KR100849465B1 - Ｄｎａ 서열을 이용하는 정보 코드 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA의 염기쌍 배열을 정보의 코드 단위로 사용하는 분자 수준의 정보 코드 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 정보 코드의 단위가 되는 DNA의 디자인 및 코드화 단계, DNA 정보 코드를 무기 캡슐을 사용하여 안정화시켜 개체에 도포하는 단계, 도포된 미량 DNA 정보 코드를 채취 및 추출하고, 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 사용하여 극미량의 DNA 정보 코드를 수집하는 단계, 수집된 정보 코드를 PCR을 사용하여 증폭하고 판독하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 정보의 축적 능력이 뛰어난 DNA에 보안장치를 지정하여 보안성이 뛰어난 정보 코드 DNA를 만들고, 안정화 작업을 거쳐서 개체에 도포할 수 있는 분자 정보 코드를 만들고, 필요할 때 DNA 정보 코드만을 추출하고 수집하여 판독하는 단계를 통하여 하나의 체계적인 분자 코드 시스템을 확립할 수 있다.
DNA 정보 코드 시스템, DNA 코드화 방법, 나노하이브리드, DNA 안정화, 미량 DNA 수거 방법, 폴리피롤-마게마이트, 금속 이중층 수산화물

Description

ＤＮＡ 서열을 이용하는 정보 코드 시스템{Information code system using DNA sequences}
도 1은 본 발명의 전체적인 과정을 보여주는 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일실시태양에 사용된 DNA의 염기쌍 배열 및 3염기쌍 정보코드 대응표이다.
도 3는 본 발명의 일실시태양에서의 DNA 정보 코드의 염기쌍 배열을 나타낸 모식도이다.
도 4는 금속이중층 수산화물 및 DNA-금속이중층 수산화물 캡슐의 X-선 회절도이다.
도 5는 DNA-LDH 나노하이브리드를 DNase I 효소 처리하여 전기영동한 사진이다.
도 6a는 마게마이트 나노입자의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 6b는 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드의 투과 전자 현미경 사진이다.
도 7는 마게마이트, 폴리피롤-마게마이트 및 폴리피롤의 적외선 분광 스펙트럼이다.
도 8는 100 fM 및 500 fM DNA 용액과 폴리피롤-마게마이트에 의해 검출된 DNA를 PCR에 의해 증폭한 후 전기영동한 사진이다.
본 발명은 DNA의 염기 배열을 정보의 단위로 이용하는 분자 단위의 정보 코드 시스템에 관한 것으로, 특정 염기 서열을 포함하는 정보 코드 영역, DNA 의 증폭이나 염기 서열 판독에 필요한 양 말단의 프라이머 영역 및 상기 프라이머와 정보 코드 영역 사이에 존재하며, 상기 정보 코드 영역과 상기 프라이머 영역 사이를 1 개 뉴클레오티드 이상 분리시키는 완충 영역으로 이루어진 DNA 정보 코드에 관한 것이다.
일반적으로 코드 체계 중 가장 많이 사용되는 것이 바코드인데, 바코드란 문자나 숫자를 흑과 백의 막대 모양 기호로 조합한 것으로, 데이터를 빠르게 입력하고 판독하기 위하여 사용된다. 바코드는 세계 상품 코드 (UPC: Universal Product Code)를 따라 상품의 종류 판별, 상점의 매출정보 관리, 도서 분류, 신분 증명 등에 다양하게 이용된다. 이 외에도 지폐의 은화 (watermark) 또한 고가의 지폐의 진위 여부를 판별할 수 있도록 해 주는 일종의 코드 체계라고 볼 수 있다. 이러한 코드 체계는 정보 이론의 네 단계, 정보의 습득 및 기록, 기록된 정보의 저장, 정보의 수집 및 판독, 판독된 정보의 표시로 이루어진다. 코드 체계를 사용하는 데에 있어서 특히 문제가 될 수 있는 부분은 중요한 문서 및 고가 상품 및 신분 증명 등에서 복제 혹은 훼손 등으로 인하여 진위 여부의 판별 및 증명에 어려움이 발생할 수 있다는 점이다. 실제로 위조지폐 사건의 경우 진위 여부를 판별할 수 있는 은화의 복제로 인하여 심각한 사회적, 경제적 문제를 일으킬 수 있다.
이러한 문제점들을 극복하기 위해서 가장 중요한 점은 해당 코드의 효과적인 숨김과 복제 불가 여부이다. 효과적인 코드의 숨김과 복제 방지는 분자 수준의 코드 개발로서 이루어질 수 있다. 분자 수준의 코드는 눈에 보이지 않는 미세한 크기로 해당 개체에 고루 담지됨으로써 쉽게 탐지되지 않는다는 장점이 있으며, 또한 특별한 장치를 통해서 복제가 불가능하게 만들 수도 있다. 이러한 분자 수준의 코드로서 가장 적절한 것이 DNA 염기쌍을 코드 단위로 사용하는 것인데, DNA 염기쌍은 매우 작은 크기의 DNA 내에 생물의 모든 유전 정보를 담을 수 있듯이 정보 저장의 효율면에서는 그 성능이 우수하다. 또한, 유전 정보는 그 자체로도 개체마다의 독특한 특성을 지니고 있기 때문에, DNA 자체를 개체나 품종을 분류하는 코드로서 사용하려는 연구들이 많았다.
한국 특허 출원 제2001-0034002호의 "품종판별을 위한 코드화 방법"에서는 각각의 농작물이 갖고 있는 유전 정보를 분류하여 코드화하는 작업을 통하여 농작물의 DNA 분석으로 품종을 분류하려는 연구를 수행하였고, 한국 특허 출원 제1993-0030237호의 "디엔에이(DNA) 다형성의 분석에 의한 한우 품종 판별법"에서는 한우의 품종 진위 여부를 가리기 위하여 DNA를 바코드처럼 이용하려는 연구를 수행하였다. 또한, 한국 특허 출원 제2000-0057825호의 "유전자를 이용한 개인식별수단 및 그 방법"에서는 개개인의 유전자를 분석하여 바코드에 대응시켜 개개인의 고유한 바코드를 지정하고 이로서 개인을 식별하는 방법을 제시하기도 하였다. 최근에는 국제 특허 출원 공개 WO 03/052101의 "Sample tracking using molecular barcode" 에서는 앞서의 경우에서 개체 자체가 지닌 게놈 DNA를 코드로 이용하는 것과 달리 임의로 제조된 분자 코드(DNA, RNA 등)를 사용하여 생화학적 반응을 수행하는 샘플이나 표본들을 구분하는 바코드로 사용할 수 있음을 연구하였다.
