CN110470828A

CN110470828A - 一种脑卒中标志物免疫传感器的制备方法和检测方法

Info

Publication number: CN110470828A
Application number: CN201910694102.0A
Authority: CN
Inventors: 孙保亮; 王莹; 杨明峰; 袁慧; 毛蕾蕾; 董其威; 曹荷清
Original assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Current assignee: Shandong First Medical University and Shandong Academy of Medical Sciences
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110470828B

Abstract

本发明属于免疫传感器技术领域，涉及一种脑卒中标志物免疫传感器的制备方法和检测方法。本发明SERS信号发生明显变化，实现SERS强度检测的方法来进行浓度的评价，从而提高检测的准确性。有效利用了纳米材料的特性，利用拉曼光谱仪进行检测，极大地降低了检测成本，本发明具有成本低、快速、简便、敏感且可重复性好等优点。基于表面修饰拉曼信号分子，产生SERS变化，可实现对不同抗原浓度的评价。纳米颗粒的比表面积大，进一步提高了检测的灵敏度和稳定性，该传感器制备方法简单、成本低、灵敏度高、稳定性好。检测只需要一步即可，检测步骤简单方便，不容易出错。

Description

一种脑卒中标志物免疫传感器的制备方法和检测方法

技术领域

本发明属于免疫传感器技术领域，涉及一种脑卒中标志物免疫传感器的制备方法和检测方法。

背景技术

脑卒中（stroke）是人类三大死亡因素之一，且患者的数量呈逐年上升趋势，具有高致死率、高致残率和高复发率的特点，严重危害人民健康和生命安全，对患者家庭、财政及社会都产生巨大的负担。缺血性脑卒中（ischemic stroke）占脑卒中比例的60-80 %，出血性脑卒中（hemorrhagic stroke）患者数量低于缺血性脑卒中患者，但其具有较高的致残率和较差的预后效果。因此，快速准确的早期诊断有助于治疗措施的制定进而降低脑卒中的致死率与致残率。神经成像技术(CT、MRI、TCD和PET)是临床上使用最广的诊断手段，能有效的检测并区分缺血性脑卒中和出血性脑卒中，但是仍存在一些不足和欠缺，如存在着不同程度的滞后性，不能实现超早期诊断；检测仪器昂贵，普及率不高，患者花费大；检测操作复杂、专业水平要求高等。脑卒中后发生早期脑损伤及相应的免疫应答，促使大量的细胞因子和生化分子释放入脑脊液和血液中，这些高水平的标志物对脑卒中的早期诊断具有重要的临床意义，能够实现对患者的早期诊断和早期治疗，有利于提高脑卒中的预后，另外，在治疗过程中对相关标志物进行动态监测，有助于掌握患者病情进展。因此，脑卒中相关标志物的检测具有极其重要的临床意义。

表面增强拉曼散射（SERS）作为一种有发展潜力的光谱分析技术，在化学、物理、生物、医学、环境监测、公共安全等各个方面得到了一定的应用。无毒性、无损、灵敏度高、可重复性强是其巨大的优势。因此，结合拉曼技术在脑卒中早期检测具有很大的前景。

发明内容

本发明针对传统脑卒中检测中存在的问题提出一种新型的脑卒中标志物免疫传感器的制备方法和检测方法。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

一种脑卒中标志物的SERS免疫传感器的制备方法,包括如下步骤:

步骤1:将紫外-可见-分光光度计测OD_700nm=1的核壳结构金纳米颗粒，利用超声震荡分散在1 mL的水中，并在室温下保存备用，

步骤2:将导电玻璃清洗并烘干后浸泡至无水乙醇和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中,密封反应后清洗,得到氨基化处理的导电玻璃片,然后将氨基化处理的导电玻璃片竖直插入核壳结构金纳米颗粒溶液中12 h，磁力搅拌后用超纯水清洗，晾干后得到金纳米SERS基底；

步骤3：将金纳米SERS基底浸入到脑卒中标志物抗体溶液中（一种或多种），得到脑卒中标志物抗体修饰的基底，BSA封闭后，用水将基底冲洗干净，晾干；

步骤4：核壳金纳米颗粒加入到拉曼信号分子标记的脑卒中标志物抗体混合溶液中3h得到核壳金纳米颗粒/信号分子标记的脑卒中标志物抗体修饰探针，BSA封闭后用清水离心洗净；

