CN1681944A - 编码可被扫描探针显微镜术(spm)读取的特定信息的纳米条形码的可控排列 - Google Patents

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Abstract

在此公开的方法、装置和组合物涉及诸如核酸或蛋白的生物分子的检测、鉴别和/或测序。在本发明的某些实施方案中，含有附着于一个或多个纳米条形码的探针分子的已编码探针可以结合到一个或多个目标分子上。在结合以及未结合的已编码探针分离之后，已结合的已编码探针可以在表面上被排列比对，然后利用扫描探针显微镜术来分析。纳米条形码可以是能够用SPM分辨的任何分子或复合物，诸如碳纳米管、富勒烯、亚微米金属条形码、纳米颗粒或量子点。在探针为寡核苷酸时，与目标核酸杂交的相邻已编码探针可以在被排列和用SPM分析之前被连接在一起。在此也公开了含有已编码探针的组合物。用于生物分子分析的系统可以包含SPM设备和至少一个粘附于表面的已编码探针。

Description

编码可被扫描探针显微镜术(SPM)读取的特定信息的 纳米条形码的可控排列
技术领域
本方法、组合物及装置是涉及分子生物学领域和生物分子分析，所述生物分子包含不限于核酸、蛋白质、脂质及多糖类。特别地，本发明是涉及使用纳米条形码(nanobarcodes)及扫描探针显微镜法(SPM)检测、鉴别和/或定序核酸和/或其它生物分子的方法、组合物和装置。
背景技术
诸如核酸或蛋白质的生物分子的鉴别及/或测序对于医学诊断、法医学、毒理学、病理学、生物战、公共卫生及大量的其它领域都是不可或缺。虽然目前针对核酸或蛋白的鉴别及/或测序已投入大量研究，其它诸如碳水化合物、多糖、脂质、脂肪酸等等的生物分子也是很重要的。在此所揭示的方法、组合物及装置并不受限于核酸的鉴别及/或测序，它们也可以用于其它类型的生物分子，包含但不限于蛋白质、脂质及多糖的分析。
诸如DNA印迹(Southern blotting)或核酸芯片结合的核酸检测的标准方法是依赖于荧光或放射性探针分子与目标核酸分子的杂交。已知的用于核酸测序的方法典型地是利用双脱氧终止(Sanger dideoxy)技术或与核酸芯片的杂交。
基于寡核苷酸杂交的阵列被广泛地用于目标核酸的检测。具有与目标核酸互补的序列的寡核苷酸探针连接上发荧光的、放射性的或其它组分(moiety)，这使得它可以通过Watson-Crick碱基配对与核酸杂交。已知该技术有许多变化。最近，DNA芯片已经被设计出来，它能够含有数百或甚至数千的寡核苷酸探针。目标核酸与寡核苷酸在芯片上的杂交可以使用荧光光谱学、放射性等来检测。非精确互补的序列之间的核酸杂交可能导致有关灵敏性及/或特异性的问题。在样本中存在的低水平的目标核酸就有可能没有被检测到。
Sanger双脱氧核酸测序方法是基于依大小分离开的四种彩色荧光或放射性核酸的检测，这种方法受到能够被测序的核酸的长度的限制。通常，一次只能确定500到1000碱基的核酸序列。使用现有的方法时，完整基因序列的确定要求生成该基因的多份拷贝，将其切割成重叠片段，然后进行测序，之后可以再将重叠的DNA序列组合起来。该程序费力、昂贵、低效率且耗时。而且通常还需要使用荧光或放射性物质，这很可能造成安全和废物处理问题。最近的通过应用与寡核苷酸芯片的杂交来进行核酸测序的方法可以被用来推断短的核酸序列，或用来检测在样品中特定核酸的存在，但是并不适合用来鉴定长的核酸序列。
有许多技术可用于鉴定蛋白、多肽及肽。一般地，这些技术都涉及抗体的结合及检测，所述抗体可以识别在蛋白上的一个或多个表位结构域(epitopic domains)。虽然基于抗体的蛋白鉴别方法相当快速，但是由于抗体与不同抗原之间的交叉反应、目标分析物的低抗原性(导致分析出现低灵敏性)、抗体对各种表面的非他特异结合等等，这样的分析有时就会出现不可接受的高水平的假阳性结果或假阴性结果。而且这样的技术还需要能够识别单个蛋白或肽的抗体的制备物。因此，它们并不适合用来鉴别先前还未曾被表征过的新的蛋白。
需要快速、精确和灵敏的方法来对诸如核酸或蛋白的生物分子进行检测、鉴别和/或测序。
附图说明
下面的附图构成了本说明书的一部分，它们被引入是为了进一步展示本发明所公开的实施方案的某些方面。本发明的实施方案可以通过参考其中的一个或多个附图并结合在此提出的特定实施方案的细节描述而被更好地理解。
图1说明了用以排列(aligning)已编码探针(coded probes)130、230、340、400于表面100、220、300上的示范性方法，每个探针包含粘附于探针分子410的一个或多个纳米条形码420。(A)将表面100、220、300浸入含有已编码探针130、230、340、400的溶液110。(B)从溶液110中移出含有已被排列的已编码探针130、230、340、400的表面100、220、300。
图2说明了另一种用以排列已编码探针130、230、340、400在表面100、220、300的示范性方法。(A)将一滴含有已编码探针130、230、340、400的溶液210置于覆盖滑片200与玻璃载片220之间。覆盖滑片200固定在适当的地方，同时载片220被移动，从而使已编码探针130、230、340、400进行排列。
图3说明了另一种用以排列已编码探针130、230、340、400在表面100、220、300上的示范性方法。
图4说明了示范性的已编码探针400，其包含附着于探针分子410的纳米条形码420。单个纳米条形码420可以由一个或多个组成部分(moieties)组成，这将在下文中更详细地讨论。
示范性实施方案的描述
在此公开的方法、组合物及装置是用来对诸如核酸的生物分子进行检测、鉴别及/或测序。在本发明的特定实施方案中，所述方法、组合物及装置适合于获得非常长的核酸分子的序列，所述核酸分子在长度上超过1,000、超过2,000、超过5,000、超过10,000、超过20,000、超过50,000、超过100,000或甚至更多的碱基。优点包括能够在单次测序操作中读取长的核酸序列、能够快速获得序列数据，以及就每单位的序列数据所需要的操作时间而言具有低的测序成本和高的效率。其它优点包括能够灵敏和精确地检测和/或鉴别核酸，假阳性结果发生的概率很低。
下面的详细描述包含了大量的特定细节以便提供对本发明所公开的实施方案更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员很明显的是，本发明的实施方案不按照这些特定细节也可以被实施。在其它例子中，本领域内为人所熟知的装置、方法、程序及个别组分不在此详细加以描述。
定义
当在此使用时，“一个”(“a”或“an”)可以表示术语的一个或多于一个的形式。
当在此使用时，“大约”是指在一个数值的百分之十内。例如，“大约100”是指在90与110之间的数值。
“核酸”包括DNA、RNA(核糖核酸)，单链、双链或三链及其任何化学修饰。实际上，核酸的任何修饰都在考虑的范围之内。“核酸”可以是几乎任何长度，从2个或更多碱基的寡核苷酸到全长染色体DNA分子。核酸包含但不限于寡核苷酸和多核苷酸。
“已编码探针”130、230、340、400是指附着于一个或多个纳米条形码420的探针分子410。探针分子410是对一个或多个目标分子显示出选择性和/或特异性结合的任何分子。在本发明的各种实施方案中，各个不同的探针分子410可以附着于可区分的纳米条形码420，以便可以从一群不同的探针分子410中检测到特定探针410的结合。至于可以使用的探针分子410的类型，本发明的实施方案并没有限制。任何在本领域已知的探针分子410都可以使用，包含但不限于寡核苷酸、核酸、抗体、抗体片段、结合蛋白、受体蛋白、肽、凝集素、底物、抑制剂、活化剂、配体、激素、细胞因子，等等。在本发明的某些实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以包含已经共价或非共价地附着于一个或多个纳米条形码420的寡核苷酸和/或核酸，其可鉴别寡核苷酸和/或核酸的序列。在本发明的各种实施方案中，成线性系列的已编码探针130、230、340、400可以被连接在一起。在这个连接的分子中的各个已编码探针130、230、340、400可以附着于可区分的纳米条形码420，以允许识别其序列。因为在该连接分子中的已编码探针130、230、340、400的序列也可以被确定，所以该整个连接分子的序列可以被鉴定。在另一实施方案中，在寡核苷酸探针410内的各个核苷酸都可以附着于可分辨的纳米条形码420，这使得该已编码探针130、230、340、400的序列可以从核苷酸的序列中鉴别出来。