하지만, 상기의 많은 연구들은 DNA를 분자 수준의 코드 혹은 분류를 위한 바코드로 사용하는 것을 제시하되 그 응용범위가 제한적이었다. DNA 자체는 노출되었을 경우 여러 가지 요인-효소환경, 화학적, 물리적 환경-등에 의하여 쉽게 파괴되고 변성이 일어날 수 있기 때문에, 적절한 안정화 조치가 없이는 범용으로 사용되는 코드로서의 응용이 제한적일 수 밖에 없다. 또한, 분자 단위의 DNA가 실제로 바코드와 같은 코드 시스템으로 사용되기 위해서는 그 분석 방법에 있어서의 획기적인 진보가 필요하다. 실제 응용에 있어서는 다량의 분자 코드를 가지고 분석하기 보다는 상황에 맞게 극미량만으로도 판독할 수 있는 기법이 필수불가결하다. 현재까지 DNA와 같은 생체 분자를 효과적으로 수집하는 방법으로는 국제 특허 공개 WO 95/11839 호에서 제시한 바와 마찬가지로 자성 입자를 사용하는 방법이 대표적인데, 이러한 방법들은 자성 입자를 사용하여 손쉽게 DNA를 수거하는 것은 가능하지만, 극미량의 DNA를 검출할 수 없다는 문제점을 갖고 있다.
따라서, 광범위한 응용 범위를 갖는 분자 코드 시스템이 확립되기 위해서는 외부 환경으로부터 DNA를 안정화할 수 있는 방안과 미량의 DNA도 검출하여 수집할 수 있는 방법이 뒷받침되어야 하며, 이를 위해서는 기존에 제시되어 있는 다양한 DNA 조작 기법들을 보완할 수 있고, 한 단계 더 진보시킬 수 있는 기법들이 개발되어야 한다.
본 발명에서 제시하고자 하는 분자 수준의 정보 코드 시스템은 종래의 시도들과 마찬가지로 DNA를 그 기본 단위로 하되, DNA 자체를 디자인함에 있어서 여러 가지 보안 장치 및 안전장치를 부가하여 제조하도록 한다. 현재의 DNA 조작기술로는 임의로 DNA를 합성하거나 염기쌍 배열을 조작하는 일이 가능하기 때문에 정보를 임의로 코딩하는 일 뿐만 아니라, 특정한 안전장치를 만들어서 정보를 보호하는 일도 가능하다.
DNA는 무기물 등의 캡슐을 사용하여 안정화시킬 수 있으며, 무기물 등에 의하여 안정화된 DNA는 DNase와 같은 DNA 분해 효소들로부터 효과적으로 보호받을 수 있으며, 산성이나 염기성 등의 화학적 조건으로부터의 안정화도 획득할 수 있다. 또한 무기물에 의해 안정화된 DNA는 적절한 화학적 방법을 통하여 정보를 보존한 상태로 추출될 수 있다.
추출된 DNA는 묽은 DNA 용액 상태이기 때문에 DNA 정보의 수집과 판독시에 문제가 될 수 있는데, 일반적으로 묽은 DNA 유전 정보의 검출을 위하여 PCR (polymerase chain reaction) 기술을 이용하고 있고, 이 기술은 1980년대 중반 K. Mullis에 의해서 고안된 기술로서, 유전자를 연구, 분석하는 분자유전학에 혁신을 일으킨 기술이다. PCR은 특정 DNA 서열의 카피수를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있다. PCR은 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 복제의 특징을 이용한다. DNA 폴리머라제가 단일가닥 DNA를 주형으로 해서 상보적인 DNA를 합성하고, 이러한 단일가닥 DNA는 두가닥 DNA를 변성시켜 간단하게 얻을 수 있다. DNA 폴리머라제가 DNA 합성을 시작하게 위해서는 시작부위가 두가닥 DNA로 되어 있어야 한다. 따라서, 증폭 시킬 DNA 서열의 양끝에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머를 함께 넣어주면 이 프라이머가 특정 DNA 서열의 양 말단에 결합해 DNA 폴리머라제가 DNA 합성을 시작할 수 있도록 해준다. 일단 프라이머가 결합한 후에는 DNA 폴리머라제의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행하여 DNA가 신장된다.
이와 같이 1) 변성, 2) 결합, 3) 신장이 한 싸이클이 된다. 다음 싸이클에서 최초 DNA와 새로 합성된 DNA가 분리되어 단일가닥 DNA 주형이 된다. 따라서, n 싸이클 후에, 이론적으로 2n 의 두가닥 DNA가 존재하게 되어 DNA를 증폭시킬 수 있고, 이와 같이 증폭된 DNA를 겔 전기영동을 통해 겔 상에서 특정 밴드를 확인함으로써 DNA의 존재를 검출할 수 있게 된다.
그러나, 상기와 같은 PCR 기술을 이용하여 DNA를 증폭하여 이를 전기영동에 의해 확인할 경우에도 일정 수준 이상의 DNA가 시료에 존재한 경우에만 그 검출이 가능하고, 극미량의 DNA는 PCR에 의해 효과적으로 증폭되지 않아 검출이 불가능하다.
일반적으로 산화철은 구조에 따라서 괴타이트, 레피도크로사이트, 헤마타이트, 마그네타이트 및 마게마이트 등으로 나뉜다. 이러한 산화철들은 구조에 따라서 자성 특성이 다양하며, 또한 입자 크기에 따라서 자성 특성이 변화하는 것들이 있다. 이 중 마게마이트 구조의 산화철은 자기적 특성이나 구조적 안정성, 그리고 합성의 용이함 등의 잇점을 가지고 있다. 마게마이트의 자기적 성질은 벌크 상태일 경우 강자성을 띠고 있으며, 10 nm 이하의 나노 입자일 경우에는 초상자성을 띤 다. 따라서, 마게마이트 나노 입자는 비표면적이 넓은 상태의 작은 나노 입자로 합성하더라도 초상자성의 자기적 특성을 그대로 유지할 수 있다는 장점을 갖고 있다.
폴리피롤의 경우 전도성 고분자로 많이 알려져 있으며, 염소 음이온을 포함하고 있어서, 여러 가지 음이온을 치환반응으로 흡착할 수 있는 특성을 가진 것으로 알려져 있다. 특히, DNA는 인산기에 음전하를 갖는 이온으로서, 폴리피롤에 이온 교환반응으로 흡착될 수 있으며, 폴리피롤의 전하간 간격이 DNA에 존재하는 인산기의 음이온 간격과 거의 흡사하여 폴리피롤은 DNA를 흡착함에 있어서 선택성이 매우 높다.
