KR101212326B1 - 뿌리는 나노 ｄｎａ 바코드를 이용한 인삼 원산지 판별 방법 - Google Patents

뿌리는 나노 ｄｎａ 바코드를 이용한 인삼 원산지 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 눈에 보이지 않는 뿌리는 나노 DNA 바코드를 이용한 인삼 원산지 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 인삼 원산지에 대한 정보를 형광물질이 부착된 소정의 염기서열(A,T,G,C)로 구성된 DNA 바코드 분자로 암호 코드화하고, 박리화된 하이드로탈사이트 무기 나노물질로 캡슐화하여 나노 DNA 바코드 복합체를 제조한 다음, 인삼의 특정 부위(비식용 뇌두부위) 표면에 도포하여, 원산지 판별 필요시에 나노물질로 캡슐화된 DNA 바코드의 염기서열을 회수한 후 바이오칩으로 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 첨단 나노-바이오 융합 기술을 인삼 원산지 판별 시스템에 접목함으로써 인삼 원산지의 위조, 복제, 둔갑 가능성을 원천 봉쇄할 수 있다. 더 나아가, 인삼 유통과정에서 국내산과 외국산의 구별, 국내산으로 둔갑된 외국산 인삼 적발, 국내 우수 인삼 원산지간의 판별을 통해 인삼 유통질서를 확립하고 소비자 신뢰를 제고하는데 기여할 수 있으며, 국내 우수 원산지 인삼을 보호할 수 있다. 또한 인삼의 원산지 판별 이외에도 인삼 품종 혼합 판별, 인삼 연근 판별 등 다양한 분야에 적용이 가능하다.

Description

뿌리는 나노 ＤＮＡ 바코드를 이용한 인삼 원산지 판별 방법{Method for Discrimination of Ginseng Origin Utilizing Nano DNA Barcode}
본 발명은 뿌리는 나노 DNA 바코드를 이용한 인삼 원산지 판별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 인삼 원산지에 대한 정보를 형광물질이 부착되고 소정의 염기서열로 구성된 DNA (DNA 바코드)로 제작하여, 생체친화적인 나노물질로 캡슐화하여 나노 DNA-하이드로탈사이트 복합체를 제조한 다음, 인삼의 특정 부위(비식용 뇌두부위)에 도포하여, 필요시에 나노물질로 캡슐화된 DNA 바코드를 염기서열을 회수한 후 바이오칩으로 염기서열을 판독하여 인삼 원산지를 판별하는 방법에 관한 것이다.
종래 우리나라에서는 한약재, 농산물, 한우, 돼지 등 먹거리로 이용되고 있는 다양한 식물 자원 또는 가축 자원에 대하여 국민의 건강 증진을 위한 안전성 확보를 위하여, 이들 자원의 품종 판별 또는 원산지 판별 방법에 관한 연구가 계속되어 왔다.
아울러, 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종내 품종간 분류를 하고자 하는 연구가 진행되어 오고 있으며 그 가능성이 극히 높은 것으로 평가되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 변종의 감별은 그 변종의 양적수준과 더불어 다수의 특성을 파악하여 알 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 이미 이러한 DNA 분석에 의한 원산지 판별 방법에 관해서는 한우, 돼지, 벼 품종 등의 판별에도 적용되고 있는 실정이다.
이 중에서, 한약재 또는 건강식품의 원료로써 널리 애용되고 있는 인삼의 경우, 우리나라에서의 인삼 생산은 1984년 10,000톤 내외에서 1993년에는 약 14,800톤으로 10년간 50%정도 증가하였으며, 이용면에서 홍삼원료삼과 백삼원료삼의 비율은 약 2:8 정도이다. 홍삼원료삼은 한국담배인삼공사에서 전량 수매하며 백삼과 기타 가공원료삼은 강화와 금산을 중심으로 유통되어 왔다. 그러나 최근에는 해외 농수산물의 수입이 급증하면서 원산지가 표시되지 않거나 국내산으로 둔갑되는 등의 불법 유통이 성행하고 있다. 특히 전 세계적으로 우수한 품질을 인정받고 있는 국내 인삼은 중국산을 중심으로 위조된 가짜 상품이 시중에 대량 유통되고 있어 생산자와 소비자들의 불만이 고조되고 있다. 따라서 인삼 유통 질서의 교란을 막기 위해, 국내산 인삼과 위조 및 둔갑된 인삼에서의 국내산 진품 판별과 국내 인삼간의 원산지 판별을 위한 원산지 추적 시스템 구축이 절실히 필요한 실정이다.
인삼의 분류학적 연구는 형태적 형질이나 동위효소(同位酵素) 분석 등 몇 가지 방법들이 개발되어 이용되어왔으나, 이러한 방법들은 동일 속(屬)의 종(種)분류에는 적용성이 높으나, 인삼은 표현형이 단순하기 때문에 비교적 유연관계가 가까운 종(種)내에서 변종 및 육종계통 간의 분류나 품종의 판별에는 이러한 방법들은 적절치 못하다. 최근 작물의 원산지 판별 기술 개발을 위해 최신기기 (ICP-MS, LC/MS/MS 등)를 이용한 동위원소, 미량원소, 저분자 화합물을 대상으로 연구가 일부 진행되고 있으나, 출처가 확실한 샘플의 판정은 가능하지만, 미지의 샘플 검정시 국내산 또는 외국산을 판정하는 것은 사실상 불가능하다.
또한, 일 예로, RFLP 기술(제한효소 단편 장다형, Resthction Fragment Length Polymorphism)을 이용한 인삼의 변종간 분류 방법 제안되었으나, 인삼 변종 들 내의 DNA 구조를 제한 효소를 이용하여 분석해서 그 차이점을 검토한 바 차이가 나타나지 않아, 인삼의 변종 및 육성계통(育成系統)에 대한 RFLP 방법의 이용은 세포질 유전자로는 한계가 있음이 밝혀졌고, 또한 RFLP는 순도가 높은 DNA가 다량으로 필요하며 시간과 노력이 많이 소요되는 단점이 있다. 그리고 비용이 많이 소요될 뿐 아니라 시험과정이 복잡하고 방사성 동위원소를 이용해야 하는 난점도 있다.
