CN109799217A - 一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针及其制备方法和应用，其中高灵敏度比率荧光探针是以巯基丙酸包覆的羧基功能化碲化镉量子点与铕离子螯合形成的复合体系。本发明利用能够被单一波长的光源激发光的量子点和铕离子，设计开发出双发射荧光传感器，可实时快速检测水体中的四环素类抗生素，且原材料简单，制备方法易于推广。本发明比率荧光化学传感器，具有灵敏度高、操作简便、选择性好、可视化检测、定量检测的特点。

Description

一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧 光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测四环素类抗生素残留的比率荧光探针，具体地说是一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针及其制备方法和应用，属于化学与纳米材料科学领域。

背景技术

四环素类抗生素，是一类口服吸收性好、价格低廉、低毒性的广谱抗生素，近年来广泛应用在畜牧业与渔业，以药品添加剂的形式促进动物的快速生长以及增重。但是滥用四环素往往造成动物体内的过量残留，随食物链流入人类体内，致使耐药细菌的产生，并且造成过敏反应，胃肠紊乱和肝毒性等不良后果。目前，许多方法已被用来检测四环素，常见的有液相色谱法，色谱-质谱联用，毛细电泳法，电化学分析和化学发光等。这些检测方法普遍存在弊端，如需要昂贵的设备、专业的技术人员和冗长的样品制备过程等条件。荧光检测法，具有易操作，成本低，检测限低等特点，因此开发高灵敏度的四环素类抗生素荧光探针具有重要的现实意义。

基于镧系元素的荧光传感器可以在与四环素结合后显示出较高的荧光强度，因为铕离子与四环素可以形成发光配合物，可以将吸收四环素吸收的能量转移到铕离子上，进而增强铕离子发光。然而，配位水分子的振动模态引起的猝灭效应，常常导致铕-四环素复合物的荧光较弱。因此通过螯合适当的试剂，可以提高铕-四环素复合物的发光。

Yang Chen等人在分在2012年的《Sensors and Actuators B:Chemical》上报道了利用银纳米颗粒增强铕-四环素复合物的发光的方法。Li Wang等人在2013年的《Biosensors and Bioelectronics》上报道了核苷酸的配位使得铕-四环素复合物的发光增强。此外，XiaomingYang等人在2014年的《Talanta》上报道了金纳米团簇的引入也可以增强铕-四环素复合物的发光。但是这些四环素荧光探针，均为单发射的荧光传感器，测量时仅仅依赖于铕离子的发射强度变化，荧光强度受环境条件、仪器效率和激发因素的影响较大，而这种变化往往不具有很高的可重复性。因此，进一步地提高荧光探针的可靠性，制备一种高灵敏度检测四环素残留的比率荧光探针是十分必要的。

发明内容

本发明针对上述现有技术的不足，旨在提供一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针及其制备方法和应用。本发明比率荧光探针能对四环素类抗生素进行可视化检测，检测灵敏度高。

本发明利用能够被单一波长的光源激发光的量子点和铕离子，设计开发出一种可视化检测四环素类抗生素的双发射比率荧光传感器。

本发明基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针，是以巯基丙酸包覆的羧基功能化碲化镉量子点与铕离子螯合形成的复合体系。

所述巯基丙酸包覆的羧基功能化碲化镉量子点是通过包括如下步骤的方法制备获得：

将0.2284g氯化镉与220μL巯基丙酸溶解在超纯水中，用1M的NaOH溶液调节pH值到9，之后通入氮气鼓泡30min，除去溶液中的氧气；将0.5M的稀硫酸在绝氧环境下注射到步骤1获得的NaHTe溶液中，并不断鼓泡，使生成的H₂Te转移到氯化镉溶液中，生成CdTe量子点的前驱体；反应体系加热至105℃回流30min，移去热源，冷却至室温，随后置于15W的紫外灯下照射以提高荧光量子产率，用丙酮离心纯化后再次溶于超纯水中，最终得到巯基丙酸包覆的碲化镉量子点溶液。