“纳米条形码”420是指可以用来检测和/或鉴别已编码探针130、230、340、400的构成物。在下文更为详细讨论的非限制性的例子中，纳米条形码420可以包括一个或多个亚微米金属条形码、碳纳米管、富勒烯或任何其它可被扫描探针显微镜术检测和鉴别的纳米级的组分。纳米条形码420并不限于单个组分，在本发明的某些实施方案中，纳米条形码420可以包含例如两个或更多个彼此粘附的富勒烯。图4所说明的非限制性的实例显示了六个不同组分合并为一个纳米条形码420。当所述组分为富勒烯时，它们可以例如由一连串大大小小的以特定页序连接在一起的富勒烯组成。在纳米条形码420中不同大小的富勒烯的顺序可以利用扫描探针显微镜术来检测，而这个顺序可以用来例如识别附着的寡核苷酸探针410的序列。
“目标”或“分析物”分子是可以结合到已编码探针130、230、340、400的任何分子，包含但不限于核酸、蛋白、脂质及多糖。在本发明的某些实施方案中，已编码探针130、230、340、400与目标分子的结合可以被用来检测在样品中该目标分子的存在。
分子梳
在本发明的各种实施方案中，纳米条形码420、已编码探针130、230、340、400和/或结合到已编码探针130、230、340、400的目标分子可以被附着到表面100、220、300并被排列以便分析。在一些实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以排列于表面上，被整入的纳米条形码420可以被探测，如下所述。在另外的实施方案中，纳米条形码420可以与探针分子410分离、排列于表面上并被探测。在某些实施方案中，结合到个别目标分子上的已编码探针130、230、340、400的顺序可以被保留和检测，例如利用扫描探针显微镜术。在其它实施方案中，目标分子的多个拷贝可以存在于一个样品中，可以通过将结合于所述多个拷贝的已编码探针130、230、340、400的所有序列组合成重叠的目标分子序列，来确定目标分子的身份和/或序列。用来例如将重叠的部分核酸或蛋白序列组合成连续序列的方法在本领域是已知的。在各种实施方案中，纳米条形码420可以是在它们附着于探针分子410时被检测，或者可以是在检测之前就已与探针分子410分离。
将分子例如核酸、寡核苷酸探针410和/或纳米条形码420附着到表面100、220、300并使之进行排列比对的方法及装置在本领域是已知的。(参见例如Bensimon等人，Phys.Rev.Lett.74：4754-57，1995；Michalet等人，Scienece 277：1518-23，1997；美国专利5,840,862；6,054,327；6,225,055；6,248,537；6,265,153；6,303,296和6,344,319)。纳米条形码420、已编码探针130、230、340、400和/或目标分子可以利用使用气-水的弯月面或其它类型的界面所固有的物理作用力而附着于表面100、220、300和被排列。这一技术通常称为分子梳(molecualrcombing)。溶解在含水介质110、210中的纳米条形码420、已编码探针130、230、340、400和/或目标分子可以是一端或者两端附着于表面100、220、300，例如硅烷化玻璃片、生物素化(biotinylated)表面、镀金表面或任何其它的本领域已知的能够结合这样的分子的表面100、220、300。该表面100、220、300可以缓慢地从含水介质中拉出(例如图1)。极性或带电荷的目标分子、纳米条形码420和/或已编码探针分子130、230、340、400会优选分配到亲水性(含水)介质110、210中。因此，当表面100、220、300从该含水介质110、210移出时，可造成结合的目标分子、纳米条形码420和/或已编码探针130、230、340、400的伸展，其方向平行于弯月面的移动方向。在所述的伸展分子的测量长度与其实际大小之间存在着直接的关联性，一微米的伸展长度对应于大约2,000个碱基的核酸序列(Herrick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：222-227，2000)。
一旦所述表面100、220、300已经全部从含水介质110中移出，附着的纳米条形码420和/或已编码探针130、230、340、400就以平行方式排列，该方式可以更容易和精确地分析。在本发明的某些具体实施方式中，已编码探针130、230、340、400的两端都附着到表面100、220、300上，被排列的已编码探针130、230、340、400将会呈现出U形形态，该形态也更容易分析。该技术并不受限于要被排列的目标分子、纳米条形码420和/或已编码探针130、230、340、400的大小，它可以对长至整个染色体的核酸起作用(例如，Michalet等人，1997；Herrick等人，2000)。在弯月面以适当的速率移动时，所产生的剪力系相当小，这样，被排列的DNA片段可以是数十万个碱基或更长(Michalet等人，1997)。
分子到处理过的表面100、220、300上的强烈的非特异性吸附会抑制分子梳作用(Bensimon等人，1995)。因此，在本发明的各种实施方案中，表面100、220、300被处理，使得目标分子或已编码探针130、230、340、400的仅仅一端或更多端会结合到表面100、220、300。将核酸及其它类型的已编码探针130、230、340、400结合到表面100、220、300的方法在本领域为人所熟知，总结于下。在非限制性的例子中，目标分子、纳米条形码420或已编码探针130、230、340、400可以在所述分子的一端或两端用生物素残基共价修饰。当暴露于覆有抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白(streptavidin)的表面100、220、300时，就只有生物素标记的末端会结合到该表面100、220、300。与表面100、220、300的非特异性吸附可以通过使用本质上具有疏水性的表面100、220、300来降低，例如硅烷化表面100、220、300。
本发明的实施方案并不受限于可以使用的表面100、220、300的类型。表面100、220、300的非限制性的例子包含玻璃、功能化玻璃、陶瓷、塑料、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、锗、硅、石英、砷化镓、金、银、尼龙、硝酸纤维素或任何其它在本领域已知的能够让目标分子、纳米条形码420和/或已编码探针130、230、340、400附着到表面100、220、300的材料。附着可以是共价的或非共价的作用。尽管在本发明的某些实施方案中，表面100、220、300可以是玻璃片或覆盖滑片的形式，但表面100、220、300的形状并没有限制，表面100、220、300可以是任何形状。在本发明的某些实施方案中，表面100、220、300是平面的。
用以排列目标分子、纳米条形码420和/或已编码探针130、230、340、400在表面100、220、300上的其它方法在本领域是已知的(例如，Bensimon等人，1995；Michalet等人，1997；美国专利5,840,862；6,054,327；6,225,055；6,248,537；6,265,153；6,303,296及6,344,319)。可以说，任何已知的用于排列的方法都可以在所要求保护的主题的范围之内被应用。在本发明的某些实施方案中，当溶解在含水介质110、210中的目标分子、纳米条形码420或已编码探针130、230、340、400透过移动的弯月面而被拉出时，排列便可发生。弯月面发生移动的机制并不重要，可以通过例如将表面100、220、300浸入缓冲溶液110、210中，再将其而缓慢地从该溶液110、210中移出，从而实现弯月面的移动。或者，表面100、220、300可以被浸入溶液110、210中，而弯月面的水平位置可以藉由液体的蒸发或移除而缓慢地降低。在本发明的其它实施方案中，可以将一滴溶液210放在覆盖滑片200和表面100、220、300例如玻璃片之间。可以将该表面100、220、300缓慢地拉出，使之与覆盖滑片200分开。因为溶液210紧贴覆盖滑片200，这就会造成覆盖滑片200与表面100、220、300接触的边缘处形成空气-水的界面。移动该界面，便使目标分子、纳米条形码420和/或已编码探针130、230、340、400排列于表面100、220、300。用以排列纳米条形码420和/或已编码探针130、230、340、400的别的方法在下文中会更详细地讨论，它们涉及使用自由流动(free-flow)电泳替代分子梳或在分子梳的过程中使用自由流动电泳。