이에 따라, 대한민국 등록특허 제10-0215084호는 상기 문제점들에 착안하여 기술적으로 단순하고 다형상성(Polymorphism)의 추적이 용이한 RAPD 표지를 이용한 고려인삼의 산지 판별방법을 제공하고 있으나, 이들 방법 모두 복잡한 고도의 분자생물학적 기술을 사용하여야 하므로, 시험 과정이 복잡하고, 비용이 많이 소요될 뿐 아니라, 원산지 또는 품종의 신속한 판별에는 적절치 못하다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 분자생물학, 나노기술 등 최신 융합 기술을 이용하여, 인삼 원산지에 대한 정보를 임의적인 형광물질이 부착된 DNA 염기서열 (DNA 바코드)로 제작하여, 생체친화적인 나노물질로 캡슐화하여 나노 DNA 바코드를 제조한 다음, 인삼의 특정 부위(비식용 뇌두부위)에 도포하여, 필요시에 나노물질로 캡슐화된 DNA 바코드를 염기서열을 회수한 후 바이오칩으로 염기서열을 판독하여 인삼 원산지를 판별하는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 국내 우수한 인삼의 올바른 유통을 위해, 이와 관련된 대내외 지적재산권 확보하고, 또한, 나노기술을 접목시킴으로써 정확성 및 재현성이 높은 인삼의 국내외 원산지 판별기술을 개발하고자 하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 목적은, 원산지별로 상이하게 제작한 소정의 DNA 염기서열인 "DNA 바코드"를 생체친화적인 나노물질로 캡슐화한 나노 DNA 바코드 복합체를 인삼에 도포시켜, 필요시에 상기 나노 DNA 바코드 복합체 내 DNA 바코드 염기서열을 확인함으로써 원산지를 판별하는 것을 특징으로 하는, 인삼의 원산지 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 인삼의 특정 원산지 정보를 소정의 염기서열을 가지는 DNA에 형광물질을 부착하여, 암호 코드화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 인삼의 특정 원산지 정보인 DNA 바코드를 인삼 도포에 용이하고, 인삼 유통 과정에서 훼손 및 손상되지 않도록, DNA 바코드를 생체친화적인 무기 나노물질로 캡슐화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 인삼의 특정 원산지 정보인 DNA 바코드를 캡슐화하여 얻은 나노 DNA 바코드 복합체(DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체)가 도포된 인삼을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 DNA 바코드와 혼성화 결합을 할 수 있는 상보적인 염기서열로 구성된 DNA 프로브가 고형기질에 고정된, 인삼의 원산지 판별용 바이오칩을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 국내 인삼 원산지에 대한 정보를 다양한 형광물질 부착과 소정의 DNA 염기(A,T,G,C)를 이용하여 임의의 서열을 암호 코드(DNA 바코드)로써 제작하고, 이러한 특정 원산지 정보인 DNA 바코드를 생체친화적인 무기 나노물질로 캡슐화하여 안정화시키는 것이다. 이와 같은 나노 DNA 바코드 복합체는 스프레이법 또는 함침법으로 인삼 특정 부위 (비식용 뇌두 부위) 표면에 매우 쉽게 도포될 수 있으며, 무기 나노물질로 캡슐화되어 복합체를 구성되어 있으므로, 인삼 유통 시스템에서 원산지 정보인 DNA 바코드의 안정성을 확보할 수 있다. 나노 DNA 바코드가 도포된 인삼의 바이오 칩을 사전에 제작하여, 무기 나노 물질로 캡슐화된 나노 DNA 바코드를 회수하고 DNA 바코드의 염기서열을 판독함으로써, 손쉽게 인삼의 원산지 판별이 가능하다.
구체적으로 본 발명은 (a) 인삼의 특정 원산지 정보로써 코드화시킨, 형광물질이 결합되고 소정의 염기서열을 가지는 DNA를 무기 나노시트의 하이드로탈사이트로 캡슐화하여 얻은 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체를, 원산지를 알고자하는 인삼에 스프레이법 또는 함침법으로 도포시키는 단계; (b) 상기 인삼으로부터 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체를 분리하고 DNA를 추출하는 단계; 및 (c) 상기 추출된 DNA의 염기서열을 바이오칩을 이용하여 확인함으로써, 인삼의 원산지를 판별하는 단계를 포함하는 인삼의 원산지 판별 방법을 제공한다.
본 발명은, 또한, 인삼의 특정 원산지를 소정의 DNA 염기(A,T,G,C)를 임의적으로 서열화시키고, 다양한 유기 형광물질을 부착하여 암호 코드화시킨, 형광물질이 부착된 DNA인 DNA 바코드를 제공한다.
본 발명은, 또한, 인삼의 특정 원산지 정보가 암호 코드화된 DNA 바코드를 인삼에 도포가 용이하고 유통 과정에서 훼손 및 손상되지 않도록 무기 나노시트 물질로 캡슐화하여 얻은 나노 DNA 바코드 복합체를 제공한다.
본 발명은, 또한, 인삼의 특정 원산지 정보가 캡슐화된 나노 DNA 바코드가 스프레이법 또는 함침법으로 인삼 특정 부위 표면(비식용 뇌두 부위)에 도포된 나노 DNA 바코드 인삼을 제공한다.
본 발명은 또한, 인삼 표면에 도포된 나노 DNA 바코드 내에 캡슐화된 인삼 원산지 정보인 DNA 바코드의 염기서열과 혼성화 결합을 할 수 있는 상보적인 염기서열로 구성된 탐침 DNA가 고형기질에 고정된, 인삼 원산지 판별용 바이오칩을 제공한다.
본 발명에 따르면, 인삼 원산지마다 상이한 임의의 염기서열과 형광물질이 부착된 DNA (DNA 바코드)를 나노물질로 캡슐화한 나노 DNA 바코드 복합체를 인삼 표면(비식용 뇌두 부위)에 도포시키고, 원산지 판별 필요시에 나노 DNA 바코드를 회수하고 캡슐화된 DNA 바코드의 염기서열을 바이오칩으로 판독하여 인삼 원산지를 판별할 수 있다. 따라서, 인삼 원산지 보호요건인 구별성, 균일성, 안정성 확보를 위한 과학적 심사기준을 이용하고자, 첨단 나노-바이오 융합 기술인 눈에 보이지 않는 나노 DNA 바코드를 인삼 원산지 판별 시스템에 접목하여 활용함으로써 인삼 원산지의 위조, 복제, 둔갑 가능성을 원천 봉쇄할 수 있다. 더 나아가, 인삼의 재배, 유통, 판매 시 외국산과 혼합되어 있는 경우, 국내 우수 원산지 인삼의 판별, 또는, 국내 우수 원산지 인삼으로의 둔갑을 방지시키는 것이 가능하여, 유통 질서를 확립하고 소비자 신뢰를 제고하는데 기여할 수 있으며, 국내 우수 원산지 인삼의 보호를 위한 대내외 지적재산권을 확보할 수 있다. 또한 나노 DNA 바코드 기술은 인삼의 원산지 판별 이외에도 인삼 품종 혼합 판별, 인삼 연근 판별 등 다양한 분야에 적용 가능하다.
