CN105527267A - 一种红色荧光金纳米团簇及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种红色荧光金纳米团簇及其制备方法和应用，属于荧光纳米材料的制备和应用。制备方法：先用便宜的鸡蛋清快速还原并包被HAuCl₄，合成发红色荧光的金纳米团簇AuNCsEW。本发明制备方法简单、快速、成本低。制得的纳米团簇可用作荧光染料，也可用来检测汞离子，还可用来检测谷胱甘肽(GSH)。

Description

一种红色荧光金纳米团簇及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光纳米材料，具体涉及一种红色荧光金纳米团簇及其制备方法，以及该纳米团簇在制作荧光染料及其染色剂、制作检测汞离子试纸以及检测谷胱甘肽(GSH)中的应用。

背景技术

众所周知，汞是一种重要的重金属元素，它广泛存在于自然界，如水、土壤以及食品中，汞离子即使在非常低的浓度也是一种剧毒的、并广泛存在的污染物离子，是对人体及自然界最具威胁的重金属元素之一，它在人体中可严重破坏消化、排泄、甚至是中枢神经系统，引起很多严重的疾病，例如颤抖、致聋、关节炎、失去肌肉协调能力、感觉失控、记忆力丧失以及运动障碍等。因此找到一种快速准确的检测汞离子的方法，对于环境污染、检测食品安全等有重要的理论和实用价值。

谷胱甘肽(GSH)作为身体中最丰富的抗氧化剂以及自由基清除剂，它参与着很多重要的生理进程。GSH在人体血液中以及组织中的含量被认为与很多的疾病以及疾病的治疗有着非常密切的关系。研究表明，GSH在人体中含量的变化有可能将直接导致老化、帕金森疾病、以及癌症的发生。

对于GSH以及汞离子的检测，过去常采用仪器检测方法进行检测，这些方法包括高效液相色谱法、原子吸收光谱测定法、质谱法、电化学方法以及荧光测定法等。在这些分析方法中，荧光检测法因其高选择性、易操作性以及短的时间响应等特点成为人们检测小分子的新宠。在过去，有机染料作为荧光探针广泛应用于重金属离子的检测。但是，有机染料斯托克斯位移小、荧光寿命短、耐光性差，因此，人们逐渐把注意力集中于制备无机纳米材料用于检测因为它们强烈的发光性、光催化稳定性高以及光谱线宽等优点。比如：荧光量子点(比如CdTe,CdSe)已经应用于荧光检测。CdS量子点用于检测低水平汞离子，这些量子点检测方法虽然灵敏，但对于检测环境中的有毒金属，它们合成步骤复杂困难；CdTe量子点用于检测GSH，短的激发波长引起的本身的高荧光背景使得该材料不能应用于某些生物应用，即使制得近红外的探针，也因为不能很好的消除自发荧光和散射光而不能得到广泛的应用。近些年来，贵金属荧光纳米材料快速发展，被人们广泛所知的是金纳米团簇和银纳米团簇，它们都用很多环境友好型配体如多肽类、凝胶、蛋白质以及DNA制得。这些荧光纳米团簇具有超小尺寸、低毒性以及强的荧光性质而被广泛用于生物标记、生物成像、催化以及离子检测。基于此，本发明在微波条件下以便宜的鸡蛋清包被并还原四氯金酸迅速得到发强烈红色荧光的金纳米团簇，并利用荧光性质应用于检测汞离子以及检测GSH。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红色荧光金纳米团簇及其制备方法，且制备方法简单、快速、成本低；制得的纳米团簇可通过制作红色荧光试纸用来检测重金属离子汞离子以及通过细胞成像来检测谷胱甘肽，从而间接初步识别正常细胞和癌细胞的方法。

本发明提供的一种红色荧光金纳米团簇的制备方法，包括如下步骤：

称取四氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)，在避光的容器中配制0.01M浓度的HAuCl₄溶液；取蛋清于烧杯中，加入适量的水，搅拌5-10min后，将其收集置于离心机中以7000rpm离心10-20min，并收集上清液，最后将其定容至蛋清体积的25倍得到蛋清溶液；配制1M的NaOH溶液备用；取上述四氯金酸溶液稀释4倍，置于微波反应器中，加入2倍体积的蛋清溶液，搅拌3-5min，然后向其中加入NaOH调节pH至11，继续搅拌1-2min后移至微波装置中，90℃下反应20-30min即得到红色荧光金纳米团簇(AuNCsEW)。反应停止后，溶液变成澄清的浅黄色，在紫外灯下照射呈现强烈的红色荧光。之后放入4℃冰箱备用。

