CN110376171B - 应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统，照明光源发出的光经过光束扩展器进行光束扩展后，再经过反射镜反射垂直入射到第一滤波片，经过滤波后激发光打在样品芯片上；样品所激发的荧光和激发光被显微成像系统所收集，显微成像系统对样本芯片进行一次性成像后，再经过第二滤波片过滤掉激发光，纯净的荧光由接收装置接收图像。本发明能以6.6°小视场角完成φ35mm大成像范围，放大倍率为‑0.540倍，且可应用于透射式检测系统。同时，本发明数值孔径为0.106，对荧光芯片通道探测的分辨率可达到10微米。系统对485nm～656nm波长范围的荧光能清晰优异成像，像质清晰明亮，并且结构紧凑，成像效果好，孔径大，分辨率高。

Description

应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统
技术领域
本发明涉及一种显微成像技术，特别涉及一种应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统。
背景技术
数字PCR(聚合酶链反应)技术是一种新型的高灵敏核酸绝对定量检测技术,在生物医疗领域具有非常重要的应用价值，尤其对于基因分析及疾病的精准诊断是一种重要的工具。
由于dPCR技术是一种终端分析法，如果目标DNA分子没有被极限稀释，将会大大降低检测的准确度，dPCR的灵敏度以及准确度随着反应通道数量增多而变大。通过液滴微流控技术目前2万甚至2万以上的反应通道数量已广泛用于dPCR检测以及应用，但是反应单元的增加也增加了检测的难度，导致传统的荧光检测方法效率不足以应对如此高通量的检测。
目前，多采用拼接成像的方法对高通量基因芯片成像。但是由于现有显微物镜的放大倍率较大以及视场较小等因素，往往需要拼接10次以上，效率依旧不高且容易发生拼接误差，并且大多基因芯片检测系统为反射式检测。
28mm*18mm高通量荧光基因芯片在荧光显微镜设计领域中，同时实现大视场和高分辨率的DNA检测是一个巨大的困难。
目前没有可满足28mm*18mm大视场、高分辨率荧光成像的透射式荧光检测系统。
发明内容
本发明是针对现在高通量dPCR基因芯片成像采用拼接成像，导致检测效率低且容易引入拼接误差的问题，提出了一种应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统，同时实现大视场和高分辨率。
本发明的技术方案为：一种应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统，包括照明装置、滤波装置、样品芯片、对样品芯片进行成像的显微成像系统以及接收图像的接收装置；激发荧光的照明装置包括照明光源、用于进行光束扩展的光束扩展器以及反射镜；滤波装置包括第一滤波片和第二滤波片；
照明光源发出的光经过光束扩展器进行光束扩展后，再经过反射镜反射，反射光垂直入射到第一滤波片，经过第一滤波片滤波后激发光打在样品芯片上；样品所激发的荧光和激发光被显微成像系统所收集，显微成像系统对样本芯片进行一次性成像后，再经过第二滤波片滤波，过滤掉激发光，过滤出纯净的荧光，最后由接收装置接收图像。
所述第一滤光片的窄带中心波长对应激发样品荧光的激发光中心波长，第二滤光片的窄带中心波长对应样品发出的荧光中心波长。
所述成像系统中镜头为大视场荧光精缩物镜，从物面端至像面端依次包括第一球面玻璃镜片，第二球面玻璃镜片，第三球面玻璃镜片，第四球面玻璃镜片，孔径光阑，第五球面玻璃镜片，第六球面玻璃镜片，第七球面镜片以及第八球面玻璃镜片，并且所有球面镜片同光轴；
第一球面玻璃镜片为具有负焦距的负弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑方向，第一球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第二球面玻璃镜片为：具有正焦距的双凸透镜，第二球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第三球面玻璃镜片为：具有正焦距的负弯月形透镜，其凹面朝向孔径光阑，第三球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第四球面玻璃镜片为：具有负焦距的正弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑，第一球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第五球面玻璃镜片为：具有负焦距的双