CN113390846A - 硫量子点作为荧光探针在四环素检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于四环素检测技术领域，具体涉及硫量子点作为荧光探针在四环素检测中的应用，为建立一种经济、快速、灵敏、高选择性的四环素检测方法，本发明提供了硫量子点的新用途，即将硫量子点作为荧光探针应用于检测四环素，利用硫量子点对四环素的检测具有较高选择性的特性，以硫量子点作为荧光探针，根据硫量子点荧光在添加四环素待测样品前后的荧光强度比值与四环素浓度之间的线性关系便可以测定待测样品中的四环素浓度，而且检测过程快速、灵敏。从而克服了传统四环素检测技术中存在的检测时间长、灵敏度低等缺点，实现了对四环素抗生素的经济、快速、灵敏检测，在食品基质四环素的快速、灵敏检测中具有巨大的应用潜力。

Description

硫量子点作为荧光探针在四环素检测中的应用
技术领域
本发明属于四环素检测技术领域，具体涉及硫量子点作为荧光探针在四环素检测中的应用。
背景技术
四环素(TC)由于具有广谱抗菌活性、低毒性、低成本以及良好的口服吸收性而被广泛用于治疗人和动物的细菌感染。此外，TC由于可促进动物生长而在畜牧业中被用作饲料添加剂。不幸的是，长期以来人类对四环素的滥用行为已经导致其在各种环境中具有较高的残留。这些残留的四环素会通过食物链进入人体，使人产生过敏、胃肠道紊乱和肝中毒等不良反应。另外，四环素还能使细菌产生耐药性，影响到其它抗菌素的使用。因此，建立有效的方法来检测食物或人体中的四环素残留，对人体健康和保护环境具有非常重要的意义。目前，已有多种用于检测TC的方法，比如高效液相色谱法、酶联适体试验法、毛细管电泳法、微生物法、比色法等。然而，这些方法大多耗时且需要昂贵的仪器和专业的人员，从而限制了它们在常规分析中的应用。
荧光分析法由于具有快速、简便、经济的优点而被广泛用来检测四环素。其中，具有独特光学性能、优越可分散性、优秀生物相容性、固有抗菌性等特性的硫量子点已经成为一种重要的荧光传感材料，具有潜在的应用前景。但目前尚未有利用硫量子点作为荧光探针检测四环素的应用。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了硫量子点作为荧光探针在四环素检测中的应用，实现了对四环素抗生素(TC)的经济、快速、灵敏检测，在食品基质四环素的快速、灵敏检测中具有潜在的应用价值。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
硫量子点作为荧光探针在四环素检测中的应用。
本发明还提供了一种四环素的检测方法，该检测方法以硫量子点作为荧光探针，根据硫量子点荧光探针在添加四环素待测样品前后的荧光强度比值与四环素浓度之间的线性关系测定待测样品中的四环素浓度。
作为本发明的一个优选实施方式，上述的一种四环素的检测方法，包括以下步骤：
S1、制备不同浓度的盐酸四环素溶液；
S2、将不同浓度的盐酸四环素溶液加入到硫量子点荧光探针中，根据硫量子点荧光探针在添加四环素溶液前后的荧光强度比值与四环素浓度之间的关系，绘制关于荧光强度比值与四环素浓度之间线性方程；
S3、将待测样品加入到硫量子点荧光探针中，计算硫量子点荧光探针在加入待测样品前后的荧光强度比值，然后根据步骤S2中绘制的线性方程确定待测样品中的四环素浓度。
优选地，所述硫量子点荧光探针的制备方法包括以下步骤：
S1、将前驱体升华硫和稳定剂聚乙二醇400溶解于碱性溶液中；
S2、将步骤S1的混合液置于加热条件下进行搅拌反应，得到深黄色的硫量子点溶液；
S3、在搅拌条件下将H2O2溶液加入到步骤S2的硫量子点溶液中进行刻蚀，刻蚀后通过透析袋进行透析纯化，获得硫量子点荧光探针溶液。
