JP2006500026A - 走査型プローブ顕微鏡検査(spm)読取用の特定の情報をエンコードするナノバーコードの制御された整列 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の方法、組成物および装置は、分子生物学および生体分子の分析の分野に関し、核酸、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない。特に、本発明は、ナノバーコードおよび走査型プローブ顕微鏡検査(SPM)を使用して、核酸および/または他の生体分子を検出、同定および/または配列決定するための方法、組成物および装置に関する。
生体分子、例えば核酸またはタンパク質の同定および/または配列決定は、医療診断、法医学、毒物学、病理学、細菌戦争、公衆衛生および多数の他の分野で必須である。現在、多大な研究が核酸またはタンパク質の同定および/または配列決定に向けられているが、他の生体分子、例えば炭水化物、多糖類、脂質、脂肪酸等も重要でありうる。本明細書に開示される方法、組成物および装置は、核酸の同定および/または配列決定に限定されず、タンパク質、脂質および多糖類を含むが、それらに限定されない他の種類の生体分子の分析にも使用される。
開示された方法、組成物および装置は、生体分子、例えば核酸を検出、同定および/または配列決定するために使用するものである。本発明の特定の態様において、方法、組成物および装置は、1,000を超えるか、2,000を超えるか、5,000を超えるか、10,000を超えるか、20,000を超えるか、50,000を超えるか、100,000を超えるか、またはそれさえも超える長さの塩基の非常に長い核酸分子の配列を得るために適切である。利点として、1回のシーケンスランで長い核酸配列を読み取る能力があること、配列データを高速で得ること、低コストで配列決定すること、および配列データの1ユニット当たりに必要な操作時間の量の点から効率が高いことが挙げられる。他の利点として、偽陽性結果の発生率が低く、高感度で正確な核酸の検出および/または同定が挙げられる。
本願で使用される「1つの」(aまたはan)は、アイテムの1つ以上を意味してもよい。
本発明の様々な態様において、ナノバーコード420、コード化プローブ130、230、340、400、および/またはコード化プローブ130、230、340、400に結合されたターゲット分子は、表面100、220、300に接着してもよく、分析のために整列されてもよい。いくつかの態様において、コード化プローブ130、230、340、400は表面に整列されてもよく、下記に検討されるように組み込まれたナノバーコード420が検出されてもよい。代替の態様において、ナノバーコード420は、プローブ分子410から取り外されてもよく、表面に整列され、検出されてもよい。一定の態様において、個別のターゲット分子に結合されたコード化プローブ130、230、340、400の順番は保持されてもよく、例えば、走査型プローブ顕微鏡検査によって検出されてもよい。他の態様において、ターゲット分子の複数のコピーが試料中に存在してもよく、ターゲット分子の同定および/または配列は、複数のコピーに結合するコード化プローブ130、230、340、400のすべての配列を重なり合っているターゲット分子配列内に集合させることによって、決定されてもよい。例えば、重なり合っている部分的な核酸またはタンパク質の配列を隣接する配列内に集合させることは、当技術分野においては公知である。様々な態様において、ナノバーコード420は、プローブ分子410に接着している間に検出されてもよく、または検出される前にプローブ分子410から取り外されてもよい。
検出、同定および/または配列決定されるべき核酸分子は、当技術分野において公知のいかなる技術によって調製されてもよい。本発明の一定の態様において、核酸は、自然発生的なDNAまたはRNA分子である。事実上いかなる自然発生的な核酸が、開示された方法によって、検出、同定および/または配列決定されてもよく、例えば、染色体DNA、ミトコンドリアDNA、および葉緑体DNA、ならびに、リボソームRNA、トランスファーRNA、ヘテロ核RNA、およびメッセンジャーRNAを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、分析されるべき核酸は、天然のホモジェネート、または細胞、組織または器官の抽出物に存在してもよい。他の態様において、核酸は、分析前に部分的にまたは完全に精製されてもよい。代替の態様において、分析されるべき核酸分子は、化学合成によって、または当技術分野において公知の広く様々な核酸増幅、複製および/または合成方法によって、調製されてもよい。