凹透镜，所述第五球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第六球面玻璃镜片为：具有负焦距的正弯月形透镜，其凹面朝向孔径光阑，第六球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第七球面玻璃镜片为：具有正焦距的双凸透镜，第七球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第八球面玻璃镜片为：具有正焦距的负弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑，第八球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第一球面玻璃镜片为高折射率、高色散的弯月形玻璃透镜，第一球面玻璃镜片的折射率大于等于1.80，阿贝数低于等于40；
第二球面玻璃镜片为高折射率、高色散的双凸透镜，第二球面玻璃镜片的折射率大于等于1.70，阿贝数低于等于40；
第三球面玻璃镜片为高折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第三球面玻璃镜片的折射率大于等于1.80，阿贝数大于等于50；
第四球面玻璃镜片为低折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第四球面玻璃镜片的折射率大于等于1.66，阿贝数大于等于55；
第五球面玻璃镜片为高折射率、高色散的双凹玻璃透镜，第五球面玻璃镜片的折射率大于等于1.75，阿贝数低于等于30；
第六球面玻璃镜片为低折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第六球面玻璃镜片的折射率小于等于1.65，阿贝数大于等于60；
第七球面玻璃镜片为低折射率、低色散的双凸玻璃透镜，第七球面玻璃镜片的折射率小于等于1.61，阿贝数低于等于55；
第八球面玻璃镜片为高折射率、高色散的弯月形玻璃透镜，第八球面玻璃镜片的折射率大于等于1.75，阿贝数低于等于30。
本发明的有益效果在于：本发明应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统，与现有技术相比，本发明能以6.6°小视场角完成φ35mm大成像范围，放大倍率为-0.65倍，且可应用于透射式检测系统。于此同时，本发明数值孔径为0.106，对荧光芯片微反应通道的分辨率能达到10微米。本发明针对485nm～656nm波长范围的荧光能清晰优异成像，像质清晰明亮，并且结构紧凑，成像效果好，孔径大，分辨率高，解决了在DNA检测中同时实现大视场和高分辨率的巨大困难。
附图说明
图1为本发明的实施例一应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统的结构示意图；
图2为本发明的实施例一中显微成像系统中精缩物镜的结构示意图；
图3-1为本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下视场为0mm时的像差图；
图3-2为本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下视场为4mm时的像差图；
图3-3为本本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下视场为7mm时的像差图；
图3-4为本本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下视场为11mm时的像差图；
图3-5为本本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下视场为16.9mm时的像差图；
图4为本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下的点列图；
图5为本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下的MTF曲线图；
图6为本发明具体实施例中的精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下的场曲/畸变曲线图。
具体实施方式
在本实施例一中，本实施例提供的荧光检测成像系统可以对28mm×18mm的透明基因芯片进行大视场、高分辨率一次性成像。