核酸
要被检测、鉴别和/或测序的核酸分子可以利用任何在本领域中已知的技术来制备。在本发明的某些实施方案中，核酸可以是天然发生的DNA或RNA分子。实际上，任何天然发生的核酸都可以利用所公开的方法来检测、鉴别和/或测序，包含但不限于染色体DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA和核糖体RNA、转运RNA、不均一核RNA和信使RNA。在一些实施方案中，要被分析的核酸是存在于细胞、组织或器官的粗制均质物或提取物中。在其它实施方案中，核酸在分析之前可以被部分或完全纯化。在另外的实施方案中，要被分析的核酸分子可以利用在本领域所熟知的化学合成法来制备，或利用本领域已知的各种核酸扩增、复制和/或合成方法来制备。
纯化各种形式的细胞内核酸的方法是已知的(参见例如，Guide toMolecular Cloning Techniques，eds.Berger和Kimmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular Cloning：A Laboratory Mannual，2nd Ed.eds.Sambrock，Fritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)。在引用的参考文献中所揭露的方法仅供示范，在本领域已知的任何变化都可加以使用。当单链DNA(ssDNA)要被分析时，ssDNA可以通过任何已知方法由双链DNA(dsDNA)制备。这样的方法可以包括加热dsDNA，使链分开，或者，可以包括通过已知的扩增或复制方法从dsDNA制备ssDNA，例如利用在M13中的克隆。任何这样的已知方法都可以用来制备ssDNA或ssRNA。
虽然本发明的某些实施方案是涉及天然发生核酸的分析，但实际上，任何类型的核酸都可以使用。例如，由各种扩增技术例如聚合酶链式反应(PCRTM)制备的核酸都可以被分析(参见美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159)。要被分析的核酸或者可以克隆到标准载体中，例如质粒、粘粒、BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)中。(参见，Berger和Kimmel，1987；Sambrook等人，1989。)核酸插入物可以与载体DNA分离，例如通过用适当的限制性核酸内切酶进行切割，接着进行琼脂糖凝胶电泳。用来分离核酸插入物的方法在本领域中是已知的。所揭示的方法并没有限制要被分析的核酸的来源，任何类型的核酸，包括原核生物的、细菌的、病毒的、真核生物的、哺乳动物的和/或人类的核酸都可以在所要求保护的主题的范围之内被分析。
在本发明的各种实施方案中，单个核酸的多个拷贝可以利用已编码探针130、230、340、400的杂交来分析，如同下文所讨论的。制备单个核酸和形成多个拷贝的方法在本领域是已知的，例如各种扩增和/或复制方法。作为选择，单个克隆，诸如含有单个核酸插入物的BAC、YAC、质粒、病毒或其它载体，可以被分离、放大，插入物可以被取出并纯化以用于分析。用以克隆和获得纯化的核酸插入物的方法在本领域是为人熟知的。
熟练的技术人员应了解到，所要求保护的主题的范围并不限于核酸的分析，它包括了其它类型的生物分子的分析，这些生物分子包含但不限于蛋白、脂质及多糖。用以制备和/或纯化各种类型的生物分子的方法在本领域是已知的，任何这样的方法都可以使用。
已编码探针文库
在本发明的某些实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以构成探针分子410文库，各个不同的探针410附着于可分辨的纳米条形码420。在一个给定的文库中，有可能某一特定探针分子410存在多于一个的拷贝。在这种情况下，相同探针410的每个拷贝将附着于相同的纳米条形码420。所使用的探针410和纳米条形码420的类型并没有限制，任何已知类型的探针分子410都可以使用，包含但不限于寡核苷酸、核酸、抗体、抗体片段、结合蛋白、受体蛋白、肽、凝集素、底物、抑制物、激活物、配体、激素、细胞因子，等等。而且，任何类型的可分辨的纳米条形码420都可被使用。
寡核苷酸文库
在本发明的各个实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以包括寡核苷酸探针410，例如具有确定序列的寡核苷酸。所述寡核苷酸410可以附着于可分辨的纳米条形码420，再杂交到要被分析的核酸上，相邻的已编码探针130、230、340、400可以连接到一起。在与所述核酸分离之后，所述的连接的已编码探针130、230、340、400可以附着到表面100、220、300，并被排列，如上文所讨论的。被排列的已编码探针130、230、340、400接着可以用扫描探针显微镜术(SPM)来分析。通过SPM分析可以检测和鉴定已编码探针130、230、340、400的纳米条形码420组成，并确定结合到所述核酸的已编码探针130、230、340、400的顺序。该信息便可以用来鉴别核酸和/或用来确定核酸序列。熟练的技术人员应意识到，所要求保护的主题的范围并不限于SPM检测方法，能够检测和鉴别纳米条形码420和/或排列于表面100、220、300上的已编码探针130、230、340、400的任何分析方法都可以被使用。熟练的技术人员也应意识到，SPM分析并不限于检测和鉴别基于寡核苷酸的已编码探针130、230、340、400，而是可以针对任何类型的已编码探针130、230、340、400和/或纳米条形码420来使用。
在本发明另外的实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以被检测，而无须连接相邻的已编码探针130、230、340、400。已编码探针130、230、340、400可以杂交到相同目标分子的多个拷贝。未杂交的已编码探针130、230、340、400可以被去除，而杂交的已编码探针130、230、340、400被检测。在一些实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以在仍然与目标分子杂交时被检测。或者，已编码探针130、230、340、400可以例如通过加热样品而与目标分子分离，然后被检测。在这样的实施方案中，纳米条形码420组分在检测之前，可以与或者不与已编码探针130、230、340、400的探针410组分分开。
在本发明的某些实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以在仍然附着于目标分子时被检测。如果在短的寡核苷酸探针410与目标核酸之间的结合作用的强度相对较弱，那么这样的方法可能更为适当，例如在已编码探针130、230、340、400已经使用交联剂共价附着于目标分子的情形，或是在探针分子410与目标之间的结合作用较强的情形，例如抗体-抗原相互作用的情形。
在本发明的各种实施方案中，寡核苷酸类型的已编码探针130、230、340、400可以是DNA、RNA或其任何类似物，例如肽核酸(PNA)，它可以用来鉴别在核酸中的特定互补序列。在本发明的某些实施方案中，一个或多个已编码探针130、230、340、400文库可以被制备，用于与一种或多种核酸分子的杂交。例如，可以使用这样的一套已编码探针130、230、340、400，其含有所有4096种六聚体或大约2000种非互补六聚体，或所有16384种七聚体或大约8000种非互补七聚体。如果非互补的寡核苷酸已编码探针130、230、340、400系列被使用，那么可以进行多次的杂交和序列分析，这些分析的结果可以通过计算方法合并为一套数据。例如，如果只包含非互补六聚体的文库被用于杂交和序列分析，那么使用相同的目标核酸分子的第二次杂交和分析可以执行，所述目标核酸分子被杂交到由第一文库排除的那些已编码探针130、230、340、400序列。
在本发明的某些实施方案中，已编码探针130、230、340、400文库可以含有具有给定的寡核苷酸长度的所有可能序列(例如，六聚体文库可以由4096种已编码探针130、230、340、400组成)。在这样的情况下，某些已编码探针130、230、340、400会与互补的已编码探针130、230、340、400序列形成杂合体。这样的杂合体以及未杂交的已编码探针130、230、340、400可以使用已知的方法与杂交到目标分子上的已编码探针130、230、340、400分离，所述方法例如高效液相色谱(HPLC)、凝胶渗透层析、凝胶电泳法、超滤和/或羟磷灰石层析。一组完整的具有既定长度的所有可能序列的寡核苷酸或其中特定的亚组的产生方法和选择方法是已知的。在各种实施方案中，长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多核苷酸的已编码探针130、230、340、400可以被使用。