도 1은 (a) DNA 바코드 분자와 박리화된 하이드로탈사이트가 혼성화 반응을 통해 나노 DNA 바코드 복합체 형성되는 제조과정, (b) 실제 용액 사진, (c) 나노 DNA 바코드 복합체의 크기, 형상, 구조를 분석한 투과전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 (a) 세척전의 인삼 뇌두 표면, (b) 세척후의 인삼 뇌두 표면, (c) 스프레이법으로 나노 DNA 바코드 복합체가 도포된 인삼 뇌두 표면, (d) 함침법으로 나노 DNA 바코드 복합체가 도포된 인삼 뇌두 표면을 주사전자현미경으로 분석한 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 5대 원산지 정보가 암호 코드화된 DNA 바코드를 바이오칩으로 판독하였을 경우, (a) 결과를 예측한 바이오칩 모식도와 (b) 실제 인삼 원산지 DNA 바코드를 판독한 바이오칩 결과 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 나노 DNA 바코드를 이용한 인삼 원산지 판별방법을 블라인드 테스트하여 그 결과를 나타낸 바이오칩 이미지를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 실시예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 실시예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 명세서 및 청구항에 사용된 용어는 종래 알려져 있는 포괄적인 의미의 용어로써 이해되어야 한다.
또한, 성분, 반응 조건 등의 수치를 나타내는 모든 숫자는 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반된 언급이 없다면, 본 발명의 명세서 및 첨부된 청구항에 나타난 수적인 파라미터는 본 발명의 목적하는 바에 따라 달라질 수 있는 근사값이다.
본 발명에서 사용된 용어의 구체적인 설명은 아래와 같다.
본 발명에서, “인삼의 특정 원산지 정보로써 코드화시킨, 형광물질이 부착된 소정의 염기서열을 가지는 DNA”란, DNA를 구성하는 4종류의 염기(A,G,C,T)의 임의 조합으로 서열이 구성되고 다양한 유기 형광물질이 염기의 말단에 부착된 것으로, "DNA 바코드"를 의미한다.
DNA 바코드 제작 시, 염기서열의 코드화는, DNA 염기서열 A, T, C, G 중의 한 개, 다양한 유기 형광물질 중의 한 개가 코드의 단위가 되며 염기서열과 형광물질을 다양하게 조합하여 인삼 원산지 정보를 암호 코드화할 수 있다.
이렇게 소정의 상이한 형광물질이 부착된 DNA 염기서열을 제작함으로써, 이러한 염기서열이 소위 “DNA 바코드”로써 이용되어, 인삼의 특정 원산지별로 코드화가 가능한 것이다.
또한, 상기 DNA 바코드 분자는 다양한 원산지, 다양한 품종, 다양한 연근에 따라 개별 인삼 자체만이 함유하고 있는 서로 상이한 특정 DNA 염기서열일 수 있다. 예컨대, 천풍, 연풍, 선풍, 고풍 및 금풍 등의 품종별로 품종을 구분할 수 있는 특이적인 최적의 DNA 염기서열을 개별 인삼 자체로부터 추출하여 이들을 DNA 바코드의 염기서열로써 사용할 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 인삼의 원산지 판별 방법은 인삼의 품종 혼입에 따른, 품종 판별에도 이용 가능할 것이다.
아울러, 그 동안 인삼 연근 육안 판별 방법은 인삼 뿌리의 머리(뇌두) 줄기 흔적 확인에 의한 연근을 판별하거나, 몸체에서 만들어지는 새로운 지근 수를 확인함으로써 연근을 판단하거나, 연근 체형에 의해 예컨대, 뇌두의 크기와 몸체의 장비폭(몸체의 길이와 직경의 비율)을 이용하여 연근을 판별하여 왔다. 여기에, 연근별로, 예컨대, 4년근, 5년근, 6년근 등의 대사 과정에서 특이적인 발현능 나타내는 DNA를 각각의 인삼으로부터 추출하여 유전자를 상기와 같은 DNA 바코드로써 이용하면 연근 판별에서도 적용 가능할 것이다.
본 발명에서, “나노 DNA 바코드” 또는 “나노 DNA 바코드 복합체”는 "DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체"와 동일한 의미로 사용되며, 상기 DNA 바코드 분자를 무기 나노시트 물질로 캡슐화하여 얻은 나노-바이오 복합체이다. DNA 등의 바이오분자는 효소, 열, 미생물 등 외부요인에 의해 쉽게 변형, 변성 또는 파괴되어 이를 이용하는 데 한계가 있었으나, 이를 무기 나노시트 물질로 이루어진 담체에 캡슐화시킴으로써 나노 DNA 바코드 복합체를 제조하여, 인삼 자체 표면에 DNA 바코드의 도포가 용이하면서도 유통과정에서 다양한 악조건의 외부환경으로부터의 DNA 바코드의 훼손 및 손상 영향을 효과적으로 차단할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "무기 나노시트 물질"은 박리화된 박편상의 하이드로탈사이트를 의미한다. 일반적으로 하이드로탈사이트는 자연계에 존재하는 염기성 무기 미네랄이며, 제산제 활성 물질 및 위산 보호제로서 산도 증가 등의 치료를 위한 경구 투여용 약제학적 조성물과 조성물의 고형제제로서의 분말성을 증가시키기 위한 약물 부형제로도 사용된다. 하이드로탈사이트는 마그네슘-알루미늄으로 구성된 무기 격자층과 탄산음이온이 층간 사이에 배열된 형태의 층상 구조를 갖고 있어 다양한 음이온성 DNA가 캡슐화될 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 있어서, "박리화된 하이드로탈사이트"는 자연계에서 존재하는 하이드로탈사이트 혹은 합성하여 얻어진 하이드로탈사이트를 박리화시킨 박편상의 물질을 의미하는 것으로, 하이드로탈사이트의 층간에 삽입되어 있는 탄산염이 제거되고, 박리되어 박편상의 형상을 이루는 물질이다.
