KR101924665B1 - 회전-의존성 전사 서열분석 시스템 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

회전-의존성 전사 서열분석 방법 및 시스템이 본원에서 제공된다.

Description

회전-의존성 전사 서열분석 시스템 및 사용 방법 {ROTATION-DEPENDENT TRANSCRIPTIONAL SEQUENCING SYSTEMS AND METHODS OF USING}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2011년 2월 23일자로 출원된 미국 출원 번호 61/463,850 및 2011년 7월 30일자로 출원된 미국 출원 번호 61/574,270에 대하여 우선권의 이익을 주장하는 바이다.

기술 분야

본 개시는 일반적으로 핵산 서열분석 시스템 및 방법, 그리고 그와 같은 시스템 및 방법에 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.

몇 가지 기술들이 현재 박테리아 및 바이러스 병원체의 검출 및 유형화에 가용하다. 여기에는 하기를 사용하는 방법들이 포함된다:

1) 종/균주-특이적 PCR, 반복 서열-기반 PCR (rep-PCR), 펄스-필드(pulse-field) 겔 전기영동 (PFGE) 및 광학적 DNA 매핑을 포함한 유전자 서열의 간접적인 결정,

2) 다-유전자좌 서열 유형화 (MLST) 또는 전체 박테리아 게놈 서열분석 중 어느 하나에 의한 직접적인 서열의 결정, 또는

3) 질량 분광측정법에 의한 PCR 생성물 염기 조성의 결정과 같은 상기의 조합.

상기 첫 번째 기술 군 (세페이드(Cepheid), 파토제네틱스, 인크.(PathoGenetix, Inc.), 오프겐, 인크.(OpGen, Inc.))은 두 번째 기술 군에 비해 더 낮은 해상력 및 분별력을 가지며, 적은 수의 보존된 게놈 영역이 조사되는 것에 의해 제한된다. 그러나, 두 번째 군의 기술들은 2세대 (라이프 테크놀로지스/이온 토렌트(Life Technologies/Ion Torrent)의 SOLiD 및 PGM, 일루미나(Illumina), 로슈(Roche) 454, 콤플리트 제노믹스(Complete Genomics)) 및 3세대 (퍼시픽 바이오사이언시즈(Pacific Biosciences), 헬리코스(Helicos))의 고처리량 서열분석 기술들이 도입되면서 샘플당 비용이 $10,000 미만으로 내려가고 있기는 하지만, 엄청나게 고가이고, 낮은 처리량만을 제공하고 있다. 또한, 현재 이용가능한 서열분석 기술들은 복잡한 샘플 제조 및 DNA 클러스터 생성 (라이프 테크놀로지스의 SOLiD 및 이온 토렌트, 로슈 454, 콤플리트 제노믹스, 일루미나), 짧은 해독 길이 (헬리코스, SOLiD, 일루미나), 또는 높은 오차 비율 (퍼시픽 바이오사이언시즈) 중 어느 하나를 겪고 있다. 또한, 현재 이용가능한 단일-분자 서열분석 기기들 (퍼시픽 바이오사이언시즈 및 헬리코스)은 부피가 크고, 매우 고가이며, 운용하는 데에 고도로 훈련된 요원을 필요로 한다. 세 번째 기술 군 (이비스 바이오사이언시즈 인크.(Ibis Biosciences Inc.))은 PCR 생성물의 비교적 짧은 서열의 뉴클레오티드 조성만을 확인할 수 있으며, 통상적인 PCR의 모든 제한을 겪고 있다.

현재 이용가능한 단일 분자 기술들 (헬리코스, 퍼시픽 바이오사이언시즈)과 달리, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 변형된 뉴클레오티드를 도입할 수 있는 돌연변이 폴리머라제의 개발, 고가의 표지된 뉴클레오티드, 또는 레이저 및 고가의 고속 카메라를 필요로 하지 않는다. 따라서, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 저렴한 휴대용 현장관리 시스템(point-of-care system)에 통합될 수 있다.

또한, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 어떠한 시약의 변화도 없이 플랫폼-장착 핵산 데이터베이스 및 소프트웨어를 단순히 업데이팅하는 것에 의해, 최고의 융통성 및 빠른 재구성을 가능케 함으로써; 예상치 못한 풍토병의 위협, 신종 질환, 범세계적이며 새로운 바이오테러 위협에 대한 신속한 반응을 가능케 한다. 이는 소정의 새로운 표적을 처리하기 위한 플랫폼 전환 전의 검정법 재구성 및 확인에 상당한 시간을 필요로 하는 PCR을 이용하는 수많은 진단 플랫폼들과는 대조되는 것이다. 이는 또한 3 kb 이상 분리되어 있는 태그의 공간 패턴에 의존함으로써 해당 기술을 kb-이하 삽입물 또는 결실은 물론 단일-뉴클레오티드 변이에는 비민감성이 되게 하는, 직접 선형 분석(Direct Linear Analysis) (DLA) 기술 (파토제네틱스(PathoGenetiX))을 사용하는 비-서열분석 단일-분자 게놈 서열 스캐닝 플랫폼과 대조되는 것이다.

또한, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 최고의 다중화 능력을 가능케 한다. PCR- 및 마이크로어레이(microarray)-기반의 방법들이 알려져 있는 감염 요소(들)의 검출만으로 제한되며 돌연변이되거나 생물조작된 (즉 단일 뉴클레오티드 차이를 가지는) 변종을 확인할 수 없는 반면, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 어느 정도까지 "표적 불가지론적(target agnostic)"인데, 본 방법이 시편 내의, 또는 그로부터 추출된 임의의 모든 DNA 분자들의 일차 구조를 해독하며, 그에 따라 수천개의 공지 또는 미지 (예컨대 유전자적으로-변형된) 표적들을 동시에 검출 및 확인할 수 있기 때문이다. 본원에서 기술되는 시스템 및 방법에 의해 제공되는 그와 같은 고유의 "광대역" 다중화 능력은 각 병원체의 검출에 특정 시약 세트 (프라이머 및 프로브)를 필요로 하는 PCR을 사용하는 접근법들과는 대조되는 것이다. 또한, PCR-기반의 기술들은 단순히 PCR의 특성으로 인한 다중화된 반응들에서 허용되는 검정법들의 수, 또는 다중의 반응들 사이로 샘플 (즉 표적 핵산을 함유하는 것)을 분할할 필요성에 의해 제한됨으로써, 검출의 감도 및 정량의 정밀도가 훼손된다.

개요

회전-의존성 전사 서열분석은 고체 표면에 대하여 고정된 RNA 폴리머라제에 의존한다. 전사의 결과로서, RNA 폴리머라제는 핵산에 회전력을 부여하고, 그것은 다시 그 자체가 핵산에 결합되어 있는 태그의 회전으로 나타난다.

한 측면에서는, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 일반적으로 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계, 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계, 및 다수의 회수로 접촉 및 검출 단계를 반복하는 단계를 포함한다. 통상적으로, 상기 서열분석 조건에는 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재가 포함되며, 상기 RNA 폴리머라제는 고체 기판상에 고정되고, 상기 표적 핵산 분자는 회전 태그를 포함한다. 표적 핵산 분자의 서열은 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 존재하에서의 회전 패턴 변화의 존재 또는 부재를 순차적으로 바탕으로 한다.

일부 실시양태에서, RNA 폴리머라제는 박테리오파지 RNA 폴리머라제 (예컨대 T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제)이다. 일부 실시양태에서, RNA 폴리머라제는 박테리아 RNA 폴리머라제 (예컨대 E. 콜라이(E. coli ) RNA 폴리머라제)이다. 일부 실시양태에서, RNA 폴리머라제는 His-태그를 통하여 고체 표면상에 고정된다. 대표적인 표적 핵산 분자는 원핵생물, 박테리아, 고박테리아 및 진핵생물의 것일 수 있다. 표적 핵산 분자는 통상적으로 이중-가닥으로써, 생물학적 샘플 내에 포함되어 있을 수 있다. 표적 핵산 분자는 또한 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하고 있을 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 회전 태그는 제1 태그 및 제2 태그를 포함한다. 예를 들면 일부 실시양태에서, 상기 제1 태그는 자성이다. 대표적인 고체 기판은 유리로 제조된다. 다른 대표적인 고체 기판에는 CMOS 또는 CCD가 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 서열분석 조건에는 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재가 포함되며; 일부 실시양태에서는, 서열분석 조건에 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재가 포함되고, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트가 속도-제한량으로 존재한다.

일부 실시양태에서, 검출 단계는 회전 태그에 광을 투사하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 단계는 또한 현미경을 통하여 회전 패턴을 관찰하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 단계는 또한 CMOS 또는 CCD상에서 회전 패턴을 포착하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 단계는 자기 이미지로서의 회전 패턴을 포착하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 자기 이미지는 GMR 센서 또는 MRAM 어레이(array)상에 포착된다. 일부 실시양태에서, 검출 단계는 전기장으로서의 회전 패턴을 포착하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이미지는 RAM 센서상에 포착된다.

이와 같은 방법은 또한 표적 핵산 분자에 지향력(directional force)을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 자석을 사용하여, 또는 유동(flow) 또는 압력을 사용하여 지향력이 생성될 수 있다.

또 다른 측면에서는, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 통상적으로 RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계; 제1 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 표적 핵산 분자는 회전 태그를 포함하고, 상기 제1 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하며, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계; 제1 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및 회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계를 포함한다.

이와 같은 방법은 또한 RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계; 제2 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 회전 태그를 포함하는 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제2 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제2 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계; 제2 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및 회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제2 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 제2 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계는 제1 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계와 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 제2 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계는 제1 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계 전 또는 후에 순차적으로 수행된다.

이와 같은 방법은 또한 RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계; 제3 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 회전 태그를 포함하는 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제3 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계; 제3 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및 회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 방법은 또한 표적 핵산 분자 내에서의 제1, 제2 및 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보로부터 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

이와 같은 방법은 또한 RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계; 제4 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 회전 태그를 포함하는 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제4 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제4 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계; 제4 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및 회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제4 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 고체 표면은 유리 슬라이드이다. 상기 유리 슬라이드는 구리 및 PEG로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제이다. 일부 실시양태에서, 상기 T7 RNA 폴리머라제는 His-태그를 통하여 고체 기판상에 고정된다.

또 다른 측면에서는, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 통상적으로 1종 이상의 RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계; 제1 서열분석 조건하에서 1종 이상의 RNA 폴리머라제를 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 표적 핵산 분자는 회전 태그를 포함하고, 상기 제1 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하는 것인 단계; 제1 서열분석 조건하에서 회전 패턴의 변화가 발생하는지를 검출하는 단계를 포함한다. 회전 패턴의 변화가 발생하는 경우, 상기 방법은 추가로 제1 서열분석 조건하에서의 접촉 단계 및 이후의 단계들을 반복하는 것을 포함하는 반면, 회전 패턴의 변화가 발생하지 않는 경우, 상기 방법은 추가로 제2 서열분석 조건하에서의 접촉 단계 및 이후의 단계들을 반복하는 것을 포함하며, 여기서 상기 제2 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제2 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함한다. 마찬가지로, 회전 패턴의 변화가 발생하는 경우, 상기 방법은 추가로 제1 서열분석 조건하에서의 접촉 단계 및 이후의 단계들을 반복하는 것을 포함하는 반면, 회전 패턴의 변화가 발생하지 않는 경우, 상기 방법은 추가로 제3 서열분석 조건하에서의 접촉 단계 및 이후의 단계들을 반복하는 것을 포함하며, 여기서 상기 제3 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함한다. 표적 핵산 분자의 서열은 상기 제1, 제2 또는 제3 서열분석 조건하에서의 회전 패턴의 변화 발생을 순차적으로 바탕으로 하여 수득될 수 있다.

또 다른 측면에서는, 제조 물품(article of manufacture)이 제공된다. 제조 물품에는 통상적으로 다수의 RNA 폴리머라제 효소가 고정된 고체 기판이 포함된다. 일부 실시양태에서, 상기 고체 기판은 구리 및 PEG로 코팅되며; 또 다른 실시양태에서, 고체 기판은 니켈 및 PEG로 코팅된다. 다르게는, 고체 기판은 Ni-NTA로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 기판은 CMOS 또는 CCD이다.

일부 실시양태에서, 제조 물품에는 또한 회전 태그가 포함된다. 회전 태그에는 비-구형 태그, 또는 광학적으로 구별될 수 있는 비-균일 표면을 가지는 구형 태그가 포함될 수 있다. 제조 물품에는 또한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열 및/또는 비오티닐화 핵산 테더 서열(tether sequence)이 포함될 수 있다. 본원에서 기술될 때의 제조 물품에는 또한 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제조 물품에는 또한 자성 참조 태그를 통하여 축에 대한 회전 태그의 회전을 확인하는 것; 회전 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 바탕으로 표적 핵산 분자의 서열을 컴파일하는 것; 또는 자력을 적용하는 것에 대한 지침이 포함된다. 이와 같은 지침은 전자 형태로 제공될 수 있다.

또 다른 측면에서는, 표적 핵산 분자의 단일-염기 서열분석을 위한 장치가 제공된다. 이와 같은 장치는 통상적으로 고정되어 있는 다수의 RNA 폴리머라제를 포함하는 고체 기판을 수용하기 위한 수용기; 고체 표면상에 고정되어 있는 다수의 RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 표적 핵산 분자에 장력이 적용되도록 하는 방향으로 충분한 지향력을 제공하기 위한 공급원; 고체 표면상에 고정되어 있는 다수의 RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 표적 핵산 분자에 결합된 회전 태그상에 광을 투사하기 위한 광원; 및 고체 표면상에 고정되어 있는 다수의 RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 표적 핵산 분자에 결합된 회전 태그의 회전 패턴을 검출하기 위한 광학기기(optics)를 포함하는 서열분석 모듈(Sequencing Module)을 포함한다.

이와 같은 장치는 또한 컴퓨터 프로세서, 및/또는 핵산을 서열분석하는 데 관련된 시약 및 완충제를 함유하며 이들을 수송하기 위한 유체공학기기(fluidics)를 포함할 수 있다. 대표적인 시약은 뉴클레오시드 트리포스페이트이며, 대표적인 완충제는 세척 완충제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지향력을 제공하기 위한 공급원은 자석 또는 액체의 유동일 수 있다. 일부 실시양태에서, 광학기기는 현미경을 포함하며, 추가로 카메라를 포함할 수 있다.

이와 같은 장치는 또한 생물학적 샘플을 수용하기 위한 수용기; 및 서열분석용 핵산을 단리하고 준비하는 데 관련된 시약 및 완충제를 함유하며 이들을 수송하기 위한 유체공학기기를 포함하는 샘플 제조 모듈(Sample Preparation Module)을 포함할 수 있다. 대표적인 시약에는 세포 용해 시약 및/또는 절단 효소가 포함되는 반면, 대표적인 완충제에는 용해 완충제 및/또는 세척 완충제가 포함된다.

이와 같은 장치는 또한 RNA 폴리머라제 프로모터 서열 및 회전 태그를 핵산 분자에 부착시키는 데 관련된 시약 및 완충제를 함유하며 이들을 수송하기 위한 유체공학기기를 포함하는 주형 마감 모듈(Template Finishing Module)을 포함할 수 있다. 대표적인 시약에는 리가제 효소, 분자 모터(molecular motor)-결합 서열, 자성 태그, 및/또는 테더가 포함되는 반면, 대표적인 완충제에는 리가제 완충제, 자성 참조 태그-결합 완충제, 및/또는 회전 태그-결합 완충제가 포함된다.

또 다른 측면에서는, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 표적 핵산 분자는 회전 태그를 포함하고, 표적 핵산 분자의 서열은 표적 핵산 분자의 전사 동안 수득되는 데이터를 바탕으로 한다. 이와 같은 방법은 일반적으로 표적 핵산 분자의 제1 위치에 대한 제1 데이터를 수득하는 단계로서, 여기서 상기 제1 데이터는 회전의 존재 또는 부재, 및/또는 회전 태그의 회전 사이의 시간 길이를 나타내는 것인 단계; 표적 핵산 분자의 제1 위치에 대한 제2 데이터를 수득하는 단계로서, 여기서 상기 제2 데이터는 전사 동안 이용가능한 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 및/또는 양을 나타내는 것인 단계; 표적 핵산 분자의 제2 위치에 대한 또 다른 제1 데이터 및 또 다른 제2 데이터를 수득하는 단계; 표적 핵산 분자의 제3 위치에 대한 또 다른 제1 데이터 및 또 다른 제2 데이터를 수득하는 단계; 표적 핵산 분자의 제4 위치 및 이후 위치에 대한 제1 데이터 및 제2 데이터의 수득 단계를 반복하는 단계; 및 각 위치에 대하여 수득된 제1 데이터 및 제2 데이터를 바탕으로 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 데이터 및 제2 데이터는 표시된 위치에서의 뉴클레오티드로 기록된다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 문제의 시스템, 방법 및 조성물이 속하는 업계 일반의 숙련자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 문제 시스템, 방법 및 조성물의 실시 또는 시험시에는 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 등가인 시스템, 방법 및 재료가 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 시스템, 방법 및 재료를 하기에 기술한다. 또한, 시스템, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것으로써, 제한하고자 하는 것이 아니다. 하기에서 언급되는 모든 공개, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌들은 그 전체가 참조로써 개재된다.