따라서, 폴리피롤-산화철 나노하이브리드와 같은 물질을 이용하여 DNA를 수집할 경우 PCR 등의 방법과 함께 사용하여 효과적인 미량 DNA의 검출 및 판독 작업을 용이하게 진행할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, DNA의 염기쌍을 임의 조작함으로써 특정 정보를 갖는 DNA 분자 정보 코드를 제조하고, 정보 코드를 무기물로 캡슐화함으로써 안정성을 부여하며, 자기적 성질이 우수한 마게마이트 나노입자와 DNA 탐지 특성이 우수한 폴리피롤을 나노 수준에서 하이브리드화하여 제조한 기능성 나노하이브리드를 이용함으로써 저농도의 DNA 용액에서도 미량의 DNA만을 선택적으로 수집 및 판독할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같이 DNA 염기쌍을 기본적인 정보의 단위로 사용하여 분자 수준의 정보 코드를 제공하고, 무기물을 이용하여 캡슐화함으로써 DNA 정보 코드에 안정성을 제공하며, 마게마이트와 폴리피롤의 특성을 이용하여 일반적인 검출 방법에 의해 분석할 수 없는 극저농도의 DNA를 검출하여 DNA 정보 코드를 판독할 수 있는 전체적인 시스템을 제공하는 것이다.
따라서, DNA를 이용한 분자 수준의 정보 코드의 제조 및 안정화, 미량 DNA 정보 수집 및 판독으로 구성되는 분자 정보 코드 시스템의 확립에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 염기 서열을 포함하는 정보 코드 영역, DNA 의 증폭이나 염기 서열 판독에 필요한 양 말단의 프라이머 영역 및 상기 프라이머와 정보 코드 영역 사이에 존재하며, 상기 정보 코드 영역과 상기 프라이머 영역 사이를 1 개 뉴클레오티드 이상 분리시키는 완충 영역으로 이루어진 DNA 정보 코드를 제공한다.
본 발명의 DNA 정보 코드에서, 상기 정보 코드 영역의 염기 서열은 예컨대 CCT TAT ACG CTC AGT GTC와 같이 어떤 염기서열도 될 수 있으나, 이를 특정 문자 및/또는 숫자열에 대응되는 것이 바람직한데, 이는 일반적인 데이터 형태인 문자 및/또는 숫자열로 변환하여 빠르게 판독할 수 있기 때문이다.
본 발명의 DNA 정보 코드에서, 상기 정보 코드 영역의 염기 서열은 DNA 염기 서열 자체를 하나의 암호로 생각하여 코드화하는 방법이나 염기 서열의 길이를 정보로 사용하는 코드화 기법도 있으나. 3 염기쌍이 하나의 문자 및/또는 숫자에 대 응되는 것이 바람직한데, 이는 3개의 염기쌍으로 하나의 문자 및/또는 숫자에 대응할 경우 64가지의 다양한 문자, 숫자 및/또는 특수 문자를 나타낼 수 있기 때문이다.
본 발명의 DNA 정보 코드에서, 상기 프라이머 영역은 그 서열이 비밀로 유지되는 것이 바람직한데, 이는 DNA 자체의 판독이나 증폭이 불가능하기 때문이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 DNA 정보 코드를 준비하는 단계, 및
금속 이중층 수산화물로 상기 DNA 정보 코드를 캡슐화하는 단계
를 포함하는, DNA 정보 코드를 안정화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 금속 이중층 수산화물이 하기 일반식을 갖는 것이 바람직하다:
[M2+ 1-x N3+ x (OH)2 ][An- ]x/n ·yH2O
(식 중, M2+ 은 Mg2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 2가 금속 양이온이며, N3+ 는 Al3+, Fe3+, V3+, Ti3+ 및 Ga3+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 3가 양이온이며, x는 0.1 내지 0.4의 범위를 갖는 수이며, A는 음이온성 DNA이며, n은 상기 DNA의 전하수이며, y는 0을 초과하는 양수이다).
본 발명의 방법에서, 상기 금속 이중층 수산화물은 Ni2Al(OH)6(NO3), Zn2Al(OH)6(NO3), Mg2Fe(OH)6(NO3), Mg3Al(OH)8(NO3) 등이 있을 수 있으나, Mg2Al(OH)6(NO3)인 것이 바람직할 수 있는데, 이는 층상 화합물은 양이온성 층전하를 띠고 있기 때문에 정전기적 인력으로 음이온성 인산기를 갖는 DNA 와 결합이 가능하기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 상기 금속 이중층 수산화물은 2가와 3가의 두가지 이상의 금속염을 용액으로 만들고 염기 용액으로 적정하는 일반적인 방법에 의해 합성할 수 있으나, 질산 마그네슘과 질산 알루미늄을 1.5:1~2.5:1로 섞은 혼합 수용액 0.01 ~ 0.5 M을 질소 분위기 하에서 0.01 ~ 0.5 M 수산화나트륨 용액으로 pH 9 ~ 10까지 적정하여 합성하는 것이 바람직한데, 이는 상기 범위를 벗어나는 경우에는 Mg와 Al의 구성비가 달라지거나 불순물이 생성되는 문제가 있기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 상기 캡슐화 단계는 종래 알려진 이온 교환 반응이나 공침 방법에 의해 수행될 수 있으나, DNA 와 금속 이중층 수산화물을 몰비 1:1~2:1 로 탄산이 제거된 증류수에 분산시켜 질소 분위기 하에서 65 ~ 75 ℃에서 5 ~ 14일간 교반하여 반응시켜 캡슐화하는 것이 바람직한데, 이는 상기 범위를 벗어나는 경우에는 DNA 염기 배열이 변성되거나 금속 이중층 수산화물에 의한 DNA 안정화가 되지 않는 문제가 있기 때문이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 안정화 방법으로 안정화된 DNA 정보 코드 시스템을 제공한다.