本発明の一定の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、プローブ分子410のライブラリを含んでもよく、各異なるプローブ410は、弁別可能なナノバーコード420に接着している。所与のライブラリ内で、特異的なプローブ分子410の2つ以上のコピーがあることが可能である。この場合、同一プローブ410の各コピーは、同一のナノバーコード420に接着する。使用されるプローブ410およびナノバーコード420の種類は限定されず、オリゴヌクレオチド、核酸、抗体、抗体フラグメント、結合タンパク質、レセプタタンパク質、ペプチド、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、サイトカイン等を含むが、それらに限定されないいかなる種類の公知のプローブ分子410が使用されてもよい。さらに、いずれの種類の弁別可能なナノバーコード420が使用されてもよい。
本発明の様々な態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、オリゴヌクレオチドプローブ410、例えば、規定された配列のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチド410は、弁別可能なナノバーコード420に接着してもよく、分析されるべき核酸、および一緒にライゲートされた隣接するコード化プローブ130、230、340、400に、ハイブリッド形成されてもよい。核酸から分離した後に、ライゲートされたコード化プローブ130、230、340、400は、上記に検討されたように、表面100、220、300に接着し、整列されてもよい。整列したコード化プローブ130、230、340、400は、次いで、走査型プローブ顕微鏡検査(SPM)によって分析されてもよい。SPM分析は、コード化プローブ130、230、340、400のナノバーコード420の検出および同定を可能にし、且つ、核酸に結合するコード化プローブ130、230、340、400の配列の決定を可能にする。その情報を使用して、核酸を同定および/または核酸配列を決定することができる。特許請求された主題は、SPM検出方法に限定されず、表面100、220、300に整列されたナノバーコード420および/またはコード化プローブ130、230、340、400を検出し、同定することができるいかなる分析方法を使用してもよいことを、当業者は完全に理解する。また、SPM分析は、オリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブ130、230、340、400の検出および同定に限定されず、いかなる種類のコード化プローブ130、230、340、400および/またはナノバーコード420で使用されてもよいことをも、当業者は完全に理解する。
各コード化プローブ130、230、340、400は、少なくとも1つの共有的または非共有的に結合したナノバーコード420を組み込んでもよい。ナノバーコード420を使用して、個別のコード化プローブ130、230、340、400を検出および/または同定してもよい。本発明の一定の態様において、各コード化プローブ130、230、340、400は、2つ以上の接着したナノバーコード420を有してもよく、その組み合わせは、特定のコード化プローブ130、230、340、400に独特である。ナノバーコード420の組み合わせを使用して、ライブラリ内のコード化プローブ130、230、340、400を特異的に同定するために利用することができる弁別可能なナノバーコード420の数を拡大することができる。本発明の他の態様において、コード化プローブ130、230、340、400は、各々が、接着した単一の独特のナノバーコード420を有してもよい。唯一必要なことは、各コード化プローブ130、230、340、400から検出された信号が、そのコード化プローブ130、230、340、400を異なるコード化プローブ130、230、340、400から弁別可能に同定することができなければならないということである。
ナノバーコード420として使用される可能性のあるマイクロメートル以下の金属バーコードの例は、当技術分野においては公知である(例えば、Nicewarner-Penaら、Science 294: 137-141, 2001)。Nicewarner-Penaら(2001)は、異なる種類の金属から構成されたマイクロメートル以下のストライプでエンコードされたマルチメタルマイクロロッドを調製する方法を開示している。このシステムによって、非常に大きな数、2種類の金属を使用した場合で4160まで、3種類の異なる金属を使用した場合で8×105までの弁別可能なナノバーコード420を作ることが可能である。そのようなナノバーコード420は、コード化プローブ130、230、340、400内に組み込まれてもよく、SPM技術によって読み取られてもよい。金属粒子、例えば金または銀をオリゴヌクレオチドおよび他の種類のプローブ分子410へ接着する方法は、当技術分野においては公知である(例えば、米国特許第5,472,881号を参照されたい)。
