CN105727316A - 一种表面增强拉曼探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表面增强拉曼探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表面增强拉曼探针，所述表面增强拉曼探针包括多层核壳结构金纳米颗粒及包覆在所述多层核壳结构金纳米颗粒外面的介孔二氧化硅层。本发明所提供的表面增强拉曼探针生物相容性好、拉曼信号稳定、拉曼信号强。本发明还提供了该表面增强拉曼探针的制备方法以及在生物医学成像中的应用。其制备及应用具有制备方法简单、成本低、成像信号强、速度快、灵敏度高、靶向性强、稳定性好、不易发生光漂白等优点，可实现对肿瘤部位及肿瘤边界的精确定位及稳定的反复成像，可以应用在手术过程中指导肿瘤及肿瘤边界的准确切除。

Description

一种表面增强拉曼探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学成像领域，尤其涉及一种表面增强拉曼探针，本发明还涉及该表面增强拉曼探针的制备方法，本发明还涉及该表面增强拉曼探针的应用。
背景技术
癌症严重威胁人类的健康和生命安全，是死亡率较高的疾病之一。目前手术切除仍是治疗癌症的最有效方法之一。但是肿瘤组织呈浸润性生长，和周围正常组织没有明显的界限，因此对于肿瘤边界的精确定位一直困扰着临床医生及科研人员。通常，医生凭借经验对肿瘤组织进行切除，如果少切可能会造成患者癌症复发，而多切又会对患者造成伤害。近年来，伴随着纳米科学和技术的发展，用于癌症成像和治疗的纳米材料也得到了人们的广泛关注。纳米材料粒径小，容易通过细胞屏障，并且由于肿瘤组织微血管通透性增加和不健全的淋巴引流系统产生的高通透高滞留效应，使得其优先在肿瘤部位聚集，从而实现对肿瘤的精确定位。其中基于荧光纳米材料的肿瘤荧光成像因其成像快速、灵敏度高、价格低廉而被广泛关注。但是目前肿瘤荧光成像还存在很多问题限制了它的应用，如很多荧光染料具有毒性、生物组织自发荧光的干扰、荧光易发生淬灭等等。
与荧光成像相比，表面增强拉曼成像特异性好、灵敏度高、不易发生光漂白、不受生物组织自发荧光的干扰，且样品制备简单。但传统的表面增强拉曼探针多是将拉曼分子吸附在粗糙贵金属颗粒表面，探针信号相对较弱、信号稳定性差，体内成像效果不佳。要得到好的成像效果，通常需要信号采集时间长、激光功率大、探针的增强因子大。但是实际应用时又要求成像时间越短越好；并且增强因子越大、激光功率越大，在连续成像时探针就越容易发生光漂白而导致不稳定；且功率加大也会损害样品。因此，制备一种拉曼信号强、信号稳定性高、生物相容性好的表面增强拉曼探针用于生物医学成像，在较低的激光功率和较短的成像时间下，得到好的成像效果是一个迫切需要解决的问题。公开号为CN104914087A，发明名称为“一种多层核壳结构的表面增强拉曼探针及制备方法”的中国专利申请公开了一种多层核壳结构的表面增强拉曼探针及其制备方法，该方法制备的探针拉曼信号强；目前还没有此种表面增强拉曼探针在生物医学成像中应用的文献资料。但此种探针在使用过程中主要存在两个问题：一是其表面活性剂的毒性；二是其在成像过程中的稳定性。探针在制备过程中需要使用高浓度的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)作为表面活性剂及稳定剂，CTAC具有较大的生物毒性，不适宜直接用于生物医学成像。稳定性方面，探针在长时间成像过程中，受到激光和热的影响会产生光漂白。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种新的表面增强拉曼探针，要解决的技术问题是改善现有拉曼探针的生物相容性和拉曼信号的稳定性。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案是：一种表面增强拉曼探针，所述表面增强拉曼探针包括多层核壳结构金纳米颗粒及包覆在所述多层核壳结构金纳米颗粒外面的介孔二氧化硅层。
优选地，所述介孔二氧化硅层厚度为5-100nm。
其中，多层核壳结构金纳米颗粒的制备方法依照公开号为CN104914087A，发明名称为“一种多层核壳结构的表面增强拉曼探针及制备方法”的中国专利申请。
优选地，所述多层核壳结构金纳米颗粒具有金纳米核，所述金纳米核的外部分布有一层或多层拉曼分子层和一层或多层金壳层，其中第奇数层为所述拉曼分子层，第偶数层为所述金壳层，第一层拉曼分子层位于所述金纳米核的外表面，其余每层拉曼分子层位于其前面一层金壳层的外表面，每层金壳层位于其前面一层拉曼分子层的外表面。