본 발명에 있어서, 이러한 하이드로탈사이트는 생체무해한 무기 나노물질로 잘 알려져 있는 바, (Cellular Toxicity of Inorganic Hydroxide Nanoparticles, Choi et al., Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2007; Safety Aspect of Inorganic Layered Nanoparticles:Size-Dependency In Vitro and In Vivo, Choi et al., Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2008 등), 약용식물인 인삼의 원산지 판별에 적절한 무기 담체이다. 특히, 하이드로탈사이트 또한 식용이 가능한 무기 나노물질이므로, 인삼 원산지 판별 방법에 이용하는 것은 잠재적 섭취시, 독성의 문제가 발생할 소지를 원천적으로 배제할 수 있다.
본 발명에서, "인삼"은 종래 기술분야에 잘 알려져 있는 용어로써, 산형화목 두릅나무과에 속하는 약용 식물로써, 여기에는, 밭에서 채구하여 가공하지 아니하고 70~80% 수분을 유지하고 있는 인삼인 수삼, 수삼을 장기간 저장할 목적으로 수증기로 찐 다음 익혀서 건조시킨 홍삼, 수삼을 대부분 껍질을 벗겨 햇볕에 말리거나 60℃ 이하로 열풍 건조시켜 수분함량을 14% 이하로 낮춘 백삼, 산삼 종자를 얻어 깊은 산속에서 기른 장뇌삼 등, 이 외에도 인삼을 재배 방법이나 가공 방법 등을 통해 다른 형태로 언급하고 있는 모든 종류의 인삼이 여기에 포함될 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 수삼에 대하여 실험을 적용하였으나, 이 이외에 홍삼, 백삼 등에서도 동일한 검출 효과를 나타낼 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 (a) 인삼의 특정 원산지 정보로써 코드화시킨, 형광물질이 결합되고 소정의 염기서열을 가지는 DNA를 무기 나노시트의 하이드로탈사이트로 캡슐화하여 얻은 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체를, 원산지를 알고자하는 인삼에 스프레이법 또는 함침법으로 도포시키는 단계; (b) 상기 인삼으로부터 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체를 분리하고 DNA를 추출하는 단계; 및 (c) 상기 추출된 DNA의 염기서열을 바이오칩을 이용하여 확인함으로써, 인삼의 원산지를 판별하는 단계를 포함하는 인삼의 원산지 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서, DNA에 부착되어 있는 형광 물질은 상기 (c) 단계에서, 바이오칩으로 검출한 DNA 바코드의 판독 여부에 사용된다.
본 발명에 있어서, DNA 바코드의 서열은 그 길이가 유전자 서열의 다양성, 안정성 등을 고려하여, 10 내지 3000bp의 길이를 가질 수 있고, 일 예로, 50bp 내외, 35bp 내외, 예컨대, 30~40bp, 또는 20~30bp 등의 다양한 길이로 제작 가능하다. 소정의 염기서열은 원산지별로 상이하며, 이합체 또는 헤어핀을 형성하지 않도록 제작되어야 하고, Tm, GC 함량을 고려하여 디자인될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광물질은 원산지별로 상이한 형광물질이 결합될 수 있고, DNA의 5‘말단, 또는 3’말단에 결합될 수 있다. 상기 유기 형광물질은 시아닌 (Cyanine), 플루오레세인 (Fluorescein), 알렉사 형광 염료 (Alexa Fluor　Dyes), 오레곤 그린 염료 (Oregon Green Dyes), 오이스터 염료 (Oyster　Dyes), 또는 로다민 염료 (Rhodamine Dyes) 등 일 수 있다.
또한, 상기 유기 형광물질은 인삼이 약용, 식용 식물인 것을 감안하여, 인체에 무해한 식용이 가능한 물질일 수 있으며, 예컨대, 커큐민(curcumin), 알루라 레드 AC (Allura Red AC, FD&C Red No.40), 타르트라진 (FD&C Yellow No. 5), 인디고틴 (FD&C Blue No.2), 에리트로신 (erythrosine, FD&C Red No.3), 선셋 옐로우 (FD&C Yellow No. 6) 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이와 같이 식용 물질을 사용하는 경우에는 농산물, 축산물, 수산물 등 인체에 섭취되는 인삼에 적용되는 경우에도 위해하지 않으므로 생체 안전성을 확보할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 무기 나노시트의 하이드로탈사이트는 층상형 하이드로탈사이트를 박리화하여 제조된 박편상 무기시트일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 무기 나노시트의 하이드로탈사이트는 하기 화학식 1로 표기되는 것일 수 있다:
[화학식 1]
[Mg(1-x)Alx(OH)2]?nH2O
상기 화학식 1에서,
x는 0.1 초과 0.4 미만의 수이며,
n은 0을 초과하는 수이다.
본 발명에 있어서, 상기 박리화된 하이드로탈사이트를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며 예를 들어, 부탄올 등의 유기용매를 사용하는 방법, 포름아마이드를 용매로 사용하는 방법이 바람직하다. 상기 포름아마이드는 층상형의 하이드로탈사이트 층간에 존재하는 수분(H2O)과 강한 수소 결합을 하여 층간 사이에 삽입되고 층간 간격을 팽창시켜 판상 격자를 박편상 쉽게 박리화할 수 있다 (Chem. Mater., 2005, 17, 4386.). 또한, 상기 포름아마이드를 이용한 박리화 방법은 별도의 온도를 가해주지 않아도 박리화 상태를 유지할 수 있다는 장점이 있다. 구체적인 예에서, Mg2Al(OH)6(NO3)?nH2O를 포름아마이드에 0.05% 농도로 분산시켜 상온의 질소 분위기 하에서 교반하면 박리화됨으로써 박편상의 하이드로탈사이트가 된다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 나노 DNA 바코드 복합체인 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체는 하기의 화학식 2로 표기되는 것일 수 있다:
[화학식 2]
[Mg(1-x)Alx(OH)2]y[DNA]z?nH2O
상기 화학식 2에서,
x는 0.1 초과 0.4 미만의 수이며,
y, z, n은 0을 초과하는 수이다.
본 발명에 있어서, 상기 "복합체(hybrid)"는 DNA와 무기 나노시트 물질이 정전기적 인력의 결합으로 삽입되어 있는 형태를 가리키며, 또한, 본 명세서에서, 용어 "나노"는 1000 나노미터(nm) 이하의 직경 또는 길이를 의미한다.
