에 고정한 경우, 특정 화학물질로 표면을 개질하거나, 또는 핵산 분자를 도입한 경우 등과 같이 금속 나노입자 주위 환경의 변화에 따라 금속 나노입자의 표면 전위(surface potential)에 변화가 생기면 원래의 밴드가 수 내지 수십 cm-1만큼 이동할 수 있다.
일 구현예에서, 핵산검출을 위해 SERS 입자에 사용되는 상기 라만 리포터 분자는 NC 관능기를 갖는 화합물을 적어도 포함한다. 또한 바람직한 구현예에서, 다중검출(multiplexing)이 가능한 SERS 입자가 제공된다. 이때 상기 라만 리포터 분자는 상기 목적 핵산분자의 혼성화 여부 탐지를 위한 NC 관능기를 갖는 화합물 및 상기 목적 핵산분자의 종류 판별을 위한 다른 종류의 화합물을 동시에 포함하는 것일 수 있다. 이 경우 타깃 DNA의 혼성화(hybridization) 여부는 NC 관능기의 밴드 이동으로 확인할 수 있고, 어떤 종류의 DNA인지는 다른 라만 밴드로 읽을 수 있다.
상술한 바와 같이 NC-SERS 입자를 이용한 핵산 분자의 검출방법에 따르면, 기존의 다른 라만 기반의 핵산 검출 시스템과는 달리, 별개의 표지 물질을 사용하지 않고 핵산 결합에 따른 물리적인 특성 변화를 직접적으로 검출함으로써 비표지(label free) 방식의 핵산 검출을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 상기 NC-SERS 입자가 지지체 비드 위에 탑재된 것일 수 있다. 상기 지지체 비드는 고분자 비드, 실리카 비드 또는 자성 물질이 포함된 실리카 비드일 수 있다.
도 4는 SERS 비드에 NC-SERS 나노입자를 탑재한 표면 증강 라만 산란 입자를 이용하여 목적 핵산 분자를 검출하는 과정의 일 구현예를 나타낸다. 도 4를 참조하면, 다양한 SERS 표지자로 코딩된 자성 또는 비자성의 SERS 비드 위에 NC-SERS 탐침자를 탑재한 후, NC-SERS 밴드의 이동을 관찰하면 DNA 또는 RNA 등의 결합 유무를 확인할 수 있으며, 동시에 (자성) SERS 비드에 도입된 SERS 표지자의 SERS 밴드를 이용하여 멀티플렉싱(multiplexing)하는 것이 가능하다. 여기서 사용된 용어 "(자성) SERS 비드"는 앞서 살펴본 자성 물질이 포함되지 않은 SERS 비드뿐 아니라 자성 물질이 포함된 SERS 비드를 포함하는 의미이다. 이때 자성 비드를 사용하면 자성을 이용하여 입자를 용이하게 분리할 수 있다.
상술한 핵산 분자 검출방법은 손쉬운 유전체 진단 시스템 및 다양한 유전체 검출 분야에 활용이 가능하다.
이하 본 발명을 다양한 실시예들을 통해 보다 상세히 설명하고자 하나, 본 발명의 기술적 사상이 하기 실시예들에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1. NC-SERS 입자의 합성
범피 모양의 금 나노입자 (이하 AuBP) 합성
NaOH 1 M 용액을 이용하여 pH 7.4로 조절한 100 mM HEPES 용액 0.8 mL 와 증류수 19.2 mL를 섞은 용액에 20 mM 농도의 HAuCl4 용액 0.2 mL를 넣었다. 섞은 용액을 25 ℃ 온도로 인큐베이터 속에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 용액을 원심분리기를 이용하여 5000 rpm에 15분간 3회 원심분리하였다. 마지막으로 얻어진 금 나노입자를 증류수 20 mL에 다시 분산시켰다.
도 5는 NC-SERS 입자에 사용된 범피형(bumpy) 금 나노입자의 합성과정의 개략도이고, 도 6은 합성한 범피형 금 나노입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지 및 전자주사현미경(SEM) 이미지이며, 도 7은 합성한 범피형 금 나노입자의 UV/Vis 흡수 스펙트럼이다. 반응의 결과물로 범피 모양의 금 나노입자가 만들어진 것을 확인할 수 있었다.
라만 리포터 분자의 도입
위에서 만든 AuBP 용액 1 mL 와 증류수 9 mL를 둥근바닥 플라스크에 넣은 뒤에 NC 관능기 함유 분자(2,6-Dimethylphenyl isocyanide, 4-Methoxyphenyl isocyanide, 2-Chloro-6-methylphenyl isocaynide 등)를 증류수에 1 μM 농도로 만든 뒤 10 mL를 앞의 용액에 섞어주었다. 이때 교반장치를 이용하여 500 rpm으로 교반해주었다. 3시간 반응시킨 후에 마찬가지로 원심분리기를 이용하여 5000 rpm에 15분간 3회 원심분리하였다. 마지막으로 얻어진 입자를 증류수 10 mL에 분산시켰다.