上述制备的红色荧光金纳米团簇可在检测汞离子以及谷胱甘肽中应用，也可用作荧光染料。

与现有技术相比本发明的有益效果：本发明所选用的鸡蛋清便宜，反应条件绿色无污染，得到的荧光纳米团簇具有超小尺寸、低毒性以及强的荧光性质；与前期研究比较，本文发明的荧光金纳米团簇更容易制得，且大大缩短了反应时间，可应用于试纸染色，直接在染色的试纸上进行汞离子的检测，而且检测限低，实现了可视化研究，所以该材料可应用于食品中或水中汞离子的检测；同时荧光位于近红外区且斯托克斯位移大，可以拓展其在生物体内的应用，如应用于癌细胞的检测。向不发光的AuNCsEW-Hg²⁺体系中加入谷胱甘肽，由于汞离子与谷胱甘肽的结合能力大于Hg²⁺与AuNCsEW的结合能力，因此荧光恢复，配制不同浓度的谷胱甘肽与猝灭体系分别作用，得到一条理想的线性关系，随着谷胱甘肽浓度的增加，荧光强度逐渐升高，表明在一定谷胱甘肽浓度范围内，材料荧光强度与谷胱甘肽浓度呈线性关系。通过荧光的变化可以检测食物中或血液中的谷胱甘肽的含量。癌细胞中谷胱甘肽含量要远大于正常细胞，利用这一性质，将不发光的AuNCsEW-Hg²⁺体系各加入正常细胞以及癌细胞中，发现癌细胞经过一段时间孵育后荧光出现，而同一时间正常细胞中没有荧光。根据这一现象，达到了识别正常细胞和癌细胞的目的，从而为识别早期癌症提供了一种简单易行的方法。

附图说明

图1A反应时间对AuNCsEW的影响

图1B反应温度对AuNCsEW的影响

图1C反应pH对AuNCsEW的影响

图1D反应浓度对AuNCsEW的影响

图2AAuNCsEW的紫外和荧光谱图

图2BAuNCsEW的透射电镜分析谱图

图2CAuNCsEW的粒径分析谱图

图2DAuNCsEW的X射线光电子能谱分析谱图

图2EAuNCsEW的红外分析谱图

图2FAuNCsEW的X射线衍射分析谱图

图3A金纳米团簇AuNCsEW作为荧光涂料的照片

图3B金纳米团簇AuNCsEW作为荧光染色剂的染色折纸照片

图4金纳米团簇AuNCsEW与各金属离子相互作用相对荧光比较图

图5A汞离子不同浓度的金纳米团簇AuNCsEW荧光发射光谱

图5B汞离子浓度与荧光强度的线性关系图

图6染色试纸滴加汞离子溶液前后对比图

图7AuNCsEW-Hg²⁺与体内某些生物分子相互作用相对荧光比较图

图8A谷胱甘肽不同浓度的AuNCsEW-Hg²⁺荧光发射光谱

图8B谷胱甘肽浓度与荧光强度的线性关系图

图9A不同浓度AuNCsEW对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)活性的影响

图9B用激光扫描共聚焦显微镜观察AuNCsEW在人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)中的成像

图10用激光扫描共聚焦显微镜观察正常细胞和癌细胞加入不发光的AuNCsEW-Hg²⁺体系对比图

具体实施方式

以下为实施例中使用的材料：

四氯金酸(HAuCl₄·4H₂O，分子量为411.9)为天津市登封化学试剂厂生产

鸡蛋清(新鲜鸡蛋)为当地超市所购买。

氢氧化钠(NaOH，分子量为40.0)为北京化工厂生产

谷胱甘肽(C₁₀H₁₇N₃O₆S，分子量为307.33)为生工生物生产

各种生物分子(半胱氨酸Cys、苯丙氨酸PHE、赖氨酸Lys、酪氨酸Tyr、葡萄糖glucose、二硫苏糖醇DTT、甘氨酸Gly、钾离子K⁺、钠离子Na⁺、钙离子Ca²⁺)