所述巯基丙酸包覆的羧基功能化碲化镉量子点的粒径为3-5nm。

所述铕离子以六水合硝酸铕溶液的形式添加。

本发明基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：将0.0319g碲粉和0.05g NaBH₄混合于2mL超纯水中，持续通入氮气，保持无氧环境；反应液在冰浴中搅拌反应10h，反应液逐渐由黑色变为白色，上层液中有NaHTe生成；

步骤2：将0.2284g氯化镉与220μL巯基丙酸溶解在超纯水中，用1M的NaOH溶液调节pH值到9，之后通入氮气鼓泡30min，除去溶液中的氧气；将0.5M的稀硫酸在绝氧环境下注射到步骤1获得的NaHTe溶液中，并不断鼓泡，使生成的H₂Te转移到氯化镉溶液中，生成CdTe量子点的前驱体；反应体系加热至105℃回流30min，移去热源，冷却至室温，随后置于15W的紫外灯下照射以提高荧光量子产率，离心、纯化后再次溶于超纯水中，最终得到巯基丙酸包覆的碲化镉量子点溶液，备用。

步骤3：取0.0446g六水合硝酸铕，加入到10mL超纯水中，得到浓度为10mM的硝酸铕溶液。

步骤4：将200μL步骤2获得的巯基丙酸包覆的碲化镉量子点溶液与32μL步骤3获得的硝酸铕溶液混合，并于室温下震荡2h，得到复合体系溶液，即为比率荧光探针溶液。

步骤2中，所述纯化是通过超滤透析(纤维素膜，分子量4000)或不良溶剂团聚沉淀的方法进行纯化；所述不良溶剂为乙醇、丙酮或异丙醇等。

本发明基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针的应用，是利用所述比率荧光探针可视化检测四环素类抗生素，具体方法包括如下步骤：

步骤1：标准曲线的绘制

以四环素水溶液与所述比率荧光探针溶液混合配制得到复合荧光探针体系，通过荧光分析法拟合出四环素浓度的标准曲线。

复合荧光探针体系成分如下：200μL碲化镉量子点溶液，32μL浓度为10mM的硝酸铕水溶液，200μL浓度为100mM的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，四环素以及超纯水；最终复合荧光探针体系的体积为2mL。复合荧光探针体系中四环素的浓度为0-80μM。

进一步地，分别配制四环素浓度为0，1，2，4，8，16，24，32，40，48，56，64，72，80μM的复合荧光探针体系，以四环素浓度的荧光强度比值I₆₁₆/I₅₁₂作线性拟合获得标准曲线。

步骤2：以步骤1的检测条件对未知的待测四环素溶液进行检测，通过测试获得其荧光强度值，与步骤1获得的标准曲线进行比对得到待测四环素溶液的浓度数据。

本发明巯基丙酸包覆的绿色量子点与铕离子在单一波长光源激发下能够分别发射绿色和红色荧光。其中单一波长光源激发的波长范围为300-400nm；绿色荧光发射波长为512nm；红色荧光发射波长为616nm。

本发明的技术方案包括发光稳定的巯基丙酸包覆的绿色量子点制备、铕离子溶液的制备、量子点/铕离子混合体系的构建，最终得到一类双发射的比率荧光传感器。由于铕离子的红色荧光对四环素类抗生素较为敏感，四环素类抗生素的加入会使绿色量子点的荧光强度逐渐猝灭，铕离子的红色荧光强度逐渐增强，从而产生荧光比率和颜色的有序变化。该类荧光传感器能够可视化检测水体中的四环素类抗生素。

相对于现有技术，本发明的有益效果体现在：

1、本发明方法操作简单，原材料简单易得，成本低，比率荧光探针的合成在一般化学实验室均能完成，易于推广；

2、本发明的传感器与现有的四环素检测技术相比，优点在于双发射比率荧光探针具有更直观明显的颜色变化，可用于痕量四环素的检测。定量检测结果可视化，不同浓度四环素类抗生素溶液得到的荧光颜色不同，根据荧光颜色判断，可计算出四环素类抗生素的浓度范围；