도 1은 본원에서 기술되는 바와 같은 단일-분자 회전-의존성 전사 서열분석 복합체의 실시양태 (도 1a), 및 칩상 회전-의존성 전사 서열분석 복합체의 실시양태 (도 1b)를 나타낸다.
도 2a는 20× 수 대물렌즈를 사용한 자성 회전 태그의 이미지이다. 이와 같은 이미지에서, FOV는 대물렌즈가 아닌 검출기에 의해 제한된다. 이와 같은 이미지에서, 자성 회전 태그는 2.7 마이크로미터의 직경을 가진다. 도 2b는 도 2a와 비교하여 나타낸 장력하의 (여기에서는 자기력 존재하의) 자성 회전 태그의 이미지로써, 자석의 적용으로 인하여 자성 회전 태그가 "상향" 이동하였다. 상부로부터 2개의 상이한 각도로 회전 태그를 조명하는 2개 광원의 존재로 인하여 이중-이미지가 생성된다. 따라서, 회전 태그가 초점면으로부터 이동하는 경우, 2개의 "영상"이 분리된다. 이와 같은 방법은 샘플의 평면에서, 그리고 평면에서 벗어난 상이한 z-축 위치에서 장력이 얼마나 균일한지를 측정하는 데에 사용될 수 있다. 도 2b에서 여전히 초점이 맞는 회전 태그는 고체 표면상에서 응집되었을 가능성이 있다. 도 2c는 부동태화된 고체 표면상의 His-태그결합 RNA 폴리머라제에 의해 테더링된(tethered) 회전 태그 및 5.1 Kb DNA 주형의 어레이 사진이다.
도 3은 본원에서 기술되는 핵산 서열분석의 2개 모드를 나타내는 그래프로써: 패널 A는 제한된 농도의 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트 (이 패널에서는 구아닌 (G))가 신생 가닥으로 G 뉴클레오티드를 도입할 때 폴리머라제가 중지되도록 하는, 비동시성의 실시간 "뉴클레오티드 패턴" 서열분석 전략을 나타낸다. 패널 B는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 "염기별" 도입이 뉴클레오티드 서열의 연속 해독으로 이어지는, 동시성 서열분석 전략을 나타낸다.
도 4는 각각 제한량으로 존재하는 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트를 가지는 4종의 상이한 유동 셀로부터의 그래프이다. 저부 패널은 4종의 유동 셀로부터 컴파일된 핵산 서열을 나타낸다.
도 5는 본원에서 기술되는 바와 같은 유동 셀의 한 실시양태를 나타내는 개략도이다. 예를 들면, 유동 셀은 옴니비젼 센서 (OV14810; SiN을 사용한 윈도우의 제거 및 코팅 후) 상부에 도포된 대략 50 마이크로미터 두께의 레이저-절단 압력 감지 접착제 (PSA) 필름을 포함할 수 있다. 이와 같은 배열구조는 CMOS 칩 상부의 유동 셀로 이어진다. 다음에는, 미세유동 공급 튜브용 구멍을 가지는 유리 또는 중합체 슬라이드가 적용된다.
도 6a는 광을 전달하는 데에 섬유가 사용되고 이미지화에 현미경 대물렌즈가 사용되는 전형적인 고체 표면을 나타내는 사진이며, 도 6b는 선도이다. 회전-태그결합 핵산 및 RNA 폴리머라제를 포함하는 고체 표면 슬라이드는 섬유 아래의 대물렌즈 위에 위치하는 것으로 나타나 있다.
도 7은 본원에서 기술되는 바와 같은 회전-의존성 전사 서열분석 시스템의 한 실시양태를 나타낸다. 개략도는 장력 공급원, 조명 공급원, 및 유입- 및 유출-유체공학기기가 구비된 고체 표면 칩 상부의 4개 유동 셀을 보여준다.
도 8a는 회전-의존성 전사 서열분석 시스템의 한 실시양태를 나타내는 사진이며, 도 8b는 선도이다. 이와 같은 실시양태는 큰 시야가 구비된 고해상도인 NA=0.9와 함께 1 mm를 초과하는 FOV를 제공하는 올림푸스의 "수퍼-렌즈"인 20× 수-대물렌즈를 사용한다. 고체 표면, 광 전달 및 장력 공급원 (예컨대 자석)도 나타내었다.
도 9a는 회전-의존성 전사 서열분석 시스템의 또 다른 실시양태를 나타내는 사진이며, 도 9b는 선도이다. 이와 같은 실시양태에서는, AF 광학 해상 표적, 조명 섬유, 20× 미투토요 대물렌즈, 튜브 렌즈 및 카메라가 구비된 콤팩트 광학 시스템을 나타낸다. 본 이미지에서는 벗어나 있기는 하지만, 표적 위에는 디스크 자석을 볼 수 있다. 대물렌즈 공간에서의 1 마이크로미터 해상도를 위하여, 20 마이크로미터를 초과하는 픽셀 크기를 가지는 하나 이상의 카메라가 사용될 수 있다.
도 10은 낮은 해상도 (즉 대물렌즈를 통하여, 또는 칩상 방법을 통하여 이미지화되는 비드 당 10×10 픽셀)를 사용하는 경우에도 회전 태그 (예컨대 제1 태그 및 제2 태그를 포함하는 이중체)의 회전이 검출될 수 있음을 보여준다. 더욱 진전된 알고리즘을 사용하면, 5×5 픽셀로의 추가적인 감소도 가능하다. 또한, 점감형 다발이 사용되는 경우라면, 코어의 크기 및 다발 타 측에서의 각 픽셀의 크기는 물론, 코어가 차지하는 검출기상 픽셀의 수와 관련된 인자에 의해 다발 코어 상부에 위치하는 각 비드에 대하여 해상도가 증가한다.
도 11a는 회전 태그의 회전 패턴 분석의 예를 도시하는 흐름도이며, 도 11b는 표적 핵산 분자의 서열을 결정하기 위한 과정의 예를 도시하는 흐름도이다.
여러 도면에서, 동일한 참조 부호는 동일한 요소를 나타낸다.

본 개시는 복잡성, 비용, 확장성, 및 궁극적으로는 더 긴 해독 길이, 더 높은 처리량 및 향상된 정밀도를 포함하여, 기존 단일 분자 시스템의 제약들 중 많은 것이 완화된 단일 분자 서열분석 시스템에 대해 기술한다. 본원에서 기술되는 실시간 단일 분자 서열분석 방법 및 시스템은 고도로 연작용성인(processive) 전사 기구, 및 단순한 광학 및 이미지화 시스템으로 인하여 매우 짧은 시간 내에 높은 정밀도로 수천개의 뉴클레오티드를 서열분석할 수 있다.

본 시스템의 장점은 매우 많다. 예를 들면, 이중 가닥의 핵산이 주형으로 사용되는데, 이는 샘플 제조의 요건을 최소화하여 제한한다. 또한, 매우 단순한 이미지화 방법이 사용될 수 있어서 (예컨대 CMOS), 표지된 뉴클레오티드가 필요치 않은데, 이는 비용을 상당히 감소시킨다. 또한, 야생형 RNA 폴리머라제 효소가 사용될 수 있으며; 효소에 대한 특별한 변형이 필요치 않고, 효면 화학 및 효소 고정 기술들이 일상적이다. 본 시스템 및 방법은 단일중합체 서열에 적합한데, 각 뉴클레오티드에 있어서의 회전이 동일하며, 이에 따라 다수의 뉴클레오티드에 걸쳐 누적되기 때문이다. 본 시스템 및 방법은 또한 고처리량 서열분석에 용이하게 적용가능하다.

회전-의존성 전사 서열분석의 개관

회전-의존성 전사 서열분석은 RNA 폴리머라제에 의한 표적 핵산 분자의 전사에 의존한다. RNA 폴리머라제는 고체 표면상에 고정되며, 표적 핵산 분자에는 회전 태그가 결합된다. 전사시, RNA 폴리머라제는 주형 핵산에 전사 버블(bubble)을 형성시키는데, 그 안에 대략 8개 염기의 RNA:DNA 혼성체를 포함하고 있다. RNA 폴리머라제가 이중-가닥 핵산 주형을 따라 전진하면서, 그것은 버블의 선도연(leading edge)에서 나선을 감김해제시키고, 추종연(trailing edge)에서 가닥들을 재어닐링시켜야 한다. 이중-가닥 나선의 감김해제의 결과로서 생성되는 회전력은 도입되는 뉴클레오티드 당 약 36°의 RNA 폴리머라제에 대비한 주형 핵산의 회전을 초래한다. 따라서, RNA 폴리머라제가 고체 표면에 고정되어 있고 주형 핵산에 회전 태그가 결합되어 있는 경우에는, 주형 핵산의 회전이 관참됨으로써 효소에 의한 전사 활성 (즉 뉴클레오시드 트리포스페이트의 도입)의 지표가 될 수 있다.

본원에서 기술되는 바와 같이, 표적 핵산 분자의 서열은 회전 태그의 회전 패턴의 변화를 바탕으로 하여 확인되거나 수득된다. 역시 본원에서 기술되는 바와 같이, 핵산 회전의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 예를 들면 표적 핵산 분자에 결합된 회전 태그의 조명(illumination)을 사용하여 수행될 수 있다. 본원에서 기술되는 회전 서열분석 방법은 일련의 RNA 폴리머라제 효소들, 및 회전 태그의 회전을 포착하는 데에 적합한 임의 수의 일상적인 이미지화 방법들을 사용하여 전체 게놈 서열분석으로 확대될 수 있다.

도 1은 단일-분자 서열분석 실시양태 (도 1a), 및 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 복합체의 칩상 어레이(on-chip array) 실시양태 (도 1b)를 나타낸다. 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 복합체는 표적 핵산 분자 (10)의 서열을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 표면 (30) 또는 칩 (80)상에 고정된 RNA 폴리머라제 (20)는 표적 핵산 분자 (10) (즉 미지의 서열을 가지고 있는 핵산 분자)와 접촉된다. 본원에서 기술되는 방법에 따라, 표적 핵산 분자 (10)는 회전 태그 (40)를 포함한다. 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함한 특정 서열분석 조건하에서, 회전 태그 (40)의 운동 및/또는 속도의 변화는 회전 패턴을 생성시킨다. 이러한 단계가 다수의 회수로 반복되고, 특정 서열분석 조건하에서의 회전 패턴 변화의 존재 또는 부재를 순차적으로 바탕으로 하여 표적 핵산의 서열이 결정된다. 이러한 특징은 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.

고체 표면

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석에 있어서, RNA 폴리머라제는 고체 표면상에 고정된다. 본원에서 기술되는 실시양태에서, 고체 표면은 통상적으로 실리카-기재 유리 (예컨대 보로실리케이트 유리, 융합 실리카 또는 석영)로 제조된다. 단일 분자 이미지화를 위한 고체 표면 재료에 대해서는 잘 알려져 있어서, 업계에서 일상적으로 사용되고 있으며, 단일 분자 이미지화에 사용되는 것과 동일한 고체 표면 재료가 어레이 포맷에서도 사용될 수 있다. 그러나, 그것이 본원에서 기술되는 서열분석에 사용하기에 적합하다는 전제하에, 다른 재료 (예컨대 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 규소, 규소 니트리드, 및 이들의 기타 중합체 또는 복합체)가 사용될 수도 있다. 도 1b는 "칩상" 실시양태를 나타내는데, 여기에서는 고체 표면 (30)이 검출 시스템도 포함하고 있다. 이러한 유형의 고체 표면 (예컨대 CMOS 및 CCD) 역시 업계에 알려져 있으며, 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.

1종 이상의 생물학적 분자를 고체 표면에 고정시키기 전에, 고체 표면은 일반적으로 생물학적 분자를 수용하여 결합하도록 변형된다 (예컨대 관능화됨). 생물학적 효소를 고정시키기 위하여 고체 표면을 관능화하는 방법에 대해서는 업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, 고체 표면은 구리 또는 니켈로 관능화될 수 있는 반면, 일부 실시양태에서, 고체 표면은 Ni-NTA (예를 들면 문헌 [Paik et al., 2005, Chem . Commun . ( Camb ), 15:1956-8] 참조) 또는 Cu-NTA로 관능화될 수 있다. 다르게는, 코발트 등과 같은 금속이 고정을 위하여 고체 표면을 변형시키는 데에 사용될 수 있다.

고체 표면을 변형시키기 전에, 예를 들면 PEG 잔기를 사용하여 고체 표면이 처리될 수 있다. 이와 같은 전략은 고체 표면상에서의 RNA 폴리머라제의 밀도를 조절하는 데에 사용될 수 있으며, 또한 RNA 폴리머라제의 균일, 반-정돈(semi-ordered) 또는 무작위 어레이와 같이, 고체 표면상에 RNA 폴리머라제의 패턴을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. PEG 환경은 효소와 표면 사이의 최소한의 상호작용을 초래하며 (N- 또는 C-말단의 결합 태그 제외), 궁극적으로 고정된 효소의 자연 입체형태에 대한 최소한의 교란을 초래한다. 더불어, 표면 부동태화 방법들이 업계에 알려져 있는데, 예를 들면 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 고체 표면을 처리하는 것이 포함될 수 있다.

RNA 폴리머라제

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법은 전사 과정에서의 RNA 폴리머라제의 작용, 및 전사되는 핵산상에 생성되는 회전력을 바탕으로 한다 (예를 들면 US 2007/0077575호 참조). 다중-하위단위의 RNA 폴리머라제 (예컨대 E. 콜라이 또는 다른 원핵생물 RNA 폴리머라제, 또는 진핵 RNA 폴리머라제들 중 1종)가 본원에서 기술되는 서열분석 방법에 사용될 수 있기는 하지만, 박테리오파지의 것과 같은 소형의 단일-하위단위 RNA 폴리머라제가 특히 적합하다. 단일 하위단위 RNA 폴리머라제 또는 그와 같은 효소를 코딩하고 있는 유전자는 T3, T7, SP6 또는 K11 박테리오파지로부터 수득될 수 있다.

박테리오파지 RNA 폴리머라제는 많은 다중-하위단위 RNA 폴리머라제들에 비해 매우 연작용성이며 정밀해서, 종종 더 적은 결실-삽입 오류를 생성시킨다. 또한, 박테리오파지로부터의 RNA 폴리머라제는 E. 콜라이로부터의 RNA 폴리머라제와 같은 다중-하위단위 상대물에 비해 후진하는 경향이 상당히 덜하다. 수종의 상이한 박테리오파지로부터의 RNA 폴리머라제들이 기술된 바 있다. 단순히 예를 들자면, T7 RNA 폴리머라제는 99 kDa의 분자량을 가지는 단일 폴리펩티드로 구성되는데, T7 RNA 폴리머라제를 코딩하고 있는 유전자의 클로닝 및 발현에 대해서는 US 특허 번호 5,693,489에 기술되어 있다. T7 RNA 폴리머라제의 구조는 3.3 옹스트롬 수준까지 밝혀져 있으며, 하기 4종의 상이한 결정 구조들이 밝혀져 있다: T7 RNA 폴리머라제 단독 (비복합체화), 핵산 프로모터에 결합된 T7 RNA 폴리머라제, 전체 개시 복합체 (핵산 프로모터에 결합된 T7 RNA 폴리머라제, 및 하나 이상의 전사 인자), 및 억제제에 의해 결합된 T7 RNA 폴리머라제.

본원에서 기술되는 방법에서 사용하기에 적합한 RNA 폴리머라제는 통상적으로 전사체로의 뉴클레오티드 도입시마다 마이크로초-이하 내지 100 밀리초 범위의 기간을 가지는 핵산의 회전을 제공하지만, 뉴클레오티드 당 100 밀리초 내지 수초 범위의 기간을 가지는 회전을 제공하는 RNA 폴리머라제 역시 사용될 수 있다. 업계 숙련자라면, 필요한 회전을 생성시키기 위해서는 RNA 폴리머라제가 이중-가닥 핵산을 전사해야 한다는 것을 알고 있을 것이다.

고체 표면상에서의 RNA 폴리머라제의 밀도 및/또는 분포는 예를 들면 수행되는 특정 서열분석 반응들을 최적화하도록 조절 또는 조작될 수 있다. 업계에 알려져 있는 바와 같이, 생물학적 분자의 어레이는 패턴으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 분자의 어레이는 고체 표면상에 무작위로 분포되거나, 균일하게 분포되거나, 또는 정돈 또는 반-정돈된 양식으로 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 표면은 거기에 고정된 100개를 초과하는 RNA 폴리머라제, 또는 1000개를 초과하는 RNA 폴리머라제 (예컨대 10,000개를 초과하는 RNA 폴리머라제)를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 표면은 ~5 ㎛² 당 하나 이상의 고정된 RNA 폴리머라제 (예컨대 ~2.5 ㎛², ~1 ㎛², ~0.5 ㎛² 또는 ~0.1 ㎛² 당 하나 이상의 고정된 RNA 폴리머라제)를 가질 수 있다. 고체 표면상에서의 RNA 폴리머라제의 밀도가 적어도 부분적으로 서열분석되는 표적 핵산 분자의 크기는 물론, 이용되는 구체적인 회전 태그에 따라서도 달라질 수 있다는 것은 이해될 것이다.

본원에서 기술되는 서열분석 방법이 RNA 폴리머라제에 의한 전사시 생성되는 회전에 의존하기는 하지만, RNA 폴리머라제와 함께 다른 분자 모터가 회전을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 분자 모터는 통상적으로 뉴클레오티드 트리포스페이트의 가수분해에 의한 에너지를 소비하여, 그것을 운동 또는 기계적 작업으로 전환하는 생물학적 분자이다. 분자 모터의 예에는 비제한적으로 헬리카제, 토포이소머라제, DNA 폴리머라제, 미오신, ATPase 및 GTPase가 포함된다. 일부 실시양태에서는, 분자 모터가 고체 표면상에 고정될 수 있으며, 분자 모터와 회전 태그 사이의 표적 핵산 분자상 위치에서 RNA 폴리머라제에 의한 전사가 이루어질 수 있다. 그와 같은 경우, 회전 패턴은 RNA 폴리머라제에 의해 핵산 분자에 인가되는 회전력과 조합된 분자 모터에 의해 핵산 분자에 인가되는 소정 회전력의 결과일 것이다. 효소형 분자 모터에 대한 대안으로서, 예를 들면 고체 상태의 MEMS 모터가 RNA 폴리머라제와 함께 회전을 생성시키는 데에 사용될 수 있다.