본 발명의 DNA 정보 코드 시스템에서, DNA 정보 코드 시스템은 임의의 매체에 결합되는 것이 바람직한데, 상기 나노 크기의 DNA 정보 코드는 어떠한 매체에도 쉽게 결합되어 매체에 안정하게 부착될 수 있습니다. 여기서, 결합은 용매에 분산하여 매체에 도포하는 방법, 종이 등의 상품 제조시 직접 심어 넣는 방법, 페인트나 도료 등에 혼합하여 사용하는 방법 등을 모두 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 DNA 정보 코드 시스템이 도포된 임의의 매체로부터 DNA-금속 이중층 수산화물을 채취하는 단계,
금속 이중층 수산화물을 용해시켜 DNA 정보 코드를 추출하는 단계,
폴리피롤-마게마이트 하이브리드 나노입자를 사용하여 상기 추출된 DNA 정보 코드를 수거하는 단계,
수거된 DNA 정보 코드를 PCR 로 증폭하는 단계, 및
증폭된 DNA 정보 코드를 판독하는 단계를 포함하는, 임의의 매체로부터 특정 DNA 정보 코드를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, DNA 정보 코드 추출 단계는 DNA-금속 이중층 수산화물 캡슐을 증류수에 분산시켜 인산 완충 용액을 사용하여 pH를 2.5 ~ 3에 맞춘 뒤 20 ~ 40 분동안 저어줌으로써 금속이중층 수산화물층을 용해시키는 것이 바람직한데, 이는 상기 범위를 벗어나는 경우에는 효과적으로 DNA가 추출되지 않거나 혹은 DNA가 파괴되는 문제가 있기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 상기 DNA 정보 코드 시스템 수거 단계에서 DNA의 농도가 500 펨토몰 (10-15 mol/L) 이하, 특히 100 펨토몰 이하인 경우에도 본 발명의 방법에 의해 충분히 DNA 정보를 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에서, DNA 정보 코드 판독 단계에서 증폭된 DNA 정보 코드의 소정 DNA 정보 코드와의 일치 여부를 전기영동에 의해 판독하는 것이 바람한데, 이는 전기영동이 간편하고 빠르기 때문이다.
본 발명의 방법에서, DNA 정보 코드 판독을 증폭된 DNA를 자동 서열결정기로 서열 결정한 후, 대응하는 문자 및/또는 숫자열로 변환하는 것이 바람직한데, 이는 신속하고 편리하기 때문이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리피롤-마게마이트 하이브리드 나노입자를 사용하여 추출된 DNA 정보 코드를 수거하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드 입자의 합성은 마게마이트 나노 입자를 과량(피롤/마게마이트 질량비 > 0.7)의 액상 피롤에 분산시킨 후, 과량의 피롤을 제거하여 표면이 피롤로 젖은 상태의 마게마이트 나노 입자를 얻고, 여기에 0.1 ~ 0.2 M 농도의 3가 염화철 에탄올 용액을 첨가하여 30분 ~ 1시간 동안 저어줌으로써 피롤의 중합반응을 유도하고, 반응이 끝난 뒤에는 에탄올로 수세하여 반응하지 않은 피롤을 제거함으로써 수행하는 것이 바람직한데, 이는 상기 범위를 벗어나는 경우에는 피롤의 중합반응이 원활하지 않거나 폴리피롤 고분자가 마게마이트 입자에 고르게 코팅되지 않는 문제가 있기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 추출된 DNA 용액에 혼합하여 분산시킨 후, 분산액 중 폴리피롤-마게마이트 부분을 자석을 이용하여 수거하는 것이 바람직하고, 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드 0.1 mg ~ 수 g 을 100 fM ~ 100 pM DNA 용액 10 ㎕ ~ 수 mL에 혼합한 뒤, 25 ~ 37 ℃에서 30 분 ~ 2시간 동안 분산시킨 후, 분산액 중 폴리피롤-마게마이트 부분을 자석을 이용하여 수거하는 것이 더욱 바람직한데, 이는 상기 범위를 벗어나는 경우에는 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드에 의한 DNA의 수거가 충분히 되지 않는 문제가 있기 때문이다.
이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
DNA 염기쌍 배열은 여러 가지 방법으로 코드화될 수 있다. 가장 일반적인 방법으로서 DNA가 유전 정보를 코드화하듯이 염기 세개를 하나의 단위로 생각하여 알파벳과 기호 하나하나에 염기쌍을 대응하는 방법이 있으며 (도 2), DNA 염기쌍 배열 자체를 하나의 암호로 생각하여 코드화하는 방법이나 염기쌍의 길이를 정보로 사용하는 코드화 기법도 있다. DNA 정보 코드는 크게 세가지 부분으로 나뉠 수 있는데, 양쪽 말단의 프라이머, 프라이머와 인접한 부분의 완충지대, 그리고 중심부의 정보 코드 영역이 그것이다.
프라이머는 약 20~30 염기쌍에 해당하는 길이로 DNA의 증폭이나 염기쌍 판독에 있어서 필수불가결한 요소로서 프라이머 염기 배열을 모를 경우, DNA 자체의 판독이나 증폭은 불가능하다. 따라서, 프라이머 염기 배열 자체를 비밀로 함으로서 1차적으로 DNA 정보 코드의 무단 복제를 막을 수 있다.
완충지대는 프라이머와 정보 코드 부분의 사이에 존재하는 부분으로서 다양한 완충 작용의 효과가 있다. 우선 DNA 염기쌍 배열 확인 작업에서 프라이머 근처의 염기쌍 배열은 판독이 불가하기 때문에 완충 지대의 염기쌍을 넣어줄 필요가 있 다. 또한, 완충 지대가 존재할 경우 정보 코드의 시작 지점을 적절히 숨길 수 있기 때문에 정보의 복제를 방지할 수 있다. 코드 제작시 정보 코드의 시작점을 미리 정해두고 비밀로 해 둘 경우, 시작점을 모른다면 정보 코드를 전혀 해석할 수 없게 되므로 복제 방지의 역할을 할 수 있다.
마지막으로 정보 코드 부분은 미리 지정된 코드화 기법대로 특정 정보를 지니고 있는 부분으로서 해당 개체 (제품 또는 문서 등)의 개체 특성 및 해당 정보를 담고 있다.
염기쌍 임의조작법을 통하여 제조된 DNA 정보 코드는 외부 극한 환경으로부터 보호받기 위하여 무기물 등으로 캡슐화될 수 있다. 특히 금속이중층 수산화물 (Mg2Al(OH)6(NO3))과 같은 층상 화합물은 양이온성 층전하를 띠고 있기 때문에 정전기적 인력으로 음이온성 인산기를 갖는 DNA와 결합할 수 있다. 정전기적 인력으로 DNA를 층 내에 안정화시킨 금속이중층 수산화물은 특히 DNA에 치명적으로 작용할 수 있는 DNase와 같은 효소로부터 DNA를 보호할 수 있으며, pH 영역 3 이상에서 DNA를 안전하게 보존할 수 있다.