3、本发明可以在一定程度上避免使用大型仪器，仅需要一个便携式紫外灯就可进行可视化检测，操作简单，快速方便，灵敏度高，效果显著；

4、本发明的传感器对四环素类抗生素具有良好的选择性，能够有效避免样品中其他杂质的干扰。面对自来水、牛奶等实际样品中的复杂环境，能保持检测的准确性。对常见的无机离子、氨基酸等具有较好的抗干扰性，可以检测自来水及牛奶等实际样品中四环素残留含量，在食品检测方面具有一定的实用价值。

附图说明

图1是本发明所得CdTe量子点的透射电镜以及高分辨透射电镜图片。

图2是本发明所得CdTe量子点和量子点/铕复合体系X射线光电子能谱图。其中图2a是总X射线光电子能谱；图b为铕元素的高分辨X射线光电子能谱。从图2a与图2b均可看到铕元素的存在，可以证实铕离子与量子点成功结合起来。

图3分别是本发明所得CdTe量子点，量子点/铕复合体系，引入四环素的量子点/铕复合体系的荧光光谱图，左上的插图是三者在365nm紫外灯下的荧光照片。从图中可以看出，在365nm紫外光激发下，CdTe量子点呈现亮绿色荧光，量子点/铕复合体系呈现暗绿色荧光，引入四环素的量子点/铕复合体系呈现红色荧光。

图4a是不同浓度四环素加入时，量子点/铕复合体系荧光图谱；图4b是荧光检测的校准曲线。

图5是不同浓度四环素对比率荧光探针的可视化颜色变化图，随着四环素浓度的增加(0-80μM)，溶液颜色绿色变到黄色，再渐变至红色。

图6是本发明所得比率荧光探针的选择性示意图。从图6a中可以看出量子点/铕复合体系探针对无机离子(K⁺，Ca²⁺，Na⁺，Mg²⁺，Fe²⁺,Zn²⁺，SO₄ ^2-，Cl^-，CO₃ ^2-)，氨基酸(Gly，His，Lys，Arg，Glu，Cys)，谷胱甘肽，抗坏血酸，葡萄糖等干扰物没有响应，仅对对四环素有响应，即红光与绿光的强度比值发生了明显变化；从图6b中可以看出量子点/铕复合体系探针对阿莫西林，羧苄青霉素钠，庆大霉素，卡那霉素，环丙沙星，氯霉素，司帕沙星等常见抗生素均无响应，仅对四环素，金霉素，土霉素，多西环素等四环素类抗生素有响应，即红光与绿光的强度比值发生了明显变化。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来对本发明的技术方案作进一步说明：

实施例1：

1、碲化镉量子点溶液的制备

将0.0319g碲粉和0.05g NaBH₄混合在2mL超纯水中，持续通入氮气，保持无氧环境。溶液在冰浴中搅拌，反应10h。混合液逐渐由黑色变为白色，上层液中有NaHTe生成。将0.2284g氯化镉与220μL巯基丙酸溶解在120mL超纯水中，用1M的NaOH溶液调节pH值到9，之后通入氮气鼓泡30min，除去溶液中的氧气。将稀硫酸绝氧环境下注射到NaHTe溶液，并不断鼓泡，使生成的H₂Te转移到氯化镉溶液中，生成CdTe量子点的前驱体。加热至105℃回流30min，移去热源，冷却至室温。将制得的碲化镉量子点水溶液在15W的紫外灯下照射以提高荧光量子产率。用丙酮离心纯化后，再次溶于120mL超纯水中，最终得到巯基丙酸包覆的碲化镉量子点溶液，备用。其形貌见图1。

2、铕离子溶液的制备

作为优选，称取0.0446g六水合硝酸铕，加入到10mL超纯水中，得到浓度为10mM铕离子溶液。

3、四环素超纯水待测液的制备

取0.0178g四环素，加入到40mL超纯水中，得到浓度为1M的四环素溶液作为待测液。4、双发射比率荧光探针的制备

向比色皿中加入200μL碲化镉量子点溶液，32μL浓度为10mM的硝酸铕溶液，200μL浓度为100mM的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，以及超纯水，最终得到总体积为2mL的混合测试体系(四环素的浓度在该测试体系中为0到80μM不等)，混合均匀后静置培养5min，使其充分反应。量子点与铕离子的成功结合可由X射线能谱图所证实，如图2。