RNA 폴리머라제는 어떠한 수의 공지 수단을 사용하여서도 고체 표면에 고정될 수 있다. 예를 들면, 한 실시양태에서, RNA 폴리머라제는 His-태그 (예컨대 4개의 His 잔기, 6개의 His 잔기 또는 10개의 His 잔기를 가지는 His 태그)를 포함한다. 상기에서 논의된 표면 화학 (예컨대 관능화)에 부합한다는 전제하에, His-태그 또는 다른 적합한 태그가 사용될 수 있다.

표적 핵산 분자

회전-의존성 전사 서열분석을 위한 핵산 분자는 진핵생물, 박테리아 및 고세균을 포함한 사실상 모든 공급원으로부터 수득될 수 있다. 진핵생물 핵산은 인간 또는 기타 동물 (예컨대 영장류, 말, 소, 개, 고양이 및 설치류), 또는 비-포유동물 (예컨대 새, 파충류 (예컨대 뱀, 거북이, 악어 등) 및 물고기)로부터의 것일 수 있는 반면, 원핵생물 핵산은 박테리아 (예컨대 병원성 박테리아 예컨대 비제한적으로 스트렙토코쿠스( Streptococcus ), E. 콜라이, 슈도모나스( Pseudomonas ) 및 살모넬라( Salmonella )) 또는 고박테리아 (예컨대 크레나르카에오타(Crenarchaeota) 및 유리아르카에오타(Euryarchaeota))로부터의 것일 수 있다.

회전-의존성 전사 서열분석을 위한 핵산 분자는 모든 수의 생물학적 샘플 내에 함유되어 있을 수 있다. 대표적인 생물학적 샘플에는 비제한적으로 체액 (예컨대 혈액, 소변, 정액) 및 조직 (예컨대 기관, 피부, 점막 및 종양)이 포함된다.

본원에서 논의되는 바와 같이, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법의 장점들 중 하나는 이중-가닥 핵산이 주형으로 사용된다는 것이다. 이것은 샘플 및 핵산을 조작할 필요성을 감소시키는데, 이는 특히 길이가 1 킬로베이스를 초과하는 (Kb; 예컨대 2 Kb 초과, 5 Kb 초과, 10 Kb 초과, 20 Kb 초과, 또는 50 Kb 초과) 핵산을 서열분석하는 경우에 상당한 장점으로써, 생물학적 샘플로부터 핵산을 수득하는 데에 사용되는 많은 방법들이 원치 않는 핵산의 절단, 전단 또는 파괴를 초래하기 때문이다. 분명히, 본 방법에서는, 단일-가닥 핵산 (또는 단일-가닥 핵산을 함유하는 샘플)이 사용될 수 있다. 그러나, 그와 같은 단일-가닥 핵산은 전사시 회전을 나타내기 위하여 이중-가닥 핵산으로 전환되어야 한다. 이중-가닥 핵산의 제조 방법에 대해서는 업계에 잘 알려져 있는데, 단일-가닥 핵산 (예컨대 DNA 또는 RNA)의 특성에 따라 달라지게 된다. 그와 같은 방법들은 통상적으로 잘 알려져 있는 DNA 폴리머라제 및/또는 리버스 트랜스크립타제 효소의 사용을 포함한다.

샘플 제조는 공급원에 따라 달라지게 되지만, 통상적으로는 핵산 단리 후 이어지는 프로모터 결찰을 포함하게 된다. 본원에서 기술되는 서열분석 방법에 사용되는 핵산 주형은 어떠한 특별한 준비도 필요로 하지 않으며, 그에 따라 표준 DNA 단리 방법이 사용될 수 있다. 마지막으로, 전사 서열분석 시스템에 사용되는 구체적인 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터 서열이 표적 핵산 분자에 결찰되어야 한다. 많은 수의 RNA 폴리머라제들에 의해 인식되는 프로모터 서열들이 업계에 알려져 있어서, 널리 사용되고 있다. 또한, 하나의 핵산 분자 (예컨대 프로모터 서열)를 또 다른 핵산 분자 (예컨대 미지의 서열을 가지는 표적 핵산 분자)에 결찰시키는 방법에 대해서는 업계에 잘 알려져 있으며, 수많은 리가제 효소들이 시중에서 구입가능하다.

또한, 단리된 핵산은 임의로 단편화될 수 있으며, 원할 경우, 특정 크기가 선택 또는 분별될 수 있다. 예를 들면, 단리된 핵산은 초음파처리를 사용하여 단편화된 후, 원할 경우, 일상적인 겔 전기영동 방법론을 사용하여 크기가 선택될 수 있다.

또한, 표적 핵산은 임의로, 반복적이거나 회귀적인 방식으로 원형의 표적상에서 서열분석이 수행될 수 있도록, 예컨대 플라스미드로 원형화될 수 있다.

회전 태그

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법에 있어서, 서열분석되는 표적 핵산 분자는 거기에 결합된 회전 태그를 포함한다. 이와 같은 태그는 RNA 폴리머라제에 의해 핵산에 부여되는 회전력하에 그것이 회전하도록 핵산에 고정된다. 회전 태그는 직경이 수 마이크로미터 (예컨대 1 마이크로미터, 2 마이크로미터, 3 마이크로미터 또는 5 마이크로미터 초과) 만큼 클 수 있으며, 직경이 나노미터급으로 (예컨대 약 50 nm, 100 nm, 250 nm, 500 nm, 750 nm, 850 nm 또는 950 nm) 작을 수 있다. 본원에서 사용될 때, 회전 태그는 비-구형 또는 구형일 수 있는데; 그러나 회전 태그가 단일의 구체인 경우, 그것은 회전을 검출하는 데에 사용될 수 있는 약간 비-균일한 특징을 가져야 한다.

비-구형 태그에는 구체가 아닌 (예컨대 점점 가늘어지는 막대형, 삼각형, 원추형 또는 계란-형상) 단일 잔기가 포함될 수 있다. 또한, 비-구형 태그는 함께 회전의 검출을 가능케 하는 비대칭성을 제공하는 2종 (이상) 상이한 크기의 구형 태그 (예컨대 제1 태그가 제2 태그에 결합됨)를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 태그는 동일하거나 본질적으로 동일한 크기일 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산 분자에 테더링되어 있는 제1 태그는 참조 태그로 간주될 수 있는 반면, 제1 태그에 결합되어 있는 제2 태그는 회전 태그로 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산 분자에 테더링되어 있는 제1 태그는 더 큰 반면, 제1 태그에 결합되어 있는 제2 태그는 더 작다. 이와 같은 배열구조는 제2 태그를 제1 태그의 회전 지점으로부터 가능한 한 멀리 위치시키는데, 이는 광학적 검출하에서의 회전의 해상도를 향상시킨다. 따라서, 더 작은 태그의 크기는 검출 목적으로는 충분하게 커야하지만, 전체 회전 태그의 크기로 인한 유체역학적 효과를 최소화하기에는 충분히 작아야 한다.

예를 들면, 일부 실시양태에서, 회전 태그는 제1 태그로서의 더 큰 비드 (예컨대 약 1 마이크로미터 내지 약 3 마이크로미터 직경), 및 제2 태그로서의 더 작은 비드 (예컨대 약 0.5 마이크로미터 내지 약 1 마이크로미터 직경)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 더 큰 비드는 0.75 또는 1 마이크로미터일 수 있으며, 더 작은 비드는 0.5 마이크로미터일 수 있다. 이러한 크기는 회전을 해상하는 데에 (예를 들면 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 1× 튜브 렌즈와 조합된 0.75의 개구수(numerical aperture)를 가지는 50× 배율의 미투토요(Mitutoyo) 대물렌즈, 및 6.5 마이크로미터 이하 픽셀 크기의 과학용 CMOS 카메라를 포함하는 광학 시스템을 사용) 적당하다. 일부 실시양태에서, 제1 태그는 직경이 0.75 마이크로미터일 수 있으며, 제2 태그는 직경이 0.35 마이크로미터일 수 있다. 이러한 크기 역시 회전을 해상하는 데에 (예를 들면 하기에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 0.9 이상의 개구수를 가지며 과학용 CMOS 카메라를 사용하는 100× 대물렌즈를 사용) 적당하다.

예컨대 제1 태그와 제2 태그 사이의 결합은 기계적 테더 또는 연결 (예컨대 스트렙타비딘-비오틴 결합), 화학 결합 (예컨대 아민 또는 카르복시), 자기 인력 또는 이들의 임의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 태그와 제2 태그는 예컨대 중합 반응을 통하여 서로 물리적으로 결합될 수 있다.

다른 한편으로, 그의 회전이 검출될 수 있다는 전제하에, 회전 태그는 구형일 수 있다. 구형인 회전 태그의 사용은 비-구형 회전 태그에 의해 생성되는 비-선형 역학을 감소시키거나 제거하므로, 구형 회전 태그는 비-구형인 회전 태그에 비해 회전시 더 낮은 유체역학적 저항을 나타내게 된다. 회전을 검출하는 데에 사용될 수 있는 비-균일 특징을 가지는 구형 태그의 일례는 야누스 비드(Janus bead)이다. 예를 들면, 문헌 [Casagrande et al. (1989, Europhys . Lett . 9:251)]을 참조하라. 야누스 비드는 구체 절반에 대한 니켈 코팅으로 인하여 일 반구는 소수성이고 타 반구는 친수성인 구형 비드를 지칭한다. 반구들의 상이한 특징은 회전 태그가 구형인 경우에도 회전을 검출하는 것을 가능케 한다.

본원에서 논의되는 일부 실시양태에서, 회전 태그는 자성일 수 있다. 구형 또는 비-구형인 자성 태그에 대해서는 업계에 잘 알려져 있는데, 자성 비드, 막대 또는 기타 자성 잔기 예컨대 비제한적으로 초상자성 입자의 형태일 수 있다. 전체 회전 태그가 자성일 수 있거나, 또는 회전 태그의 일부만이 자성일 수 있다. 예를 들면 일부 실시양태에서는, 회전 태그 중 제1 태그만이 자성일 수 있다. 수많은 시중의 자성 태그 공급처가 존재한다. 하기 단락은 본원에서 기술되는 서열분석 방법에 사용하기 위하여 자성 회전 태그가 생성될 수 있는 수많은 방식들에 대해 기술한다.

일부 실시양태에서는, 나노자성 용액 (예컨대 톨루엔 또는 크실렌 중 코발트, 또는 Fe3O4 또는 FePt를 사용한 톨루엔 또는 크실렌 중 1% w/v)이 일반적인 중합체 비드에 적용됨으로써 그것을 자성이 되게 할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 나노자성 재료가 중합체 비드의 표면 절반에 적용될 수 있다. 이는 그 절반들이 상이한 굴절률 또는 다른 광학적 특성 (예컨대 산란)을 나타내는 자성 비드를 초래한다. 일부 실시양태에서, 초상자성 입자 (또는 입자의 절반)가 나노은 잉크로 코팅됨으로써, 광학적으로 반사성이며 여전히 완전히 초상자성인 비드를 생성시킬 수 있다. 이러한 실시양태에서는, 자성 입자 또는 자성 입자의 일부에 특정 광학 특성을 부여하기 위하여, 그와 같은 "잉크" (예컨대 PRIMAXX)를 사용하는 침착 및 증발 과정이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 초상자성 입자 (또는 입자의 절반)는 이미 자성인 입자에 특정 광학 특성을 부여하기 위하여 양자점(quantum dot)으로 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 자기변색 입자가 회전 태그로 사용될 수 있다. 자기변색 입자 내에서는, 나노자석이 중합체 내에서 사슬을 형성하거나, 탄소 쉘(shell) 내에 캡슐화된다. 나노입자의 사슬은 외부의 자기장 또는 전자기장을 사용하여 서로에 대해 정렬된다. 입자로부터 광이 확산되는 경우, 정렬된 사슬은 브래그(Bragg) 회절 격자로 작용함으로써, 적절하게 정해진 방향으로 광을 산란시킨다. 자기변색 입자는 외부 장 내부에서 회전함으로써, 다음 회전까지 시작 위치로부터 휴지 또는 정지 위치까지의 회전 기간을 측정하기 위하여, 모든 사슬이 정렬되어 있는 정지된 입자와 사슬이 완전히 정렬되어 있지 않은 회전 입자 사이에 강도 변조가 모니터링될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제1 자성 태그는 검출기에 전기장 변화를 유도할 수 있는 제2 태그와 조합될 수 있다. 그와 같은 전기 태그에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 금속 원소를 포함하거나, 하전되거나, 또는 마이크로미터-크기인 라디오주파수 오씰레이터(oscillator)로써, 자기장 또는 전기장에 변화를 유도하며 기기상에 포착될 수 있는 중합체성 구체일 수 있다 (하기에서 더욱 상세하게 기술됨).

단순히 공간적 관점을 제공하기 위한 것으로써 어떠한 구체적인 크기 또는 거리 제한에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 회전 태그의 저부 표면은, 10 Kb의 핵산 분자가 전사되는 경우에도, 여전히 고체 표면의 상부로부터 겨우 3 ㎛일 수 있다. 즉, 회전 태그는 전사 개시시에도 고체 표면에 매우 근접하여 있다. 전사 종료시에, 회전 태그는 RNA 폴리머라제 효소에 거의 접촉될 수 있으며, 그에 따라 매우 작은 거리만큼 고체 표면의 상부로부터 떨어져 있다. 다른 말로 하면, 2 ㎛의 직경을 가지는 회전 태그가 전사되는 핵산 분자와 대략 동일한 크기가 될 것이다. 업계의 사람이라면, RNA 폴리머라제에 의한 표적 핵산 분자의 전사가 반대 방향으로 진행됨으로써, 전사시 회전 태그를 고체 표면으로부터 멀리 이격시켜 이동시킬 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.

회전 태그는 테더를 사용하여 표적 핵산 분자에 결합될 수 있다. 회전 태그를 표적 핵산분자에 결합시키는 테더에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 비제한적으로 화학적 연결 (예컨대 가교결합, 반 데르 발스 또는 수소 결합) 또는 단백질 연결 (예컨대 비오틴-스트렙타비딘 결합 쌍, 디곡시게닌 및 인식 항체, 히드라진 결합 또는 His-태그결합)이 포함된다. 예를 들면 일부 실시양태에서, 회전 태그는 적어도 부분적으로 스트렙타비딘으로 코팅될 수 있는 반면, 표적 핵산 분자에는 비오티닐화 핵산 테더가 결찰될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 비오틴-표지된 핵산 (예컨대 약 500 염기쌍 (bp))이 표적 핵산 분자의 일 단부에 결찰될 수 있다. 다음에, 비오틴-표지된 테더를 가지는 표적 핵산 분자는 스트렙타비딘-코팅된 회전 태그와 조합될 수 있다. 다양한 화학에 따라 코팅되거나 부분적으로 코팅되어 있으며, 표적 핵산 분자를 테더링시키거나 및/또는 제2 태그를 결합시키는 데에 사용될 수 있는 자성 태그를 포함하여, 수많은 시중에서 구입가능한 태그들이 존재한다 (예컨대 디날(Dynal), 인비트로겐(Invitrogen), 스페로테크(Spherotech), 키스케르 인크.(Kisker Inc.), 방스 래보래토리즈 인크.(Bangs Laboratories Inc.)).

핵산 분자에 대한 장력

일부 실시양태에서, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법은 표적 핵산 분자에 지향력을 적용하는 단계를 포함하는데, 이는 표적 핵산 분자가 일정량의 장력하에 놓이게 되는 것으로 이어진다. 표적 핵산 분자에 대한 장력은 더 긴 표적 핵산 분자에서 중요해지는데, 더 긴 핵산 분자는 그 자체가 접히거나 붕괴될 수 있기 때문이다. 표적 핵산 분자의 어떠한 유형의 비정상적인 나선 구조도 RNA 폴리머라제로부터 회전 태그로 전달되는 회전력을 약화시키거나 차단할 수 있다.

표적 핵산 분자에 적용되는 지향력은 특히 전사 복합체의 하류에서, 그리고 특히 회전 태그가 RNA 폴리머라제로부터 수천 또는 수십만 뉴클레오티드 떨어져 있는 경우에, 표적 핵산 분자의 이중-가닥 나선 특성을 유지하기에 충분할 필요가 있다. 그러나, 표적 핵산 분자에 적용되는 지향력이 소정 방식으로 회전 태그의 회전이 방해받거나 표적 핵산 분자의 백본이 파괴될 정도로 강할 수는 (즉 너무 큰 장력을 적용할 수는) 없다. 표적 핵산 분자에 대한 이와 같은 장력은 또한 회전 태그의 브라운 운동 또는 기타 노이즈 효과(noise effect) (예컨대 열유동 노이즈 효과)를 감소시킴으로써, 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 것의 정밀도를 증가시킬 수 있다.