更优选地，所述金壳层的层数为一层或两层。
更优选地，所述拉曼分子层中的拉曼分子选自对二巯基苯、对甲苯硫酚、对氨基苯硫酚和2-萘硫醇中的一种。
本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将制备好的多层核壳结构金纳米颗粒加入到表面活性剂的水溶液里，加入碱性溶液调节pH值至10-11，获得碱性的金纳米颗粒溶液；
步骤二：将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中加入含正硅酸四乙酯的甲醇溶液，反应获得包覆介孔二氧化硅层的多层核壳结构金纳米颗粒；
步骤三：将步骤二所得的金纳米颗粒溶液离心，分散于乙醇中，加入离子交换剂超声，洗涤，获得所述的表面增强拉曼探针。
优选地，所述表面活性剂选自十六烷基溴化铵和十六烷基氯化铵中的一种；所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种；所述离子交换剂选自硝酸铵和氯化铵中的一种。
优选地，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将4mg的多层核壳结构金纳米颗粒加入到5ml表面活性剂的水溶液里，加入碱性溶液将溶液的pH值调整至10-11，获得碱性的金纳米颗粒溶液；
步骤二：将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中加入含有5％正硅酸四乙酯的甲醇溶液，每次10-100ul，共加3次，继续搅拌反应10-24h，获得包覆介孔二氧化硅层的多层核壳结构金纳米颗粒；
步骤三：将包覆介孔二氧化硅层的多层核壳结构金纳米颗粒离心，分散于乙醇中，加入少量离子交换剂超声，重复洗涤3-5次后离心分散于乙醇中，获得用于成像的表面增强拉曼探针。
本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针在生物医学成像中的应用。
本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针在细胞水平成像的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
1)将细胞与表面增强拉曼探针溶液共孵育，使表面增强拉曼探针进入细胞内部；
2)用拉曼光谱仪对细胞进行拉曼成像。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)将细胞与0.001-100nmol/L表面增强拉曼探针溶液共同置于细胞培养箱中，以37℃孵育2-24h，使表面增强拉曼探针进入细胞内部；
2)用拉曼光谱仪对细胞进行超快、超灵敏、超稳定的拉曼成像，可长时间成像，并对成像结果进行分析。
优选地，所述的细胞为正常细胞或肿瘤细胞株中的一种。
本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针在动物模型水平成像的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
1)构建肿瘤动物模型；
2)向试验动物体内局部注射表面增强拉曼探针溶液；
3)使用拉曼光谱仪对试验动物的肿瘤部位进行拉曼成像并对成像结果进行分析。
优选地，所述方法包括如下步骤：
1)构建肿瘤动物模型；
2)将表面增强拉曼探针均匀分散于生理盐水或pH＝7.4的PBS溶液中制成0.01-50nmol/L的溶液；
3)向试验动物体内局部注射经超声分散的0.01-50nmol/L的表面增强拉曼探针溶液；
4)注射2-24h后，使用拉曼光谱仪对试验动物的肿瘤部位进行超快、超灵敏的拉曼成像并对成像结果进行分析，实现对肿瘤位置及肿瘤边界的快速、精确定位；并且信号稳定不易发生光漂白，可反复成像对肿瘤边界进行确认。
优选地，所述的局部注射方式为局部皮下注射、皮内注射、肌肉注射、瘤内注射、尾静脉注射或腹腔注射。
更优选地，所述的肿瘤动物模型为原位移植肿瘤模型、原位转移肿瘤模型、皮下接种肿瘤模型、药物诱导肿瘤模型、基因突变肿瘤模型或自发瘤模型。
本发明的有益效果为：
(1)本发明在多层核壳结构金纳米颗粒的最外层金属外表面包覆有5-100nm的介孔二氧化硅层，解决了之前多层核壳结构金纳米颗粒用于生物医学成像存在的表面活性剂毒性问题，以及连续成像过程中的信号稳定性问题。二氧化硅是一种相对稳定的物质，可以提高颗粒的生物相容性，增强颗粒在连续成像过程中的信号稳定性，易于实现表面修饰，并且其制备方法简单，成本低。使用此表面增强拉曼探针可实现在较低的激光功率、较短的积分时间、长时间连续成像过程中获得好的成像效果；