금속 이중층 수산화물(Layered Double Hydroxide : LDH)은 하이드로탈사이트 (hydrotalcite) 유사 화합물이라고도 불리며, 마그네슘과 알루미늄의 이중층 수산화물 구조로 이루어진 하이드로탈사이트와 유사한 구조를 가지면서 마그네슘과 알루미늄의 금속이 다른 2가와 3가의 금속으로 치환될 수 있는 화합물을 말한다. 금속 이중층 수산화물을 층 내의 3가 금속 이온의 존재 때문에 층 자체가 양전하로 하전되어 있고, 층 내에 다양한 음이온을 도입시킬 수 있다. 따라서 본 발명에서 금속 이중층 수산화물의 층 내에 음의 하전을 띠는 DNA를 도입할 수 있다.
금속 이중층 수산화물은 일반적으로 2가와 3가의 두가지 이상의 금속염을 용액으로 만들고, 염기 용액으로 적정하여 합성한다. 2가의 금속으로는 마그네슘(Mg2+), 칼슘(Ca2+), 아연(Zn2+) 등이 사용될 수 있고, 3가의 금속으로는 알루미늄(Al3+), 철(Fe3+)등이 사용될 수 있으며, 염기 용액으로는 수산화나트륨(NaOH), 암모니아(NH3)등이 사용될 수 있다. 침전이 형성되어 합성되는 금속 이중층 수산화물은 합성에서의 금속 이온의 농도, 금속 이온의 비율, 적정 속도, 총 반응 시간 등의 조건에 따라서, 원하는 조성, 입형 및 입도를 지니는 입자로 얻어낼 수 있다. 생체 내에 주사제로 사용될 때의 금속 이중층 수산화물은 모세혈관이 막히지 않고, 생체에 물리적 충격을 가하지 않게 하기 위하여 300 nm 이하의 작은 입자로 균일하게 만들어 내야 할 필요가 있다. 본 발명에서는 마그네슘과 알루미늄을 사용하여 24시간동안 반응시킨 결과 균일한 크기의 금속 이중층 수산화물 입자를 얻어낼 수 있었다.
합성된 금속 이중층 수산화물에 DNA를 캡슐화하는 방법으로는 이온 교환 반응이나 공침 방법이 사용될 수 있다. 이온 교환 방법은 합성된 금속 이중층 수산화물의 층간에 존재하는 질산 (NO3 -), 염화 (Cl-), 탄산 (CO3 2-) 등의 이온을 이온화된 DNA 분자로 치환하는 방법이고, 공침 방법은 금속 혼합 용액의 적정시 해당 DNA 분 자를 이온화시켜 첨가함으로서 층의 형성시 동시에 DNA 분자가 캡슐화되도록 유도하는 방법이다. 금속 이중층 수산화물 내에 도입될 수 있는 DNA는 음전하를 띠는 한 일반 DNA 뿐만 아니라, PNA(peptide nucleic acid) 와 LNA(locked nucleic acid)와 같은 유사 핵산을 사용할 수도 있다.
DNA가 담지된 금속 이중층 수산화물, 즉 DNA-무기 하이브리드 복합체의 구체적으로 다음 화학식1의 구조를 갖는다:
[M2+ 1-x N3+ x (OH)2 ][An- ]x/n ·yH2 O
(식 중, M2+ 은 Mg2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 2가 금속 양이온이며, N3+ 는 Al3+, Fe3+, V3+, Ti3+ 및 Ga3+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 3가 양이온이며, x는 0.1 내지 0.4의 범위를 갖는 수이며, A는 음이온성 DNA이며, n은 상기 DNA의 전하수이며, y는 0을 초과하는 양수이다).
또한, 상기 화학식 1에서 금속의 배합비와 관련한 x의 범위는 0.1 내지 0.4 정도가 바람직하며, 0.25 내지 0.33의 범위를 갖는 것이 특히 바람직하며, 이 범위를 벗어나는 경우, 금속 이중층 수산화물의 무기 담체내에서 DNA의 바람직한 캡슐화가 일어나지 않아, 즉, 층간 삽입이 이루어지지 않아 목적하는 DNA-무기 하이브리드 복합체의 생성이 용이하지 않게 된다.
또한, 본 발명의 DNA-무기하이브리드 복합체는 수화물 형태로 이용될 수 있으며, 그 수화물화 정도는 y로 나타낼수 있다. 여기서, y는 공기중 수분 함량 정도 등의 다양한 요인에 의해 변화될 수 있는 값으로 광범위한 정도에서 보편적으로 이용할 수 있기에, 0을 초과하는 양수로서 나타내어 사용할 수 있다.
DNA를 담지하고 있는 금속 이중층 수산화물은 크기가 100~200 nm에 이르는 미세 입자이기 때문에 정보 코드를 삽입할 해당 개체에 도포함으로써 표면에 흡착되어 눈에 보이지 않는 상태로 정보 코드 삽입을 가능하게 해 준다. 또한 금속 이중층 수산화물은 인산 완충용액과 같은 산성 완충용액으로 처리할 경우 금속 수산화물층만 선택적으로 용해시켜 DNA를 추출할 수 있는 장점을 갖고 있다.
금속 이중층 수산화물로 캡슐화된 DNA 정보 코드는 DNase I 효소로 처리한 후 금속 이중층 수산화물로부터 추출하여 추출물 자체에 대해 전기영동을 실시하고, 이와 별개로 추출물을 PCR로 증폭하여 전기영동하였다. 그 결과 추출물 자체를 전기영동한 것은 농도가 매우 묽어 전기영동상에서 검출되지 않았으며 PCR을 통하여 증폭한 DNA는 뚜렷한 DNA 밴드를 보이고 있음을 알 수 있다 (도 5 참조). PCR 반응은 DNA 중 일부가 변성이 되거나 파괴되었을 경우 전혀 수행되지 않는 반응임을 생각할 때 PCR 증폭을 한 시료가 DNA 밴드를 보인다는 것은 PCR이 효과적으로 수행되었음을 보여줌과 동시에 원래의 DNA 정보 코드가 그 내용을 그대로 보존되어 있음을 나타낸다. 따라서, DNA 정보 코드는 금속 이중층 수산화물로 캡슐화할 때 외부 효소 조건 등으로부터 안전하게 보존될 수 있음을 알 수 있다.
추출된 DNA 정보 코드는 미량의 DNA를 포함하고 있기 때문에 효과적인 방법으로 DNA를 수거하지 않을 경우, DNA의 정보 판독이 불가능하다. 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드는 약 10 nm 정도의 크기의 초상자성을 띠는 마게마이트 나노 입자 표면에 DNA 탐지 능력을 지닌 폴리피롤 고분자를 코팅시킨 하이브리드 물질로서 자성으로 DNA를 수거할 수 있도록 제조된 DNA 수거 물질이다. 이 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드는 미량의 DNA도 자기력을 통하여 쉽게 수거할 수 있도록 해 준다.