5、可视化检测超纯水中的四环素

在365nm手持紫外灯照射下，通过肉眼可以清晰地看到，添加不同浓度的四环素后，混合测试体系的荧光颜色不同。随着四环素浓度的增加(0～80μM)，荧光颜色从绿色变为黄色，再变为红色。

实施例2：

1、碲化镉量子点溶液的制备

本步骤的制备过程同实施例1。

2、铕离子溶液的制备

本步骤的制备过程同实施例1。

3、四环素超纯水待测液的制备

本步骤的制备过程同实施例1。

4、双发射比率荧光探针的制备

向比色皿中加入200μL碲化镉量子点溶液，32μL浓度为10mM的硝酸铕溶液，200μL浓度为100mM的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，四环素溶液以及超纯水，最终得到总体积为2mL的混合测试体系(四环素的浓度在该测试体系中为0到80μM不等)，混合均匀后静置培养5min，使其充分反应。

5、定量测试校准曲线的绘制

用波长为365nm的激发光，记录混合体系在450～750nm波长范围内的荧光光谱，如图2所示。另外，图4四环素检测的校准曲线，其中横坐标为四环素的浓度，纵坐标为616nm和512nm处的荧光强度比值。

6、定量检测超纯水中的四环素

向比色皿中加入200μL碲化镉量子点溶液，32μL浓度为10mM的硝酸铕溶液，200μL浓度为100mM的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，四环素溶液以及超纯水，使总测试体系的体积为2mL(所添加四环素的浓度实际浓度为20μM)，混合均匀后静置培养5min，使其充分反应。用波长为365nm的激发光来激发，分别读取616nm与512nm处的荧光强度并计算比值(I₆₁₆/I₅₁₂)，将其代入校准曲线，求出四环素浓度的计算值为19.32μM，误差为3.65％。

实施例3：

1、碲化镉量子点溶液的制备

本步骤的制备过程同实施例1。

2、铕离子溶液的制备

本步骤的制备过程同实施例1。

3、干扰物待测液的制备

作为优选，分别配制无机离子(K⁺，Ca²⁺，Na⁺，Mg²⁺，Fe²⁺,Zn²⁺，SO₄ ^2-，Cl^-，CO₃ ^2-)，氨基酸(Gly，His，Lys，Arg，Glu，Cys)，抗生素(金霉素，土霉素，多西环素，阿莫西林，羧苄青霉素钠，庆大霉素，卡那霉素，环丙沙星，氯霉素，司帕沙星)，谷胱甘肽，抗坏血酸，葡萄糖等干扰物待测液，浓度均为1M。

4、双发射比率荧光探针的制备

向比色皿中加入200μL碲化镉量子点溶液，32μL浓度为10mM的硝酸铕溶液，200μL浓度为100mM的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，以及超纯水，最终得到总体积为2mL的比率荧光探针溶液。

5、四环素检测的抗干扰性

在四环素溶液中加入相同体积等浓度的四环素溶液或不同干扰物溶液，用波长为365nm的激发光来激发，分别读取616nm与512nm处的荧光强度并计算比值(I₆₁₆/I₅₁₂)，绘制成为柱状图，如图6。从图中可以看出，本发明比率荧光探针只对四环素类抗生素有明显的响应。

实施例4：

1、碲化镉量子点溶液的制备

本步骤的制备过程同实施例1。

2、铕离子溶液的制备

本步骤的制备过程同实施例1。

3、牛奶上清液的制备

从超市购买牛奶，用三氯乙酸1％(V/V)除去牛奶中的蛋白质和油脂。加入三氯乙酸后，超声20min。以12000rpm的转速离心10min，使用0.22μm的滤膜过滤后，得到牛奶上清液。

4、四环素牛奶待测液的制备

取0.0178g四环素，加入到40mL牛奶上清液中，得到浓度为1M的四环素溶液作为牛奶待测液。

5、双发射比率荧光探针的制备

本实施例中荧光探针的制备方法同实施例1。

6、可视化牛奶中的四环素

将含四环素的牛奶滴加到盛有荧光探针溶液的比色皿中进行荧光可视化检测。200nM含量就有响应。

Claims (10)