장력은 3-차원 공간에서 정해진 양의 힘 및 위치로 핵산-테더링된 회전 태그를 표면으로부터 이격하여 상승시키기 위한 것이다. 장력의 방향은 고체 표면의 평면 (즉 x-축)에 대비하여 본질적으로 90 ° 각도 (즉 z-축)로 표적 핵산을 연장시킬 수 있으나, 지향력 역시 고체 표면의 평면 대비 90 ° 전후인 방향으로 표적 핵산 분자를 연장시킬 수 있다. 그러나, 회전 태그가 고체 표편에 너무 가까워 표면이 (예컨대 표면 화학 또는 표면 유동 현상으로 인하여) RNA 폴리머라제 활성의 신호로서의 회전력 프로필 및/또는 회전 태그의 운동 패턴을 방해 (예컨대 변화, 변경, 약화, 감소, 제거)할 수는 없다는 것을 알고 있을 것이다.

일부 실시양태에서, 장력 공급원 (또는 지향력 공급원)은 자석일 수 있다. 그와 같은 경우, 회전 태그 또는 회전 태그의 일부는 자성일 수 있다. 본원에 표시되어 있는 바와 같이, 자성 태그 (예컨대 비드, 막대 등)에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 약 1 pN의 크기로 z-축 방향으로 균일한 공간적 힘을 제공하는 자기력이 적용됨으로써, 표적 핵산 분자를 적당하게 연장시키고 임의의 루프화(looping)를 방지할 수 있다. 그와 동시에, 상기 자석은 x-축 방향으로는 미미한 힘만을 생성시킨다. 이러한 특징은 회전 태그가 자유롭게 회전하도록 하는 동시에, 회전 태그의 소정의 브라운 운동을 안정화시킨다. 일부 실시양태에서, 장력 공급원은 예를 들면 액체 (예컨대 물 또는 완충제) 또는 공기의 지향 유동(directional flow)의 결과일 수 있다.

표적 핵산 분자에 적용되는 장력의 양은 표준 유동 방법론을 사용하여 보정된 후, 데이터 획득 및 분석 과정 또는 염기 지정 알고리즘(base calling algorithm)에 통합될 수 있다. 예를 들면, 상기 보정은 표면 위의 다양한 위치에서, 표면 평면 대비 다양한 각도로, 및/또는 상이한 유동 또는 자기장에서, 표면상에 고정되어 있는 RNA 폴리머라제에 의해 전사되는 핵산 분자에 결합되어 있는 회전 태그의 브라운 운동을 모니터링하는 것을 포함할 수 있다.

단순히 공간적 관점을 제공하기 위한 것으로써 어떠한 구체적인 크기 또는 거리 제한에도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 칩상 실시양태에서, 회전 태그는 장력이 적용될 때 표면 위 1 마이크로미터 정도에 있을 수 있다. 예를 들면, 각 염기는 다음 염기로부터 0.3 nm 만큼 떨어져 있기 때문에, 표면에서 RNA 폴리머라제에 결합되어 있는 1 Kb의 핵산 분자는 표면으로부터 약 300 nm 거리의 타 단부에 회전 태그를 가지게 된다. 이와 같은 거리는 비제한적으로 고체 표면에 대한 RNA 폴리머라제의 상이한 고정 방법, 및 상이한 길이의 핵산 (예컨대 프로모터 서열, 테더 서열)을 사용하여 변화될 수 있다. 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 회전 태그가 표면으로부터 10 nm 내지 수 마이크로미터까지인 상황들을 수용할 수 있다.

도 2는 자기장 적용 전 (도 2a) 및 후 (도 2b)의 2.7 마이크로미터 자성 비드를 나타낸다.

검출 방법

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법에서 다양한 서열분석 조건하에 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 것은 회전 태그상에 광을 투사하기 위한 광원, 및 회전 태그를 가시화하고 회전 패턴의 변화를 관찰하기 위한 광학기기를 필요로 한다. 어떠한 수의 적합한 조명 방법 및 광학기기들도 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법에 사용될 수 있기는 하지만, 본 시스템 및 방법의 단순성, 및 검출 구성요소를 위한 복잡하고 고가인 기술에 대한 어떠한 요건도 없음의 예로써 하기 실시양태들이 제공된다.

광원은 LED일 수 있거나, 또는 광원은 백색광, 또는 단일- 또는 다중-섬유일 수 있다. 광원은 정상 조명일 수 있거나, 또는 원할 경우 펄스화된 조명으로 제공될 수 있다. 광은 동일한 방향으로부터, 또는 다중 방향으로부터 투사될 수 있다. 예를 들면, 광원은 조정가능할 수 있는 (예컨대 강도 및/또는 스펙트럼) 중합체 섬유 또는 다발일 수 있다. 회전 태그를 확인하고 (예컨대 회전 태그의 형상) 그의 회전을 확인하는 데에는, 회전 태그의 크기 및 검출기로부터의 그의 거리를 바탕으로, 프레넬(Fresnel) 및/또는 프라운호퍼(Fraunhoffer) 회절이 사용될 수 있다.

광학기기는 단순 렌즈 및 대물렌즈 (예를 들면 50× 대물렌즈, 예컨대 0.75의 개구수를 가지는 미투토요 50×가 구비된 현미경 렌즈), 및 1× 배율을 가지는 튜브 렌즈일 수 있다. 광학기기에는 또한 적절한 초 당 프레임으로 작동하는 카메라 (예를 들면 비디오 카메라, 예컨대 과학용 CMOS)가 포함될 수 있다. 다르게는, 광학기기는 그것이 적당한 픽셀 수를 가진다는 전제하에 (그리고 회전 태그의 회전을 이미지화하는 데에 광원이 충분한 광자를 제공한다는 전제하에), 전류 보충 금속-산화물-반도체 (current complementary metal-oxide-semiconductor, CMOS) 또는 전하-커플링 소자 (charge-coupled device, CCD) 기술을 활용할 수 있다. 현재 사용되고 있는 CMOS 검출기는 매우 빠르다 (예컨대 초 당 1000 프레임 이상, 1 ms 이하의 노출에 해당). 이와 같은 검출기 속도 수준은 현행 접근법들을 괴롭히는 빠른 뉴클레오티드 도입의 확률론적 특성으로 인한 어떠한 불명료성도 배제한다. 예를 들면, 많은 현행 접근법들 (예컨대 퍼시픽 바이오사이언시즈, 콤플리트 제노믹스, 인크.)은 통상적으로 카메라 노출 윈도우 내에서 적당한 수의 형광 광자를 수집할 필요성으로 인하여 10 ms 이상의 노출로 제한되는데, 이는 수집되는 서열 데이터의 오류로 이어진다.

이미지화 검출기에 작은 픽셀 크기를 사용하는 능력은 다른 서열분석 기술 (예컨대 고처리량 이미지 포착시 단일-분자 형광 또는 일반적인 형광에 의존하는 퍼시픽 바이오사이언시즈, 콤플리트 제노믹스 인크., 및 기타)과 비교되는 본 방법의 또 다른 장점이다. 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 다른 실시간 서열분석 적용분야에서 사용되는 CMOS 센서에 있어서의 현행 기술인 6.5 마이크로미터에 비해, 작은 픽셀 크기 (예컨대 휴대용 폰 카메라에 있어서의 현행 기술인 1.4 마이크로미터)를 사용할 수 있다. 이는 주로 본 서열분석 방법이 다른 시스템에 비해 더 많은 노이즈를 수용할 수 있기 때문이다. 두드러지게도, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석에서는, 이미지화 처리량이 훨씬 더 높을 수 있는데, 작은 픽셀 (예컨대 차세대 휴대용 폰에서 통용되는 8-10 M픽셀)을 가지는 대형 센서를 사용함으로써 더 큰 표면 영역을 이미지화하는 능력때문이다. 특수화된 광학 플랫폼에 의존하는 업계의 다른 서열분석 시스템 (예컨대 켐펫(ChemFet), 이온 토렌트)과는 달리, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법에서의 검출 방법은 소프트웨어에 대한 변형만을 적용한 시중 CMOS 카메라 하드웨어의 사용을 가능케 한다.

이러한 센서로부터의 비디오 모드에서의 데이터 획득 방법은 통상적으로 각 픽셀의 강도 값을 사용한다 (예컨대 미가공 포맷 데이터 사용). 광원이 색상들 사이의 적절한 균형을 갖춘 백색 LED 또는 RGB 조명기기인 경우, 회전 태그의 회절 및 영상(shadow) 패턴은 인접 픽셀들에 기록되게 되며, 마치 센서가 흑색 및 백색 센서였던 것처럼 이미지가 생성될 수 있다. 예를 들면, 비-구형 회전 태그의 직접 영상 또는 회절은 검출기의 픽셀상에 기록될 수 있으며, 회절에 대한 변화 효과로 인하여 회전이 검출될 수 있다.

단순히 예를 들자면, 회전의 검출 (예컨대 회전 태그에 의한 회전 패턴의 검출)은 하기와 같이 이루어질 수 있다. 회전 태그는 예를 들면 LED 또는 섬유 커플링 - LED 또는 LED 어레이를 사용하여 위로부터 조명될 수 있다. 고체 표면 유동 셀 아래에는, 0.75의 개구수를 가지며 무한대로 보정된 미투토요 50× 대물렌즈가 과학용 CMOS 칩상으로의 시야를 이미지화하는 튜브 렌즈와 함께 사용될 수 있다 (예컨대 5.5 MP를 가지며, 각각 대략 6.5 마이크로미터 크기인 픽셀들 사이에 6.5 마이크로미터의 중심-대-중심 거리를 가짐). 각 회전 태그에 대하여 10×10 픽셀을 할당하는데, 그와 같은 픽셀 크기는 전체 CMOS 표면에서 55,000개를 초과하는 회전 태그를 초래할 수 있는 1 마이크로미터 비드의 회전을 검출하는 데에 적당하다. 각 회전 태그가 5 Kb 표적 핵산 분자에 결합되는 경우, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 단일 칩에서의 단일 전개로 275 M염기가 넘게 서열분석할 수 있다. 비교하자면, E. 콜라이 게놈은 4.5 M염기이다. 전사 속도가 고정된 RNA 폴리머라제에 있어서 합리적인 수인 초 당 10개 뉴클레오티드인 경우, 전체 E. 콜라이 게놈은 500초 이내에, 즉 10분 미만에 본원에서 기술되는 바와 같이 서열분석될 수 있다. 초 당 100 프레임 (즉 각 뉴클레오티드 전사 당 10 프레임)까지 기록하는 능력을 가지는 검출기이면, 본원에서 기술되는 서열분석 시스템 및 방법에 충분하다. 상기 계산은 어떠한 결합 효율도 포함하고 있지 않다. 또한, RNA 폴리머라제에 의한 중지가 10 프레임 미만인 것으로 가정한 비동시성 서열분석 패턴에서는, 상기 계산에 어떠한 추가적인 반응 시간도 부가되지 않지만, 속도-제한 뉴클레오시드 트리포스페이트가 훨씬 더 낮은 농도로 조절되는 경우에는, 비동시성 서열분석 패턴이 반응에 시간을 부가할 수 있다 (예컨대 정밀도를 증가시키고 결실 오류를 최소화하기 위함).

회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 또 다른 예를 하기한다. 회전 태그는 LED 또는 섬유 커플링 - LED 또는 LED 어레이를 사용하여 조명될 수 있는데, 이 경우 일 측에 350 nm의 코어 크기를 가지며, 타 측에는 6.5 마이크로미터의 코어 크기를 가지고 (약 1:19 점감), 과학용 CMOS 칩 (예컨대 페어차일드 이미징(Fairchild Imaging)의 표면에 결합될 수 있는 점감형 도파로의 상부에 회전-의존성 전사 서열분석 복합체가 위치된다. 그와 같은 칩은 각각 대략 6.5 마이크로미터인 픽셀들 사이에 6.5 마이크로미터의 중심-대-중심 거리를 가지는 5.5 M픽셀을 가진다. 이와 같은 경우, 350 nm 코어의 상부에서 1 마이크로미터 비드의 회전을 검출하기에 적당한 3×3 픽셀을 각 회전 태그에 할당하는 것은 해당 칩상에 610,000개를 초과하는 회전 태그를 가능케 한다. 각 회전 태그가 5 Kb 표적 핵산 분자에 결합되는 경우, 단일 칩상에서의 단일 전개로 총 3 G염기가 넘게 서열분석될 수 있다. 이는 사실상 전체 인간 게놈을 한번에 포괄하는 것이다. 상기 계산은 결합의 효율, 점감 내지 정사각형 픽셀의 원형 코어로부터의 신호의 원형화 효과(rounding effect), 또는 코어-대-픽셀의 결합 과정에서의 부조화로 인한 픽셀의 손실은 고려하지 않은 것이다.

하기는 고처리량 서열분석 시스템에서의 회전 패턴 검출의 예이다. 예를 들면, 상기 예에서 기술된 점감형 도파로 및 과학용 CMOS 센서를 사용하는 대신, 예를 들면 14.5 MP 및 픽셀 당 1.2 마이크로미터의 옴니비젼 인크.(OmniVision Inc.) 칩이 검출기 윈도우를 제거하고, 회전-의존성 전사 서열분석 복합체의 하나 이상 구성요소를 칩의 마이크로렌즈 어레이에 직접 결합시킨 후, 사용될 수 있다. 2.8 마이크로미터 회전 태그를 사용하는 회전 패턴은 2×2 픽셀에서 비디오의 신호 처리를 사용하여 검출될 수 있다. 서로 근접한 회전 태그의 어레이에 대하여 각 방향으로 추가 2 픽셀을 허용함으로써, 회전 태그 당 총 8개 픽셀이 할당될 수 있다. 이와 같은 경우, 하나의 칩은 서열분석되는 표적 핵산 분자에 결합된 1,800,000개를 초과하는 회전 태그를 가질 수 있다. 따라서, 이러한 칩 3개면, 완전한 인간 게놈을 서열분석하는 데에 적당한 반면, 4개의 칩은 정밀도를 상당히 증가시킬 수 있다. FPGA 또는 기타 DSP 설계 및 고체 상태 드라이브의 어레이에 대한 직접 저장을 바탕으로 하여, 적당한 속도로 (예컨대 특정 칩에 뉴클레오티드 도입 속도를 조화시킴) 이와 같은 센서의 해독치를 산출하기 위한 전자공학이 사용될 수 있으며, 그 구성요소에 대해서는 업계에 알려져 있다.

단순히 예를 들자면, 회전의 검출은 하기와 같이 이루어질 수 있다. LED 구조의 조명 (예컨대 4× 렌즈가 구비된 무-오염 여기용으로 개조된 라이트스피드 제노믹스(Lightspeed genomics) 모듈)이 SciCMOS 카메라 (예컨대 초 당 100 프레임으로 5.5 MP)의 표면에 회전 태그의 회절 영상을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 간섭패턴은 해상도를 9× 향상시킴으로써 20 fps에서 49 MP 센서를 효과적으로 생성시키기 위하여, 이미지 당 5 프레임을 이용할 수 있다. 각 단일 분자는 예를 들면 칩 당 약 2,000,000개의 회전 태그를 가능케 하는 5×5 픽셀에 할당될 수 있다. 태그-대-태그 커플링에서의 포아송 효율을 가정하면, 각각 5 Kb 핵산 분자를 전사하는 660,000개의 이용가능한 단일 RNA 폴리머라제 분자는 단일 전개로 3.3 G염기가 서열분석될 수 있는 것으로 이어진다. 비동시성 서열분석 방법에서는, 4종의 반응이 수행될 수 있다 (하지만, 일부 실시양태에서는 3종의 반응이 수행되며, 제4 뉴클레오티드는 다른 3종 뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하여 수득된 서열분석 정보로부터 추론됨). 효소 중지 당 5 프레임으로 각 중지에서 총 250 ms를 허용하는 반면, 그밖에 폴리머라제는 초 당 15개의 nt를 도입하므로, 처리량은 시간 당 18 Gb에 육박한다. 이와 같은 서열분석 속도는 짧은 해독 길이에 있어서도 어떠한 현행 기술보다 상당히 더 높은 것이다. 본원에서 표시되는 바와 같이, 현행 휴대용 폰 카메라 기술 (10 MP, 1.2 ㎛ 픽셀 크기)이 이와 같은 시스템의 요건을 충족한다.

마찬가지로, 컬러 (예컨대 센서상의 RGB 필터 코팅 사용) 또는 단색 휴대용 폰 또는 디지털 카메라 센서가 본원에서 기술되는 서열분석 방법 및 시스템에서 사용하기 위한 요건을 충족한다 (예컨대 14.5 MP 및 1.25 마이크로미터 픽셀 센서). RGB 센서의 각 픽셀이 적색 또는 녹색 또는 청색 필터를 사용하여 패턴으로 코팅되기는 하지만, 이러한 센서는 본원에서 기술되는 서열분석 시스템 및 방법에 사용될 수 있는데, 본원에서 기술되는 서열분석 시스템 및 방법에서 사용되는 광원이 넓은 스펙트럼 (예컨대 백색 LED(들))을 가지며, 카메라 칩 (예컨대 규소)의 검출기 부분에 산란, 반사, 회절 또는 투과 광학 신호를 제공할 수 있기 때문이다.