또한, 상기 DNA-하이드로탈사이트 복합체는 용액반응에 의해 쉽게 제조될 수 있다. DNA가 용해되어 있는 용액에 박리화된 하이드로탈사이트 콜로이드 용액을 첨가한 후, 질소 분위기 하에서 교반하면, 양이온성 전하를 띠는 박리화된 하이드로탈사이트와 음이온성 인산기를 갖는 DNA는 강한 정전기적 인력에 의한 자가조립(self-assembly)을 통해 상호 결합되면서 DNA가 박리화된 하이드로탈사이트의 재조합에 의해 캡슐화될 수 있다. 상기 복합체 제조 반응시 DNA 및 박리화된 하이드로탈사이트의 농도, 비율, 적정 속도, 교반시간 등의 조건에 따라서 원하는 조성, 입형 및 입도를 지니는 복합체를 얻어낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 나노 DNA 바코드 복합체는 스프레이법 또는 함침법을 이용하여, 인삼 원산지 정보인 DNA 바코드를 인삼 표면에 매우 쉽고도 용이하게 도포할 수 있다.
인삼은 또한, 부위별로 머리 부위인 뇌두, 몸체 부위인 동체 그리고, 잔뿌리인 지근으로 나눌 수 있으며, 각 부위별로 상기 나노 DNA 바코드 복합체의 도포가 가능하며, 특히, 뇌두 부위는 비식용 부위로써, 유통과정에서 소비자가 섭취하기 직전에 비로소 제거되는 부위이므로, 도포하기에 가장 바람직한 부위일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서, 인삼 표면에 도포되어 있는 나노 DNA 바코드 복합체는 EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid)를 함유하는 pH 4~5 이하의 산성 완충 용액을 사용하여 세척하면, 쉽게 나노 DNA 바코드 복합체가 분리 및 회수되고 무기 나노캡슐도 분해되어 DNA 바코드 분자를 추출할 수 있다.
상기 산성 용액은 예를 들어, 인산 완충용액, 질산, 염산 등을 들 수 있다. 상기 EDTA는 박리화된 하이드로탈사이트로 이루어진 무기 나노캡슐이 분해되었을 때 생성되는 마그네슘 및 알루미늄 금속 양이온과 강하게 결합하여 킬레이트 화합물을 형성하는 물질이다. 따라서, 나노 DNA 바코드 복합체를 이루는 무기 나노물질이 분해된 부산물을 제거하여 내부에 캡슐화된 DNA 바코드 분자를 안전하게 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서는 상기 인삼 원산지 정보가 코드화된 DNA 바코드 분자의 염기서열과 혼성화 반응이 일어나는 상보적인 염기서열을 가진 탐침 DNA가 고형기질에 고정된 바이오칩을 이용하게 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 바이오칩에서 혼성화 반응 여부는 상기 인삼 원산지 정보가 코드화된 DNA 바코드에 부착된 형광물질이 나타내는 형광 이미지를 통해 판독할 수 있다. 바이오칩을 이용할 경우, 나노몰 단위이하의 극미량 DNA 바코드 분자만으로도 수초 이내의 반응시간 내에서 DNA 함유 유무를 검출 및 판독해 낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탐침 DNA는 인삼의 원산지별로 특정한 패턴으로 배열되어 있어서, 혼성화 반응을 통해 상기 바이오칩 상의 패턴을 검출하면, 특정 원산지로 확인할 수 있으며, 이러한 혼성화 반응여부는 형광이미지 검출을 통해 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 바코드 분자의 염기서열을 해석하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로, PCR 기법 등 종래 알려진 염기서열 분석 방법을 이용하여 구체적인 염기서열을 해석할 수도 있다.
특히 본 발명에 있어서, 하기 실시예에서 나타난 바와 같이, 상기 바이오칩은 10×10 (100개 spot) 배열의 경우, 나노몰 농도의 극미량 DNA 바코드 분자만으로도 혼성화 반응이 발생하고 혼성화 시간이 최소 30초 내에 판별이 가능하여, 신속하고 정확한 검출 및 판독이 가능하다. 그 외에, 더 많은 수의 아주 높은 밀도, 높은 밀도, 중간 밀도, 낮은 밀도의 바이오칩에서도 동일한 신속성 및 정확성을 나타낼 것이다.
또한 상기 고형기질은 DNA 바코드 분자에 부착된 형광물질의 검출을 허용하며 신호 방출을 간섭하지 않는 소재라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 가소성 물질, 세라믹, 유리, 폴리스티렌, 메틸스티렌, 아크릴 중합체, 상자성 물질, 토리아 솔, 탄소 그래파이트, 이산화티탄,라텍스 또는 가교-결합된 덱스트란 예컨대 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 가교 결합된 마이셀(micelle), 테프론(Teflon) 등을 들 수 있다.
상기 고형기질의 표면 및 탐침 DNA는 고정을 용이하게 하기 위해 개질될 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노기, 카르복시기, 옥소기 및 티올기 등의 반응성 작용기 또는 링커 분자를 포함하도록 개질될 수 있다. 구체적인 예에서, 유리 슬라이드는 알데하이드(－CHO) 등으로 표면개질될 수 있고, 상기 탐침 DNA는 말단에 아민(NH2)이 부착될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 인삼의 특정 원산지 정보가 코드화된 형광물질이 결합된 소정의 염기서열을 가지는 DNA를 무기 나노시트의 하이드로탈사이트로 캡슐화하여 얻은 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체 내에 포함된 DNA와 혼성화 결합을 할 수 있는 상보적인 염기서열로 구성된 탐침 DNA가 고형기질에 고정된, 인삼 원산지 판별용 바이오칩에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오칩 상에 인삼의 원산지마다 상보적인 염기서열을 갖는 탐침 DNA가 특정한 패턴으로 배열되어 있을 수 있다. 또한, 상기 바이오칩은 DNA 바코드 분자가 혼성화되는 위치를 사전에 임의로 디자인하여 판독 결과가 특정 인삼 원산지를 나타내는 형광 그래픽 이미지로 판독될 수 있다. 이에, 디자인한 패턴 이미지와 혼성화 반응에 의한 형광 그래픽 이미지가 일치하는지 여부를 통해 인삼의 원산지 판별을 쉽게 수행할 수 있다. 미지의 인삼 시료로부터 추출된 DNA 바코드 분자를 적용하여, 패턴화된 이미지가 광학 그래픽 이미지로써 나오지 않는 경우는, 특정 원산지의 인삼이 아니라고 판별할 수 있는 것이며, 복수의 원산지 탐침 DNA분자들을 여러 모양으로 패턴화한 하나의 바이오칩에서 미지의 DNA 바코드 시료를 적용함으로써, 특정 인삼의 원산지 유래임을 손쉽게 추적 및 판별할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오칩에 고정되는 탐침 DNA는 인삼 원산지마다의 특정한 패턴으로 배열되어 있어서, 혼성화 반응을 통해 검출된 상기 바이오칩 상의 패턴을 판독하면, 특정 인삼 원산지로 즉시 판별 확인됨을 특징으로 할 수 있다. 예컨대, 인삼의 원산지별로, 풍기인삼, 강화인삼, 금산인삼 마다 바이오칩에 각각의 탐침 DNA의 패턴을 다르게 디자인하는 것으로, 풍기 인삼을 바이오칩에 센서 내에 “A”라는 글자로 패턴화하고, 강화인삼을 “B”라는 글자로, 금산 인삼을 “C”라는 글자로 패턴화하면, 원산지를 알 수 없는 인삼으로부터 추출한 DNA 바코드 분자를 적용하여, 상기 어떤 형상의 패턴 글자로 판독 되는지 만을 확인함으로써 바로 즉시 인삼 원산지 판별이 가능한 것이다.