이와 같이 제조한 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드 입자는 검출 대상 DNA 용액에 분산시킨 후, DNA가 흡착된 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 자기력에 의해 수거한다. 수거한 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 증류수에 분산시키고 PCR을 수행한다. PCR을 수행한 DNA 시료를 아가로스 겔로 전기영동을 실시하고, DNA 밴드를 분석하여 DNA를 검출할 수 있다.
본 발명에서 확립된 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 적용시킬 경우 일반적으로 유전자 검출 및 증폭에 사용되는 방법으로도 검출해 낼 수 없는 극미량의 DNA도 검출할 수 있다. 검출된 DNA는 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드에 흡착된 상태이므로 자기적 힘으로 다른 불순물로부터 쉽게 분리가 가능하며, 흡착된 DNA는 PCR 방법을 통하여 증폭이 가능하므로, 일반적 방법으로 검출하여 분석할 수 없는 극저농도, 예를 들어 펨토몰 (10-15 mol/L) 수준의 DNA를 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 통하여 수거할 수 있다.
수거된 DNA 정보 코드는 PCR을 통하여 증폭되어 그 정보를 판독할 수 있다. 수거된 DNA 정보 코드를 PCR로 증폭하여 전기영동한 결과 원래의 DNA와 같은 DNA가 검출됨을 확인할 수 있으며, 이에 따라 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 통 하여 DNA 정보에 손상이 없이 정보를 수집할 수 있는 동시에 저농도에서도 정보 판독을 위한 DNA 수집이 가능함을 알 수 있다 (도 8 참조).
따라서, 본 발명은 다음과 같은 네가지 과정의 DNA 정보 코드 시스템을 확립하게 해 준다. 우선 염기쌍 임의조작을 통한 복제 불가능한 DNA 정보 코드 단위를 제조하고, 금속 이중층 수산화물로 DNA 정보 코드를 안정화시키며, 폴리피롤-마게마이트를 사용하여 미량의 DNA 정보 코드를 수집하고, PCR 및 전기영동 방법으로 DNA를 증폭하여 판독하는 네 가지 단계를 통하여 DNA 정보 코드 시스템을 확립할 수 있음을 알 수 있다 (도 1).
본 발명에서 제조한 DNA-금속 이중층 수산화물 캡슐 및 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드 입자의 특성 및 DNA 분석은 다음과 같이 평가하였다.
1) X-선 회절을 이용한 평가
시료의 전처리 : 고체 분말 형태의 시료로 건조한 상태로 측정
측정기기 : Philips
측정 회절각 범위 : 20~70도
2) 적외선 스펙트럼
시료의 전처리 : KBr과 혼합시켜 디스크 형태로 압축한 후 측정
측정기기 : Bruker IFS 48
측정 주파수 범위 : 400~4000 cm-1
3) PCR에 의해 증폭한 전기영동
시료의 전처리 : 각 과정에서 용액이나 콜로이드 상태로 얻어진 DNA를 PCR 증폭기에서 증폭
전기영동 조건 : 1% 아가로스 겔에서 TBE (Tris Boric EDTA) 버퍼 용액을 사용하여 75 V 전압으로 전기영동
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명은 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1
DNA 정보 코드는 다음과 같이 디자인되었다. 100 염기쌍 길이의 한가닥 DNA와 그에 상보적인 DNA 가닥은 각각 합성되어 하이브리드화 과정을 통하여 두가닥 DNA로 제조되었다. DNA 정보 코드는 양쪽 말단의 1번째~20번째 및 81번째~100번째 염기쌍에 대응하는 프라이머, 21~40번째 및 59번째~80번째 염기쌍에 대응하는 완충 지대, 그리고 41~58번째 염기쌍이 대응하는 정보 코드 영역으로 이루어지도록 디자인되었다. 41~58번째 염기쌍에 해당하는 부분은 5'-CCT TAT ACG CTC AGT GTC-3' 으로서 3염기쌍 코드화 방법에 따라서 6개의 문자를 지정하도록 디자인되었으며, 도 2에서 도시한 정보 코드 배치표에 따라서 HYBRID라는 단어를 코드화하도록 제조되었다.
도 2는 본 실시예에서 사용한 DNA 정보 코드에 정보를 대입시키기 위하여 사용한 3염기쌍 코드화 방법의 정보 코드 배치도이다. 본 정보 코드 배치도에 따라서 3염기쌍이 하나의 문자에 대입되게 되며, 본 실시예에서 사용된 정보 코드가 HYBRID라는 단어를 지칭함을 알 수 있다.
도 3은 본 실시예에서 사용한 DNA 정보 코드의 염기쌍 배열을 모식화한 것으로서, 100 염기쌍 길이의 DNA 내부에 프라이머, 완충지대, 정보 코드의 부분을 배치함으로써 정보 코드의 보안성을 유지할 수 있음을 보여준다.
실시예 2
DNA 정보 코드는 외부 환경으로부터의 안정화를 위하여 금속 이중층 수산화물로 캡슐화되었다. 금속 이중층 수산화물 (Mg2Al(OH)6(NO3))는 질산 마그네슘과 질산 알루미늄을 2:1로 섞은 혼합 수용액 0.1 M을 질소 분위기 하에서 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 pH 9.5까지 적정하여 합성하였고, 합성된 금속 이중층 수산화물은 동결건조 방법으로 건조되어 DNA 캡슐화 단계에 사용되었다. DNA 10 mg과 금속 이중층 수산화물 10 mg을 탄산이 제거된 1 mL의 증류수에 분산시켜 질소 분위기 하에서 75℃에서 7일간 교반하여 반응시켰다.
도 4a는 DNA 캡슐화에 사용된 금속이중층 수산화물의 X-선 회절도, 도 4b는 DNA를 캡슐화하여 안정화한 금속 이중층 수산화물의 X-선 회절도로서 003 피크는 층의 두께와 층간 거리의 합에 해당된다. 층간에 DNA 분자가 삽입됨으로써 층간 거리가 10.2 Å에서 23.9 Å으로 증가한 것을 통하여 DNA가 금속이중층 수산화물 내에 안정하게 캡슐화되었음을 알 수 있다.