開示された方法に使用されるナノバーコード420の別の例として、単層カーボンナノチューブ(SWNT)が挙げられる。ナノチューブは、SPM方法によって弁別されてもよい様々な形状およびサイズに作られてもよい(例えば、Freitagら、Phys. Rev. B 62: R2307-R2310, 2000; Claussら、Europhys. Lett. 47: 601-607, 1999; Claussら、Phys. Rev. B. 58: R4266-4269, 1998; Odomら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 960: 203-215, 2002を参照されたい)。Odomら(2002)は、サイズが10nm以下のSWNTのトンネルスペクトルにおける別々のピークを検出することができるSTM(走査型トンネル顕微鏡)技術を開示している。そのようなピークは、カーボンナノチューブの電子状態密度(DOS)におけるバンホーブ特異点を表してもよい。
ΔE=hvF/2L (式 1)
ただし、hはプランク定数であり、vFはフェルミ速度(8.1×105m/秒)である(Venemaら、「Imaging Electron Wave Functions of Carbon Nanotubes」、Los Alamos Physics Preprints: cond-mat/9811317, 23 Nov. 1996)。電子エネルギーレベルの間の差は、ナノチューブの長さに反比例し、より長いチューブではより微細な分割が観察される。
Egap=2y0acc/d (式 2)
本発明の代替の態様において、フラーレンが、ナノバーコード420として使用されてもよい。フラーレンを作る方法は周知である(例えば、米国特許第6,358,375号)。フラーレンは、カーボンナノチューブ用に上記に開示されたものに類似した方法によって、誘導体化し、プローブ分子410に接着してもよい。フラーレン含有コード化プローブ130、230、340、400は、ナノチューブ用に上記に開示されたものに類似したSPM技術によって同定されてもよい。
本発明の様々な態様において、ターゲット核酸のオリゴヌクレオチドに基づくコード化プローブ130、230、340、400ライブラリへのハイブリッド形成は、完全に相補的な核酸配列の間にしかハイブリッド形成を可能にしない厳しい状況下で発生してもよい。厳重さの低いハイブリッド形成は一般に、20℃から50℃までの温度範囲で0.15Mから0.9MのNaClで実施される。厳重さの高いハイブリッド形成は一般に、50℃から70℃までの温度範囲で0.02Mから0.15MのNaClで実施される。適切な厳重さの温度および/またはイオン強度は、部分的には、オリゴヌクレオチドプローブ410の長さ、ターゲット配列の塩基含有量、およびホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたはハイブリッド形成混合物内の他の溶媒の存在、によって決定されることが理解される。上述の範囲は模範的なものであり、特定のハイブリッド形成反応のための適切な厳重さは、正および/または負の対照と比較することによって、経験的に決定されることが多い。当業者は、日常的にハイブリッド形成状態を調整することができ、正確に相補的な核酸配列の間にしか厳重なハイブリッド形成が発生しないことを可能にする。
本発明の様々な態様において、分析されるべきターゲット分子は、コード化プローブ130、230、340、400結合の前、後および/またはその最中に、固定化されてもよい。例えば、ターゲット分子の固定化を使用して、結合されたコード化プローブ130、230、340、400を、結合されていないコード化プローブ130、230、340、400から、分離するのを容易にしてもよい。一定の態様において、ターゲット分子の固定化を使用して、コード化プローブ130、230、340、400の検出および/または同定の前に、結合されたコード化プローブ130、230、340、400を、ターゲット分子から分離してもよい。下記の検討は核酸の固定化に関するが、様々な種類の生体分子を固定化する方法が当技術分野においては公知であり、特許請求された方法に使用されてもよいことを当業者は完全に理解する。
走査型プローブ顕微鏡(SPM)は、マイクロメートルおよび/またはナノメートルの尺度で、物体の物理的特性を測定するために使用される器具の種類である。SPM技術の異なる様相が利用可能であり、下記においてより詳細に検討する。SPM分析のいずれかの様相は、コード化プローブ130、230、340、400検出および/または同定のために使用してもよい。一般に、SPM器具は、物体の特性を測定するために、表面100、220、300の非常に近くに、非常に小さな先の尖ったプローブを使用する。いくつかの種類のSPM器具において、プローブは、長さ数百ミクロンおよび厚さ約0.5〜5.0ミクロンであってもよいカンチレバーに装着されてもよい。典型的に、プローブ先端は、表面100、220、300特性の局所変動をマッピングするために、xyパターンで表面100、220、300上をラスター走査される。生体分子をイメージングしたり、ナノバーコード420として使用される分子を検出したりするために使用されるSPM方法は、当技術分野においては公知である(例えば、Wangら、Amer. Chem. Soc. Lett., 12: 1697-98. 