이와 같은 예에서, 각 회전 태그를 검출하는 데에 사용되는 픽셀의 수는 회전 태그의 영상 또는 회절에 의해 추정될 수 있다. 형광 여기 대신 직접적인 광 조명이 사용되는 경우, 여기 광을 차단하거나 및/또는 형광 통과대역을 가지는 두꺼운 광학 필터는 필요하지 않다. 이러한 필터는 수백 마이크로미터 두께일 수 있는데, 이는 칩상 검출기에서 적은 수의 픽셀에 형광을 수집하는 데에 필요한 광학적 설계를 복잡하게 할 수 있다. 적은 수의 픽셀에 광을 수집하는 것은 중요한데, 서열분석 시스템의 처리량의 한 측면이 각 부위 또는 사례에 할당되는 픽셀의 수로 나눈 검출기상 픽셀의 총 수에 의해 한정되기 때문이다. 예를 들면, 부위 당 10개 픽셀을 할당하는 i-폰-유형 8 MP CMOS 센서의 경우, 총 800,000 부위를 가능케 한다. 부위 당 전개 당 평균 1 Kb 핵산이 서열분석되는 경우라면, 처리량은 전개 당 최대 800 M염기이다. 프라운호퍼 회절, 및 1 마이크로미터 거리의 3 마이크로미터 비드를 사용하는 경우라면, 복잡한 광학적 설계를 가지는 렌즈에 대한 필요성 없이 부위 당 10개 미만의 픽셀이 사용될 수 있다.

한 실시양태에서는, 회전 태그의 어레이가 표면으로부터 예컨대 4×4 mm²을 초과하는 면적으로 상승되는 것을 가능케 하는 장력의 공급원이 제공될 수 있다. 특히 서열분석이 칩상에서 수행되는 경우 (유효 FOV가 칩의 전체 면적임), 본 방법 및 시스템이 시야(field of view) (FOV)로 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 옴니비젼 14 MP 센서의 표면적은 약 6×4 mm이다.

본원에서 표시되는 바와 같이, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법에 의해 제공되는 많은 장점들 중 하나는 그의 확률론적 특성으로 인한 RNA 폴리머라제에 의한 극히 빠른 뉴클레오티드 도입이다. 그러나, 높은 도입 속도 및 결과적인 회전 속도는 데이터 포착을 까다롭게 만들 수 있다. 업계 숙련자라면, 현재 기술되고 있는 비동시성 서열분석 방법에서는 예컨대 중지가 발생할 때까지 "종료점(end-point)" 정보만이, 예를 들면 총 회전의 수만이 기록될 필요가 있다는 것을 알고 있을 것이다. 즉, 매우 빠르고 단순 검출기가 효과적으로 이미지화하기는 어려울 수 있는 개별 도입 단계를 포착할 필요는 없다. 따라서, 서열분석 반응이 RNA 폴리머라제에 의한 중지들 (속도-제한량인 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재로 인함) 사이의 총 회전량을 검출하기에 충분한 높은 프레임 속도로 기록되는 한, 정밀한 핵산 서열이 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 자성 회전 태그의 회전 패턴은 센서로서 GMR (거대 자기-저항성(giant magneto-resistance)) 어레이를 사용하여 포착될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 회전-밸브(spin-valve) 어레이 또는 MRAM이 자성 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터 메모리 어레이 (예를 들면 RAM, 예컨대 DRAM)가 메모리 셀 용량성 소자에 가까운 표면 변형 (예컨대 자기장 효과를 은폐하는 것일 수 있는 표면으로부터의 층을 제거하기 위하여 연마함)을 수용하여 변형될 수 있다. 자성 회전 태그의 유도 전기장은 RAM의 셀/커패시터의 2-차원 어레이에 의해 감지될 수 있다. 다음에, RAM 어레이의 셀은 컴퓨터에의 메모리의 설치 후 메모리 해독 소프트웨어를 사용하여 직접 해독될 수 있다. MRAM이 센서로서 사용되는 경우, 자기장의 사용 없이 표적 핵산에 장력의 공급원을 제공하기 위하여, 유동이 사용될 수 있다. 다르게는, MRAM 셀의 감지 신호가 변형되는 장에서는, 자기장이 장력의 공급원으로 사용될 수 있다.

서열분석 조건

다시 도 1a를 참조하면, 회전-의존성 전사 복합체 (100)는 수많은 상이한 방식으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 프로모터-결합 표적 핵산 분자 (10)가 거기에 고정된 RNA 폴리머라제 (20)를 가지는 고체 표면 (30)에 제공될 수 있다. 이와 같은 실시양태에서, 회전 태그 (40)는 표적 핵산 분자 (10)가 고정된 RNA 폴리머라제 (20)와 복합체화되기 전 또는 그 후에 표적 핵산 분자 (10)에 결합될 수 있다. 또 다른 예에서는, RNA 폴리머라제 (20)와 프로모터-결합된 표적 핵산 분자 (10)가 조합된 다음, 고체 표면 (30)에 침착될 수 있다. 표시되어 있는 바와 같이, 회전 태그 (40)는 복합체가 교체 표면 (30)상에 침착되기 전 또는 그 후에 프로모터-결합된 표적 핵산 분자 (10)에 결합될 수 있다. 또 다른 예에서, 회전 태그 (40)는 프로모터-결합된 표적 핵산 분자 (10)에 결합된 후, RNA 폴리머라제 (20)와 접촉될 수 있다. RNA 폴리머라제 (20)는 회전 태그결합-표적 핵산 분자 (10)를 도입하기 전체 고체 기판 (30)상에 고정될 수 있거나, 또는 전체 복합체가 침착된 후, 고체 기판 (30)상에 고정될 수 있다.

표적 핵산 분자의 서열을 결정하기 위하여, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석은 비동시성 (즉, 속도-제한) 모드 (도 3a) 또는 동시성 (즉 염기별(base-by-base)) 모드로, 또는 이들의 임의 조합으로 수행될 수 있다 (도 3b). 최소한, 본원에서 사용될 때의 "서열분석 조건"은 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 지칭하며, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하기 위하여 하기하는 바와 같이 사용될 수 있다.

본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같은 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 이외에도, 서열분석 반응이 수행되는 조건들에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 적절한 완충제 성분들 (예컨대 KCl, 트리스-HCl, MgCl₂, DTT, 트윈-20, BSA)이 사용되어 효소를 위한 적합한 환경을 제공할 수 있다.

a) 비동시성 서열분석

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법은 뉴클레오티드의 비동시성 도입을 바탕으로 핵산을 서열분석하는 데에 사용될 수 있다. 비동시성 실시양태에 있어서, 최초의 반응이 이루어지는 서열분석 조건 (즉 제1 서열분석 조건)은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하며, 여기서 뉴클레오시드 트리포스페이트는 그 중 1종 이상은 속도-제한적이고 1종 이상은 속도-제한적이 아닌 상이한 양으로 존재한다. 예를 들면, 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 1종은 속도-제한량으로 (예컨대 다른 3종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 양 미만인 양으로) 제공된다. 이와 같은 반응에서, RNA 폴리머라제는 그것이 속도-제한량으로 제공된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 전사체에 도입하려고 하는 시점마다 효과적으로 중지될 것이며, 그와 같은 중지는 본원에서 기술되는 바와 같이 회전 태그의 회전 패턴에서 관찰될 수 있다.

두드러지게도, 각 중지 사이의 염기의 수는 중지 사이 회전의 누적량을 검출함으로써 정밀하게 결정될 수 있다. 따라서, 예를 들면 표적 핵산 분자의 서열상에서의 각 구아닌 (G) 뉴클레오티드의 정밀한 위치는 G 뉴클레오시드 트리포스페이트가 속도-제한량으로 제공될 때의 회전 패턴의 변화로 인하여 간단하게 확인될 수 있다. 유사한 반응이 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 각각 제2, 제3 및 제4 뉴클레오시드 트리포스페이트가 속도-제한량으로 존재하는 제2, 제3, 및 원할 경우 제4의 서열분석 조건하에서 수행될 수 있다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 서로 동시에 수행되는지, 또는 서로에 이어서 순차적으로 수행되는지에 관계없이, 4종의 반응으로부터의 조합된 정보는 표적 핵산 분자의 완전한 서열을 제공한다.

4종 뉴클레오티드 중 1종의 위치 서열로 이어지는 단일 반응으로부터의 패턴도 핵산 데이터베이스와 비교됨으로써, 높은 신뢰 수준으로 핵산 분자를 확인하는 데에 사용될 수 있다. 또한, 일단 다른 3종의 뉴클레오티드가 알려지고 나면 서열에서의 제4 뉴클레오티드의 위치 정보가 추론될 수 있기 때문에, 업계 숙련자라면, 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 3종으로부터 생성되는 위치 정보를 사용하여 표적 핵산 분자의 서열이 컴파일될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.

b) 동시성 또는 염기별 서열분석

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법은 달리 염기별 서열분석으로 알려져 있을 수 있는 동시성 패턴으로 핵산을 서열분석하는 데에 사용될 수 있다. 동시성 또는 염기별 실시양태에 있어서, 최초 반응이 이루어지는 서열분석 조건 (즉 제1 서열분석 조건)은 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함한다. 이와 같은 반응에서, RNA 폴리머라제에 의한 전사는 표적 핵산이 그 위치에서 상보성인 염기를 함유하는 경우에만 진행될 것이며, 그것은 본원에서 기술되는 바와 같이 회전 태그의 회전 패턴 변화로 관찰될 수 있다. 이중-나선의 구조적 특징으로 인하여, RNA 폴리머라제에 의한 1개 뉴클레오티드의 도입은 약 36회전을 초래한다. 이와 같은 반응 조건은 회전 태그의 회전 패턴이 변화하지 않을 때까지 계속된다. 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트가 순차적으로 전사체에 도입된 (예컨대 표적 핵산 분자의 단일중합체 영역에서의) 회수를 정밀하게 확인하는 데에는 회전 패턴의 누적 변화가 사용될 수 있다는 것은 이해될 것이다.

제1 서열분석 조건 (즉 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재)하에 회전 태그의 회전 패턴에서 더 이상 변화가 관찰되지 않는 경우, 또는 제1 서열분석 조건하에서는 회전 패턴의 변화가 관찰되지 않는 경우에는, 제2 서열분석 조건하에서 반응이 수행된다. 제2 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제2 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함한다. 회전 태그의 회전 패턴의 변화는 전사 (즉 RNA 폴리머라제에 의한 전사체로의 존재하는 특정 뉴클레오시드 트리포스페이트 하나 이상의 도입)를 나타내는 반면, 회전 태그의 회전 패턴 변화의 부재는 전사가 이루어지지 않았음을 나타낸다.

제1 서열분석 조건, 제2 서열분석 조건, 제3 서열분석 조건 (즉 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재), 또는 제4 서열분석 조건 (즉 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제4 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재) 하에서의 이와 같은 반응들은 각 서열분석 조건 각각하에서의 회전 태그 회전의 회전 패턴의 변화 및/또는 누적 각도를 바탕으로 표적 핵산 분자의 서열이 순차적으로 확인되는 방식으로 수행될 수 있다. 업계 숙련자라면, 상이한 서열분석 조건을 도입하기 전에 일 서열분석 조건하에서의 잔류 뉴클레오시드 트리포스페이트를 제거하는 단계가 이루어질 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들면, 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트를 도입하기 전에, RNA 폴리머라제가 고정된 표면이 세척 또는 플러싱될 수 있다. 그와 같은 세척 단계가 필요한 것은 아니지만, 해당 단계가 결과적인 서열 정보의 정밀도를 증가시키게 된다는 것을 알고 있을 것이다.

c) 추가적인 서열분석 방법론

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법은 예를 들면 비제한적으로 서열분석 정보의 정밀도를 증가시키고 서열분석 반응에서 수득되는 정보의 양을 증가시키기 위하여, 이용할 수 있는 수많은 상이한 변동 및 일상적인 변형들을 받을 여지가 있다.

예를 들면, 많은 RNA 폴리머라제들이 "가닥-전환(strand-switching)" 또는 "전환 전사(turn-around transcription)" 능력을 가지고 있다. 이와 같은 특징은 결과적인 서열 정보의 정밀도를 증가시키기 위하여 본원에서 기술되는 방법에 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들면, RNA 폴리머라제가 표적 핵산의 말단에 도달하는 경우, RNA 폴리머라제는 반대편 가닥으로 "점프"하여 전사를 계속할 수 있다. 예를 들면 맥칼리스터(McAllister) 등 (US 2007/0077575호) 및 롱(Rong) 등 (문헌 [1998, "Template Strand Switching by T7 RNA Polymerase", J. Biol . Chem., 273(17):10253-60])을 참조하라. 또한, 어떤 RNA 폴리머라제는 이중-가닥 DNA 주형으로부터 혼성 DNA-RNA 전사체로 "점프"한 후, DNA 가닥의 전사를 재개할 수 있다. 또한, 표적 핵산 분자의 이와 같은 유형의 회귀성 서열분석은 RNA 폴리머라제가 반대편 가닥에 결합하여 전사하도록 표적 핵산 분자의 각 말단에 RNA 폴리머라제 프로모터를 도입 (예컨대 결찰)하는 것에 의해 유전자적으로 조작될 수 있다.

또한, 1종 이상의 상이한 RNA 폴리머라제들 (예컨대 상이한 생물체로부터의 RNA 폴리머라제들, 또는 동일한 생물체로부터의 상이한 RNA 폴리머라제들)이 고체 표면상에 고정될 수 있다. 업계에 알려져 있는 바와 같이, 상이한 RNA 폴리머라제는 상이한 프로모터 서열을 인식하여 거기에 결합한다. 따라서, 1종 이상의 상이한 RNA 폴리머라제 프로모터가 상이한 표적 핵산 분자 군집에 결찰될 수 있으며, 고체 표면상에 고정된 1종 이상의 상이한 RNA 폴리머라제들을 사용하여, 회전 태그의 회전 패턴을 바탕으로, 합쳐진 표적 핵산 분자 군집이 서열분석될 수 있다. 예를 들면 상이한 RNA 폴리머라제들 또는 상이한 표적 핵산 분자의 군집들을 상이하게 표지하는 것에 의해 (예를 들면 상이한 파장을 방출하는 비드, 형광 태그 또는 형광-표지된 항체를 사용), 일 표적 핵산 분자 군집의 서열이 또 다른 표적 핵산 분자 군집의 서열로부터 구별될 수 있다. 이와 같은 방법을 사용하면, 상이한 표적 핵산 분자 군집에서의 서열분석 반응들이 동시에 이루어질 수 있다.

일부 실시양태에서는, RNA 폴리머라제 및 표적 핵산 분자 군집 모두가 상이하게 표지될 수 있다. 표적 핵산 분자를 표지하는 것이 핵산을 통하여, 또는 예컨대 회전 태그를 통하여 직접적으로 이루어질 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 서열분석 반응의 여러 수준에서 상이하게 표지하는 이와 같은 능력은 예를 들면 동일한 서열을 가지는 표적 핵산 분자에 대한 상이한 RNA 폴리머라제들의 연작용성(processivity) (예컨대 단일중합체 영역 또는 메틸화 영역을 식별할 수 있음)을 비교하는 데에, 또는 1종을 초과하는 RNA 폴리머라제들에 의한 상이한 서열을 가지는 표적 핵산 분자의 전사를 비교하는 데에 사용될 수 있다.

단순히 예를 들자면, 적절한 핵산 프로모터 서열과 함께인 RNA 폴리머라제 효소들 (예컨대 T7, T3, SP6 또는 K11 박테리오파지 중 1종 이상으로부터의 것)의 어떠한 조합도 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 방법에 사용될 수 있다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 이와 같은 특징은 서열분석 반응의 다중화를 가능케 한다. 해당하는 특정 프로모터 서열과 함께 상이한 RNA 폴리머라제들은 물론, 차별-표지화 기술을 이용하는 기타 변종들은 본원에서 고려된다.

일부 실시양태에서는, 동일한 서열분석 조건하에서 (예컨대 제1 서열분석 조건) 2개의 비동시성 회전-의존성 전사 서열분석 반응이 수행될 수 있다. 일단 충분한 뉴클레오티드 수 (예컨대 100 nt, 500 nt, 1,000 nt, 5,000 nt 또는 10,000 nt 이상)로 서열분석이 진행되고 나면, 반응들 중 하나의 서열분석 조건이 변화된 후 (예컨대 제2 서열분석 조건으로), 회전-의존성 전사 서열분석이 계속될 수 있다. 제1 서열분석 조건하에서 수득되는 결과적인 서열 정보는 제2 반응에서와 동일한 특정 표적 핵산 분자를 사용한 제1 반응에서 특정 표적 핵산 분자를 정렬하는 데에 사용될 수 있는데, 이는 서열분석 조건이 변화되는 경우, 특정 표적 핵산 분자 내에서의 2종의 뉴클레오티드에 대하여 위치 서열 정보가 수득되는 것을 가능케 한다.

업계 숙련자라면, RNA 폴리머라제에 의해 핵산 분자에 인가되는 비틀림으로 인하여, 회전 태그가 RNA 폴리머라제를 느리게 할 가능성이 있는 "부하"를 생성시킬 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 이는 예를 들면 단순 구형 비드에 비해 유동 매체 중에서 더 큰 마찰을 초래할 수 있는 상이한 형상 (2개의 타원형 비드 또는 비드-막대 조합)을 가지는 회전 태그를 사용하는 것에 의해 방지 또는 감소될 수 있다. 다른 한편으로는, RNA 폴리머라제의 기계적 부하가 서열분석 속도에 유리하게 영향을 주도록 사용될 수 있는 RNA 폴리머라제 및/또는 서열분석 조건이 있을 수 있다.

제조 물품 / 키트

본원에서는, 제조 물품 (예컨대 키트)이 제공된다. 제조 물품에는 다수의 RNA 폴리머라제 효소가 고정된 본원에서 논의되는 바와 같은 고체 기판이 포함될 수 있다. 다수의 RNA 폴리머라제 효소는 10개 이상의 RNA 폴리머라제 (예컨대 20, 50, 75 또는 100개 이상의 효소), 100개 이상의 RNA 폴리머라제 (예컨대 200, 500 또는 1,000개 이상의 효소), 또는 1,000개 이상의 RNA 폴리머라제 (예컨대 약 2,500, 5,000, 10,000 또는 50,000개 이상의 효소)를 지칭한다.