目前高通量dPCR基因芯片，每个反应腔室为直径100μm的圆，共2万个反应腔室分布在尺寸为28mm×18mm的基因芯片阵列区内。每个反应腔室的间距分别为60μm和120μm。根据实际应用需求，dPCR基因芯片往往有着不止一种荧光素。目前用于dPCR检测的几乎所有的荧光素的激发波长以及荧光波长都在可见光谱内。
如图1所示应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统的结构示意图，快速荧光检测成像系统包括用于激发荧光的照明装置、用于分开激发光和荧光滤波装置、样品芯片3、对样品芯片进行成像的显微成像系统4、以及接收图像的接收装置5。
激发荧光的照明装置包括用于提供照明光源的LED灯11、用于进行光束扩展的光束扩展器12以及用于光路转向的反射镜13。
滤波装置包括对激发光进行滤波和滤除的第一滤波片21和第二滤波片22。
照明光源发出的光经过光束扩展器12进行光束扩展后，再经由反射镜13反射，反射镜13的反射光垂直入射到第一滤波片21，经过第一滤波片滤波后的激发光打在样品芯片3上，样品所激发的荧光和激发光被显微成像系统4所收集，显微成像系统4对样本芯片进行一次性成像后，再经过第二滤波片22滤波，过滤掉激发光，过滤出纯净的荧光，最后由接收装置接收图像。
所述滤波装置，用于对光源进行滤波，为样品芯片提供激发光，且将激发光与荧光区分开。由于干涉滤光片的角度依赖性，也就是当入射角度增大时，能透过滤波片的中心波长的位置发生移动，这样边缘视场亮度降低，成像质量下降。这样，由于在荧光检测系统中需要加入激发滤光片和荧光滤色片，这需要显微物镜以及成像透镜的视场角越小越好，为此，本发明的成像范围达到φ35mm的同时，半视场角控制在6.6°
第一滤光片21的窄带中心波长对应激发样品3荧光的激发光中心波长，第二滤光片22的窄带中心波长对应样品3发出的荧光中心波长。
所述样品3，应为透明的基因芯片，也可以是任意需要检测的透明载物片。
所述成像系统4中镜头为大视场荧光精缩物镜，用于对样本进行一次性成像。
所述接收装置5具体为摄影相机CMOS，检测系统选用的CMOS型号为S-1500-M-G-CL，它的有效成像面积为24.488mmx 12.614毫米，可以使基因芯片成像更清晰。
所述接收装置5也可以是任意能满足成像质量的任何相机，例如CCD。接收装置，如CMOS、CCD的成像靶面(感光元件有效尺寸)需要大于24mm*12mm,每个像素的尺寸为4.25μm。显微成像系统到相机的工作距离需要大于14.6mm。
图2是本发明的实施例一中显微成像系统的结构示意图。
本发明的目的是提供一种精缩物镜镜头，解决了在DNA检测中同时实现大视场和高分辨率的巨大困难。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图2为本发明一种显微物镜镜头的一个实施例的结构图，如图2所示，本发明实施例提供的显微物镜结构，从物面端至像面端依次包括：
第一球面镜片L1，第二球面镜片L2，第三球面镜片L3，第四球面镜片L4，孔径光阑，第五球面镜片L5，第六球面镜片L6，第七球面镜片L7，第八球面镜片L8。所有球面镜片同光轴。
所述第一球面玻璃镜片具体为：具有负焦距的负弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑方向，所述第一球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第二球面玻璃镜片具体为：具有正焦距的双凸透镜，所述第二球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第三球面玻璃镜片具体为：具有正焦距的负弯月形透镜，其凹面朝向孔径光阑，所述第三球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第四球面玻璃镜片具体为：具有负焦距的正弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑，所述第一球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第五球面玻璃镜片具体为：具有负焦距的双凹透镜，所述第五球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第六球面玻璃镜片具体为：具有负焦距的正弯月形透镜，其凹面朝向孔径光阑，所述第六球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第七球面玻璃镜片具体为：具有正焦距的双凸透镜，所述第七球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