도 8은 범피형 금 나노입자(AuBP)와 구형 금 나노입자(AuNP)의 라만 스펙트럼 결과이다. 도 8을 참조하면, 범피형 금 나노입자 기반의 NC-SERS 입자의 라만 스펙트럼으로 범피 모양의 금 나노입자 기반의 NC-SERS 입자가 구형 금 나노입자 기반의 NC-SERS 입자보다 신호가 월등히 높음을 나타낸다. 신호 대비를 위해 사용한 구형의 금 나노입자(AuNP)는 시그마 알드리치에서 입수한 Gold(III) chloride trihydrate (제품번호 520918) 와 Sodium citrate tribasic dihydrate (제품번호 S4641)을 사용하여 합성하였다. 0.01 % Gold(III) chloride trihydrate 용액 50 mL를 100 ℃ 로 가열하다 1 % Sodium citrate tribasic dihydrate 용액 0.2 mL를 추가하였다. 그 후에 30 분간 추가로 가열한 후 상온에서 서서히 식혀주었다. 이후 AuBP와 SERS 신호 비교를 위해 라만 리포터 표지화는 AuBP와 동일한 방식으로 수행하였다.
양 전하를 띠는 중합체 PAH 도입
라만 리포터 도입이 끝난 AuBP 용액 10 mL에 PAH (pollyallylamine hydrochloride, 평균분자량 45000 g/mol)를 10 mg/mL 농도로 1 mL 추가하였다. 그리고 500 rpm으로 교반해주고 12 시간가량 교반한 뒤 원심분리기를 이용하여 5000 rpm에서 15분간 3회 원심분리하였다. 최종적으로 증류수 1 mL를 넣어 AuBP를 다시 분산시켰다.
탐침 핵산 분자의 결합
탐침 핵산 분자 결합 (Surf DNA): PAH까지 도입된 AuBP 용액 1 mL를 염화나트륨의 농도가 0.3 M 인 용액에 다시 분산시킨 뒤 탐침 핵산 분자를 (100 μM, 10 μL) 추가한 후 셰이커에 12 시간 반응시켰다. 그 후 반응이 끝난 용액을 원심분리기를 이용하여 5000 rpm에서 15분간 3회 원심분리한 후 얻어진 입자를 증류수에 다시 분산시켰다.
탐침 핵산 분자 결합 (Bind DNA): PAH 까지 도입된 AuNP 용액 또는 AuBP 용액 1 mL를 염화나트륨의 농도가 0.3 M인 pH 5.2, 100 mM 농도의 아세테이트 버퍼에 다시 분산시킨 뒤 알데히드 개질된 탐침 핵산 분자 (100 μM, 10 μL) 추가한 후 아민과 알데히드 사이의 결합을 위해 100 mM 농도의 NaCNBH3를 100 μL를 추가하였다. 그리고 셰이커를 이용해 12 시간 반응시킨 후 원심분리기를 이용하여 5000 rpm에서 15분간 3회 원심분리한 후 증류수에 다시 분산시켰다.
2. NC-SERS 입자의 특성
도 9는 표면 개질에 따른 범피형 금 나노입자의 제타 전위의 변화를 나타낸 결과이다. 도 9의 (a) 및 (b)는 각각 NC-SERS 탐침자(Surf DNA) 및 NC-SERS 탐침자(Bind DNA) 제타 전위의 변화를 나타낸다. 도 9를 참조하면, 표면에 아무 처리도 하지 않은 범피형 나노입자의 제타 전위는 -18.05 mV이고, NC 작용기를 가지는 라만 리포터를 처리하였을 때의 제타 전위는 -11.0 mV이며, 양 전하를 띠고 있는 PAH를 도입하였을 때의 제타 전위는 9.43 mV였다. 한편 탐침자 DNA를 도입한 후의 제타 전위는 -13.2 mV (Surf DNA) 및 -16.9 mV (Bind DNA)였다.
도 10은 표면개질에 따른 범피형 금 나노입자 기반의 NC-SERS 탐침자의 SERS 신호의 이동을 나타낸 결과이다. 표면개질 전의 NC-SERS 탐침자의 최대 신호를 내는 라만 이동(shift)은 2180.5 cm-1에서 나타나고 표면에 양전하를 띠는 PAH를 처리하면 처리 전에 비해 낮은 에너지 방향으로 라만 밴드가 이동하고 음전하를 띠는 DNA를 결합하면 DNA 결합 전에 비해 높은 에너지 방향으로 라만 밴드가 대폭 이동하는 것을 관찰할 수 있다.