三羟甲基氨基甲烷(C₄H₁₁NO₃，分子量为121.14)为天津市光复精细化工研究所生产

实施例1

鸡蛋清还原并包被制备红色荧光金纳米团簇

所有用到的容器用王水(V_HCl:V_HNO3＝3:1)泡洗，之后用二蒸水洗净并烘干备用。首先从新鲜鸡蛋中将蛋清小心提取出来，取4mL蛋清溶液加入烧杯中，加入适量的水开始搅拌，时间为10min，搅拌结束后将所有溶液转移至10mLEP管中，将其收集至离心机中以7000rpm离心20min，离心结束后取出，将上清液收集至100mL容量瓶中，最终定容至100mL，放入4℃冰箱冷藏备用。称取206.0mg四氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)，在棕色50mL容量瓶中配制0.01M浓度的HAuCl₄溶液并放置4℃冰箱冷藏备用。配制1M的NaOH溶液10mL。取1mL已经配好的HAuCl₄溶液，用二蒸水稀释至4mL，取2mL置于10mL微波玻璃反应器中，并加入4mL已稀释的蛋清溶液，在搅拌器上进行搅拌，时间为5min，之后向其中加入80μL的NaOH溶液，将此反应器置于微波装置中，设置反应条件(时间30min，温度90℃，电功率150W，压强250psi，搅拌速度高速，预搅拌时间2min。)，开始反应。反应结束后得到淡棕色液体，将其转入EP管中并放入4℃冰箱备用。(图1为制备材料时改变时间、温度、浓度、pH以确定最佳的反应条件)

实施例2

(1)金纳米团簇AuNCsEW紫外以及荧光表征

图2A中观察到，合成的材料在日光灯下呈现淡淡的棕色，为了确认合成的材料发什么荧光，将合成的材料放在紫外灯下，观察到强烈的红色的荧光；取2mL二蒸水于紫外杯中作为空白，进行测定；之后取200μL制得的AuNCs溶液于紫外杯中，再向其中加入1800μL二蒸水进行稀释，测定紫外吸收曲线，结果显示该物质没有确切的吸收峰值，但是从400nm开始该物质有吸收出现；在荧光光谱仪上改变不同的激发峰，确定了最佳的发射峰位置以及强度。结果表明最佳激发位置为320nm，最佳发射峰为650nm。

(2)金纳米团簇AuNCsEW的透射电镜分析谱图以及粒径分析谱图表征

为了确认金纳米团簇形貌和尺寸大小，将超声了半小时的金纳米团簇溶液滴在铜网上制样，待液体挥发，在透射电镜下进行观察。另外将超声好的液体放入Zeta电位仪中配套的容器中，进行粒径大小的测量。

图2B为所制备的金纳米团簇的透射电镜分析谱图，从图中可看出制得的金纳米团簇呈球状，并且均匀分散，图2C为所制备的金纳米团簇的粒径分析谱图，结果显示平均尺寸在4-6nm，与透镜结果呼应。

(3)金纳米团簇AuNCsEW的X射线光电子能谱分析(XPS)谱图表征

为了确认AuNCsEW的元素化合价态，将所制得的液体样品经过冷冻干燥器干燥得到固体，在X射线光电子能谱分析仪上进行表征。

图2D为所制备的金纳米团簇的X射线光电子能谱分析谱图，AuNCsEW中Au4f_5/2和Au4f_7/2的结合能分别是87.6eV和84.0eV，这和文献当中报道的一致，在XPS中，Au(4f)峰的位置在Au(I)和Au(0)之间。这表明在所制得的AuNCsEW中Au(I)和Au(0)都存在。

(4)金纳米团簇AuNCsEW的X射线衍射分析(XRD)谱图表征

为了观察所制得的金纳米团簇的晶型状态，将所制得的液体样品经过冷冻干燥器干燥得到固体，制样测量。

在图2E中，XRD分析中31.6°和45.4°对应的尖峰与AuNCs的(111)和(200)晶面分别对应，另外两个特征峰(220)和(311)证明了合成的金纳米团簇是面心立方结构。

(5)金纳米团簇AuNCsEW的红外分析(FTIR)谱图表征

为了观察蛋清与所制得的金纳米团簇AuNCsEW表面基团的差异，将所制得的液体样品经过冷冻干燥器干燥得到固体，分别取微量蛋清与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱；接着取微量所制得的材料与溴化钾按质量比为1:100混合研磨压片，测定其红外光谱。