进一步地，所述搅拌反应为先以1100～1300rpm的搅拌速度加热至65～75℃，然后在65～75℃下以450～550rpm的搅拌速度搅拌反应70～75h。具体地，所述搅拌反应为先以1200rpm的搅拌速度加热至70℃，然后在70℃下以500rpm的搅拌速度搅拌反应72h。
进一步地，所述升华硫的质量浓度为0.02～0.03g/mL，所述聚乙二醇400的体积浓度为4～8％。具体地，所述升华硫的质量浓度为0.028g/mL，所述聚乙二醇400的体积浓度为6％。
进一步地，所述H2O2溶液为30wt％H2O2溶液，所述H2O2溶液与深黄色的硫量子点溶液的体积比为2:5。
进一步地，所述透析袋的分子量为500Da。
进一步地，步骤S3的硫量子点荧光探针溶液浓缩至原体积的13～16％后，取3mL再稀释至100mL，然后以8:1的体积比与PBS缓冲溶液混合后制备得到最终的硫量子点荧光探针。
进一步地，PBS缓冲溶液的pH为4.0～11.0。具体地，PBS缓冲溶液的pH为7.0。
优选地，往硫量子点荧光探针中加入盐酸四环素溶液或待测样品后孵育1～10min。
优选地，盐酸四环素溶液的浓度范围为0.1～50.0μM。
优选地，荧光强度采用日本岛津公司的RF-5301型荧光光谱仪测试，测试时激发光和发射光狭缝均为5mm，激发波长为355nm，发射波长为440nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了硫量子点的新用途，即将硫量子点作为荧光探针应用于检测四环素，本发明经研究发现，硫量子点对TC的检测具有较高的选择性，四环素的添加可以使硫量子点的荧光强度发生明显的变化，且荧光强度的变化与四环素浓度之间表现出一定的线性关系，利用硫量子点的上述特性，以硫量子点作为荧光探针，根据硫量子点荧光在添加四环素待测样品前后的荧光强度比值与四环素浓度之间的线性关系便可以测定待测样品中的四环素浓度，而且检测过程快速、灵敏。从而克服了传统四环素检测技术中存在的检测时间长、灵敏度低等缺点，实现了对四环素抗生素的经济、快速、灵敏检测，在食品基质四环素的快速、灵敏检测中具有巨大的应用潜力。
附图说明
图1为硫量子点荧光探针对三类物质的荧光响应结果(A为硫量子点荧光探针对常见金属离子和四环素的荧光响应；B为硫量子点荧光探针对生物分子和四环素的荧光响应)；
图2为硫量子点荧光探针在添加不同浓度TC(0、0.1、0.5、1、3、7、10、15、20、25、30、40、50、60、80和100μM)后的荧光光谱图；
图3为硫量子点荧光探针在添加不同浓度TC后的荧光强度比值(F0/F)与TC的浓度之间的线性方程。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1硫量子点荧光探针的制备
(1)将50mL双蒸馏水加入100mL圆底烧瓶中，加入4.0g氢氧化钠并搅拌至全部溶解，然后加入3.0mL聚乙二醇400，最后再加入1.4g升华硫，搅拌溶解。
(2)将圆底烧瓶置于油浴锅中，在1200rpm的搅拌速度下加热至70℃，然后在70℃下以500rpm的搅拌速度搅拌反应72h，得到深黄色的硫量子点溶液。
(3)自然冷却至室温后，在500rpm的搅拌速度下将H2O2溶液(30wt％)以2:5的体积比快速加入到所得的溶液中(H2O2溶液：硫量子点溶液＝2:5)，并将混合物继续以该搅拌速度搅拌30min；随后，将获得的淡黄色溶液通过透析袋(500Da)纯化，将获得的溶液在45℃、80rpm的条件下先旋蒸浓缩至5mL。取3mL浓缩后的水溶性硫量子点溶液用二次蒸馏水稀释至100mL，得到检测使用的水溶性硫量子点溶液。
(4)将2mL上述的硫量子点溶液和250μL 0.2mol/L的PBS缓冲溶液(PBS缓冲溶液的pH值为7.0)混合，制备成硫量子点荧光探针。