所述第八球面玻璃镜片具体为：具有正焦距的负弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑，所述第八球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面。
在实际应用中，第一球面玻璃镜片为高折射率、高色散的弯月形玻璃透镜，第一球面玻璃镜片的折射率大于等于1.80，阿贝数低于等于40。
在实际应用中，第二球面玻璃镜片为高折射率、高色散的双凸透镜，第二球面玻璃镜片的折射率大于等于1.70，阿贝数低于等于40。
在实际应用中，第三球面玻璃镜片为高折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第三球面玻璃镜片的折射率大于等于1.80，阿贝数大于等于50。
在实际应用中，第四球面玻璃镜片为低折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第四球面玻璃镜片的折射率大于等于1.66，阿贝数大于等于55。
在实际应用中，第五球面玻璃镜片为高折射率、高色散的双凹玻璃透镜，第五球面玻璃镜片的折射率大于等于1.75，阿贝数低于等于30。
在实际应用中，第六球面玻璃镜片为低折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第六球面玻璃镜片的折射率小于等于1.65，阿贝数大于等于60。
在实际应用中，第七球面玻璃镜片为低折射率、低色散的双凸玻璃透镜，第七球面玻璃镜片的折射率小于等于1.61，阿贝数低于等于55。
在实际应用中，第八球面玻璃镜片为高折射率、高色散的弯月形玻璃透镜，第八球面玻璃镜片的折射率大于等于1.75，阿贝数低于等于30。
各球面玻璃镜片的优选参数值见下表1：
表1
Figure BDA0002129974870000071
Figure BDA0002129974870000081
为达到上述目的且有效提升该精缩显微物镜镜头光学效能，本发明物镜具体参数如图表1；其中参数包含各镜片的厚度、间距，各镜片的折射率Nd，(Refractive index)曲率半径R(Radius of curvature),焦距F(Focus Length)以及各镜片的阿贝系数Vd(Abbenumber)。经测量，该具体实施例中的精缩物镜镜头在光谱F，d，C光(486nm，588nm，656nm)均有优良的透过性，且进行了像差、色差校正。整个变焦镜头系统的长度为244.655mm，数值孔径为0.1，缩小比为-0.540，最大视场半宽度为16.7mm。
在光学系统中，数值孔径(NA)用于测量系统能够采集到的光的角度范围。透镜的收集角越大，透镜的光吸收和空间分辨率越好。由于荧光强度相对较弱，因此在透镜的设计中需要较大的数值孔径。根据现有荧光显微镜成像，本设计的物镜NA值需要大于0.1。NA可以表示为
NA＝n×sinα (3)
其中n为透镜的折射率，α为孔径角。为了获得更大的数值孔径，需要非常仔细地考虑工作距离和玻璃种类。
如图3-1至3-5所示，是本发明精缩显微镜在436nm至656nm可见光波段下的光线像差图，分别对应物面视场半高度为0mm、4mm、7mm、11mm和16.7mm情况下的光线像差图；。图4为本发明具体实施例中的显微成像系统中精缩显微镜头在436nm至656nm可见光波段下的点列图。由图4可知，各个视场下的像点弥散斑比较集中，分布也较均匀。在物面视场半高度为0mm、4mm、7mm、11mm、16.7mm时，点列图RMS半径分别为2.4μm、2.1μm、2.0μm、2.4μm、4.875μm。系统色差校正也较好。
图5为本发明具体实施例中的精缩显微镜头在436nm至656nm可见光波段下的MTF曲线图。MTF曲线图代表了一个光学系统的综合解像水平，由图5可知，镜头在70lp/mm时，MTF曲线达到了0.6以上。
图6为本发明具体实施例中的精缩显微镜头在436nm至656nm可见光波段下的场曲/畸变曲线图。由此可见本发明畸变较小，不到0.1％，平场特性高，场曲不到0.05毫米。
实施例作用与效果
根据本实施例提供的快速荧光检测成像系统，与现有技术相比，本发明能以6.6°小视场角完成φ35mm大成像范围，且放大倍率为-0.540倍。于此同时，本发明数值孔径为0.106，对荧光通道的探测分辨率可达到10微米。本发明针对485nm～656nm波长范围的荧光能清晰优异成像，像质清晰明亮，并且结构紧凑，成像效果好，孔径大，分辨率高。
实施例中，第一滤光片的窄带中心波长对应光源发出的激发光中心波长，第二滤光片的窄带中心波长对应样本发出的荧光中心波长。第一滤光片用于滤去激发光从而不影响荧光的成像，第二滤光片用于过滤激发光源发出的激发波长以外的光，避免激发光中含有样品荧光的波长从而影响成像的效果。