(2)本发明的表面增强拉曼探针的介孔二氧化硅层还具有载药的潜能，在成像的同时，兼具潜在的治疗效果；
(3)本发明的表面增强拉曼探针的制备及其在生物医学成像上的应用具有制备方法简单、成本低、成像信号强、速度快、灵敏度高、靶向性强、稳定性好、不易发生光漂白等优点，可实现对肿瘤部位及肿瘤边界的精确定位及稳定的反复成像，可以应用在手术过程中指导肿瘤及肿瘤边界的准确切除。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明实施例3所制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)的结构示意图；
图2是本发明实施例3所制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)的拉曼光谱，所用拉曼分子为对二巯基苯；
图3是本发明实施例3所制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)被激光连续照射30分钟的信号稳定性结果图；
图4是本发明实施例4所制备的表面增强拉曼探针(三层核壳结构)的结构示意图；
图5是本发明实施例4所制备的表面增强拉曼探针(三层核壳结构)被激光连续照射30分钟的信号稳定性结果图；
图6是本发明实施例5肺癌细胞(H1299)被激光连续照射30分钟的拉曼成像结果图，图中标尺为5um；
图7是本发明实施例6肺癌细胞(H1299)的超快拉曼成像结果图，图中标尺为5um；
图8是本发明实施例7小鼠原位前列腺转移癌的拉曼成像结果图，图中标尺为1000um；
图中：1-拉曼信号分子；2-介孔二氧化硅层。
具体实施方式
实施例1制备双层核壳结构金纳米颗粒
步骤一：将400uL1nmol/L的采用种子生长法制备得到的金纳米核颗粒(粒径为20nm)，加入到1mL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在400uL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核；
步骤二：在金纳米核中加入50uL2mmol/L对二巯基苯的乙醇溶液，混合震荡30分钟后，离心分离、重分散在200uL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在金纳米核的外表面修饰有一层拉曼分子层的第一金纳米颗粒；
步骤三：将第一金纳米颗粒加入到4mL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液、200uL4.86mmol/L氯金酸溶液、200uL40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，振荡搅拌，得到在第一金纳米颗粒的外表面贴覆有一层金壳层的第二金纳米颗粒，即双层核壳结构金纳米颗粒。此处所说的双层核壳结构金纳米颗粒从内到外依次包括金纳米核、拉曼分子层和金壳层(金壳层的层数为一层)。
实施例2制备三层核壳结构金纳米颗粒
步骤一：将400uL1nmol/L的采用种子生长法制备得到的金纳米核颗粒(粒径为20nm)，加入到1mL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在400uL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核；
步骤二：在金纳米核中加入50uL2mmol/L对二巯基苯的乙醇溶液，混合震荡30分钟后，离心分离、重分散在200uL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在金纳米核的外表面修饰有一层拉曼分子层的第一金纳米颗粒；
步骤三：将第一金纳米颗粒加入到4mL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液、200uL4.86mmol/L氯金酸溶液、200uL40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，振荡搅拌，得到在第一金纳米颗粒的外表面贴覆有一层金壳层的第二金纳米颗粒；
步骤四：在400uL第二金纳米颗粒中加入50uL2mmol/L对二巯基苯的乙醇溶液，混合震荡30分钟后，离心分离，重分散在200uL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在第二金纳米颗粒的外表面修饰有又一层拉曼分子层的第三金纳米颗粒；