1996; Kimら、Appl. Surface Sci. 130, 230, 340-132: 602-609, 1998; Kobayashiら、Appl. Surface Sci. 157: 228-32, 2000; Hiraharaら、Phys. Rev. Lett. 85: 5384-87, 2000; Kleinら、Applied Phys. Lett. 78: 2396-98, 2001; Huangら、Science 291: 630-33, 2001; Andoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12468-72, 2001)。
走査型トンネル顕微鏡検査は、1980年代初期に開発された最初のSPM技術であった。STMは、プローブ先端と表面100、220、300との間に量子力学的電子トンネルが存在することに依存する。先端は単一原子点へと鋭利化され、表面100、220、300上でラスター走査され、表面100、220、300に実際に接触せずに数オングストロームのプローブ−表面100、220、300ギャップ距離を維持する。小さな電圧差(ミリボルトから数ボルトのオーダで)が、プローブ先端と試料との間に加えられ、先端と試料との間のトンネル電流が測定される。先端が表面100、220、300を走査するため、試料の電気特性および位相的性質の差が、トンネル電流の量に変動を生じさせる。本発明の一定の態様において、先端の相対高さは、コンピュータとのインタフェースを有し、フィードバック制御を備えた圧電要素によって制御されてもよい。コンピュータは、電流強度をリアルタイムでモニタすることができ、先端を上または下に動かし、比較的一定の電流を維持する。異なる態様において、先端の高さおよび/または電流強度は、走査された表面100、220、300の画像を展開するためにコンピュータによって処理されてもよい。
SPMの別の様相は、原子間力顕微鏡検査(AFM)である。AFMによる生体分子分析の方法は、一般に当技術分野において公知である(例えば、Uchihashiら、「非接触モード原子間力顕微鏡検査の分子イメージングへの適用(Application of Noncontact-Mode Atomic Force Microscopy to Molecular Imaging)」、http://www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)。AFM顕微鏡検査において、プローブは、分析されるべき表面100、220、300に接触するバネ荷重のまたは可撓性のあるカンチレバーに接着する。接触は、分子力範囲内で起こる(すなわち、ファンデルワールス力の相互作用の範囲内)。AFM内で、異なるモードの作用が可能であり、接触モード、非接触モードおよびタッピングモード(TappingMode)(商標)を含む。
本発明の一定の態様において、生体分子分析用のシステムは、情報処理および制御システムを具備してもよい。態様は、使用される情報処理システムの種類に限定されない。そのようなシステムを使用して、SPM器具から得られた情報を分析したり、SPMプローブ先端の運動、使用されるSPMイメージングの様相、およびSPMデータが得られる正確な技術を制御したりしてもよい。模範的な情報処理システムは、情報を通信するためのバスおよび情報を処理するためのプロセッサを具備するコンピュータを組み込んでもよい。1つの態様において、プロセッサは、プロセッサのPentium(登録商標)シリーズより選択され、Intel Corp.(Santa Clara、CA)が販売するプロセッサのPentiumII(登録商標)シリーズ、PentiumIII(登録商標)シリーズ、Pentium4(登録商標)シリーズを含むが、それらに限定されない。本発明の代替の態様において、プロセッサは、Celeron(登録商標)、Itanium(登録商標)、X-Scale(登録商標)またはPentium Xeon(登録商標)プロセッサ(Intel Corp., Santa Clara, CA)であってもよい。本発明の様々な他の態様において、プロセッサは、Intel(登録商標)アーキテクチャ、例えば、Intel IA-32(登録商標)またはIntel IA-64(登録商標)アーキテクチャに基づいてもよい。または他のプロセッサが使用されてもよい。
実施例1:ナノバーコードおよび走査型プローブ顕微鏡検査
本発明の模範的な態様が図1〜図4に例示されている。図1Aおよび図1Bは、表面100、220、300にコード化プローブ130、230、340、400を整列するための非限定的な方法を例示する。表面100、220、300、例えば、公知の方法によってストレプトアビジンでコートされているガラス顕微鏡スライド表面100、220、300が、ビオチン化されたコード化プローブ130、230、340、400を含有する溶液110、210に浸漬される。溶液は、容器120に含まれてもよい。