步骤5：将步骤3中晾干后的基底浸泡到0.1 M pH=7.0的PBS溶液中，添加不同浓度脑卒中标志物，得到脑卒中标志物的SERS免疫传感器。

作为优选,所述步骤(1)中核壳结构金纳米颗粒制备方法为：

将1-2 g HAuCl₄溶于100-150 mL纯水中配成HAuCl₄溶液，4 -5℃避光保存；再将200 -220mL、 4-5 ℃预冷的纯水置于磁力搅拌器上，在搅拌状态下快速加入3-4mL上述配制的HAuCl₄溶液，分散均匀（约10 min）后再加入1 mL 0.2 M的K₂CO₃溶液，搅拌3-10分钟后快速加入新鲜配制的0.5 mg/mL NaBH₄溶液9-10 mL；反应溶液由浅黄色变为紫黑色再变为酒红色，说明有GNPs的生成；继续搅拌5-10min后置于4-5℃冰箱保存备用；通过静电吸附作用，GNPs吸附到SiO₂-APTES表面，形成SiO₂/GNPs阵列；为了让GNPs更充分的吸附，此过程连续搅拌5-6 h；后用超纯水清洗3-4次，以去除未吸附在SiO₂表面的GNPs；置于空气中自然干燥后备用。

作为优选,所述步骤(1)中核壳结构金纳米颗粒通过紫外-可见-分光光度计测得OD_700nm=1.0-2.0。

作为优选,所述步骤(2)中导电玻璃规格为5cm×0.9cm 大小的长方形，导电玻璃清洗过程为依次用洗洁精、自来水、超纯水、无水乙醇各自超声清洗1-4次，每次超声20分钟以上，烘箱烘干温度为80-90℃；无水乙醇和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的混合液中无水乙醇为10-20mL，3-氨丙基三乙氧基硅烷为100-200μL,室温下密封反应时间为12-15h；氨基化处理的导电玻璃片竖直插入核壳结构金纳米颗粒溶液中，室温下进行磁力搅拌12小时，后取出用超纯水淋洗5次，自然晾干后获得金纳米SERS基底，备用。

一种脑卒中标志物的SERS免疫传感器的检测方法，具体检测方法如下：

S1：标准脑卒中标志物样品配置成浓度为0.1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40ng/mL、80 ng/mL的PBS溶液作为测试溶液，并在室温条件下孵育10-60 min；

S2：测试溶液在PBS中进行SERS分析，选用785 nm激光；

S3：启动SERS免疫传感反应，分别测量0.1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40ng/mL、80 ng/mL的溶液对应的SERS强度，建立SERS光谱强度与溶液浓度之间的定量关系。

作为优选，所述测试溶液孵育时间为30 min。

作为优选,所述PBS溶液的pH=7.0。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

（1）本发明SERS信号发生明显变化，实现SERS强度检测的方法来进行浓度的评价，从而提高检测的准确性。

（2）本发明有效利用了纳米材料的特性，利用拉曼光谱仪进行检测，极大地降低了检测成本，本发明具有成本低、快速、简便、敏感且可重复性好等优点。基于表面修饰拉曼信号分子，产生SERS变化，可实现对不同抗原浓度的评价。

（3）纳米颗粒的比表面积大，进一步提高了检测的灵敏度和稳定性，该传感器制备方法简单、成本低、灵敏度高、稳定性好。

（4）检测只需要一步即可，检测步骤简单方便，不容易出错。

附图说明

图1为本发明核壳结构金纳米颗粒的电子显微镜图片；

图2为本发明脑卒中标志物抗原SERS免疫传感器制备流程图；

图3为本发明制备的基底及其均一性表达；

图4为血液中检测脑卒中标志物响应图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

核壳结构金纳米颗粒和基底的制备

1、核壳金纳米颗粒的制备：

首先在直径约为110 nm 的SiO₂表面进行氨基化修饰并吸附2-3 nm的金纳米颗粒形成复合颗粒，所形成的复合颗粒为金纳米壳生长前体物；再以过氧化氢为还原剂，在前体物表面的催化下不断还原氯金酸并不断沉积在其表面，从而形成一定厚度的完整的金纳米壳。而后3000 rpm 离心10 min，弃上清，收集沉淀，重悬（OD_{700 nm}=1.0）。取上述重悬液7 mL，加入3 μL 0.02M新配置的氢氟酸水溶液，放入磁子搅拌待颜色无变化后收集，离心重悬（OD_{700 nm}=2.0），避光保存备用。该金纳米壳的直径为165~175 nm，直径在该范围内的金纳米壳，对785 nm的激光有强烈的共振，结合785 nm 激光的穿透性，可实现表面甚至更深度的探针信号变化的检测。