在图2F中，两个光谱都非常相似，这说明蛋清结合在了AuNCs的表面。蛋清在～1648cm^-1处出峰，这个是酰胺1区，表明蛋白质中有更高含量的α螺旋结构，而这个谱带出现在AuNCs中的1651cm^-1处，表明官能团在蛋清和AuNCs之间发生了相互作用。比起在3200–3500cm^-1区域内蛋清的–NH₂弯曲振动，AuNCs出现了一些移动，蛋清中–NH₂弯曲振动峰在3200–3500cm^-1内变成了一个宽峰在3420cm^-1处。

实施例3

AuNCsEW作为荧光涂料及其染色剂的应用研究

将金纳米团簇储存液填满钢笔中在滤纸上画出熟悉的图片，在日光灯下显示无色，但放在紫外灯下，用365nm的光进行激发，如图3A显示，在紫外灯的照射下，用笔画出的图案呈现明亮的红色；将滤纸置于金纳米团簇储存液中，半小时后取出，放在烘箱中烘干，之后取出进行折纸，同样，折纸在日光灯下显示无色，但放在紫外灯下，用365nm的光进行激发，如图3B显示，在紫外灯的照射下，折纸呈现明亮的红色。

实施例4

各种离子与合成的金纳米团簇AuNCsEW的相互作用的荧光研究

配制0.01M的各离子溶液2mL(Na⁺,K⁺,Ni²⁺,Pb²⁺,Ba²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Mg²⁺,Zn²⁺,Mn²⁺,Ca^{2 +},Al³⁺,Fe³⁺,Cu²⁺,Hg²⁺)于2mLEP管中，取200μL制得的AuNCs溶液于荧光杯中，向其中加入pH＝6.5的Tris-HCl溶液800μL，再向其中加入1mL二蒸水进行稀释，设置荧光光谱仪的参数(λ_ex＝320nm,λ_em＝520nm～850nm,E＝580V)，扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μLNa⁺溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数据；继续重复滴定，直到荧光不再变化，保存数据。其它离子重复上述实验。图4记录了实验结果，结果证明只有汞离子能使材料的荧光完全猝灭。

实施例5

汞离子与合成的金纳米团簇AuNCsEW的相互作用的荧光研究

配制不同浓度的汞离子溶液(终浓度为0、125、250、625、1250、2000、2500、3750、5000、7500、10000nM)；取200μL制得的AuNCs溶液于荧光杯中，向其中加入pH6.5的Tris-HCl溶液800μL，再向其中加入990μL二蒸水进行稀释，设置荧光光谱仪的参数(λ_ex＝320nm,λ_em＝520nm～850nm,E＝580V)，扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μLHg²⁺溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数据；将不同浓度的Hg²⁺溶液重复上述实验。图5A、5B结果表明，在一定浓度范围内(0～5000nM),汞离子的浓度与相对荧光强度成良好的线性关系，且检测限为0.81nM。

实施例6

染色试纸检测汞离子的研究

将滤纸裁剪成一长条，将其浸泡在制得的溶液中，浸泡15min后取出放入烘箱中烘干,紫外灯下观察呈现明亮的红色；此时向试纸上滴加含有汞离子的溶液，红色迅速消失；向试纸上滴加不含汞离子的其他溶液，红色不消失。图6为所照照片。

实施例7

各种生物分子与不发光AuNCsEW-Hg²⁺体系相互作用的荧光研究

配制0.05M的各生物小分子溶液2mL(半胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、葡萄糖、二硫苏糖醇、甘氨酸、钾离子、钠离子、钙离子)于2mLEP管中，取200μL实施例1制得的AuNCsEW溶液于荧光杯中，向其中加入pH＝6.5的Tris-HCl溶液800μL，再向其中加入990μL二蒸水进行稀释，加入浓度为0.002M的汞离子溶液10μL，设置荧光光谱仪的参数(λ_ex＝320nm,λ_em＝520nm～850nm,E＝580V)，扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL半胱氨酸溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数据；继续重复滴定，直到荧光不再变化，保存数据。其它生物小分子重复上述实验(其中谷胱甘肽的初始浓度是其他生物小分子的0.2倍)。图7记录了实验结果，结果证明谷胱甘肽能使不发光的体系荧光恢复，且恢复程度最大。