实施例中，根据实施例一的显微系统，其成像透镜、显微物镜以及滤波装置之间依次紧密层叠并固定，保证结构的稳定，从而保护成像效果。
实施例中，照明设备为样品提供激发光源，光源为汞灯光源，通过复眼照明系统产生照度均匀的激发光，从而观测样本的荧光图像。
实施例中，成像透镜和显微物镜均由多个单透镜或胶合透镜组成，很好的矫正了球差、色差、场区等像差，有效的提高了整个系统的MTF曲线
实施例中，CMOS最为图像接收设备，以类似DRAM的方式读出信号，电路简单，读出速率高，成像面积，很好的将整个样品芯片进行一次性成像。

Claims (1)

1.一种应用于dPCR检测仪的透射式荧光检测成像系统，包括照明装置、滤波装置、样品芯片、对样品芯片进行成像的显微成像系统以及接收图像的接收装置；激发荧光的照明装置包括照明光源、用于进行光束扩展的光束扩展器以及反射镜；滤波装置包括第一滤波片和第二滤波片；
照明光源发出的光经过光束扩展器进行光束扩展后，再经过反射镜反射，反射光垂直入射到第一滤波片，经过第一滤波片滤波后激发光打在样品芯片上；样品所激发的荧光和激发光被显微成像系统所收集，显微成像系统对样本芯片进行一次性成像后，再经过第二滤波片滤波，过滤掉激发光，过滤出纯净的荧光，最后由接收装置接收图像；
其特征在于，所述成像系统中镜头为大视场荧光精缩物镜，从物面端至像面端依次包括第一球面玻璃镜片，第二球面玻璃镜片，第三球面玻璃镜片，第四球面玻璃镜片，孔径光阑，第五球面玻璃镜片，第六球面玻璃镜片，第七球面镜片以及第八球面玻璃镜片，并且所有球面镜片同光轴；
第一球面玻璃镜片为具有负焦距的负弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑方向，第一球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第二球面玻璃镜片为：具有正焦距的双凸透镜，第二球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第三球面玻璃镜片为：具有正焦距的负弯月形透镜，其凹面朝向孔径光阑，第三球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第四球面玻璃镜片为：具有负焦距的正弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑，第一球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第五球面玻璃镜片为：具有负焦距的双凹透镜，所述第五球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第六球面玻璃镜片为：具有负焦距的正弯月形透镜，其凹面朝向孔径光阑，第六球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第七球面玻璃镜片为：具有正焦距的双凸透镜，第七球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；
第八球面玻璃镜片为：具有正焦距的负弯月形透镜，其凸面朝向孔径光阑，第八球面玻璃镜片的两个表面均为玻璃球面；所述第一球面玻璃镜片为高折射率、高色散的弯月形玻璃透镜，第一球面玻璃镜片的折射率大于等于1.80，阿贝数低于等于40；
第二球面玻璃镜片为高折射率、高色散的双凸透镜，第二球面玻璃镜片的折射率大于等于1.70，阿贝数低于等于40；
第三球面玻璃镜片为高折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第三球面玻璃镜片的折射率大于等于1.80，阿贝数大于等于50；
第四球面玻璃镜片为低折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第四球面玻璃镜片的折射率大于等于1.66，阿贝数大于等于55；
第五球面玻璃镜片为高折射率、高色散的双凹玻璃透镜，第五球面玻璃镜片的折射率大于等于1.75，阿贝数低于等于30；
第六球面玻璃镜片为低折射率、低色散的弯月形玻璃透镜，第六球面玻璃镜片的折射率小于等于1.65，阿贝数大于等于60；
第七球面玻璃镜片为低折射率、低色散的双凸玻璃透镜，第七球面玻璃镜片的折射率小于等于1.61，阿贝数低于等于55；
第八球面玻璃镜片为高折射率、高色散的弯月形玻璃透镜，第八球面玻璃镜片的折射率大于等于1.75，阿贝数低于等于30。
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