Claims (10)

  1. 라만 리포터 분자 및 탐침 핵산 분자가 도입된 나노입자를 함유한 표면 증강 라만 산란 입자를 제공하는 단계;
    상기 탐침 핵산 분자에 목적 핵산 분자를 혼성화하는 단계; 및
    상기 혼성화에 따라 상기 나노입자의 표면 및 주변 전하의 변화가 유도되는 단계; 및
    상기 전하의 변화에 따른 상기 라만 리포터 분자의 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동을 관찰하는 단계; 및
    상기 표면 증강 라만 산란 밴드의 이동 여부에 따라 목적 핵산 분자의 존재 여부를 판단하는 단계를 포함하는 핵산 분자의 검출방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 라만 리포터 분자는 티올기, 아지드기, 시아노기, 이소시아노기 또는 티오이소시아노기를 포함하는 방향족 화합물인 핵산 분자의 검출방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 라만 리포터 분자는 이소시아나이드 (-NC) 관능기 또는 시아나이드 (-CN) 관능기를 갖는 화합물을 적어도 포함하는 핵산 분자의 검출방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 나노입자는 금 나노입자 또는 은 나노입자인 핵산 분자의 검출방법.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 나노입자의 표면 및 주변 전하의 변화시 상기 나노입자의 제타전위가 높아질수록 상기 라만 리포터 분자의 라만 밴드가 낮은 에너지 방향으로 이동하고 상기 나노입자의 제타전위가 낮아질수록 상기 라만 리포터 분자의 라만 밴드가 높은 에너지 방향으로 이동하는 핵산 분자의 검출 방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 탐침 핵산 분자에 상기 목적 핵산 분자가 혼성화될 경우, 상기 라만 리포터 분자의 라만 밴드가 높은 에너지 방향으로 이동하는 핵산 분자의 검출 방법.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 라만 리포터 분자는 이소시아나이드 관능기를 갖는 방향족 화합물을 포함하거나 단일 라만 리포터 분자 내에 복수의 이소시아나이드 관능기를 갖는 덴드리머 구조를 갖는 화합물을 포함하는 것인 핵산 분자의 검출방법.
  8. 제1 항에 있어서,
    상기 라만 리포터 분자는 상기 목적 핵산분자의 혼성화 여부 탐지를 위한 NC 관능기를 갖는 화합물 및 상기 목적 핵산분자의 종류 판별을 위한 다른 종류의 화합물을 동시에 포함하는 것인 핵산 분자의 검출방법.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 나노입자가 지지체 비드 위에 탑재된 것인 핵산 분자의 검출방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 지지체 비드는 고분자 비드, 실리카 비드 또는 자성 물질이 포함된 실리카 비드인 것인 핵산 분자의 검출방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109655436A (zh) * 2018-12-07 2019-04-19 武汉工程大学 一种柱芳烃修饰的氰离子荧光检测试纸及其制备方法、检测方法
CN113075191A (zh) * 2021-03-17 2021-07-06 南通大学 一种基于拉曼光谱法的miRNA的高灵敏度检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080003576A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Jingwu Zhang Assay platforms and detection methodology using surface enhanced Raman scattering (SERS) upon specific biochemical interactions
US20110070662A1 (en) * 2000-09-22 2011-03-24 Iowa State University Research Foundation, Inc. Raman-active reagents and the use thereof
WO2011071343A2 (ko) * 2009-12-11 2011-06-16 한국화학연구원 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 이합체 코어쉘 나노 입자, 이의 용도 및 이의 제조방법
WO2012070893A2 (ko) * 2010-11-24 2012-05-31 한국화학연구원 코어 물질과 쉘 물질 사이에 나노갭이 형성된 단일 나노입자 및 이의 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110070662A1 (en) * 2000-09-22 2011-03-24 Iowa State University Research Foundation, Inc. Raman-active reagents and the use thereof
US20080003576A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Jingwu Zhang Assay platforms and detection methodology using surface enhanced Raman scattering (SERS) upon specific biochemical interactions
WO2011071343A2 (ko) * 2009-12-11 2011-06-16 한국화학연구원 라만 활성분자가 나노입자 이합체의 접합부에 위치한 이합체 코어쉘 나노 입자, 이의 용도 및 이의 제조방법
WO2012070893A2 (ko) * 2010-11-24 2012-05-31 한국화학연구원 코어 물질과 쉘 물질 사이에 나노갭이 형성된 단일 나노입자 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, KWAN ET AL.: "Surface Enrichment of Ag Atoms in Au/Ag Alloy Nanoparticles Revealed by Surface-enhanced Raman Scattering of 2,6-dimethylphenyl Isocyanide", THE JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY C, vol. 114, no. 8, 5 February 2010 (2010-02-05), pages 3448 - 3453, XP055342369 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109655436A (zh) * 2018-12-07 2019-04-19 武汉工程大学 一种柱芳烃修饰的氰离子荧光检测试纸及其制备方法、检测方法
CN109655436B (zh) * 2018-12-07 2021-03-30 武汉工程大学 一种柱芳烃修饰的氰离子荧光检测试纸及其制备方法、检测方法
CN113075191A (zh) * 2021-03-17 2021-07-06 南通大学 一种基于拉曼光谱法的miRNA的高灵敏度检测方法

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