实施例8

谷胱甘肽与AuNCsEW-Hg²⁺体系的相互作用的荧光研究

配制不同浓度的谷胱甘肽溶液(终浓度为0、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50μM)；取200μL实施例1制得的AuNCs溶液于荧光杯中，向其中加入pH＝6.5的Tris-HCl溶液800μL，再向其中加入980μL二蒸水进行稀释，向荧光杯中加入10μLHg²⁺溶液，进行搅拌后，设置荧光光谱仪的参数(λ_ex＝320nm,λ_em＝520nm～850nm,E＝580V)，扫描样品，记录数据；向荧光杯中加入10μL谷胱甘肽溶液，进行搅拌后，计时2min，扫描样品，记录数据；将不同浓度的谷胱甘肽溶液重复上述实验。图8A、8B结果表明，在一定浓度范围内(5～35μM),谷胱甘肽的浓度与相对荧光强度成良好的线性关系，且检测限为91.9nM。

实施例9

细胞成像实验的研究，采用实施例1制得的AuNCsEW。

将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)(10％FBS/DMEM培养基，5％CO₂，37℃)按每孔5×10³个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(浓度由大到小为：1.2mg/mL、0.12mg/mL、0.012mg/mL、0.0012mg/mL、0.00012mg/mL)，每组均以未处理的HepG2、HeLa细胞为空白对照组，培养24h后，将材料吸出，每孔分别加入200μL新鲜培养基，接着每孔加入20μl5mg/mlMTT溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，接着每孔加入150μLDMSO，振摇10min，进行MTT检测。

图9A为不同浓度AuNCsEW对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)活性的影响。由图可知，细胞即使在最大浓度材料的孵育之下也能保持很高的活性，存活率达85％以上，表明材料有相对较低的毒性，因此可以进一步应用于细胞成像。

将人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)(10％FBS/DMEM培养基，5％CO₂，37℃)按密度1×10³个接种于14mm的共聚焦盘中，加入1mL的培养基进行培养，20h贴壁后，弃除旧培养液，用PBS(pH＝7.4)洗三次后，加入1mL含有浓度为1.2mg/mL的AuNCsEW的培养基孵育2h(10％FBS/DMEM培养基，5％CO₂，37℃)，然后用冷PBS(pH＝7.4)洗三次，最后用激光共聚焦显微镜进行观察。

图9B为用激光扫描共聚焦显微镜观察AuNCsEW在人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)中的成像，图片明确显示材料主要分布在细胞质中，一些材料在细胞核的表面，但没有进入细胞核，这表明AuNCsEW可以用来标记细胞。

将人肝癌细胞(HepG2)、正常细胞(HT22)(10％FBS/DMEM培养基，5％CO₂，37℃)按密度1×10³个接种于14mm的共聚焦盘中，加入1mL的培养基进行培养，20h贴壁后，弃除旧培养液，用PBS(pH＝7.4)洗三次后，加入1mL含有浓度为1.2mg/mL的AuNCsEW(加入适量Hg²⁺使之完全猝灭，形成不发光的AuNCsEW-Hg²⁺体系)的培养基孵育1h，然后用冷PBS(pH＝7.4)洗三次，最后用激光共聚焦显微镜进行观察。

图10为用激光扫描共聚焦显微镜观察正常细胞和癌细胞加入不发光的AuNCsEW-Hg²⁺体系对比图，(A)为未加入材料的图片，由图可知细胞没有荧光，随着时间的变化，材料中的Hg²⁺与癌细胞中的谷胱甘肽结合后，材料成为游离的AuNCsEW而进入细胞，荧光逐渐恢复(B)；而对于正常细胞(C)，随着时间的变化，荧光没有恢复。表明癌细胞中谷胱甘肽含量远大于正常细胞，因此达到了初步识别正常细胞与癌细胞的目的。

Claims (5)

1.一种红色荧光金纳米团簇的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

称取四氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)，在避光的容器中配制0.01M浓度的HAuCl₄溶液；取蛋清于烧杯中，加入适量的水，搅拌5-10min后，将其收集置于离心机中以7000rpm离心10-20min，并收集上清液，最后将其定容至蛋清体积的25倍得到蛋清溶液；配制1M的NaOH溶液备用；取上述四氯金酸溶液稀释4倍，置于微波反应器中，加入2倍体积的蛋清溶液，搅拌3-5min，然后向其中加入NaOH调节pH至11，继续搅拌1-2min后移至微波装置中，90℃下反应20-30min即得到红色荧光金纳米团簇。

2.如权利要求1所述的方法制备得到的红色荧光金纳米团簇。

3.如权利要求2所述的红色荧光金纳米团簇用作荧光染料。

4.如权利要求2所述的红色荧光金纳米团簇在制作检测汞离子试纸中的应用。

5.如权利要求2所述的红色荧光金纳米团簇在制备检测GSH试剂中的应用。