1.一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针，其特征在于：

所述高灵敏度比率荧光探针是以巯基丙酸包覆的羧基功能化碲化镉量子点与铕离子螯合形成的复合体系。

2.根据权利要求1所述的高灵敏度比率荧光探针，其特征在于所述巯基丙酸包覆的羧基功能化碲化镉量子点是通过包括如下步骤的方法制备获得：

将0.2284g氯化镉与220μL巯基丙酸溶解在超纯水中，用1M的NaOH溶液调节pH值到9，之后通入氮气鼓泡除去溶液中的氧气；将0.5M的稀硫酸在绝氧环境下注射到步骤1获得的NaHTe溶液中，并不断鼓泡，使生成的H₂Te转移到氯化镉溶液中，生成CdTe量子点的前驱体；反应体系加热至105℃回流30min，移去热源，冷却至室温，随后置于15W的紫外灯下照射以提高荧光量子产率，用丙酮离心纯化后再次溶于超纯水中，最终得到巯基丙酸包覆的碲化镉量子点溶液。

3.根据权利要求1或2所述的高灵敏度比率荧光探针，其特征在于：

所述巯基丙酸包覆的羧基功能化碲化镉量子点的粒径为3-5nm。

4.根据权利要求1所述的高灵敏度比率荧光探针，其特征在于：

所述铕离子以六水合硝酸铕溶液的形式添加。

5.一种权利要求1-4中任一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：将0.0319g碲粉和0.05g NaBH₄混合于2mL超纯水中，持续通入氮气，保持无氧环境；反应液在冰浴中搅拌反应10h，反应液逐渐由黑色变为白色，上层液中有NaHTe生成；

步骤2：将0.2284g氯化镉与220μL巯基丙酸溶解在超纯水中，用1M的NaOH溶液调节pH值到9，之后通入氮气鼓泡除去溶液中的氧气；将0.5M的稀硫酸在绝氧环境下注射到步骤1获得的NaHTe溶液中，并不断鼓泡，使生成的H₂Te转移到氯化镉溶液中，生成CdTe量子点的前驱体；反应体系加热至105℃回流30min，移去热源，冷却至室温，随后置于15W的紫外灯下照射以提高荧光量子产率，离心、纯化后再次溶于超纯水中，最终得到巯基丙酸包覆的碲化镉量子点溶液，备用；

步骤3：取0.0446g六水合硝酸铕，加入到10mL超纯水中，得到浓度为10mM的硝酸铕溶液；

步骤4：将200μL步骤2获得的巯基丙酸包覆的碲化镉量子点溶液与32μL步骤3获得的硝酸铕溶液混合，并于室温下震荡2h，得到复合体系溶液，即为比率荧光探针溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：

步骤2中，所述纯化是通过超滤透析或不良溶剂团聚沉淀的方法进行纯化；所述不良溶剂为乙醇、丙酮或异丙醇。

7.一种权利要求1-4中任一种基于碲化镉量子点与铕离子复合体系的高灵敏度比率荧光探针的应用，其特征在于：是利用所述比率荧光探针可视化检测四环素类抗生素。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：标准曲线的绘制

以四环素水溶液与所述比率荧光探针溶液混合配制得到复合荧光探针体系，通过荧光分析法拟合出四环素浓度的标准曲线；

步骤2：以步骤1的检测条件对未知的待测四环素溶液进行检测，通过测试获得其荧光强度值，与步骤1获得的标准曲线进行比对得到待测四环素溶液的浓度数据。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

复合荧光探针体系成分如下：200μL碲化镉量子点溶液，32μL浓度为10mM的硝酸铕水溶液，200μL浓度为100mM的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，四环素以及超纯水；最终复合荧光探针体系的体积为2mL；复合荧光探针体系中四环素的浓度为0-80μM。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

分别配制四环素浓度为0，1，2，4，8，16，24，32，40，48，56，64，72，80μM的复合荧光探针体系，以四环素浓度的荧光强度比值I₆₁₆/I₅₁₂作线性拟合获得标准曲线。