본 발명은 다른 측면에서, 인삼의 특정 원산지 정보인 DNA 바코드를 캡슐화하여 얻은 나노 DNA 바코드 복합체인 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체가 도포된 인삼에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 나노 DNA 바코드가 도포된 인삼은 국내의 경우 원산지마다, 예컨대, 풍기 인삼, 강화 인삼, 또는 금산 인삼일 수 있으며, 인삼의 품종별로는, 상기 인삼은 예컨대, 천풍, 연풍, 고풍, 금풍 또는 선풍일 수 있으며, 연근별로는 4년근 인삼, 5년근 인삼, 6년근 인삼 등 일 수 있다. 따라서, 상기 나노 DNA 바코드가 도포된 인삼은 품종 및 연근 판별 방법에도 적용가능할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 관리 기관에서 인삼 유통 구조 시스템의 재정립을 통해 인삼 원산지 생산 이력 추적 시스템을 구축할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예에는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
DNA 바코드 분자 제작
인삼 대표 5대 원산지 정보로써, 시아닌(cyanine) 형광물질이 부착된 소정의 염기서열을 암호 코드화하여 제작하였다. 35bp (base pair) 길이의 서로다른 염기서열을 갖는 5개의 단일가닥 DNA를 제작하고, 5’ 말단에 녹색 형광을 띄는 시아닌3 형광물질을 공유결합으로 부착하였으며, 구체적인 염기 서열은 아래와 같다:
A 원산지: 5'-(Cy3)-GCC AGC AGC CAC ACC AGA ATG ATG AGC GTC CGA AT-3' (서열번호 : 1)
B 원산지: 5'-(Cy3)-GAG TAC TAT AAA ATT AAA GTG GCC GAC CTG TTG TC-3' (서열번호: 2)
C 원산지: 5'-(Cy3)-GTC ACG ACA TCA AAG AAG ATT TTT CCA ATT TAA TC-3' (서열번호: 3)
D 원산지: 5'-(Cy3)-GAA GTG CAC AAA GGA TCG CTG AAG ACA TCT GTA CC-3' (서열번호: 4)
E 원산지: 5'-(Cy3)-ATA TTA CAA GTC GTT GGA TAT TGC CCA TGC AGA CG-3' (서열번호: 5)
또한, 각각의 5개 단일가닥 DNA와 상보적인 염기서열을 가지며, 5’말단에 적색 형광을 띄는 시아닌5 형광물질이 공유결합되어 있는 동일한 35bp 길이의 단일가닥 DNA 또한 제작하였다. 상기 DNA는 Integrated DNA Technologies(미국)에 의뢰하여 제작하였다. 각각의 단일가닥 DNA의 염기서열은 헤어핀 루프(Hairpin loops)나 자가 이량체(Self dimer)가 형성되지 않도록 제조되었다.
DNA 바코드를 제작하기 위해, 원산지마다 상보적인 2개의 단일가닥 DNA를 각각 STE 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 nM NaCl, 1 mM EDTA)에 같은 농도로 용해시켜, 95℃에서 2분간 가열한 후 상온에서 천천히 식힘으로써 이중가닥 형태의 DNA 바코드가 제작되었다.
박리화된 하이드로탈사이트 무기 나노시트 물질 제조
공침반응 및 수열반응을 통하여 100 ㎚ 크기의 층상형 하이드로탈사이트 나노물질을 제조한 후, 박리화시켜 박편상의 하이드로탈사이트를 제조하였다.
0.3 M Mg(NO3)2?H2O, 0.15 M Al(NO3)3?H2O를 탄산 음이온(CO3 2 -)이 제거된 3차 증류수에 녹이고, pH가 9 내지 11이 될 때까지 0.5 M NaOH로 적정한 후, 상온에서 30분간 강하게 교반하여 층상형 하이드로탈사이트 결정을 얻은 후, 수열합성 용기에 넣고 100℃에서 12 시간 동안 교반한 후, 세척과정을 통해 미반응 염을 제거하여 100 ㎚의 균일한 크기의 하이드로탈사이트를 얻었다.
합성한 층상형 하이드로탈사이트를 포름아마이드에 0.05 중량%로 분산시켜, 상온에서 질소 분위기를 유지하며 2일간 강하게 교반하여, 박리화된 박편상의 하이드로탈사이트 무기 나노시트를 제조하였다.
나노 DNA 바코드 복합체 제조
박리화된 하이드로탈사이트를 이용한 나노 DNA 바코드 복합체(DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체)의 제조과정 및 실제 사용된 물질은 도 1(a)와 도 1(b)에 개략적으로 나타나있고, 구체적인 과정은 다음과 같다.
박리화된 하이드로탈사이트 무기 나노시트 콜로이드 용액에 인삼 원산지 정보가 코드화된 DNA 바코드 분자가 증류수에 용해되어 있는 수용액을 1:0.75의 중량 비율로 혼합하여 상온에서 30분간 교반하였다. 반응이 끝난 후, 증류수로 세척하여 나노 DNA 바코드 복합체를 제조하였다. 전 과정은 공기 중의 이산화탄소에 의한 탄산 음이온 생성을 방지하기 위하여 질소 분위기하에서 진행하였다.