제조 물품에 대해서는 업계에 잘 알려져 있는데, 포장 재료 (예컨대 발포 팩, 병, 튜브, 바이알 또는 용기)가 포함될 수 있으며, RNA 폴리머라제가 고정되어 있는 고체 표면 이외에도, 1종 이상의 추가적인 구성요소들이 포함될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제조 물품에는 회전 태그가 포함될 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 회전 태그는 비-구형 태그, 또는 회전을 검출하는 데에 사용될 수 있는 비-균일 특징을 가지고 있는 구형 태그일 수 있다.

일부 실시양태에서, 제조 물품에는 RNA 폴리머라제 프로모터에 해당하는 핵산 서열이 포함될 수 있다. 본원에서 논의되는 바와 같이, RNA 폴리머라제에 의한 전사를 유도하는 프로모터에 대해서는 업계에 잘 알려져 있으며, 일상적으로 사용되고 있다.

일부 실시양태에서, 제조 물품에는 테더가 포함될 수 있다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 테더는 표적 핵산 분자를 회전 태그에 결합시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 테더는 예를 들면 그것이 스트렙타비딘-표지 비드에 결합되도록 비오티닐화될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제조 물품에는 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 포함될 수 있다. 1종을 초과하는 뉴클레오시드 트리포스페이트가 제공되는 경우, 그들은 조합으로써 (예컨대 단일 용기 중에) 또는 별도로 (예컨대 별도의 용기 중에) 제공될 수 있다.

일부 실시양태에서, 제조 물품에는 또한 지침이 포함된다. 지침은 종이 형태로, 또는 임의 수의 전자 형태로 (예컨대 CD 또는 플래시 드리이브상의 전자 파일, 또는 인터넷 상의 위치에 대한 안내 (예컨대 링크)) 제공될 수 있다. 이와 같은 지침은 축 내지 자성 참조 태그에 대비한 회전 태그의 회전을 확인하는 데에, 회전 패턴 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 바탕으로 표적 핵산 분자의 서열을 컴파일하는 데에; 및/또는 핵산에 적절한 장력을 적용하는 데에 사용될 수 있다.

회전-의존성 전사 서열분석 시스템

본원에서 기술되는 바와 같은 회전-의존성 전사 서열분석 시스템은 적어도 서열분석 모듈을 포함한다. 표적 핵산 분자를 서열분석하기 위한 서열분석 모듈은 통상적으로 고체 기판을 수용하기 위한 수용기, 지향력을 제공하기 위한 장력 공급원, 회전 태그상에 광을 투사하기 위한 광원, 및 회전 태그의 회전 패턴을 검출하기 위한 광학기기를 포함한다. 상기 장력 공급원, 광원 및 광학기기에 대해서는 본원에 논의되어 있다. 고체 기판을 수용하기 위한 수용기는 예를 들면 오목한 챔버로 구성될 수 있다. 일반적으로, 회전-의존성 전사 서열분석 시스템에 사용하기 위한 고체 기판은 고정되어 있는 다수의 RNA 폴리머라제를 가지게 되는데, 고처리량 서열분석 시스템의 경우에는, 고체 표면이 본원에서 기술되는 바와 같이 칩상 실시양태일 수 있다. 서열분석 모듈은 또한 컴퓨터 프로세서, 또는 컴퓨터 프로세서와 접속하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 또한, 주 분석 소프트웨어가 서열분석 모듈의 일부로서 제공될 수 있다.

또한, 서열분석 모듈은 가열 및 냉각 소자, 그리고 서열분석 반응의 온도를 변화시켜 조절하기 위한 온도 조절 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 서열분석 모듈은 유체공학기기 (예컨대 1종 이상의 시약 및 완충제를 반응 챔버 (예컨대 칩)으로 전달하기 위한 1종 이상의 시약 또는 완충제 저장용기 및 배관)를 추가로 포함할 수 있다. 1종 이상의 시약 또는 완충제를 전달하기 위한 유체공학기기에는 또한 비제한적으로 하나 이상의 펌프가 포함될 수 있다. 비제한적으로, 서열분석 반응에 사용될 수 있는 대표적인 시약에는 예를 들면 뉴클레오시드 트리포스페이트, 효소 (RNA 폴리머라제) 및 회전 태그가 포함될 수 있다. 역시 비제한적으로, 서열분석 반응에 사용될 수 있는 대표적인 완충제에는 예를 들면 세척 완충제, 효소-결합 완충제 및 서열분석 완충제가 포함될 수 있다.

도 5는 대표적인 유동 셀 (70)을 나타내는 개략도이다. 나타낸 유동 셀 (70)에는, 대략 50 마이크로미터 두께인 레이저-절단 압력 감지 접착제 (PSA) 필름이 옴니 비젼 센서(OV14810; SiN을 사용한 윈도우의 제거 및 코팅 후)의 상부에 도포되어 있다. 이와 같은 구성은 CMOS 칩 (80) 상부의 유동 셀로 이어진다. 다음에, 미세유동 공급 튜브(microfluidic feed-through tube)용 구멍을 가지는 유리 또는 중합체 슬라이드 (90)가 적용된다. 다중 회전-의존성 전사 복합체 (100)을 그대로 나타내었다. 도 6은 광을 전달하는 데에 섬유 (60)가 사용되며 이미지화에는 현미경 대물렌즈 (200)가 사용되는 대표적인 유동 셀 (70)의 사진 (패널 A) 및 선도 (패널 B)를 나타낸다. 고체 표면 (30)도 나타내었다.

도 7은 회전-의존성 전사 서열분석 시스템 (300)을 나타내는 개략도이다. 개략도는 유입- 및 유출-유체공학기기 (90)와 함께 장력 공급원 (50), 광원 (60) 및 유동 셀 (70)을 나타낸다. 도 7의 유동 셀 (70)은 칩 (80) (예컨대 CMOS, CCD, 또는 이들의 변형된 버젼)상에 나타내었다.

도 8a 및 9a는 본원에서 기술되는 바와 같은 회전-의존성 전사 서열분석 시스템 (300)의 상이한 실시양태들의 사진을 나타내며, 도 8b 및 9b는 각 사진에 나타낸 실시양태의 각 선도이다. 양 회전-의존성 전사 서열분석 시스템 (300)인 도 8b 및 9b를 말하자면, 고체 표면 (30), 광원 (60), 및 다양한 시약 및/또는 완충제를 전달하고 제거하기 위한 유체공학기기 (90)를 나타낸다. 도 8 및 9 각각에 장력 공급원 (50)이 보이는데, 도 9에서는, 고체 표면 (30)상 유동 셀에 더 용이하게 접근하기 위하여, 장력 공급원 (50)이 밖으로 치워져 있다. 도 8 및 9 모두에서의 회전-의존성 전사 서열분석 시스템 (300)은 유사한 광학기기 (200)를 이용한다. 도 8의 시스템 (300)은 20× 수-대물렌즈 (200) (여기에서는, NA=0.9와 함께 1 mm를 초과하는 FOV, 즉 큰 시야와 함께 고해상도를 제공하는 올림푸스의 "수퍼-렌즈(super-lens)")를 이용하며, 도 9의 시스템 (300)은 20× 대물 튜브 렌즈 (200)를 이용한다. 도 8 및 9 모두는 카메라 (200)도 포함한다.

한 실시양태에서는, 구조화된 조명 및 섬광촬영법(stroboscopy)이 하기와 같이 회전-의존성 전사 서열분석 시스템에 사용될 수 있다. 예를 들면, 2개 이상의 섬유가 각각 별도의 LED에 연결될 수 있으며, 고체 표면의 평면 대비 상이한 각도로 그의 조명이 유도된다. 광원은 광 강도 (또는 "진폭"), 스펙트럼 함량 (예컨대 상이한 색상의 LED 또는 여과된 백색 LED) 및 시간 (예컨대 단일 촉발로부터의 전자공학을 촉발하는 것을 통하나, 촉발의 시점에 상이한 지연이 도입된 후임)이 독립적으로 조절될 수 있다. 동일하지만, 예컨대 상이한 지연 또는 진폭 또는 형상에서의 촉발이 카메라의 노출을 개시할 수 있다. 카메라의 노출 기간이 별도로 조절될 수 있기 때문에, 회전 태그 및 그의 신호를 조명하도록 제1 광원 (예컨대 짝수 프레임에 의해 반사가 포착될 수 있음) 및 제2 광원 (예컨대 홀수 프레임에 의해 반사가 포착될 수 있음)을 시간조정하는 것이 가능하다. 조명이 상이한 각도에 있기 때문에 (하나는 상부로부터 그리고 하나는 저부로부터, 즉 위치외로(in epiposition), 또는 하나는 상부로부터 그리고 하나는 예컨대 수직에 대하여 45 ° 각도로), 또 다른 이미지가 아닌 하나의 이미지에 회전 태그가 검출될 수 있다. 일련의 이미지들이 포착되기 때문에, 그리고 하나를 초과하는 공급원이 사용될 수 있기 때문에, 모든 프레임에서 회전 태그의 사실상 3-차원 형상을 재구성하는 것이 가능하다. 이와 같은 검출 수준은 최종 서열에서의 더 높은 정밀도 및 더 적은 결실 오류로 이어진다.

본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석 시스템은 단일 뉴클레오티드 해상도를 가지는 대규모의 평행 단일 분자 분석을 바탕으로 현장 진단학 및 게놈학을 상당히 진전시킬 수 있다. 본 시스템은 본질적으로 고도로 다중화된 표적 확인에 적합하며, 상이한 핵산 표적, 예컨대 병원체 및 인간 바이오마커를 동시에 또는 순차적으로 조사하기 위하여 재구성될 수 있음에 있어서 무한한 유연성을 가진다. 또한 이에 반해, 현행 PCR- 및 마이크로어레이-기반의 핵산 서열분석 방법은 알려져 있는 서열 또는 감염 인자(들)만을 검출할 수 있는 것에 의해 제한되는데, 양성 확인에 특별한 시약 (프라이머 및 프로브) 세트가 요구되기 때문이다.

예컨대 고처리량 임상 진단 또는 현장 진단용으로 설계된 시스템의 경우, 본원에서 기술되는 바와 같은 회전-의존성 전사 서열분석 시스템은 샘플 제조 모듈 및 주형 마감 모듈과 연결될 수 있다.

샘플 제조 모듈은 세포를 용해함으로써 핵산을 방출하도록 구성될 수 있으며, 샘플 제조 모듈은 또한 핵산을 전단/단편화하는 능력을 가질 수 있다. 샘플 제조 모듈은 통상적으로 생물학적 샘플을 수용하기 위한 수용기; 및 1종 이상의 시약 또는 완충제를 생물학적 샘플로 전달하기 위한 유체공학기기를 포함한다. 샘플 제조 모듈은 다양한 여러 생물학적 샘플을 수용하도록 구성될 수 있거나, 또는 샘플 제조 모듈은 특정 유형의 생물학적 샘플 (예컨대 면봉, 조직 샘플, 혈액 또는 혈장 샘플, 타액, 또는 배양물의 일부), 또는 특정 형태로 제공되는 생물학적 샘플 (예컨대 바이알 또는 튜브 내의 것, 또는 블러팅 페이퍼상의 것)을 수용하도록 구성될 수 있다. 서열분석 제조 모듈은 또한 예컨대 필터, 컬럼, 자석, 면역학적 방법 또는 이들의 조합 (예컨대 병원체 포착 시스템, 나노MR 인크.)을 사용하여 생물학적 샘플 (예컨대 박테리아 세포, 바이러스 등)로부터 소정의 분자를 포착하도록 구성될 수 있다.

샘플 제조 모듈은 생물학적 샘플로부터 핵산을 수득하여 서열분석용 핵산을 준비하는 것에 관련된 시약 또는 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열분석을 위하여 핵산을 수득하는 것에 관련된 시약에는 세포 용해 시약, 핵산 절단 효소, DNA 폴리머라제, 올리고뉴클레오티드, 및/또는 DNA 결합제 (예컨대 표적 핵산 분자에 결합하여 세척하는 비드 또는 고체 매트릭스)가 포함되는 반면, 서열분석을 위하여 핵산을 수득하는 것에 관련된 완충제에는 용해 완충제, 세척 완충제, 용리 완충제, 또는 결합 완충제가 포함된다. 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석이 이중-가닥 핵산 주형을 필요로 하기 때문에, 샘플 제조 모듈은 단일-가닥 DNA 또는 RNA를 이중-가닥 핵산 분자로 전환하는 데에 필요한 시약 및 완충제 (예컨대 PCR 시약)를 포함할 수 있다.

샘플 제조 모듈의 많은 기능성 구성요소들이 시중에서 구입가능하거나 (예컨대 실리카 겔 막 (키아젠(Qiagen) 또는 암비온(Ambion) 키트), 또는 팔라듐(Palladium) 시스템 (인테그레이트디 나노 테크놀로지스 인크.(Integrated Nano Technologies Inc.))의 통합된 일부로서 가용하다. 또한, 핵산 주형의 효소 절단에 대한 대안으로서, 핵산을 단편화하는 기기들이 시중에서 구입가능하다 (예컨대 코바리스(Covaris)).

주형 마감 모듈은 RNA 폴리머라제 프로모터 서열 및 회전 태그를 표적 핵산 분자에 결합시키도록 구성될 수 있다. 주형 마감 모듈은 통상적으로 1종 이상의 시약 또는 완충제를 표적 핵산 분자에 전달하기 위한 유체공학기기를 포함한다. 예를 들면, 주형 마감 모듈은 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 표적 핵산 분자에 결찰시킬 목적을 위한 시약 및 완충제를 포함할 수 있으며, 주형 마감 모델은 또한 회전 태그를 표적 핵산 분자에 결합시키기 위한 시약 및 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산 분자에 프로모터 서열을 결찰시키는 것 또는 회전 태그를 결합시키는 것에 관련된 시약에는 분명히 프로모터 서열 및 회전 태그가 포함될 수 있음은 물론, 예컨대 리가제 효소, 테더 또는 PCR 시약들도 포함될 수 있는 반면, 표적 핵산 분자에 프로모터 서열을 결찰시키는 것 또는 회전 태그를 결합시키는 것에 관련된 완충제에는 결찰 완충제, 회전 태그-결합 완충제, 효소-결합 완충제, 세척 완충제 및 서열분석 완충제가 포함된다.

본원에서 기술되는 바와 같은 회전-의존성 전사 서열분석 시스템의 배열구조에 따라서는, 프로모터- 및 회전 태그-결합 표적 핵산 분자를 도입하기에 앞서, 다수의 RNA 폴리머라제가 고체 표면상에 고정될 수 있다. 다르게는, 다수의 RNA 폴리머라제가 프로모터- 및 회전 태그-결합 표적 핵산 분자와 조합된 후, 전체 복합체가 고체 표면상에 침착될 수 있다. 후자의 절차가 가능성이 있는데, RNA 폴리머라제 및 그의 상응하는 프로모터 서열에 대한 결합 동역학이 매우 빠르며, 효율적이고, 특이적이기 때문이다.

회전-의존성 전사 서열분석에 이어지는 서열 결정

도 10은 회전 태그 회전 패턴의 비디오의 스크린샷 및 상응하는 디지탈화물을 나타내는 것으로써 (상단), 다음에는 도표 형태로 나타내었다 (하단). 회전 태그는 1 마이크로미터 비오틴-코팅 비드가 거기에 결합되어 있는 2.8 마이크로미터의 스트렙타비딘-코팅 비드이다. 전사는 전체 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에 His-태그결합 RNA 폴리머라제에 의해 수행되었다. 도 10은 검출기를 사용하여 포착된 이미지로부터 회전 태그의 회전 패턴이 선명하고 신뢰성있게 검출 및 측정될 수 있다는 것을 나타내고 있다.

도 11a는 회전 분석을 도시한 흐름도이다. 타임스탬프(timestamp), 치환 (n=1 및 n-1로부터), 치환 한정 원(displacement bounding circle), 비드 직경, 이중 배향(doublet orientation), 누적 회전, 각속도, 및 타원 이심성을 포함한 수많은 측정치들이 회전 분석으로부터 측정될 수 있다. 각 픽셀을 2개 클래스(class)인 전경 (회전 태그) 및 배경으로 분리하는 데에는 이미지 분절화가 사용될 수 있다. 한가지 방법 (오츠법(Otsu's method))을 사용하여, 각 강도 수준의 이미지 막대 그래프 및 확률이 계산될 수 있으며, 다음에는 클래스-내 변이를 최소화하는 역치가 측정될 수 있다. 또 다른 방법 (삼각형법)을 사용하면, 회색 수평 축상 b에서의 막대 그래프의 최대값과 회색 수평 축상 최저값 a 사이에 선이 그려진다. a 내지 b의 모든 값에 대하여 선에 수직인 선과 막대 그래프 사이의 거리 L이 계산된다. 막대 그래프와 선 사이의 거리가 최대인 수평이 역치에 해당한다. 또 다른 방법 (적응 평균 또는 중앙값)을 사용하면, 이후 해당 윈도우에 대한 평균 또는 중앙값을 계산하는 데에 사용되는 최대 강도 변이를 찾는 데에, 국소 윈도우(localized window) (즉 5×5 픽셀)가 사용될 수 있다.