실시예 3
금속 이중층 수산화물에 의하여 캡슐화된 DNA의 효소 안정성은 제조된 DNA- 금속 이중층 수산화물 캡슐의 효소 처리 반응으로 시험하였다. 10 mg의 DNA-금속 이중층 수산화물 캡슐을 증류수 10 mL에 분산시켜 96 유닛의 DNase I/Tris 완충 용액 (100 uL)으로 함께 처리하고, Ca2+/Mg2+ 이온을 추가하여 2시간 동안 37 ℃에서 인큐베이팅하였다. 마찬가지로 DNA 자체에 대해 DNase I 효소로 처리하여 같은 조건에서 인큐베이팅하였다. 효소 처리가 끝난 후 인산 완충 용액을 사용하여 pH를 약 2.5에 맞춘 뒤 30분 동안 저어주며 금속이중층 수산화물층을 용해시켜 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 PCR 증폭을 실시한 것과 실시하지 않은 것으로 분리하여 각각 전기영동하였다.
PCR은 200 uM의 각 dNTP, 0.2 uM의 각 프라이머, 1 U의 Taq polymerase (Nova-taq, Genemed)를 포함한 25 uL의 1 x PCR 완충용액 내에서 수행되었다. 초기에 이 시료를 95 ℃에서 10분간 처리한 후 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초의 가열 싸이클로 35회 수행한 뒤 다시 72 ℃에서 10분간 두는 것으로 마무리하였다.
도 5는 DNase I 처리에 따른 DNA의 손상 여부를 나타내 주는 전기영동 사진으로서, 레인 1은 100 bp마다 사다리형의 DNA 밴드를 보이는 마커 DNA이고, 레인 2는 실시예 1에서 디자인된 양성대조군 (positive control) DNA, 레인 3은 DNA-금속 이중층 수산화물로부터 직접 추출한 DNA 정보 코드의 밴드, 레인 4는 DNase I 효소 처리한 DNA 정보 코드, 레인 5는 DNase I 효소 처리한 DNA-금속 이중층 수산화물에서 DNA를 추출한 뒤 PCR로 증폭하지 않은 DNA, 레인 6은 DNase I 효소 처리한 DNA- 금속 이중층 수산화물에서 DNA를 추출한 뒤 PCR로 증폭한 DNA 밴드이다.
도 5로부터, 금속 이중층 수산화물 캡슐이 없는 경우 DNA가 완전히 제거된 반면, 금속 이중층 수산화물에 의해 안정화된 DNA는 그대로 유지되고 있음을 알 수 있다. 또한, 추출된 DNA는 PCR로 증폭하지 않았을 경우 농도가 묽어서 전기영동상에 DNA 밴드가 나타나지 않지만, PCR로 증폭하였을 경우 DNA 밴드가 나타나는 것으로 볼 때, 효과적인 PCR이 이루어졌음을 알 수 있고, 이로부터 DNase I 처리 후에도 DNA 정보 코드의 치명적인 손상은 발생하지 않았음을 알 수 있다.
실시예 4
마게마이트 나노 입자는 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 2가와 3가의 염화철 수용액(Fe2+ = 43.9 mM, Fe3+ = 87.8 mM)을 Fe2+/F3+ = 0.5의 비율로 섞은 뒤 암모니아수로 적정하여 염기성을 띠게 하여 Fe3O4의 마그네타이트 나노 입자 5g 을 침전시켰다. 침전된 마그네타이트를 질산으로 처리하여 산화시키고, 표면의 산화를 위하여 질산철(Fe(NO3)3) 0.1g 을 첨가하였다. 이러한 과정을 통하여 마그네타이트 나노 입자는 마게마이트 나노 입자로 산화된다.
합성된 마게마이트 나노 입자는 다음과 같은 과정을 통하여 폴리피롤에 의해 코팅하여 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드 입자를 합성하였다. 마게마이트 나노 입자 1.7g을 과량의 액상 피롤에 분산시킨 후 (피롤/마게마이트(질량비) > 0.7), 과량의 피롤을 제거하여 표면이 피롤로 젖은 상태의 마게마이트 나노 입자를 얻었다. 여기에 0.15 M 농도의 3가 염화철 에탄올 용액을 첨가하여 30분 동안 저 어줌으로써 피롤의 중합반응을 유도하고, 반응이 끝난 뒤에는 에탄올로 수세하여 반응하지 않은 피롤을 제거하였다.
도 6a는 마게마이트 나노 입자의 투과 전자 현미경 사진으로서 평균 크기가 7 nm인 마게마이트가 합성되었음을 보여준다. 도 6b는 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드의 투과 전자 현미경 사진으로서 마게마이트의 모습에는 전혀 변화가 없으며, 마게마이트 입자 사이에 옅은 회색으로 나타나는 고분자 영역이 있음을 확인할 수 있으며, 이에 의해 폴리피롤이 마게마이트 입자에 고르게 코팅되었음을 알 수 있다.
도 7에서, (a)는 마게마이트 나노 입자의 적외선 흡수 분광 스펙트럼이고, (b)는 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드의 적외선 분광 스펙트럼이고, (c)는 폴리피롤의 적외선 분광 스펙트럼으로서 마게마이트에 폴리피롤이 코팅되었음을 보여주고 있다.
실시예 5
금속이중층 수산화물 캡슐로부터 추출된 DNA 정보 코드는 pM 수준 이하의 저농도 DNA 용액으로 희석하고 PCR 방법으로 증폭하여 전기영동을 시행하였고, 같은 DNA 용액에 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 혼합하여 DNA를 검출해 낸 뒤 PCR로 증폭시켜 전기영동을 시행하였다.
우선 100 fM 농도의 DNA 용액 1 mL를 취하여 PCR에 의해 증폭하였다 (정방향 프라이머: TCC CAG CTT CAT CCC TAC TG, 역방향 프라이머: CAG GCC TCG TGA GGC GAG GC, 사용한 비율; 주형: 10× PCR 반응 완충액: dNTP: 정방향 프라이머(10 μ M): 역방향 프라이머(10 μM): 100× BSA: Taq: D.W = 1:2.5:2:0.5:0.5:0.25:0.2:18. PCR 조건: 95℃ 30초, 60℃ 10초, 72℃ 30초를 30 싸이클 반복). 또한, 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드 1 mg을 100 fM DNA 용액 1 mL에 혼합한 뒤, 37℃에서 6시간 동안 분산시켰다. 분산액 중 폴리피롤-마게마이트 부분은 자석을 이용하여 수거하였고, 이를 다시 증류수에 분산시켜 수세하였다. 수세 과정은 5회에 걸쳐 수행하였으며, 각 수세 단계에서 분산액의 상층액 중 1 mL를 취하여 PCR을 실시하였다.