在本发明的某些实施方案中，已编码探针130、230、340、400文库可以包含这样的已编码探针130、230、340、400，其中间是随机核酸序列，而在其一端或两端是固定不变的核酸序列。例如，12聚体的已编码探针130、230、340、400的一个亚组可以由两端是固定的二聚体的一组完整的随机八聚体序列组成。这些已编码探针130、230、340、400文库可以根据它们固定不变的部份被再划分，并独立地与核酸杂交，然后使用各个不同的已编码探针130、230、340、400文库的数据组合进行分析，以确定所述核酸的序列。熟练的技术人员会意识到，所需要的亚文库的数目是连接于随机序列的固定不变碱基的数目的函数。另一种实施方案可以应用使用单个已编码探针130、230、340、400文库的多重杂交和分析，所述单个文库含有连接于随机寡核苷酸序列的特定固定部份。对于核酸上任何给定的位点，序列不同但是有重叠的多个已编码探针130、230、340、400能够以稍微有偏移的方式结合到该位点，这是可能的。因此，应用使用单个文库的多重杂交和分析，该核酸的完整序列可以通过编辑所述的重叠、偏移的已编码探针130、230、340、400序列来获得。
在本发明的涉及寡核苷酸文库的实施方案中，寡核苷酸可以利用任何已知方法来制备，例如利用Applied Biosystems 381A DNA合成仪(Foster City，CA)或类似设备来合成。或者，寡核苷酸可以从供货商(例如Proligo，Boulder，CO；Midland Certified Reagents，Midland，TX)买到。在寡核苷酸是被化学合成的实施方案中，纳米条形码420可以共价地连接于用于合成的一种或多种核苷酸前体。或者，纳米条形码420可以是在寡核苷酸探针410已经合成之后才粘附上。在其它替代的选择中，纳米条形码420可以在寡核苷酸合成的同时被贴附上。
在本发明的某些实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以包括肽核酸(PNA)。PNA是聚酰胺型的DNA类似物，其具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的单体单元。PNA已经商业化，可以从诸如PE Biosystem(Foster City，CA)的公司获得。或者，可以在叔胺，N，N-二异丙基乙胺(DIEA)存在的条件下，使用O-(7-偶氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)来活化和偶联9-芴甲氧羰基(Fmoc)单体，从而实施PNA的合成。PNA能够利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)来纯化，可利用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析来证实。
纳米条形码
每个已编码探针130、230、340、400可以整合有至少一个共价或非共价联结的纳米条形码420。纳米条形码420可以用来检测和/或鉴别单个已编码探针130、230、340、400。在本发明的某些实施方案中，每个已编码探针130、230、340、400可以具有两个或更多个附着的纳米条形码420，它们的组合对于特定的已编码探针130、230、340、400是独特的。纳米条形码420的组合可以用来扩展可分辨的纳米条形码420的数目，这些纳米条形码在特异地鉴别在文库中的已编码探针130、230、340、400时是可利用的。在本发明的其它实施方案中，每个已编码探针130、230、340、400可以具有单个独特的纳米条形码420附着。这里唯一的要求就是由每个已编码探针130、230、340、400检测到的信号必须能够将已编码探针130、230、340、400从不同的已编码探针130、230、340、400中可区分地鉴别出来。
在本发明的某些实施方案中，纳米条形码420可以在合成已编码探针130、230、340、400之前整合到前体中。对于基于寡核苷酸的已编码探针130、230、340、400，为了在腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)位置处进行共价连接而进行的内部氨基修饰是可以考虑的。内部连接也可以使用商业上可获得的亚磷酰胺在胸腺嘧啶(T)位置出实施。在一些实施方案中，在A和G位置处具有丙胺连接子(linker)的文库片段可以用来将纳米条形码420连接到已编码探针130、230、340、400上。内部氨烷基尾端的导入允许纳米条形码420的合成后附着。连接子可以从供货商处购得，例如Synthetic Genetics(San Diego，CA)。在本发明的一个实施方案中，使用适当的亚磷酰胺衍生物进行纳米条形码420的自动偶联也被考虑到。这样的纳米条形码420可以在寡核苷酸合成期间被偶联到其5′-端。
通常，纳米条形码420将以能够使所述纳米条形码420的空间位阻最小化的方式共价附着于探针410上，以便于已编码探针130、230、340、400结合到目标分子，例如杂交到核酸上。可以使用连接子，这样可以为已编码探针130、230、340、400提供一定程度的柔性。同质或异质双功能连接子可以从各种商业来源获得。
寡核苷酸碱基上的附着点会随着碱基的变化而变化。当在任何位置上的附着都是可能的时候，在某些实施方式中，附着是发生在不涉及互补碱基的氢键的位置。因此，例如，附着可以发生在嘧啶例如尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶的5或6位置处。对于诸如腺嘌呤和鸟嘌呤的嘌呤，连接可以是经由8位置处。所要求保护的方法及组分并不限于任何特定类型的探针分子410，例如寡核苷酸。用以将纳米条形码420附着于其它类型的探针410例如肽、蛋白和/或抗体探针410的方法在本领域是已知的。
本发明的实施方案并没有限制可以使用的纳米条形码420的类型。在本领域已知的任何类型的纳米条形码420都可以使用。非限制性的实例包括碳纳米管、富勒烯和亚微米金属条形码。
金属条形码
潜在的可用作纳米条形码420的亚微米金属条形码的实例在本领域是已知的(例如，Nicewarner-Pena等人，Science 294：137-141，2001)。Nicewarner-Pena等人(2001年)公开了制备由亚微米条(submicrometerstripes)编码的多金属微棒(multimetal microrods)的方法，其是由不同类型的金属组成。该系统允许产生非常大量的可区分的纳米条形码420——使用两种类型的金属就可达到4160种，而利用三种不同类型的金属则可以达到8×105种之多。这样的纳米条形码420可以整合到已编码探针130、230、340、400，并利用SPM技术读取。将诸如金或银的金属颗粒粘附到寡核苷酸和其它类型的探针分子410的方法在本领域是已知的(例如美国专利5,472,881)。
碳纳米管
其它的在所揭示的方法中使用的示范性的纳米条形码420包括单壁碳纳米管(SWNT)。纳米管可以制作成各种形状和大小，并可通过SPM方法来区分(参见，例如Freitag等人，Phys.Rev.B 62：R2307-R2310，2000；Clauss等人，Europhys.Ltte.47：601-607，1999；Clauss等人，Phys.Rev.B 58：R4266-4269，1998；Odom等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.960：203-215，2002)。Odom等人(2002年)公开了一种STM(扫描穿隧显微镜)技术，该技术能够检测到10纳米或更小尺寸的SWNT的隧穿谱中的离散峰。这样的峰可以代表碳纳米管的电子态密度(DOS)中的van Hove奇异性。
碳纳米管的电子性质通过该管的长度和直径来调节。电子波函数对长度的敏感性可以通过长度为L的管子的能级劈裂的估计来说明。
ΔE＝hvF/2L(式1)