2、探针的合成：

取出100 μL加入到1 mL （OD_{700 nm}=2.0）的核壳金纳米颗粒溶液中，与拉曼信号分子共孵育30 min后，离心清洗3次并重悬得到探针，得到的探针的溶液的紫外光吸收峰强度为1。

3、基底的制备：

将导电玻璃切成5 cm × 0.9 cm 大小的长方形，依次用洗洁精、自来水、超纯水、无水乙醇各自超声清洗3次（每次至少超声20分钟）后，置于80 ºC的烘箱中烘干备用；取一干燥洁净的小烧杯，加入15 ml 的无水乙醇以及150 μL APTES，混匀后将上述洗净的导电玻璃片竖直插入其中，保鲜膜密封烧杯口以防水分进入，室温下作用12小时；将上述与APTES作用后的玻璃片取出，无水乙醇超声清洗3次以去除未反应的APTES，置于80 ºC的烘箱中烘干备用。将氨基化好的导电玻璃片分别竖直插入制备好的纳米溶液中，室温下进行磁力搅拌12小时，然后将玻璃片取出，超纯水淋洗5次，自然晾干后备用。这样，就获得了金纳米SERS基底。

原理验证：

标准脑卒中标志物（例如：NSE、MMP-9、RNA等检测标准品）样品配置成浓度为0.1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的溶液作为测试溶液，并在室温条件下孵育10-60 min。测试溶液在PBS中进行SERS分析，选用785 nm激光。SERS免疫传感反应，分别测量0.1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的溶液对应的SERS强度，建立SERS光谱强度与溶液浓度之间的定量关系。

实施例2

采用如下步骤制备：

步骤1：取150μL核壳结构金纳米颗粒OD_700nm=1，利用超声震荡分散在1 mL的水中，并在室温下保存备用。

步骤2：将导电玻璃切成5 cm × 0.9 cm 大小的长方形，依次用洗洁精、自来水、超纯水、无水乙醇各自超声清洗3次（每次至少超声20分钟）后，置于80 ºC的烘箱中烘干备用；取一干燥洁净的小烧杯，加入15 ml 的无水乙醇以及150 μL APTES，混匀后将上述洗净的导电玻璃片竖直插入其中，保鲜膜密封烧杯口以防水分进入，室温下作用12小时；将上述与APTES作用后的玻璃片取出，无水乙醇超声清洗3次以去除未反应的APTES，置于80 ºC的烘箱中烘干备用。将氨基化好的导电玻璃片分别竖直插入制备好的纳米溶液中，室温下进行磁力搅拌12小时，然后将玻璃片取出，超纯水淋洗5次，自然晾干后备用。这样，就获得了金纳米SERS基底。

步骤3：把金纳米基底浸入到脑卒中标志物抗体溶液中，得到脑卒中标志物抗体修饰的基底，用BSA进行封闭，用水将基底冲洗干净，晾干。

步骤4：用核壳金纳米颗粒加入到拉曼信号分子标记的脑卒中标志物抗体混合溶液中3 h后得到核壳金纳米颗粒/拉曼信号分子标记的脑卒中标志物抗体修饰探针。用BSA进行封闭，清水离心洗净。

步骤5：将制备好的免疫传感器浸泡于0.1 M pH=7.0的PBS溶液中，添加不同浓度脑卒中标志物，即可得到脑卒中标志物的SERS免疫传感器。

步骤6：将1 g HAuCl₄溶于100 mL纯水中配成1 ％的HAuCl₄溶液，4 ℃避光保存。再将200 mL 4 ℃预冷的纯水置于磁力搅拌器上，在搅拌状态下快速加入3 mL 上述配备的1％HAuCl₄溶液，待其在溶液中分散均匀后（约10 min）再加入1 mL 0.2 M的K₂CO₃溶液，搅拌数分钟后快速加入新鲜配制的0.5 mg/mL NaBH₄溶液9 mL。反应溶液由浅黄色变为紫黑色再变为酒红色，说明有GNPs的生成。继续搅拌5 min后置于4 ℃冰箱保存备用。通过静电吸附作用，GNPs吸附到SiO₂-APTES表面，形成SiO₂/GNPs阵列。为了让GNPs更充分的吸附，此过程连续搅拌6 h。后用超纯水清洗3次，以去除未吸附在SiO₂表面的GNPs。于空气中自然干燥后备用。

步骤7：标准脑卒中标志物样品配置成浓度为0.1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的溶液作为测试溶液，并在室温条件下孵育10~60 min。测试溶液在PBS中进行SERS分析，选用785 nm激光。SERS免疫传感反应，分别测量0.1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的溶液对应的SERS强度，建立SERS光谱强度与溶液浓度之间的定量关系。