Claims (27)
- 以下の段階を含む、方法:
a)1つ以上のコード化プローブを得る段階であって、各コード化プローブが、少なくとも1つのナノバーコードに接着したプローブ分子を含む段階;
b)ターゲット分子をコード化プローブと接触させる段階;
c)ターゲット分子に結合するコード化プローブを同定する段階;ならびに
d)ターゲット分子を検出および/または同定する段階。 - 各コード化プローブが、オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
- ターゲット分子が、核酸である、請求項2記載の方法。
- 特定の長さのオリゴヌクレオチド用の可能なすべての配列を含むコード化プローブのライブラリをターゲット分子に接触させる、請求項3記載の方法。
- ナノバーコードが、カーボンナノチューブ、フラーレン、マイクロメートル以下の金属バーコード、ナノ粒子、および量子ドットからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 核酸を表面に接着させる、請求項3記載の方法。
- 核酸にハイブリダイスする隣接したコード化プローブをライゲートすることをさらに含む、請求項6記載の方法。
- ライゲートされたコード化プローブを核酸およびライゲートされていないコード化プローブから分離することをさらに含む、請求項7記載の方法。
- コード化プローブが、分子コーミングによって表面に整列することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- コード化プローブを走査型プローブ顕微鏡検査によって同定する、請求項1記載の方法。
- 走査型プローブ顕微鏡検査手法が、原子間力顕微鏡検査、走査型トンネル顕微鏡検査、水平力顕微鏡検査、化学力顕微鏡検査、フォースモジュレーションイメージング、磁気力顕微鏡検査、高周波磁気力顕微鏡検査、磁気抵抗感受性マッピング、電気力顕微鏡検査、走査型容量顕微鏡検査、走査型広がり抵抗顕微鏡検査、トンネル原子間力顕微鏡検査および導電性原子間力顕微鏡検査からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
- 表面に整列されたコード化プローブを走査型プローブ顕微鏡検査によって同定する、請求項9記載の方法。
- 核酸に結合するオリゴヌクレオチドの配列を決定することをさらに含む、請求項12記載の方法。
- 核酸に結合するオリゴヌクレオチドの配列から核酸の配列を決定することをさらに含む、請求項13記載の方法。
- 核酸に結合するコード化プローブから核酸を同定することをさらに含む、請求項3記載の方法。
- ターゲット分子が、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、脂質、糖脂質または多糖類である、請求項1記載の方法。
- 2つ以上のターゲット分子が試料中に存在し、試料中のすべてのターゲット分子を同時に分析する、請求項16記載の方法。
- 2つ以上のターゲット分子が試料中に存在し、同種類のすべてのターゲット分子を同時に分析する、請求項16記載の方法。
- 少なくとも1つのコード化プローブを含む組成物であって、各コード化プローブが少なくとも1つのナノバーコードに接着したプローブ分子を含む組成物。
- プローブ分子が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、抗体、抗体フラグメント、遺伝子操作抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、結合タンパク質、レセプタタンパク質、輸送タンパク質、転写調節因子、ペプチド、レクチン、基質、阻害物質、活性化物質、リガンド、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、医薬品および薬からなる群より選択される、請求項19記載の組成物。
- プローブ分子が、オリゴヌクレオチドである、請求項19記載の組成物。
- オリゴヌクレオチドが、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25塩基の長さを有する、請求項21記載の組成物。
- ナノバーコードが、カーボンナノチューブ、フラーレン、マイクロメートル以下の金属バーコード、ナノ粒子、および量子ドットからなる群より選択される、請求項19記載の組成物。
- 以下を含む、核酸配列決定用のシステム:
a)走査型プローブ顕微鏡;
b)表面;および
c)表面に接着した少なくとも1つのコード化プローブ。 - コード化プローブが、分子コーミングによって表面に整列されている、請求項24記載のシステム。
- コード化プローブが、ライゲートされたオリゴヌクレオチドを含む、請求項24記載のシステム。
- 走査型プローブ顕微鏡が、原子間力顕微鏡または走査型トンネル顕微鏡である、請求項24記載のシステム。
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