其中h为普朗克常数，vF为费米速度(8.1×105米/秒)(1996年11月23日，Venema等人，“Imaging Electron Wave Functions of CarbonNanotubes”，Los Alamos Physics Preprints：cond-mat/9811317)。电子能级间的差异与该纳米管的长度成反比，较长的管子会观察到的较细密的劈裂。
碳纳米管的光学性质也是管直径的函数。基本能量间隙(最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道)与管直径间的关系可以利用下列函数来建模：
Egap＝2y0acc/d(式2)
其中y0为碳-碳紧密结合重叠能量(C-C tight bonding overlapenergy)(2.7±0.1电子伏特)，acc为最邻近的碳-碳距离(0.142纳米)，d为管直径(1998年，Jeroen等人，Nature 391：59-62)。
对于本发明的某些实施方案，用作纳米条形码420的纳米管可以具有大约10到200纳米的管长度，及大约1.2到1.4纳米的直径。用作纳米条形码420的纳米管的长度或直径并没有限制，而实际上可以考虑任何长度或直径的纳米管。
可以预想到，纳米管可通过已知的方法制备或从商业来源取得，例如CarboLex(Lexington，KY)、NanoLab(Watertown，MA)、材料和电化学研究中心(Tucson，AZ)或碳纳米科技公司(Houston，TX)。在使用之前，合成的或购买到的纳米管可以进行适当的处理。所述处理可以包含通过纯化将纳米管与其它污染物分开、将混合直径和/或长度的纳米管分离为具有离散的直径和长度的纳米管、将纳米管的末端结构去除，和/或进行共价修饰以有利于纳米管附着到探针410上，形成已编码探针130、230、340、400。
在本发明的某些实施方案中，具有可变长度和/或直径的碳纳米管可以利用在本领域已知的各种技术来产生，所述技术包含但不限于碳-电弧放电、藉由碳氢化合物的催化高温分解的化学气相沉积、等离子体辅助化学气相沉积、含有催化金属的石墨目标的激光烧蚀、或压缩电解(参见，例如美国专利6,258,401、6,283,812和6,297,592)。在某些实施方案中，纳米管可以通过质谱方法按大小进行分选(参见，1991年，Parker等人，J.Am.Chem.Soc.113：7499-7503)。或者，纳米管可以在整合入已编码探针130、230、340、400之前，使用AFM(原子力显微镜术)或STM(扫描穿隧显微镜术)来分选，精确地量测单个纳米管的几何形状。其它的在本领域中已知的大小分级的方法是已知的，例如气相色谱、飞行时间质谱、超滤或等同的技术都可以考虑。被分选之后，碳纳米管可以被衍生化，共价地附着于具有已知序列的寡核苷酸探针410或任何其它类型的探针410。
对于碳纳米管可能的是，其管长度的最小增量为碳-碳键的长度，或者大约0.142纳米。对于200纳米的管长度范围，可允许获得大约1400个离散的纳米条形码420。然而，该方法并不限于每一已编码探针130、230、340、400使用一个纳米管。在另外的实施方案中，不同长度及直径的多个纳米管可以附着于单个已编码探针130、230、340、400。利用不同长度的纳米管的组合，可能的可分辨纳米条形码420的数目将以指数方式增加。在一些实施方案中，单个纳米管可以附着于单个碳针分子410，以简化分析。
本发明的其它实施方案涉及制造具有确定长度和直径的碳纳米管的方法。在一个非限制性的示范实施方案中，一个芯片可以含有一层具有预先选择的厚度的SiC，还重叠着一个由例如硅或掺杂有催化剂(例如，金属原子，比如镍)的硅所组成的层。使用标准的芯片处理方法，诸如照相平板印刷和蚀刻或激光烧蚀，该SiC层可以被分割成任何长度、宽度、厚度和形状的SiC沉积物。然后，该芯片可以在真空中加热，例如在大约10-7Torr和大约1400℃，或者从大约10-3到10-12Torr、10-4到10-10Torr，或10-5到10-9Torr，以及从1200℃到2200℃或1400℃到2000℃。在这些条件下，SiC晶体会自发地分解，失去硅原子(美国专利6,303,094)。剩余的碳原子自发地组合成碳纳米管。SiC沉积物的大小及形状可以精确地控制，以制造任何长度和直径的碳纳米管。
在上文中所讨论的本发明的示范性实施方案并不是限制性的，制造具有已选择的长度和直径的碳纳米管的任何方法都可以使用(例如美国专利6,258,401；6,283,812和6,297,592)。在某些实施方案中，纳米管长度可以通过使用激光束、电子束、离子束或气体等离子束切除其末端来调节。或者，纳米管的末端可以在含氧的气氛中与热片(hotblade)接触，通过氧化反应去除该管子的末端。含有纳米管的块状物也可以被切割成段或被抛磨以截断纳米管。
在本发明的某些实施方案中，碳纳米管可以用反应活性基团来衍生化，以促进与探针分子410的粘附。在一个非限制性的例子中，纳米管可以被衍生化以含有羧酸基团(美国专利6,187,823)。羧化衍生的纳米管可以通过标准的化学方法附着到探针分子410上，例如与位于探针410上的伯胺或仲胺基团形成由碳二亚胺介导的酰胺连接。衍生化和交联的方法并没有限制，任何在本领域中已知的反应基团或交联方法都可以使用。
富勒烯
在本发明的另外的实施方案中，富勒烯可以用作纳米条形码420。制造富勒烯的方法是为人所熟知的(例如美国专利6,358,375)。富勒烯可以利用类似于上文中针对碳纳米管所揭示的方法来衍生和附着到探针分子410上。含有富勒烯的已编码探针130、230、340、400可以利用SPM技术来鉴别，类似于上文中针对纳米管所揭示的方法。
在本发明的某些实施方案中，富勒烯可以附着于寡核苷酸已编码探针130、230、340、400中单独的核苷酸。在这样的情况下，只要求两种不同类型的可区分的富勒烯，因为在寡核苷酸中只发现四种类型的核苷酸，而两种类型的富勒烯可以组合成四种不同的组合(例如AA、BB、AB和BA)。当单个的核苷酸被附着到纳米条形码420时，在该核苷酸和富勒烯之间使用已知的链接基团可能是恰当的，这样可以避免与目标核酸杂交时的空间位阻。
熟练的技术人员会意识到，在所揭示的方法中使用的纳米条形码420并不限于在此揭示的实施方案，而是可以包括任何其它类型的已知的纳米条形码420，所述纳米条形码420可以附着于探针410和被检测。其它可能使用的纳米条形码420的非限制性的例子包括量子点(例如Schoenfeld等人，Proc.7th Int.Conf.on Modulated SemiconductorStructures，Madrid，pp.605-608，1995；Zhao等人，1st Int.Conf.on LowDimensional Structures and Devices，Singapore，pp 467-471，1995)。量子点和其它类型的纳米条形码420可以利用已知的方法来合成和/或从商业来源取得(例如量子点公司，Hayward，CA)。其它可能使用的纳米条形码420包括纳米颗粒，可以从例如Nanoprobes Inc.(Yaphank.NY)和Polysciences，Inc.(Warrington，PA)获得。
基于寡核苷酸的已编码探针的杂交和连接反应
在本发明的各种实施方案中，目标核酸与寡核苷酸型已编码探针130、230、340、400文库的杂交可以在只允许完全互补的核酸序列杂交的严紧条件(stringent conditions)下发生。低严紧的杂交通常是在0.15M到0.9M的NaCl和20℃到50℃的温度范围执行。高严紧杂交通常是在0.02M到0.15M的NaCl和50℃到70℃的温度范围执行。应了解的是，具有适当的严紧性的温度和/或离子强度是部分地由寡核苷酸探针410的长度、目标序列的碱基组成，及在杂交混合物中甲酰胺、四甲基氯化铵或其它溶剂的存在来决定的。上文所提到的范围是供示范用，对于特定的杂交反应，合适的严紧性通常是利用与阳性和/或阴性对照的比较依经验确定的。本领域普通技术人员能够惯常地调整杂交条件，以保证只有精确互补的核酸序列间的严紧杂交发生。