실험예 1: 나노 DNA 바코드 복합체의 X선 회절 분석
상기 실시예 3에 따라 제조된 나노 DNA 바코드 복합체의 형상 및 결정 구조를 미세하게 확인하기 위하여, 투과 전자 현미경 분석을 수행하였다. 나노 DNA 바코드 복합체를 에폭시 수지에 고정하여 50 ㎚ 두께로 절단하고 특정한 염색 과정 없이 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 1(c)에 나타내었다.
도 1(c)에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 3에서 제조한 나노 DNA 바코드 복합체는 매우 얇은 박리화된 하이드로탈사이트 무기 나노시트가 무질서하게 DNA 바코드 분자를 코어-셀 구조로 캡슐화시키면서 복합체가 형성되었음을 알 수 있다. 박리화된 하이드로탈사이트 무기 나노시트는 DNA 바코드 분자 주위에 재조합되면서 약 10 ㎚ 두께로 무기 나노셀을 형성하였고, DNA 바코드 분자가 그 안에 캡슐화된 약 150 ㎚ 크기의 완벽한 코어-셀 구조의 나노 DNA 바코드 복합체임을 알 수 있다.
인삼 뇌두 표면에 나노 DNA 바코드 복합체 도포
상기 실시예 3에서 제조한 나노 DNA 바코드 복합체를 증류수에 0.01 중량%로 분산시킨 후, 일정량의 복합체 용액을 스프레이로 분사시켜, 일정량의 복합체 용액에 함침시켜, 인삼 뇌두 표면에 도포하였다.
도 2는 인삼 뇌두 표면 및 상기 실시예 4에서 스프레이법 및 함침법으로 나노 DNA 바코드 복합체를 도포시킨 인삼의 뇌두 표면의 주사전자현미경 이미지이다.
인삼의 뇌두 표면을 주사전자현미경으로 관찰해보면, 세척 전의 뇌두는 인삼 재배 토양에서 비롯된 다양한 물질이 분포되어 있는 기와지붕 형태의 표면이 보이며 (도 2(a)), 세척 후에는 돌기가 형성되어 있는 무공성 표면임을 알 수 있는데 (도 2(b)), 나노 DNA 바코드 복합체를 스프레이법 및 함침법으로 도포한 결과, 친수성 용매에 분산되어 있는 나노 DNA 바코드가 인삼 내부로 흡수되지 않고, 인삼 표면에 물리적 흡착으로 고르게 분포되어 있었다 (도 2(c)). 또한 실제 인삼의 유통 구조에서 보관되는 7일간의 냉장 보관(4℃) 후에도 인삼 표면에 도포된 나노 DNA 바코드가 손상 및 훼손되지 않고 계속 유지되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 2(d)).
5대 원산지 인삼 시료는 2009년 10월 대한민국 서울특별시 동대문구 제기동 소재 약령시장에서 4년근 인삼을 20채씩 구입하여 실험을 수행하였다. 각각 원산지마다 20채 인삼에 각 원산지에 해당하는 나노 DNA 바코드 복합체를 스프레이법 및 함침법으로 도포시켜, 안정성을 시험하였다.
DNA 바코드 바이오칩 제작
상기 실시예 1의 단일가닥 서열번호 1 내지 5에 각각 상보적인 염기서열을 갖고, 5' 말단에 아민이 부착된 12개의 티민을 포함하는, 서열번호 6 내지 10으로 기재되는 47 bp 길이의 탐침 DNA A 내지 E를 제조하였다.
A 원산지 탐침 DNA: 5'-NH2-TTTTTTTTTTTT ATT CGG ACG CTC ATC ATT CTG GTG TGG CTG CTG GC -3'(서열번호 6)
B 원산지 탐침 DNA: 5'-NH2-TTTTTTTTTTTT GAC AAC AGG TCG GCC ACT TTA ATT TTA TAG TAC TC -3'(서열번호 7)
C 원산지 탐침 DNA: 5'-NH2-TTTTTTTTTTTT GAT TAA ATT GGA AAA ATC TTC TTT GAT GTC GTG AC -3'(서열번호 8)
D 원산지 탐침 DNA: 5'-NH2-TTTTTTTTTTTT GGT ACA GAT GTC TTC AGC GAT CCT TTG TGC ACT TC -3'(서열번호 9)
E 원산지 탐침 DNA: 5'-NH2-TTTTTTTTTTTT CGT CTG CAT GGG CAA TAT CCA ACG ACT TGT AAT AT -3'(서열번호 10)
유리 슬라이드 표면을 알데하이드로 개질한 후, 49 ㎟의 면적에 총 100 개(가로 10 X 세로 10)의 스팟(spot)에 상기 탐침 DNA를 고정함으로써 인삼 원산지 판별용 바이오칩을 제작하였다. 하나의 스팟에는 한 종류의 탐침 DNA를 고정하였고, 상기 5 종류의 탐침 DNA의 스팟 위치 패턴을 적절히 조절함으로써, 5대 인삼 원산지 DNA 바코드와 상보적인 염기서열의 탐침 DNA의 혼성화 반응을 유도하여, 도 3(a)에 나타낸 바와 같이 판독된 이미지가 원산지별로 독특한 패턴으로 나타나도록 디자인 하였다.
인삼으로부터 나노 DNA 바코드 판독 및 인삼 원산지 판별
상기 실시예 4에서 준비한 나노 DNA 바코드가 도포된 인삼을 임의로 혼합한 후에, 고유 특정 원산지를 판별하기 위하여, 인삼 뇌두를 절단하고 나노 DNA 바코드 복합체를 수거하여 DNA 바코드 정보를 검출하였다.
EDTA 0.05 중량%가 함유된 인산 완충 용액 (pH 2)으로 절단한 인삼 뇌두를 세척하여 나노 DNA 바코드 복합체를 뇌두 표면으로부터 분리수거한 후, 나노 DNA 바코드 복합체를 함유하고 있는 산성 완충 용액을 5분간 교반하여 DNA를 캡슐화하고 있는 무기 나노물질인 박리화된 하이드로탈사이트를 분해시켰다. DNA 바코드 분자가 추출된 용액 5㎕ (DNA 10nM 함유)을 뉴클레아제가 없는 바이오칩용 혼성화 완충용액(30% 포름아마이드, 5X SSC, 0.1% SDS, poly A) 10 ㎕에 용해시킨 후, 95℃에서 5분간 가열함으로써 단일가닥 형태의 DNA 바코드 분자로 만들었다.