步骤五：将第三金纳米颗粒加入到4mL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液、200uL4.86mmol/L氯金酸溶液、200uL40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，得到在第三金纳米颗粒的外表面贴覆有又一层金壳层的第四金纳米颗粒，即三层核壳结构金纳米颗粒。此处所说的三层核壳结构金纳米颗粒从内到外依次包括金纳米核、拉曼分子层、金壳层、拉曼分子层和金壳层(金壳层的层数为两层)。
实施例3制备表面增强拉曼探针(双层核壳结构)
步骤一：将5mL0.6nmol/L的实施例1制备的双层核壳结构金纳米颗粒(颗粒粒径为60nm)，加入到5mL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在5mL0.001mol/L十六烷基氯化铵溶液中，加入0.1mol/L的NaOH溶液30ul将溶液的pH值调整至10-11；
步骤二：将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中分三次加入含有5％正硅酸四乙酯的甲醇溶液，每次50ul，继续搅拌反应15h，获得包覆10nm介孔二氧化硅层的双层核壳结构金纳米颗粒；
步骤三：将包覆介孔二氧化硅层的金纳米颗粒离心，分散于乙醇中，加入6-8粒固体硝酸铵颗粒超声，重复洗涤3-4次后离心分散于乙醇中，得到用于成像的表面增强拉曼探针。
所制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)的结构示意图如图1所示。
所制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)的拉曼光谱如图2所示。
所制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)被激光连续照射30分钟的信号稳定性结果如图3所示。
实施例4制备表面增强拉曼探针(三层核壳结构)
步骤一：将5mL0.1nmol/L的实施例2制备的三层核壳结构金纳米颗粒(颗粒粒径为100nm)，加入到5mL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在5mL0.001mol/L十六烷基氯化铵溶液中，加入0.1mol/L的NaOH溶液30ul将溶液的pH值调整至10-11；
步骤二：将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中分三次加入含有5％正硅酸四乙酯的甲醇溶液，每次60ul，继续搅拌反应15h，获得包覆12nm介孔二氧化硅层的三层核壳结构金纳米颗粒；
步骤三：将包覆介孔二氧化硅层的三层核壳结构金纳米颗粒离心，分散于乙醇中，加入6-8粒固体硝酸铵颗粒超声，重复洗涤3-4次后离心分散于乙醇中，得到用于成像的表面增强拉曼探针。
所制备的表面增强拉曼探针(三层核壳结构)的结构示意图如图4所示。
所制备的表面增强拉曼探针(三层核壳结构)被激光连续照射30分钟的信号稳定性结果如图5所示。
实施例5表面增强拉曼探针(双层核壳结构)的细胞应用
将实施例3制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)均匀分散于pH＝7.4的PBS溶液中制成0.2nmol/L的溶液；
选用肺癌细胞(H1299)作为研究对象，将无菌的0.2nmol/L的表面增强拉曼探针溶液与处于对数生长期的H1299细胞置于细胞培养箱中，以37℃孵育6h，使表面增强拉曼探针进入细胞内部；
用拉曼光谱仪对肺癌细胞(H1299)进行超灵敏、超稳定的拉曼成像，并进行30分钟的长时间成像，通过拉曼图谱对成像结果进行分析。实验结果如图6所示，每个像素点的积分时间为10ms，完整细胞成像所用的时间为53s，使用表面增强拉曼探针内的拉曼信号分子对二巯基苯的拉曼特征峰(1555cm-1)重构出图像，可观察到表面增强拉曼探针聚集在H1299细胞表面和细胞内部，并且在30分钟的长时间成像过程中探针信号稳定，不易发生光漂白。
实施例6表面增强拉曼探针(三层核壳结构)的细胞应用
将实施例4制备的表面增强拉曼探针(三层核壳结构)均匀分散于pH＝7.4的PBS溶液中制成0.2nmol/L的溶液；
选用肺癌细胞(H1299)作为研究对象，将无菌的0.2nmol/L的表面增强拉曼探针溶液与处于对数生长期的H1299细胞置于细胞培养箱中，以37℃孵育6h，使表面增强拉曼探针进入细胞内部；