一旦短的已编码探针130、230、340、400已经杂交到核酸上，相邻的已编码探针130、230、340、400便可以使用已知的方法(参见例如美国专利6,013,456)连接在一起。短至6到8个碱基的核苷酸序列可以有效地与目标核酸杂交(美国专利6,013,456)。不依赖于引物的连接可以用长度为至少6到8个碱基的寡核苷酸来完成(Kaczorowski和Szybalski，Gene 179：189-193，1996；Kotler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4241-45，1993)。将与核酸模板杂交的寡核苷酸已编码探针130、230、340、400连接起来的方法在本领域中是已知的(美国专利6,013,456)。相邻的寡核苷酸已编码探针130、230、340、400的酶促连接可以利用DNA连接酶，例如T4、T7或Taq连接酶或大肠杆菌DNA连接酶。酶促连接的方法是已知的(例如，Sambrook等人，1989)。
分子的固定化
在本发明的各种实施方案中，要被分析的目标分子可以在已编码探针130、230、340、400结合之前、之后和/或期间被固定化。例如，目标分子的固定化可用来促进已结合的已编码探针130、230、340、400与未结合的已编码探针130、230、340、400的分离。在某些实施方案中，目标分子的固定化也可在已编码探针130、230、340、400被检测和/或鉴别之前，用来将已结合的已编码探针130、230、340、400与目标分子分离。虽然下面的讨论是针对核酸的固定，但是技术人员应了解到，固定各种类型的生物分子的方法在本领域是已知的，它们可以用于所要求保护的方法中。
核酸固定化可以用来，例如，促进目标核酸与连接的已编码探针130、230、340、400的分离、与未杂交的已编码探针130、230、340、400的分离，或与彼此杂交的已编码探针130、230、340、400的分离。在非限制性的实例中，目标核酸可以被固定，并允许与已编码探针130、230、340、400杂交，之后，已杂交的相邻的已编码探针130、230、340、400被连接在一起。含有已结合的核酸的混合物被轻轻清洗，以除去未杂交的已编码探针130、230、340、400和杂交到其它已编码探针130、230、340、400上的已编码探针130、230、340、400。在清洗之后，已杂交且已连接的已编码探针130、230、340、400可以通过加热到大约摄氏90到95度数分钟，使之与固定化的目标核酸分离。所述的已连接的已编码探针130、230、340、400可以粘附至一个表面100、220、300上，并利用分子梳来排列对准，如同上文中所揭示。经排列对准的已编码探针130、230、340、400接着可以用SPM来分析。
核酸的固定可以利用本领域已知的各种方法来达成。在本发明的一个示范性的实施方案中，固定化可以通过将基质以链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆，接着粘附生物素标记核酸来实现(Holmstrom等人，Anal.Biochem.209：278-283，1993)。固定化也可以通过在硅、玻璃或其它基质上包覆聚-L-Lys(赖氨酸)，接着用双功能交联试剂共价联结氨基修饰或巯基修饰的核酸来实现(Running等人，BioTechniques 8：276-277，1990；Newton等人，Nucleic Acids Res.21：1155-62，1993)。胺类残基可以通过应用氨基硅烷而被导入到基质上，以便交联。
固定可以通过5′-磷酸化核酸与经化学修饰的基质之间的直接共价连接而发生(Rasmussen等人，Anal.Biochem.198：138-142，1991)。在核酸与基质之间的共价键通过水溶性碳二亚胺或其它交联剂的缩合来形成。该方法方便了核酸主要经由其5′-磷酸的5′-连接。示范性的修饰基质包含已经在酸液中处理过的玻璃载片或覆盖滑片，其在玻璃上暴露出SiOH基团(美国专利5,840,862)。
通常，首先硅烷化玻璃基质，然后用碳二亚胺或戊二醛活化，这样DNA被结合到玻璃上。另外的程序可以使用诸如3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GOP)、乙烯基硅烷或氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)的试剂和在分子的3′或5′末端连接有整合的氨基连接子的DNA。DNA可以使用紫外辐射直接结合到薄膜基质。其它的核酸固定技术的非限制性的例子公开在美国专利5,610,287、5,776,674和6,225,068。商业上可获得的用于核酸结合的基质是可利用的，例如Covalink、Costar、Estapor、Bangs和Dynal。技术人员应了解到，在此所公开的方法并不受限于核酸的固定，它们也可能用于，例如，将寡核苷酸已编码探针130、230、340、400的一端或两端粘附至基质。
用以固定核酸或其它目标分子的基质的类型是没有限制的。在本发明的各种实施方案中，固定基质可以是磁珠、非磁性珠、平面基质或可由几乎任何材料构成的具有任何其它形态的固体基质。可以使用的基质的非限制性的例子包含玻璃、硅石、硅酸盐、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、用银或其它金属涂覆的基质、硝酸纤维素、尼龙、活化石英、活化玻璃、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、其它的诸如聚氯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯的聚合物，以及光敏聚合物，其含有光活性物质，例如能够与核酸分子形成共价连接的氮宾、卡宾、羰自由基(参见美国专利5,405,766和5,986,076)。
双功能交联剂可以在本发明的各种实施方案中应用。双功能交联剂能够根据它们的功能基团的特异性来划分，例如氨基、胍基、吲哚、或羧基特异性基团。在这些之中，针对自由氨基基团的试剂是较为普遍应用的，因为它们可从商业途径获得、容易合成，并且它们被加以应用时的反应条件温和。交联分子的示范性方法被公开在美国专利5,603,872和5,401,511。交联试剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)，以及碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。
扫描探针显微镜术
扫描探针显微镜术(SPM)是在微米和/或纳米尺度上量测物体的物理性质的一系列仪器。SPM技术的不同形式是可利用的，这在下文会更详细讨论。任何形式的SPM分析都可以用来检测和/或鉴别已编码探针130、230、340、400。一般来说，SPM仪器是使用非常小的、点式的探针在非常靠近表面100、220、300的区域测量物体的性质。在一些类型的SPM仪器中，探针可以安装在悬臂上，该悬臂可以长约数百微米，厚度大约0.5到5.0微米。典型地，探针尖端是在xy模式下越过表面100、220、300进行光栅扫描，以描绘表面100、220、300性质的局部变化。应用SPM来描绘生物分子和/或检测用作纳米条形码420的分子的方法在本领域是已知的(例如1996年Wang等人，Amer.Chem.Soc.Lett.，12：1697-98；1998年Kim等人，Appl.Surface Sci.130，230，340-132：602-609；2000年Kobayashi等人，Appl.Surface Sci.157：228-32；2000年Hirahara等人，Phy.Rev.Lett.85：5384-87；2001年Klein等人，Applied Phys.Lett.78：2396-98；2001年Huang等人，Science 291：603-33；2001年Ando等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA12468-72)。
扫描穿隧显微镜术(STM)
扫描穿隧显微镜术在20世纪80年代初发展出来的第一种SPM技术。STM依赖于在探针尖端与样品表面100、220、300间量子机械电子穿隧的存在。该尖端被锐化成单个原子点，在表面100、220、300进行光栅扫描，扫描时维持探针-表面100、220、300的间隔距离为几个埃而又不实际接触到表面100、220、300。微小的电势差(在微伏到几伏这个级别)被施加于在探针尖端与样品之间，在尖端与样品间的穿隧电流便可以被测量到。当尖端扫描过表面100、220、300时，样品的电子性质和拓扑性质的差异会造成穿隧电流大小的变化。在本发明的某些实施方案中，尖端的相对高度可以通过具有回馈控制且与计算机相连接的压电组件来控制。计算机可以实时监控电流强度，上下移动尖端以维持相对固定的电流。在不同的实施方案中，尖端的高度和/或电流强度可以利用计算机来处理，从而得到被扫描的表面100、220、300的图像。