5회의 수세과정이 끝난 후 자석으로 수거한 폴리피롤-마게마이트는 물에 젖은 상태로 1 ㎕를 취하여 위와 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다. 같은 방법으로 500 fM DNA 용액으로도 PCR을 수행하였고, 모든 시료는 아가로스 겔에서 전기영동을 수행하였으며, 에티듐 브로마이드로 염색하고 자외선을 조사하여 DNA 밴드를 분석하였다. 측정된 DNA 밴드는 도 8에 도시하였다.
도 8에서 레인 1은 100 bp마다 사다리형 밴드를 보이는 마커 DNA, 레인 2는 실시예 1에서 디자인된 DNA의 양성 대조군, 레인 3은 100 fM 농도 DNA 용액의 PCR 증폭 DNA 밴드이고, 레인 4는 500 fM 농도 DNA 용액의 PCR 증폭 DNA 밴드이고, 레인 5은 100 fM DNA 용액으로부터 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드에 의해 흡착된 DNA를 PCR로 증폭한 DNA 밴드이고, 레인 6은 500 fM DNA 용액으로부터 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드에 의해 흡착된 DNA를 PCR로 증폭한 DNA 밴드이다.
도 8의 DNA 분석 결과에 따르면, 500 fM 또는 100 fM의 DNA 용액을 PCR로 증폭시에 DNA 밴드가 거의 나오지 않는 것을 볼때 500 fM 이하의 저농도에서는 PCR 방법만을 통해서 DNA를 증폭하는 것이 적절하지 않음을 알 수 있다. 이에 비해 폴리피롤-마게마이트에 의해 DNA를 흡착한 경우, 흡착 후에 수차례 수세하여 PCR로 증폭한 결과에 따르면 명확한 DNA 밴드가 검출되는 것으로 나타났고, 이것은 폴리피롤-마게마이트에 의하여 DNA가 효과적으로 흡착되었으며, 동시에 폴리피롤-마게마이트에 의해 미량의 DNA를 흡착하여 증폭하는 것이 DNA 검출을 위해 적절한 방법이었음을 의미한다.
또한, 폴리피롤-마게마이트를 통한 DNA 정보 코드의 수거 방법을 통하여 DNA 정보에 영향을 끼치지 않으면서 정보를 판독할 수 있다는 것을 알 수 있으며, 따라서 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드가 DNA를 사용한 분자 코드 시스템의 정보 수거 및 판독 방법에 적절한 방법임을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 임의 조작된 염기 배열을 갖는 DNA를 분자 수준의 정보 코드로 지정하고, DNA 내에 프라이머와 완충 지역을 설정하여 보안장치를 배치할 수 있다. 또한, 이렇게 디자인된 분자 수준의 DNA 정보 코드는 금속 이중층 수산화물과 같은 무기물로 캡슐화하여 외부의 환경으로부터 보호받을 수 있으며, 동시에 필요한 개체에 보이지 않게 도포되어 숨은 정보 코드로서의 기능을 할 수 있다.
개체에 담지된 정보 코드는 일부를 채취하여 DNA만을 추출함으로써 정보를 추출해 낼 수 있고, 추출된 정보는 폴리피롤-마게마이트 나노하이브리드를 통하여 미량이라도 효과적으로 검출해 낼 수 있다. 마지막으로 수거된 DNA 정보 코드는 PCR 방법으로 효과적으로 증폭될 수 있고, 전기영동 등의 방법을 통하여 초기의 정보를 판독해 낼 수 있다. 따라서, 본 발명에서 제시한 바와 마찬가지로 보안성이 뛰어난 분자 수준의 정보 코드 시스템을 마련할 수 있다.

Claims (20)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. DNA가 도포된 임의의 매체로부터 DNA-금속 이중층 수산화물을 채취하는 단계,
    금속 이중층 수산화물을 용해시켜 DNA를 추출하는 단계,
    폴리피롤-마게마이트 하이브리드 나노 입자를 사용하여 상기 추출된 DNA를 수거하는 단계,
    수거된 DNA를 PCR로 증폭하는 단계, 및
    증폭된 DNA를 판독하는 단계를 포함하는, 임의의 매체로부터 특정 DNA를 검출하는 방법으로서,
    상기 DNA는 특정 염기 서열을 포함하는 정보 코드 영역, 그 서열이 비밀로 유지되어 정보 코드 영역만의 증폭이나 염기 서열 판독에 필요한 양 말단의 프라이머 영역 및 상기 프라이머와 정보 코드 영역 사이에 존재하며, 상기 정보 코드 영역과 상기 프라이머 영역 사이를 1 개 뉴클레오티드 이상 분리시키며, 정보 코드의 시작 지점을 숨길 수 있는 완충 영역으로 이루어진 DNA로서, 금속 이중층 수산화물로 상기 DNA를 캡슐화하는 단계를 포함하는 방법에 의해 안정화된 DNA인 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, DNA 추출 단계는 DNA-금속 이중층 수산화물 캡슐을 증류수에 분산시켜 인산 완충 용액을 사용하여 pH를 2.5 ~ 3에 맞춘 뒤 20 ~ 40 분 동안 저어줌으로써 금속이중층 수산화물층을 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, DNA 수거 단계에서 DNA의 농도가 500 펨토몰 (10-15 mol/L) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, DNA의 농도가 100 펨토몰 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, DNA 판독 단계에서 증폭된 DNA의 소정 DNA와의 일치 여부를 전기영동에 의해 판독하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12 항에 있어서, DNA 판독을 증폭된 DNA를 자동 서열결정기로 서열 결정한 후, 대응하는 문자 및/또는 숫자열로 변환하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 삭제
  19. 제 12 항에 있어서, 폴리피롤-마게마이트 하이브리드 나노 입자는 마게마이트 나노 입자를 과량의 액상 피롤에 분산시킨 후, 과량의 피롤을 제거하여 표면이 피롤로 젖은 상태의 마게마이트 나노 입자를 얻고, 여기에 0.1 ~ 0.2 M 농도의 3가 염화철 에탄올 용액을 첨가하여 30분 ~ 1시간 동안 저어줌으로써 피롤의 중합반응을 유도하고, 반응이 끝난 뒤에는 에탄올로 수세하여 반응하지 않은 피롤을 제거함으로써 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 12 항에 있어서, 폴리피롤-마게마이트 하이브리드 나노 입자를 추출된 DNA 용액에 혼합하여 분산시킨 후, 분산액 중 폴리피롤-마게마이트 부분을 자석을 이용하여 수거하는 것을 특징으로 하는 방법.
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