用显微拉曼光谱仪对肺癌细胞(H1299)进行超快、超灵敏的拉曼成像，通过拉曼图谱对成像结果进行分析。实验结果如图7所示，每个像素点的积分时间为1ms，整个细胞成像所用的时间为40s，使用表面增强拉曼探针内的拉曼信号分子对二巯基苯的拉曼特征峰(1555cm-1)重构出图像，可以看出拉曼图像和明场图像相对应。
实施例7表面增强拉曼探针(双层核壳结构)的动物体应用
构建小鼠原位前列腺转移癌模型；
将实施例3制备的表面增强拉曼探针(双层核壳结构)均匀分散于生理盐水中制成1nmol/L的溶液；
向原位前列腺转移癌模型小鼠体内通过尾静脉注射的方法注射200ul经超声分散的1nmol/L的表面增强拉曼探针溶液；
注射22h后，使用拉曼光谱仪对小鼠的肿瘤部位进行超快、超灵敏、超稳定的拉曼成像并对成像结果进行分析。实验结果如图8所示，使用表面增强拉曼探针内的拉曼信号分子对二巯基苯的拉曼特征峰(1555cm-1)重构出图像，可实现对前列腺肿瘤位置及肿瘤边界的快速、精确定位；并且成像稳定不易发生光漂白，可反复成像对肿瘤边界进行确认。这种表面增强拉曼探针用于生物医学成像增强了成像的信号强度及稳定性，较传统的拉曼成像更有潜力应用于手术过程中指导肿瘤及肿瘤边界的准确切除。
在以上实施例所制备的表面增强拉曼探针中，通过改变多层核壳结构金纳米颗粒内部的拉曼分子的种类和位置，可获得具有不同信号特征的表面增强拉曼探针；通过对表面增强拉曼探针的介孔二氧化硅层进行一定的生物修饰，可用于实现多指标的成像。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种表面增强拉曼探针，其特征在于，所述表面增强拉曼探针包括多层核壳结构金纳米颗粒及包覆在所述多层核壳结构金纳米颗粒外面的介孔二氧化硅层。
2.如权利要求1所述的表面增强拉曼探针，其特征在于，所述介孔二氧化硅层厚度为5-100nm。
3.如权利要求1所述的表面增强拉曼探针，其特征在于，所述多层核壳结构金纳米颗粒具有金纳米核，所述金纳米核的外部分布有一层或多层拉曼分子层和一层或多层金壳层，其中第奇数层为所述拉曼分子层，第偶数层为所述金壳层，第一层拉曼分子层位于所述金纳米核的外表面，其余每层拉曼分子层位于其前面一层金壳层的外表面，每层金壳层位于其前面一层拉曼分子层的外表面。
4.如权利要求3所述的表面增强拉曼探针，其特征在于，所述金壳层的层数为一层或两层。
5.如权利要求3所述的表面增强拉曼探针，其特征在于，所述拉曼分子层中的拉曼分子选自对二巯基苯、对甲苯硫酚、对氨基苯硫酚和2-萘硫醇中的一种。
6.如权利要求1所述的表面增强拉曼探针的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将制备好的多层核壳结构金纳米颗粒加入到表面活性剂的水溶液里，加入碱性溶液调节pH值至10-11，获得碱性的金纳米颗粒溶液；
步骤二：将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中加入含正硅酸四乙酯的甲醇溶液，反应获得包覆介孔二氧化硅层的多层核壳结构金纳米颗粒；
步骤三：将步骤二所得的金纳米颗粒溶液离心，分散于乙醇中，加入离子交换剂超声，洗涤，获得所述的表面增强拉曼探针。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自十六烷基溴化铵和十六烷基氯化铵中的一种；所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种；所述离子交换剂选自硝酸铵和氯化铵中的一种。
8.如权利要求1-5中任一所述的表面增强拉曼探针在生物医学成像中的应用。
9.如权利要求1-5中任一所述的表面增强拉曼探针在细胞水平成像的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
1)将细胞与表面增强拉曼探针溶液共孵育，使表面增强拉曼探针进入细胞内部；
2)用拉曼光谱仪对细胞进行拉曼成像。
10.如权利要求1-5中任一所述的表面增强拉曼探针在动物模型水平成像的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
1)构建肿瘤动物模型；
2)向试验动物体内局部注射表面增强拉曼探针溶液；
3)使用拉曼光谱仪对试验动物的肿瘤部位进行拉曼成像并对成像结果进行分析。
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