因为STM测量样品的电子性质和拓扑性质，所以它能够分辨不同类型的传导材料，例如在金属条形码中的不同类型金属。STM也能够测量局部电子密度。因为穿隧传导性与局部能态密度(DOS)成正比，所以STM也可用以区分碳纳米管，所述碳纳米管的电性质依其直径和长度而发生变化。STM可用以侦测及/或鉴别任何不同于它们电子性质之纳米条形码420。
STM探针的尖端可以扫描含有已排列对准的已编码探针130、230、340、400的表面100、220、300，从而检测和鉴别在该表面100、220、300上的各个已编码探针130、230、340、400。连接的已编码探针130、230、340、400也可以被鉴别。目标分子可以通过确定哪些已编码探针130、230、340、400结合到目标分子上来加以鉴别。在本发明的一些实施方案中，已编码探针130、230、340、400表示特定序列(例如寡核苷酸序列)的存在，那么生物分子的序列就可以从结合于目标分子的已编码探针130、230、340、400的序列来确定。
原子力显微镜术
另一种形式的SPM是原子力显微镜术(AFM)。利用AFM进行生物分子分析的方法在本领域中是广为人知的(例如，Uchihashi等人，“Application of Noncontact-Mode Atomic Force Microscopy toMolecular Imaging”，http：//www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)。在AFM显微镜术中，探针是附着在载有弹簧的或弹性的悬臂上，该悬臂与待分析的表面100、220、300相接触。接触时的距离是在分子力范围之内(即在范德华力的作用范围内)。在AFM中，不同模式的操作都是可能应用的，包含接触模式、非接触模式和TappingModeTM。
在接触模式中，探针尖端与样品表面100、220、300之间的原子力被测量，其中保持尖端-样品的距离不变，测量悬臂的偏移，这通常是利用将激光从悬臂反射到位置灵敏的检测器。悬臂的偏移造成被反射的激光束的位置变化。与在STM中的情形一样，探针尖端的高度可以由计算机控制，其中使用具有回馈控制的压电组件。在本发明的一些实施方案中，通过升起或降低探针尖端来维持相对固定角度的偏移。由于探针尖端与样品可以有实际的(范德华)接触，所以接触模式的AFM往往会使非刚硬的样品变形。在非接触模式中，尖端被维持在样品表面100、220、300之上约50到150埃之间，并且该尖端会振荡。在尖端与样品表面100、220、300之间的范德华相互作用就反映在该尖端振荡的相位、振幅或频率的变化。非接触模式所达到的分辨率相对较低。
在TappingModeTM中，悬臂梁应用压电组件，在其共振频率或接近其共振频率处振荡。AFM尖端周期性地接触(拍打)样品表面100、220、300，其频率约为在空气中每秒50,000到500,000个循环，而在液体中频率要低些。当尖端开始接触样品表面100、220、300时，振荡的振幅会降低。振幅的变化被用来确定样品的拓扑性质。因为AFM分析并非取决于电子传导，所以它可以用来分析非传导材料的拓扑性质。拓扑性质具有差异的某些类型的纳米条形码420，包含但不限于碳纳米管、富勒烯及纳米颗粒，都可以利用AFM技术来检测和/或鉴别。
在别的AFM模式中，除了样品的拓扑描述之外，还可以获得额外的信息。例如，在横向力显微镜术(LFM)中，探针是以垂直于其长度的方向扫描，悬臂的扭力的角度被确定。悬臂扭力取决于表面100、220、300的摩擦特性。因为已编码探针130、230、340、400的摩擦特性可以依其组成而发生变化，所以LFM可用以检测和鉴别不同的已编码探针130、230、340、400。
另一种变化是化学力显微镜术(CFM)，其中探针尖端用化学物质功能化，扫描样品时检测在该化学物质与该样品之间的粘附力(例如，1994年，Frisbie等人，Science，265：2071-2074)。对纳米条形码420材料具有不同亲和性的化学物(例如金或银)可以被整入到AFM探针尖端中，它扫描表面100、220、300以检测和鉴别纳米条形码420。其它可能使用的SPM模式是力调变成像(1991年，Maivald等人，Nanotechnology，2：103)。Uchihashi等人公开了一种在非接触模式AFM中使用频率调变进行生物分子成像的方法(http：//www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)。
其它可能用以检测和/或鉴别已编码探针130、230、340、400的SPM模式包括磁力显微镜术(MFM)、高频MFM、磁阻敏感映像(magnetoresistive sensitivity mapping，MSM)、电子力显微镜术(EFM)、扫描电容显微镜术(SCM)、扫描延伸电阻显微镜术(SSRM)、穿隧AFM和传导AFM。在这些形式中的某一些，样品的磁性质可以被确定。本领域技术人员应了解，金属条形码和其它类型的纳米条形码420可以被设计成能够利用其磁性及电性质来鉴别。
供已编码探针130、230、340、400检测和/或鉴别使用的SPM仪器可以在商业上获得(例如Veeco Instruments，Inc.，Plainview，NY；Digitali Instruments，Oakland，CA)。或者，可以使用为客户定制的SPM仪器。
信息处理和控制系统及数据分析
在本发明的某些实施方案中，用于生物分子分析的系统可以包含信息处理及控制系统。实施方案并不限制所使用的信息处理系统的类型。这样的系统可以用来分析由SPM仪器获得的数据，和/或用来控制SPM探针尖端的移动、所使用的SPM成像的形式以及获得SPM数据的精确技术。示范性的信息处理系统可以包含计算机，该计算机含有用于数据通讯的总线和用于处理信息的处理器。在一个实施方案中，处理器是奔腾(Pentium)系列的处理器，包括但不限于奔腾II系列、奔腾III系列及奔腾4系列的处理器，这些可以从英特尔公司(SantaClara，CA)获得。在本发明的另外的实施方案中，处理器可以是Celeron、Itanium、X-Scale或奔腾Xeon处理器(英特尔公司，SantaClara，CA)。在本发明的各种其它的实施方案中，处理器可以是基于英特尔(Intel)构架，例如英特尔IA-32或英特尔IA-64构架。或者，也可以使用其它处理器。
计算机可以进一步包含随机存储器(RAM)或其它的动态储存装置、只读存储器(ROM)或其它的静态储存和数据储存装置，例如磁盘或光盘及其对应的驱动。信息处理系统还可以包含其它在本领域已知的外围设备，例如显示设备(例如阴极射线管或液晶显示器)、字母数字输入设备(例如键盘)、光标控制设备(例如鼠标、跟踪球或光标方向键)及通讯设备(例如调制解调器、网络连接卡、或用来连接到以太网、令牌网或其它类型的网络的接口设备)。
在本发明的特定实施方案中，SPM(扫描探针显微镜术)单元可以连接到该数据处理系统。来自SPM的数据可以用该处理器和储存在主存储器中的数据来处理。处理器可以分析来自SPM的数据以鉴别和/或确定附着于表面100、220、300的已编码探针130、230、340、400的序列。通过将连接的已编码探针130、230、340、400的序列重叠在一起，计算机可以编辑出目标核酸的序列。或者，基于附着于表面100、220、300的已编码探针130、230、340、400的身份，计算机可以鉴别出存在于样品中的不同的已知生物分子物质。
应该了解，配置不同的信息处理系统可以供某些特定执行使用。因此，系统的配置可以在本发明的不同实施方案中有所变化。在本发明的另外的实施方案中，在此描述的处理过程可以在程序控制的处理器的控制下执行，此时处理器可以完全或部分地通过任何可编程逻辑或硬编码逻辑，例如，现场可编程序门阵列(FPGA)、TTL逻辑或特定用途集成电路(ASIC)，来加以执行。另外，所公开的方法可以通过程控的通用计算机组件和/或定制的硬件组件的任何组合来加以实施。
在本发明的某些实施方案中，可以应用为客户设计的软件包来分析从SPM获得的数据。在本发明另外的实施方案中，数据分析可以使用信息处理系统和可公开获得的软件包来执行。可以获得的用于DNA序列分析的软件的非限制性的例子包括PRISMTM DNA测序分析软件(Applied Biosystem，Foster City，CA)、SequencherTM软件包(GeneCodes，Ann Arbor，MI)，和可以通过访问National BiotechnologyInformation Facility，网址 www.nbif.org/links/1.4.1.php获得的各种软件包。