타원 한정법은 하기의 몇 가지 방법들 중 어느 것을 이용할 수 있다: 전경 (회전 태그) 영역의 2차 시기(2^nd-order moment)에 표준화되는 중심법; 영역의 중심에서 영역 가장자리까지의 최대 거리가 주 축의 제1 지점이 되고 반사 (중심으로부터)가 제2 지점이 되는 타원 주축법; 영역의 중심에서 영역 가장자리까지의 최대 거리이며 주축에 대하여 수직인 타원 부축법; 및 타원 주축과 x축 사이의 각도인 타원 배향법.

도 11b는 표적 핵산 분자의 서열을 결정하기 위한 예시적인 과정 (1100)을 도시하는 흐름도이다. 일부 예에서, 과정 (1100)은 하나 이상의 컴퓨팅 장치를 사용하여 실행되는 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 어플리케이션을 사용하여 수행될 수 있다. 도시의 목적상, 표적 핵산 분자의 전사 동안 수득되는 데이터를 바탕으로 하여 회전 태그를 포함하는 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 것에 관한 비제한적인 예의 내용이 제공된다.

과정 (1100)은 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석을 사용하여 서열분석되는 표적 핵산 분자의 현재 핵산 위치로 확인 위치를 설정하는 것 (1110)으로 시작된다. 확인 위치는 예를 들면 전사되는 첫 번째 뉴클레오티드, 표적 핵산 분자로부터 전사되는 첫 번째 뉴클레오티드 (즉, 프로모터 서열 이후의 것), 또는 표적 핵산 분자상의 임의의 뉴클레오티드 위치일 수 있다.

표적 핵산 분자의 확인 위치에서의 제1 데이터 (즉 제1 정보)가 회전-의존성 전사 서열분석 시스템으로부터 수득되거나 (1120), 또는 회전-의존성 전사 서열분석의 가동으로부터의 정보를 바탕으로 하여 제공된 후, 표적 핵산 분자의 확인 위치에서의 제2 정보 (즉 제2 데이터)가 제공 또는 수득된다 (1120). 예를 들면, 제1 데이터는 회전 태그의 회전에 관한 정보일 수 있다. 예를 들면, 제1 데이터는 회전의 속도 (즉 회전/시간의 정도), 회전의 존재 또는 부재의 확인, 또는 확립되어 있는 회전 패턴의 변화일 수 있다. 예를 들면, 제2 데이터는 서열분석 반응에서의 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 및/또는 가용성 (예컨대 농도)에 관한 정보일 수 있다.

다음에, 확인 위치에서의 뉴클레오티드가 제1 및 제2 데이터를 바탕으로 하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 제1 데이터가 회전 패턴의 변화를 나타내고, 제2 데이터가 반응에서의 구아닌 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 나타내는 경우라면, 표적 핵산 분자의 확인 위치에서의 뉴클레오티드는 시토신인 것으로 결정된다. 마찬가지로, 제1 데이터가 회전 패턴 변화의 부재를 나타내고, 제2 데이터가 반응에서의 구아닌 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 나타내는 경우, 표적 핵산 분자의 표시 위치에서의 뉴클레오티드는 비-구아닌인 것 (즉 아데닌, 구아닌 및 티민)으로 결정된다.

확인 위치가 다음 위치로 전진할 수 있는 것으로 결정되는 경우 (1140), 확인 위치는 동일하게 표적 핵산 분자의 다음 핵산 위치로 설정되고 (1150), 과정 (1100)이 계속된다 (1120). 확인 위치가 다음 위치로 전진할 수 없는 것으로 결정되는 경우 (1140), 각 확인 위치에서 수득된 제1 정보 및 제2 정보를 바탕으로 한 표적 핵산 분자의 서열이 컴파일되고 (1160), 과정 (1100)은 종료된다. 예를 들어 표적 핵산 분자의 전사 완료 또는 RNA 폴리머라제 활성 종료 (예컨대 효소 활성의 붕괴에 기인함)로 인하여 전사가 더 이상 이루어질 수 없는 경우에는, 확인 위치가 다음 위치로 전진할 수 없다.

본 명세서에서 기술되는 주제 및 작동의 실시양태는 디지털 전기 회로로, 또는 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어 또는 하드웨어로, 또는 이들 1종 이상의 조합으로 실행될 수 있다. 본원에서 기술되는 주제의 실시양태는 1종 이상의 컴퓨터 프로그램, 즉 데이터 처리 장치에 의한 실행용으로, 또는 그의 작동을 제어하도록 컴퓨터 저장 매체에 코딩되어 있는 1종 이상의 컴퓨터 프로그램 명령어의 모듈로 실행될 수 있다. 다르게는 또는 더하여, 프로그램 명령어는 인공적으로 생성된 전파용 신호, 예컨대 데이터 처리 장치에 의한 실행을 위한 적합한 수신기 장치로의 전달을 위하여 정보를 코딩하도록 생성되는 기계-생성 전기, 광학 또는 전자기 신호상에 코딩될 수 있다. 컴퓨터 저장 매체는 컴퓨터-해독가능 저장 장치, 컴퓨터-해독가능 저장 기판, 랜덤 또는 시리얼 억세스 메모리 어레이 또는 장치, 휴대용 통신 장치, 또는 이들 1종 이상의 조합일 수 있거나, 또는 거기에 포함될 수 있다. 또한, 컴퓨터 저장 매체가 전파되는 신호는 아니지만, 컴퓨터 저장 매체는 인공적으로 생성되는 전파 신호에 코딩되어 있는 컴퓨터 프로그램 명령어의 공급원 또는 수신자일 수 있다. 컴퓨터 저장 매체는 또한 1종 이상의 별도의 물리적 구성요소 또는 매체 (예컨대 다중 CD, 디스크 또는 기타 저장 장치)일 수 있거나, 또는 거기에 포함될 수 있다.

본원에서 기술되는 작동은 하나 이상의 컴퓨터-해독가능 저장 장치에 저장되어 있거나 다른 공급원으로부터 수신되는 데이터상에서 데이터 처리 장치에 의해 수행되는 작동으로 실행될 수 있다. "데이터 처리 장치"라는 용어는 예를 들자면 프로그램가능 프로세서, 휴대용 통신 장치, 컴퓨터, 칩상 시스템, 또는 전기한 것들의 다중의 것 또는 조합을 포함하여, 데이터 처리를 위한 모든 종류의 장치, 소자, 및 기계를 포괄한다. 장치는 특별한 목적의 논리 회로, 예컨대 FPGA (필드 프로그램가능 게이트 어레이) 또는 ASIC (어플리케이션 특이적 통합 회로)를 포함할 수 있다. 장치는 또한 하드웨어 이외에도, 문제의 컴퓨터 프로그램을 위한 실행 환경을 생성시키는 코드, 예컨대 프로세서 펌웨어, 프로토콜 스택(stack), 데이터베이스 관리 시스템, 작동 시스템, 크로스-플랫폼(cross-platform) 실행시간 환경, 가상 기계, 또는 이들 1종 이상의 조합을 구성하는 코드를 포함할 수 있다. 장치 및 실행 환경은 웹 서비스, 분산 컴퓨팅 및 격자 컴퓨팅 인프라구조와 같은 다양한 상이한 컴퓨팅 모델 인프라구조들을 구현할 수 있다.

컴퓨터 프로그램 (프로그램, 소프트웨어, 소프트웨어 어플리케이션, 스크립트(script) 또는 코드로도 알려져 있음)은 컴파일되거나 해석된 언어, 진술형 또는 절차형 언어를 포함한 소정 형태의 프로그래밍 언어로 기록될 수 있으며, 독립형 프로그램으로서, 또는 모듈, 구성요소, 서브루틴, 항목(object) 또는 기타 컴퓨팅 환경에서 사용하기에 적합한 유닛으로서를 포함한 어떠한 형태로도 배치될 수 있다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 컴퓨터 프로그램은 파일 시스템의 파일에 해당할 수 있다. 프로그램은 다른 프로그램 또는 데이터 (예컨대 마크업(markup) 언어 도큐먼트에 저장되는 하나 이상의 스크립트)를 보유하는 파일의 일부에, 문제 프로그램 전용 단일 파일로, 또는 다중 조화 파일 (예컨대 하나 이상의 모듈, 서브 프로그램 또는 코드의 일부를 저장하고 있는 파일)로 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 하나의 컴퓨터 상에서, 또는 하나의 위치에 배치되어 있거나, 다수의 위치에 걸쳐 분산되어 통신 네트워크에 의해 연결되는 다수의 컴퓨터 상에서 실행되도록 배치될 수 있다.

본원에서 기술되는 과정 및 논리 흐름은 입력 데이터상에서 작동하여 출력을 생성시킴으로써 기능을 수행하기 위하여 하나 이상의 컴퓨터 프로그램을 실행하는 하나 이상의 프로그램가능 프로세서에 의해 수행될 수 있다. 상기 과정 및 논리 흐름은 특별한 목적의 논리 회로, 예컨대 FPGA 또는 ASIC에 의해 수행될 수도 있으며, 장치 역시 그것으로 실행될 수 있다.

컴퓨터 프로그램의 실행에 적합한 프로세서에는 예를 들자면 일반적이고 특별한 목적의 마이크로프로세서 모두, 및 모든 종류의 디지털 컴퓨터 중 소정의 1종 이상 프로세서가 포함된다. 일반적으로, 프로세서는 리드 온리 메모리 또는 랜덤 억세스 메모리 또는 양자로부터 명령어 및 데이터를 수신하게 된다. 컴퓨터의 필수 요소는 명령어에 따라 기능을 수행하기 위한 프로세서, 및 명령어 및 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 메모리 장치이다. 일반적으로, 컴퓨터는 또한 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 대량 저장 장치, 예컨대 자기, 자기 광학 디스크, 또는 광학 디스크를 포함하거나, 그로부터 데이터를 수신하거나, 거기로 데이터를 전달하거나, 또는 이들 모두를 하도록 거기에 작동 연결되게 된다. 그러나, 컴퓨터가 그와 같은 장치를 반드시 가지는 것은 아니다. 또한, 컴퓨터는 또 다른 장치, 예컨대 몇 가지만 거명하자면 휴대용 통신 장치, 개인용 디지털 보조장치 (PDA), 휴대용 오디오 또는 비디오 플레이어, 게임 콘솔, 위성 위치확인 시스템 (GPS) 수신기, 또는 휴대용 저장 장치 (예컨대 범용 직렬 버스 (USB) 플래시 드라이브)에 삽입될 수 있다. 컴퓨터 프로그래밍 명령어 및 데이터를 저장하는 데에 적합한 장치에는 예를 들자면 반도체 메모리 소자, 예컨대 EPROM, EEPROM 및 플래시 메모리 소자; 자기 디스크, 예컨대 내장 하드 디스크 또는 제거가능 디스크; 자기 광학 디스크; 및 CD ROM 및 DVD-ROM 디스크를 포함하여, 모든 형태의 비 휘발성 메모리, 매체 및 메모리 장치가 포함된다. 상기 프로세서 및 메모리에는 특별한 목적의 논리 회로가 보충되거나 도입될 수 있다.

사용자와의 상호작용을 제공하기 위하여, 본 명세서에서 기술되는 주제의 실시양태는 사용자에게 정보를 표시해주기 위한 디스플레이 장치, 예컨대 CRT (캐소드 레이 튜브) 또는 LCD (액정 디스플레이) 모니터, 그리고 사용자가 컴퓨터에 입력치를 제공할 수 있는 키보드 및 포인팅(pointing) 장치, 예컨대 마우스 또는 트랙볼(trackball)을 가지는 컴퓨터에서 실행될 수 있다. 또한, 컴퓨터는 사용자에 의해 사용되는 장치로 도큐먼트를 전송하고 그로부터 도큐먼트를 수신함으로써; 예를 들면 웹 브라우저로부터 수신된 요청에 반응하여 사용자의 클라이언트 장치에서 웹 브라우저로 웹 페이지를 전송함으로써 사용자와 상호작용할 수 있다.

본 명세서에서 기술되는 주제의 실시양태는 예컨대 데이터 서버로서 후위(back end) 구성요소를 포함하거나, 미들웨어(middleware) 구성요소, 예컨대 어플리케이션 서버를 포함하거나, 또는 전위(front end) 구성요소, 예컨대 그래픽 유저 인터페이스(graphical user interface), 또는 사용자가 본 명세서에서 기술되는 주제의 실행과 상호작용할 수 있는 웹 브라우저를 가지는 클라이언트 컴퓨터를 포함하거나, 또는 이와 같은 후위, 미들웨어 또는 전위 구성요소 하나 이상의 임의 조합을 포함하는 컴퓨팅 시스템에서 실행될 수 있다. 시스템의 구성요소들은 어떠한 형태 또는 매체의 디지털 데이터 통신, 예컨대 통신 네트워크에 의해서도 연결될 수 있다. 통신 네트워트의 예에는 근거리 통신망 ("LAN") 및 광역 네트워크 ("WAN"), 인터-네트워크(inter-network) (예컨대 인터넷), 및 피어-투-피어(peer-to-peer) 네트워크 (예컨대 ad hoc 피어-투-피어 네트워크)가 포함된다.

컴퓨팅 시스템은 클라이언트 및 서버를 포함할 수 있다. 클라이언트 및 서버는 일반적으로 서로 원거리에 있으며, 통상적으로 통신 네트워크를 통하여 상호작용한다. 클라이언트와 서버의 관계는 각 컴퓨터에서 전개되며 서로 클라이언트-서버 관계를 가지는 컴퓨터 프로그램에 의하여 발생한다. 일부 실시양태에서, 서버는 데이터 (예컨대 HTML 페이지)를 클라이언트 장치 (예컨대 클라이언트 장치에 데이터를 표시하고, 그와 상호작용하는 사용자로부터 사용자 입력을 수신하기 위한 목적)에 전송한다. 클라이언트 장치에서 생성되는 데이터 (예컨대 사용자 상호작용의 결과)는 서버에서 클라이언트 장치로부터 수신될 수 있다.

본 발명에 따라, 업계 기술에 속하는 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 생화학 및 재조합 DNA 기술이 사용되었을 수 있다. 그와 같은 기술들에 대해서는 문헌에 완전하게 설명되어 있다. 하기의 실시예로써 본 발명을 추가 기술하게 될 것인 바, 청구범위에서 기술되는 문제의 방법 및 조성물의 영역을 제한하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 - 고체 표면 제조

기술되어 있는 바와 같이 (문헌 [Paik et al., 2005, Chem . Commun ., 15:1956-58] 참조), NTA 모노레이어(monolayer)를 제조하였다. NTA-관능화된 기판을 0.1 M NiCl₂를 함유하는 10 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0)에 30분 동안 침지함으로써, Ni-NTA 표면을 수득하였다. 다음에, 상기 기판을 밀리(Milli)-Q 수로 수회 세정하고, 질소 스트림하에서 건조하였다.

새로 세척된 기판을 1% (v/v) 3-글리시딜옥시프로필 트리메톡시실란을 함유하는 증류 톨루엔 용액에 아르곤하에서 2일 동안 침지하였다. 기판을 용액으로부터 제거한 후, 증류 톨루엔으로 세정하고, 질소 스트림하에서 건조하였다. 에폭시-종결 SAM으로 관능화된 기판을 2.5 mM N,N 비스(카르복시메틸)-L-리신 (NTA)을 함유하는 10 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0)에서 60℃로 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 상기 기판을 밀리-Q 수로 세정한 후, 마이크로콘택트(microcontact) 인쇄를 위한 준비로 건조하였다.

NTA SAM에 대한 His-태그결합 단백질의 제한된 비특이적 결합 효과가 관찰됨으로써, NTA SAM이 마이크로콘택트 인쇄 및 딥-펜(dip-pen) 나노리소그래피 기술을 사용하여 Ni(II) 이온 패턴을 제조하는 데에 적합한 표면임을 나타내었다.

실시예 2 - His -태그결합 RNA 폴리머라제의 클로닝 및 정제

주형으로 pTAGk19를 사용하고 프라이머로서 합성 DNA 올리고머 RP46 및 RP47 (하기 참조)를 사용하는 PCR에 의해, 38개 아미노산의 SBP-태그를 코딩하고 있는 DNA 단편을 합성하였다. 상기 단편을 NcoI을 사용하여 소화한 후, pBH16117에 결찰시킴으로써, pRP6를 생성시켰다.

SBP-His-RNA 폴리머라제 및 His-RNA 폴리머라제를 발현시키고, 이전에 기술된 바와 같이 정제하였다 (문헌 [He et al., 1997, J. Protein Expression Purif ., 9:142-51]; 및 [Keefe et al., 2001, J Protein Expression Purif ., 23:440-46]).

실시예 3 - RNA 폴리머라제의 고정

하기의 반응 개요를 따라 RNA 폴리머라제 분자를 Si(III) 상에 고정시켰다: (a) 40% NH₄F, 10 분, 25℃; (b) Cl₂ 기체, 20 분, 100℃; (c) mPEG, 밤새, 진공, 150℃; (d) DSC, DEIDA, DMAP, DMF, 밤새, 25℃; (f) BBTO, 디에틸 에테르, 6 h, 25℃; (g) CuSO₄, 에탄올 20분, 25℃; (h) 6× His-태그결합 단백질 인큐베이션.