对比例1

按所述的相同步骤重复进行实施例，取空白血液样品，采用标准加入法分别配置了不同浓度的脑卒中标志物溶液，按照发明具体实施例中的具体实验步骤，构建脑卒中标志物的SERS免疫传感器并对加标样品进行了检测。

对比例2

按所述的相同步骤重复进行实施例，选取病人血清样品，采用传统ELISA方法及制备的SERS免疫传感器进行检测比较，按照发明具体实施例中的具体实验步骤，比较两种方法。

检测结果如下：

表1本发明与传统方法检测情况比较

检测结果显示，本发明与传统方法相比较，具有很好的检测稳定性及准确性。

从附图1中可以看出制备的纳米材料形貌均一，拉曼增强效果好；从附图3中可以看出制备的基底拉曼增强均一性好；从附图4 （以S100-β做代表）可以看出，在血液中检测，本发明显示了检测稳定，检测极限低的特性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种脑卒中标志物的SERS免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

步骤1:将核壳结构金纳米颗粒超声分散至水中，得到核壳结构金纳米颗粒溶液备用，

步骤2:将导电玻璃清洗并烘干后浸泡至无水乙醇和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中,密封反应后清洗,得到氨基化处理的导电玻璃片,然后将氨基化处理的导电玻璃片竖直插入核壳结构金纳米颗粒溶液中，磁力搅拌后用超纯水清洗，晾干后得到金纳米SERS基底；

步骤3：将金纳米SERS基底浸入到脑卒中标志物抗体溶液中，得到脑卒中标志物抗体修饰的基底，BSA封闭后，用水冲洗干净，晾干；

步骤4：核壳金纳米颗粒加入到拉曼信号分子标记的脑卒中标志物抗体混合溶液中得到核壳金纳米颗粒/信号分子标记的脑卒中标志物抗体修饰探针，BSA封闭后用清水离心洗净；

步骤5：将步骤3中晾干后的基底浸泡PBS溶液中，添加不同浓度脑卒中标志物，得到脑卒中标志物的SERS免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的脑卒中标志物的SERS免疫传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中核壳结构金纳米颗粒制备方法为：

将1-2 g HAuCl₄溶于100-150 mL纯水中配成HAuCl₄溶液，4 -5℃避光保存；再将200 -220mL、 4-5 ℃预冷的纯水置于磁力搅拌器上，在搅拌状态下快速加入3 -4mL 上述配制的HAuCl₄溶液，分散均匀后再加入1 mL 0.2 M的K₂CO₃溶液，搅拌3-10分钟后快速加入新鲜配制的0.5 mg/mL NaBH₄溶液9-10 mL；反应溶液由浅黄色变为紫黑色再变为酒红色，说明有GNPs的生成；继续搅拌5 -10min后置于4-5 ℃冰箱保存备用；通过静电吸附作用，GNPs吸附到SiO₂-APTES表面，形成SiO₂/GNPs阵列；为了让GNPs更充分的吸附，此过程连续搅拌5-6 h；后用超纯水清洗3-4次，以去除未吸附在SiO₂表面的GNPs；置于空气中自然干燥后备用。

3.根据权利要求1所述的脑卒中标志物的SERS免疫传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中核壳结构金纳米颗粒通过紫外-可见-分光光度计测得OD_700nm=1.0-2.0。

4.根据权利要求1所述的脑卒中标志物的SERS免疫传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中导电玻璃规格为5 cm × 0.9 cm 大小的长方形，导电玻璃清洗过程为依次用洗洁精、自来水、超纯水、无水乙醇各自超声清洗1-4次，每次超声20分钟以上，烘干温度为80-90℃；无水乙醇和3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合液中无水乙醇为10-20mL，3-氨丙基三乙氧基硅烷为100-200μL, 密封反应时间为12-15h；氨基化处理的导电玻璃片竖直插入核壳结构金纳米颗粒溶液中，室温下进行磁力搅拌12小时，后取出用超纯水淋洗5次。

5.一种脑卒中标志物的SERS免疫传感器的检测方法，其特征在于，具体检测方法如下：

S2：测试溶液在PBS中进行SERS分析，选用785 nm激光；

6.根据权利要求5所述脑卒中标志物的SERS免疫传感器的检测方法，其特征在于，所述测试溶液孵育时间为30 min。

7.根据权利要求5所述脑卒中标志物的SERS免疫传感器的检测方法，其特征在于，所述PBS溶液的pH=7.0。