                       实施例
实施例1：纳米条形码和扫描探针显微镜术
本发明的示范性的实施方案描述于图1到图4。图1A和图1B说明了一种用以在表面100、220、300上排列对准已编码探针130、230、340、400的非限制性的方法。表面100、220、300，例如已经利用已知的方法以链霉抗生物素蛋白包覆的玻璃显微镜载片100、220、300，被浸入到含有生物素标记已编码探针130、230、340、400的溶液110、210中。该溶液可以存放在容器120内。
在非限制性的实例中，已编码探针130、230、340、400包括寡核苷酸探针410，所述探针已经被杂交到目标核酸分子上。核酸分子可以通过粘附到尼龙膜、96孔微量滴定板或其它固定基质上来固定。包含例如所有4096种可能的六聚体序列的生物素化寡核苷酸可以从商业来源获得(例如Midland Certified Reagents，Midland，TX)。生物素化寡核苷酸可以粘附至例如亚微米金属条形码(2001年，Nicewarner-Pena等人)，从而形成已编码探针130、230、340、400。所述的已编码探针130、230、340、400被允许与目标核酸发生杂交。杂交之后，相邻的已编码探针130、230、340、400使用连接酶连接在一起。未杂交的已编码探针130、230、340、400以及彼此互相杂交的已编码探针130、230、340、400通过轻轻的清洗来去除，只留下杂交到核酸上的已编码探针130、230、340、400。所述的已编码探针130、230、340、400通过加热溶液110、210到95℃达5分钟来分开。粘附在固定基质上的核酸被移走，只留下连接的已编码探针130、230、340、400在溶液110、210中。
生物素标记的已编码探针130、230、340、400在其一末端粘附到链霉抗生物素蛋白包覆的表面100、220、300。该表面100、220、300缓慢地从溶液110、210中移出。或者，溶液110、210中的液体缓慢地从容器120中移走，例如通过蒸发或缓慢的抽吸。当空气-水界面的弯月面缓慢地移过该表面100、220、300时，已粘附的已编码探针130、230、340、400便排列对准于该表面100、220、300上。被排列的已编码探针130、230、340、400可以利用AFM、STM或其它扫描探针方法来分析。
本发明的另一个示范性的实施方案说明于图2中。一滴含有已编码探针130、230、340、400的溶液210被放置在表面100、220、300上，例如玻璃载片上。在某些实施方案中，载片100、220、300可以如上所公开地进行处理，以结合已编码探针130、230、340、400的一端或两端。液滴210被夹在表面100、220、300与玻璃覆盖滑片200之间。在各种实施方案中，覆盖滑片200可以保持在固定的位置，此时表面100、220、300慢慢地抽离该覆盖滑片200。这就在覆盖滑片200的边缘处产生了弯月面，它可以用来排列比对已编码探针130、230、340、400。
在本发明的各种实施方案中，已编码探针130、230、340、400可以在其两端而非一端粘附到表面100、220、300上。在这种情况中，已编码探针130、230、340、400的排列会造成U形的分子，而非线性的分子(例如美国专利5,840,862)。图1和图2所说明的示范性实施方案也可以通过将已编码探针130、230、340、400的两端粘附到表面100、220、300来执行(未显示)。
在另一种示范性实施方案中，如在图3中所说明的，已编码探针130、230、340、400可以藉由自由流动电泳排列在表面100、220、300。该表面可以含有传导材料和非传导材料相交替的带状物，例如金属膜310涂布在玻璃片320上。在存在交流电场330的情况下，含有带电残基例如寡核苷酸上的磷酸基团的已编码探针130、230、340、400将随电场330排列。自由流动电泳可以和分子梳结合使用，或者替代分子梳使用，以排列已编码探针130、230、340、400于表面100、220、300上。执行自由流动电泳的方法是已知的(例如，Adjari和Prost，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：4468-71，1991)。然而，本申请第一次提出将自由流动电泳用以在表面上排列分子的应用。
所有在此公开的和要求保护的方法、组合物和装置都可以根据这里的公开内容来制作和使用，而不需要非预期的实验。对于本领域技术人员应了解的是，变化可以在不悖离所要求保护的主题的构思、精神和范围的情况下，应用于在此所公开的方法、组合物及装置。更特别地，应了解，某些相关的试剂可以替代在此描述的试剂，而且能够获得相同或类似的结果。所有这些对于本领域技术人员来说是很明显的类似替代和修饰都被视为落入所要求保护的主题的精神、范围和构思之内。

Claims (27)

1.一种方法，包括：
a)获得一个或多个已编码探针，每个已编码探针包含附着有至少一个纳米条形码的探针分子；
b)将目标分子与已编码探针接触；
c)鉴别结合到目标分子上的已编码探针；和
d)检测和/或鉴别该目标分子。
2.如权利要求1的方法，其中每个已编码探针包括寡核苷酸。
3.如权利要求2的方法，其中所述目标分子是核酸。
4.如权利要求3的方法，其中将已编码探针的文库与目标分子接触，所述已编码探针的文库含有具有特定长度的寡核苷酸的所有可能序列。
5.如权利要求1的方法，其中所述纳米条形码选自碳纳米管、富勒烯、亚微米金属条形码、纳米颗粒和量子点。
6.如权利要求3的方法，其中所述核酸粘附于表面上。
7.如权利要求6的方法，进一步包括将已杂交到核酸上的相邻的已编码探针连接起来。
8.如权利要求7的方法，进一步包括将连接起来的已编码探针与核酸和非连接的已编码探针分离。
9.如权利要求1的方法，进一步包括通过分子梳将已编码探针排列在表面上。
10.如权利要求1的方法，其中已编码探针是利用扫描探针显微镜术来鉴别。
11.如权利要求10的方法，其中所述扫描探针显微镜术是选自原子力显微镜术、扫描穿隧显微镜术、横向力显微镜术、化学力显微镜术、力调变成像术、磁力显微镜术、高频磁力显微镜术、磁阻敏感映像、电子力显微镜术、扫描电容显微镜术、扫描延伸电阻显微镜术、穿隧原子力显微镜术和传导原子力显微镜术。
12.如权利要求9的方法，其中被排列在表面上的已编码探针是利用扫描探针显微镜术来鉴别。
13.如权利要求12的方法，进一步包括确定结合到核酸的寡核苷酸的序列。
14.如权利要求13的方法，进一步包括由结合到核酸的寡核苷酸的序列，确定出核酸的序列。
15.如权利要求3的方法，进一步包括由结合到核酸的已编码探针来鉴别该核酸。
16.如权利要求1的方法，其中所述目标分子是蛋白、肽、糖蛋白、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、脂质、糖脂或多糖。
17.如权利要求16的方法，其中两个或更多个目标分子存在于样品中，在该样品中的所有目标分子同时被分析。
18.如权利要求16的方法，其中两个或更多个目标分子存在于样品中，所有相同类型的目标分子同时被分析。
19.一种组合物，其包含至少一个已编码探针，每个已编码探针包含附着于至少一个纳米条形码的探针分子。
20.如权利要求19的组合物，其中所述探针分子是选自寡核苷酸、多核苷酸、核酸、抗体、抗体片段、基因工程抗体、单链抗体、人源化抗体、结合蛋白、受体蛋白、传运蛋白、转录因子、肽、凝集素、底物、抑制剂、活化剂、配体、激素、细胞因子、趋化因子、药物和药剂。
21.如权利要求19的组合物，其中所述探针分子是寡核苷酸。
22.如权利要求21的组合物，其中所述寡核苷酸的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基。
23.如权利要求19的组合物，其中所述纳米条形码是选自碳纳米管、富勒烯、亚微米金属条形码、纳米颗粒和量子点。
24.用于核酸测序的系统，包含：
a)扫描探针显微镜；
b)表面；和
c)至少一个附着于该表面的已编码探针。
25.如权利要求24的系统，其中所述已编码探针通过分子梳排列在表面上。
26.如权利要求24的系统，其中所述已编码探针包括连接在一起的寡核苷酸。
27.如权利要求24的系统，其中所述扫描探针显微镜为原子力显微镜或扫描穿隧显微镜。
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