실시예 4 - 마이크로콘택트 인쇄 (μ CP ) 및 복합체 형성

폴리(디메틸실록산) (PDMS)과 경화제 (실가드(Sylgard) 184, 다우 코닝(Dow Corning))의 10:1 (v/v) 혼합물을 패턴화된 규소 원판(master)에 대하여 캐스팅함으로써, 3 및 10 마이크로미터 선 폭의 간격 및 5 마이크로미터의 간격을 가지는 5 마이크로미터 선 폭의 PDMS 스탬프를 제조하였다. 상기 비-산화 PDMS 스탬프를 0.1 M NiCl₂를 함유하는 10 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0) 중에서 약 1시간 동안 인큐베이팅한 다음, 질소 스트림으로 건조하였다. 상기 스탬프를 NTA-종결 기판과 3분 동안 접촉시켰다. 스탬프를 벗겨낸 후, Ni(II)-인쇄된 기판을 ds-DNA, 프로모터 및 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통하여 결합된 자성 태그와 함께 100 nM의 His-T7 RNAP를 함유하는 약 200 μL의 25 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 7.5) 중에서 30분 동안 인큐베이팅한 다음, 10 mM 트리스-HCl 완충제 (pH 8.0) 및 밀리-Q 수로 세정하여 과량 단백질을 제거하였다.

실시예 5 - 테더링 ( Tethering ) 및 회전

2.8 마이크로미터 SA-접합 비드 (디날) 및 1.0 마이크로미터 비오티닐화 비드를 PBS 중에 희석하고 (각각 1:20 및 1:200), 실온에서 15분 동안 혼합하였다. Ni2+-NTA HRP 접합체 (키아젠)를 사용하여 커버슬립을 코팅하고, 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Noji et al., 1997, Nature , 386:299-302] 참조), 약간 떨어진 커버슬립과 함께 정렬함으로써, 유동 챔버를 조립하였다.

일 말단에서 비오티닐화된 4 kb DNA 주형을 SA 비드 이중체와 혼합한 후, 20 nM 히스-T7 RNAP, 0.3 mM GTP, 및 0.1 mM ATP화 함께 2분 동안 인큐베이팅함으로써, 연장 복합체의 형성을 허용하였다. 샘플 (~30 μl)을 유동 셀에 주사하고, 5분 동안 인큐베이팅한 후, 0.1 pN의 자기력을 인가하였다. 유동 셀을 TB로 세척한 후, 이어서 0.5 mM NTP를 첨가하였다.

비드 위치로부터 벗어나서 자석을 위치시키는 것, 즉 바로 상부가 아니라, 광원 및 대물렌즈에 대하여 각도를 생성시키는 것이 위치 변화 및 힘의 더 용이한 보정을 가능케 한다는 것이 발견되었다.

실시예 6 - 회전-의존성 전사 서열분석 복합체의 형성

도 2c는 수동태화된 니켈-코팅 유리 슬라이드상의, His-태그결합 RNA 폴리머라제에 의해 테더링된 회전 태그 및 5.1 Kb DNA 주형의 어레이를 나타낸다. 비드 자체가 서로에 대하여 정돈된 거리로 위치하도록 하는 자기장 적용을 통하여, "반랜덤" 어레이가 생성되었다. 원추형 자기장이 정돈된 방식으로 자성 태그를 유리 표면으로 견인하도록 슬라이드를 뒤집어 올려놓음으로써, 단일-, 이중- 및 삼중-비드-보유 핵산을 표면에 결합시켰다. 2-차원 공간에서의 자성 비드의 퍼콜레이션(percolation)은 도 2c에 나타낸 패턴을 활발하게 생성시켰다. 이어서, 자석을 제거하고, 유동 챔버를 자석에 대하여 뒤집어 올려놓음으로써, 핵산에 장력을 적용하였다. 다음에, 서열분석 반응 혼합물을 유동 챔버로 전달함으로써, 모든 분자의 전사 및 서열분석을 동시에 개시하였다.

실시예 7 - 주형 제조

T7 프로모터를 보유하는 4.6 kb 파지 T7 DNA 단편과 람다 DNA의 0.5 kb 비오티닐화 단편을 서로 결합시킴으로써, 전사에 의한 서열분석용 DNA 주형을 제조하였다. 4.6 kb 단편은 3' 말단에 XbaI 인식 부위를 포함하는 #T7pPK13 순방향 프라이머 및 #T7phi17REV 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 생성시켰다. 0.5 kb PCR 단편은 비오틴-16-dUTP (로슈)의 존재하에 #F3 및 #R3 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 생성시켰다. PCR이 완료된 후, 정제된 PCR 생성물은 NheI로 소화시키고, 키아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (키아젠)로 세척하였다.

XbaI을 사용한 PCR 생성물의 소화 후, 4.6 kb 단편을 15℃에서의 밤샘 결찰에 의해 NheI으로 소화된 0.5 kb 비오티닐화 PCR 단편과 연결시켰다. 생성된 5.1 kb의 결찰 생성물을 0.7% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 해상한 후, 키아퀵 겔 추출 키트 (키아젠)를 사용하여 겔로부터 추출하였다. 이 DNA를 전사 및 서열분석 실험에 사용하였다.

PCR에는 하기의 프라이머들을 사용하였다: #T7pPK13: GCA GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA GGG AGG GAT GGA GCC TTT AAG GAG GTC AAA TGG CTA ACG (서열 1; T7 프로모터 서열에는 밑줄쳤으며, 굵은 G는 +1이고, 진한 C는 위치 +20에서의 중지 부위임); #T7phi17REV: GGC A-T CTA GA- TGC ATC CCT ATG CAG TCC TAA TGC (서열 2; Xba 부위 포함); #F3: GGC AGC TAG CTA AAC ATG GCG CTG TAC GTT TCG C (서열 3; 5' 말단에 NheI 제한 부위 포함); 및 #R3: AGC CTT TCG GAT CGA ACA CGA TGA (서열 4).

하기 표는 T7프로모터를 포함하는 T7 파지로부터 4.6 Kb 단편을 제조하는 데에 사용된 반응 혼합물을 나타낸다. PCR 증폭은 하기의 순환 조건하에서 수행하였다: 30" 동안 94℃, 10" 동안 94℃로 32 순환, 30" 동안 55℃, 4' 10" 동안 65℃, 10' 동안 65℃, 이어서 4℃ 유지.

하기 표는 다수의 비오틴을 포함하는 0.5 Kb 람다 단편을 제조하는 데에 사용된 반응 혼합물을 나타낸다. PCR 증폭은 하기의 순환 조건하에서 수행하였다: 10' 동안 94℃, 10" 동안 94℃로 32 순환, 30" 동안 55℃, 1' 동안 72℃, 7' 동안 72℃, 이어서 4℃ 유지.

실시예 8 - 단일 분자 전사 및 서열분석 반응

조건 1 (유동 셀 내에서의 2-입자의 형성)

1000 μl의 1 마이크로미터 디나비드 마이원(Dynabead MyOne) 스트렙타비딘 T1을 PBS 중에 1:100으로 희석하고, 자석에 의해 끌어내려 세척한 후, 상청액을 제거하고, 비드를 20 μl의 완충제 B + 0.1% BSA에 재현탁하였다. 비드를 0.5 ml 튜브로 옮기고, 2분 동안 초음파처리한 후, 유동 셀에 주입하였다.

비-자성 폴리스티렌 비오티닐화 0.8 마이크로미터 비드 (키스케르(Kisker), PC-B-0.8)를 하기와 같이 제조하였다: 10 μl 비드를 스핀 다운하여(spun down), 10 μl의 완충제 B + 0.1% BSA에 재현탁함으로써, 세척된 비드의 원액을 제조하였다.

완충제 B + 1% BSA를 사용하여 PEG-Cu⁺⁺ 관능화된 유리 슬라이드 (마이크로서페이시즈, 인크(MicroSurfaces, Inc))를 수동태화하였다.

실온에서 하기의 반응을 설정하고, 37℃에서 3분 동안 인큐베이팅하였다.

주형의 위치 +20에 정지된 T7RNAP-DNA 연장 복합체를 포함하는 반응 혼합물에 45 μl의 완충제 B를 첨가하고, 5분의 기간에 걸쳐 혼합물을 유동 셀에 주입하였다.

완충제 B로 유동 셀을 세척하고, 1 ㎛ SA 자성 비드 (완충제 B + 0.1% BSA 중 세척 비드 6 μl와 혼합된 46 μl의 완충제 B + 0.1% BSA)를 12분의 기간에 걸쳐 주입하였다. 완충제 B + 0.1% BSA를 사용하여 유동 셀을 세척하였다.

0.8 마이크로미터 폴리스티렌 비오티닐화 비드 (2 μl의 세척 비드 + 48 μl의 1×B/0.1% BSA)를 유동 셀에 주입하고, 15분 동안 인큐베이팅함으로써, 표면 테더링된 자성 SA 비드를 포함하는 2-입자(bi-particle)를 형성시켰다. 유동 셀을 완충제 B로 세척함으로써, 비결합 0.8 마이크로미터 폴리스티렌 비드를 제거하였다.

완충제 B + 250 μM NTP + 10 mM DTT를 유동 셀에 주입함으로써, 전사/서열분석을 개시하였다. 4종의 상이한 NTP 혼합물들 (각각 1종의 뉴클레오티드를 덜 함유함)을 4개의 상이한 유동 셀에 사용하였다.

조건 2 (사전-형성 2-입자)

자성 및 폴리스티렌 비드의 순차적인 배치 대신 하기와 같이 2-입자가 사전-형성된 것 이외에는, 상기 조건 1에서 기술된 바와 같이 전체적인 전사/서열분석 반응을 설정하였다. PBS 중에 1:100으로 희석된 1 마이크로미터 디나비드 마이원 SA T1 (디날)와 1:500으로 희석된 0.8 마이크로미터 폴리스티렌 비오틴 비드 (키스케르)의 혼합물 1000 μl를 실온에서 30분 동안 회전장치에서 혼합하여, 2-입자를 형성시켰다. 자석으로 비드를 끌어내리고, 비-결합 폴리스티렌 입자를 포함하는 상청액을 제거한 후, 완충제 B + 0.1% BSA 20 μl 중에 비드를 재현탁하였다. 비드를 0.5 ml 튜브로 옮기고, 2분 동안 초음파처리한 후, 반응 혼합물에 첨가하였다.

실시예 9 - 회전-의존성 전사 서열분석을 사용한 전체 게놈 서열분석을 위한 예상 비용

두드러지게도, 본원에서 기술되는 회전-의존성 전사 서열분석의 장점들 중 하나는 특히 매우 긴 전개 능력을 감안한 낮은 비용이다. 하기 표는 전체 인간 게놈을 서열분석하기 위한 예상 비용을 나타낸다.

본원에서 문제의 시스템, 방법 및 조성물이 수많은 상이한 측면들과 연계되어 기술되기는 하였지만, 다양한 측면들에 대한 전기한 설명은 예시를 위한 것으로써, 문제 시스템, 방법 및 조성물의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형들이 하기하는 청구범위의 영역에 속한다.

개시되는 것은 사용될 수 있거나, 연계하여 사용될 수 있거나, 제조시 사용될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물이거나, 또는 개시된 시스템, 방법 및 조성물의 생성물이다. 이들 및 기타의 것들이 본원에서 개시되는 바, 이러한 시스템, 방법 및 조성물의 조합, 하위세트, 상호작용, 군 등이 개시되는 것으로 이해된다. 즉, 이러한 조성물 및 방법들의 각 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 대한 구체적인 언급이 명시적으로 개시될 수는 없지만, 각각은 본원에서 구체적으로 고려되고 기술된다. 예를 들면, 특정 시스템 부분, 문제의 조성물 또는 특정 방법이 개시 및 논의되고 수많은 시스템 부분, 조성물 또는 방법들이 논의되는 경우, 시스템 부분, 조성물 및 방법들의 각각 및 모든 조합 및 순열들은 구체적으로 아니라고 표시되지 않는 한, 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 어떠한 하위세트 또는 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다.

SEQUENCE LISTING <110> Eve Biomedical, Inc. <120> ROTATION-DEPENDENT TRANSCRIPTIONAL SEQUENCING SYSTEMS AND METHODS OF USING <130> 36166-0002WO1 <140> PCT/US2012/026339 <141> 2012-02-23 <150> 61/574,270 <151> 2011-07-30 <150> 61/463,850 <151> 2011-02-23 <160> 8 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 gcagtaatac gactcactat agggagaggg agggatggag cctttaagga ggtcaaatgg 60 ctaacg 66 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 ggcatctaga tgcatcccta tgcagtccta atgc 34 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 ggcagctagc taaacatggc gctgtacgtt tcgc 34 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 agcctttcgg atcgaacacg atga 24 <210> 5 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hypothetical transcription product <400> 5 ugauguggga aagucg 16 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of hypothetical transcription product of SEQ ID NO:5 <400> 6 actacaccct ttcag 15 <210> 7 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hypothetical transcription product <400> 7 gcgagcugau cugcgcagcg aacauggagc ugagccugga ucugcuggcu 50 <210> 8 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hypothetical transcription product <400> 8 ucugcgcagc gagcauggag cugaaccugg au 32

Claims (65)

1. RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계;
   제1 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 표적 핵산 분자는 회전 태그를 포함하고, 상기 제1 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하며, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계;
   제1 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및
   회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계
   를 포함하는, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 고체 기판이 유리인 방법.
3. 제1항에 있어서, RNA 폴리머라제가 박테리오파지 RNA 폴리머라제인 방법.
4. 제3항에 있어서, 박테리오파지 RNA 폴리머라제가 T7 RNA 폴리머라제인 방법.
5. 제3항에 있어서, 박테리오파지 RNA 폴리머라제가 T3 RNA 폴리머라제인 방법.
6. 제1항에 있어서, RNA 폴리머라제가 박테리아 RNA 폴리머라제인 방법.
7. 제6항에 있어서, 박테리아 RNA 폴리머라제가 E. 콜라이(E. coli) RNA 폴리머라제인 방법.
8. 제1항에 있어서, RNA 폴리머라제가 His-태그를 통하여 고체 표면에 고정된 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 표적 핵산 분자가 진핵생물의 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 표적 핵산 분자가 이중-가닥인 방법.
11. 제1항에 있어서, 표적 핵산 분자가 생물학적 샘플 내에 포함되어 있는 것인 방법.
12. 제1항에 있어서, 표적 핵산 분자가 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 포함하는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 회전 태그가 제1 태그 및 제2 태그를 포함하는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 제1 태그가 자성인 방법.
15. 제1항에 있어서, 검출 단계가 회전 태그상에 광을 투사함을 포함하는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 검출 단계가 현미경을 통하여 회전 패턴을 관찰함을 추가로 포함하는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 검출 단계가 보충 금속-산화물-반도체(complementary metal-oxide-semiconductor, CMOS) 또는 전하-커플링 소자(charge-coupled device, CCD) 상에서 회전 패턴을 포착함을 추가로 포함하는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 고체 기판이 보충 금속-산화물-반도체(complementary metal-oxide-semiconductor, CMOS) 또는 전하-커플링 소자(charge-coupled device, CCD)인 방법.
19. 제1항에 있어서, 검출 단계가 자기 이미지(magnetic image)로서의 회전 패턴을 포착함을 포함하는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 자기 이미지가 거대자기저항(giant magneto-resistance; GMR) 센서 또는 자기 랜덤 접근 메모리(magnetic random access memory; MRAM) 어레이상에 포착되는 것인 방법.
21. 제1항에 있어서, 검출 단계가 전기장으로서의 회전 패턴을 포착함을 포함하는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 이미지가 랜덤 접근 메모리(random access memory; RAM) 센서상에 포착되는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서,
    표적 핵산 분자에 지향력을 적용하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 지향력이 자석을 사용하여 생성되는 것인 방법.
25. 제23항에 있어서, 지향력이 유동 또는 압력을 사용하여 생성되는 것인 방법.
26. 제1항에 있어서,
    RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계;
    제2 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 회전 태그를 포함하는 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제2 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제2 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계;
    제2 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및
    회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제2 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 제2 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계가 제1 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계와 동시에 수행되는 것인 방법.
28. 제26항에 있어서, 제2 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계가 제1 서열분석 조건하에서의 접촉 및 검출 단계 전 또는 후에 순차적으로 수행되는 것인 방법.
29. 제26항에 있어서,
    RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계;
    제3 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 회전 태그를 포함하는 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제3 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계;
    제3 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및
    회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
30. 제29항에 있어서,
    표적 핵산 분자 내에서의 제1, 제2 및 제3 뉴클레오시드 트리포스페이트에 대한 위치 정보로부터 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
31. 제29항에 있어서,
    RNA 폴리머라제가 고정된 고체 기판을 제공하는 단계;
    제4 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 회전 태그를 포함하는 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 제4 서열분석 조건은 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 상기 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제4 뉴클레오시드 트리포스페이트는 속도-제한량으로 존재하는 것인 단계;
    제4 서열분석 조건하에서의 회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계; 및
    회전 패턴의 변화를 바탕으로 표적 핵산 분자를 따라 제4 뉴클레오시드 트리포스페이트의 위치 정보를 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
32. 서열분석 조건하에서 RNA 폴리머라제를 표적 핵산 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 서열분석 조건은 1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 상기 RNA 폴리머라제는 고체 기판상에 고정되며, 상기 표적 핵산 분자는 회전 태그를 포함하는 것인 단계;
    회전 태그의 회전 패턴을 검출하는 단계;
    다수의 회수로 접촉 및 검출 단계를 반복하는 단계; 및
    1종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 존재하에서의 회전 패턴 변화의 존재 또는 부재를 순차적으로 바탕으로 하여 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는, 표적 핵산 분자의 서열을 결정하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 서열분석 조건이 단일 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하는 것인 방법.
34. 제32항에 있어서, 서열분석 조건이 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재를 포함하고, 4종 뉴클레오시드 트리포스페이트 중 제1 뉴클레오시드 트리포스페이트가 속도-제한량으로 존재하는 것인 방법.
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