상기 실시예 5에서 제작한 바이오칩에 상기 단일가닥 DNA 바코드 분자가 포함된 용액 15 ㎕를 올려서 1초 동안 혼성화 반응을 진행한 후, 곧바로 1 내지 3차 세척 (1차: 2xSSC, 0.1% SDS 2차: 0.1xSSC, 0.1% SDS 3차: 0.1xSSC)을 하였다. 상기 세척된 바이오칩을 건조한 뒤, 형광스캐너 (Molecular Devices, GenePix 4200B)로 이미지를 스캔하였다.
그 결과, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 각 인삼으로부터 나노물질 내 캡슐안에 안정화된 DNA 바코드를 추출하여 판독하면, 각각의 원산지마다 독특한 녹색 및 적색으로 이루어지는 그래픽 이미지로 원산지를 판독할 수 있다. 또한 각 원산지마다 개별형으로 검출할 수도 있으며, 국내 원산지를 일괄적으로 판별해 낼 수 있는 통합형 검출도 가능할 수 있다. 따라서 이에 본 발명의 나노 DNA 바코드가 접목된 인삼 원산지 판별 방법은 신속하고 정확하게 판독해낼 수 있어 접근성이 높은 인삼 원산지 생산이력추적시스템으로 구축될 수 있다.
나노 DNA 바코드를 이용한 인삼 원산지 판별 블라인드 테스트 ( Blind test )
상술된 방법에 의해 개발된 본 발명에 의한 인삼 원산지 판별 방법을 검증하기 위해, A원산지, B원산지, 중국산 인삼 시료를 준비하여 블라인트 테스트를 실시하였다.
A원산지 인삼 뇌두 표면에 상기 실시예 3에서 준비한 나노 DNA 바코드 복합체를 도포시키고, B원산지 인삼 뇌두 표면에 상기 실시예 4에서 준비한 나노 DNA 바코드 복합체를 도포시키고, 중국산 인삼 뇌두 표면에는 DNA 바코드가 없는 순수한 하이드로탈사이트 무기 나노물질만을 도포시켰다. 그 다음, 수검자가 알 수 없도록 인삼을 혼합하고 번호를 부여한 뒤, 원산지 판별을 실시하였다. 인삼 표면으로부터 나노 DNA 바코드 복합체를 수거하여, DNA 바코드를 추출하고, 바이오칩으로 검출하는 과정은 상술된 실시예와 동일한 방법으로 진행하였다. 그 결과, (1)번 인삼은 아무런 판독 정보가 없어 중국산으로 판별되었으며. (2)번 인삼은 B원산지 인삼으로, (3)번 인삼은 A원산지 인삼으로 각각의 특정 원산지를 100% 정확하게 판별하였고 중국산과 혼재된 인삼으로부터 국내 우수 원산지를 100% 분별해 낼 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (17)

  1. 다음의 단계를 포함하는 인삼의 원산지 판별 방법:
    (a) 인삼의 특정 원산지 정보로써 코드화시킨, 원산지별로 상이한 형광물질이 결합되어 있고, 원산지별로 상이한 소정의 염기서열로 구성되어 있는 DNA를 무기 나노시트의 하이드로탈사이트로 캡슐화하여 얻은 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체를, 원산지를 알고자하는 인삼에 스프레이법 또는 함침법으로 도포시키는 단계;
    (b) 상기 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체가 도포된 인삼으로부터 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체를 분리하고 DNA를 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 추출된 DNA의 염기서열을 인삼의 원산지별 유래 DNA와 상보적인 서열을 가지는 탐침 DNA가 특정한 패턴으로 배열되어 있는 바이오칩과 반응시켜 상기 바이오칩 상의 패턴을 검출?확인함으로써, 인삼의 원산지를 판별하는 단계.
    (상기 (a) 단계에서의 무기 나노시트의 하이드로탈사이트는 하기 화학식 1로 표현되는 것임)
    [화학식 1]
    [Mg(1-x)Alx(OH)2]?nH2O
    상기 화학식 1에서,
    x는 0.1 초과 0.4 미만의 수이며,
    n은 0을 초과하는 수이다.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서, DNA의 염기서열은 10 내지 3000 bp 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 형광물질은 인체에 무해하여 식용이 가능한 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 식용가능한 형광물질은 커큐민(curcumin), 알루라 레드 AC (Allura Red AC, FD&C Red No.40), 타르트라진 (FD&C Yellow No. 5), 인디고틴 (FD&C Blue No.2), 에리트로신 (erythrosine, FD&C Red No.3), 또는 선셋 옐로우 (FD&C Yellow No. 6)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 형광물질은 시아닌 (Cyanine), 플루오레세인 (Fluorescein), 알렉사 형광 염료 (Alexa Fluor　Dyes), 오레곤 그린 염료 (Oregon Green Dyes), 오이스터 염료 (Oyster　Dyes), 또는 로다민 염료 (Rhodamine Dyes)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 상기 무기 나노시트의 하이드로탈사이트는 층상형 하이드로탈사이트를 박리화하여 제조된 박편상 무기시트인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 상기 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체를 인삼의 뇌두, 동체, 또는 지근에 도포시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체는 EDTA를 함유하는 산성 용액을 처리하여 인삼으로부터 분리하고 DNA를 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서의 확인은 상기 DNA와 혼성화 반응을 할 수 있는 상보적인 서열을 가진 탐침 DNA가 부착된 바이오칩에 상기 DNA를 반응시켜 혼성화 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 (c) 단계에서, 혼성화 반응 여부를 상기 (a) 단계의 DNA에 결합되어 있는 형광물질을 검출함으로써 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 혼성화 반응 여부는 형광이미지 검출을 통해 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 DNA의 염기서열을 해석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 인삼의 특정 원산지 정보가 코드화된 형광물질이 결합된 소정의 염기서열을 가지는 DNA를 무기 나노시트의 하이드로탈사이트로 캡슐화하여 얻은 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체 내에 포함된 DNA와 혼성화 결합을 할 수 있는 상보적인 염기서열로 구성되며, 인삼의 원산지별 유래 DNA와 상보적인 서열을 가지는 탐침 DNA가 고형기질에 특정한 패턴으로 배열되어 고정된, 인삼 원산지 판별용 바이오칩.
  17. 인삼의 특정 원산지 정보가 코드화된, 형광물질이 결합된 소정의 염기서열을 가지는 DNA를 무기 나노시트의 하이드로탈사이트로 캡슐화하여 얻은 DNA-하이드로탈사이트 나노 복합체가 도포된 인삼.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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