实施例2硫量子点荧光探针对三类物质(金属离子、生物分子和四环素)的荧光响应
本实例提供了实施例1的硫量子点荧光探针对三类物质的荧光响应，这三类物质包括常见的金属离子(Al3+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Co2+、Pb2+、Cd2+、Ni2+、Ba2+、Fe3+)、生物分子【半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)谷胱甘肽(GSH)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)、抗坏血酸(AA)、维生素B1(VB1)、葡萄糖(Glu)】和四环素(TC)。
具体试验包括以下步骤：
(1)取一定质量上述金属离子的硝酸盐，分别配制成0.01mol/L的金属离子溶液；
(2)取一定质量上述的生物分子，分别配制成0.1mol/L的氨基酸溶液及其他生物分子溶液；
(3)准确称取0.0481g盐酸四环素粉末，将其置于50mL烧杯中溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至100mL配制成0.001mol/L的盐酸四环素溶液；
(4)往实施例1的荧光探针(2mL稀释后的硫量子点溶液和250μL 0.2mol/L的PBS缓冲溶液)中分别加入上述步骤(1)中配制的金属离子溶液，并稀释至5.0mL，使金属离子的浓度均为50.0μM，孵育1min后利用荧光光谱仪(日本岛津公司的RF-5301型荧光光谱仪，测试时激发光和发射光狭缝均为5mm，激发波长为355nm，发射波长为440nm)分别测定并记录探针对上述10种金属离子的荧光响应。
(5)往实施例1的荧光探针中分别加入上述步骤(2)中配制的氨基酸溶液、其他生物分子溶液，并稀释至5.0mL，使氨基酸分子和其他生物分子的浓度为100.0μM，孵育1min后利用荧光光谱仪(日本岛津公司的RF-5301型荧光光谱仪，测试时激发光和发射光狭缝均为5mm，激发波长为355nm，发射波长为440nm)分别测定并分别记录探针对这些生物分子的荧光响应。
(6)往实施例1的荧光探针中加入上述步骤(3)中配制的四环素溶液，稀释至5.0mL，使体系中四环素抗生素的浓度为50.0μM，孵育1min后利用荧光光谱仪(日本岛津公司的RF-5301型荧光光谱仪，测试时激发光和发射光狭缝均为5mm，激发波长为355nm，发射波长为440nm)测定并记录探针对四环素的荧光响应。
如图1A所示，加入50μM的TC后，硫量子点的荧光强度急剧降低，荧光强度比值(F/F0)与空白溶液相比变化明显。而相同条件下50μM的金属离子(Al3+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Co2+、Pb2 +、Cd2+、Ni2+、Ba2+、Fe3+)却不能使硫量子点的荧光强度发生明显的变化，荧光强度比值(F/F0)与空白溶液接近。
如图1B所示，加入50.0μM的TC后，硫量子点的荧光强度急剧降低，荧光强度比值(F/F0)与空白溶液相比变化明显。而相同条件下100.0μM的生物分子【半胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、谷胱甘肽(GSH)、多巴胺(DA)、尿酸(UA)、抗坏血酸(AA)、维生素B1(VB1)、葡萄糖(Glu)和四环素(TC)】却不能使硫量子点的荧光强度发生明显的降低，荧光强度比值(F/F0)也不会像TC一样与空白溶液相比变化明显。表明实施例1制备的硫量子点荧光探针对TC的检测具有较高的选择性。
实施例3一种硫量子点荧光探针检测牛奶样品中四环素的方法
本实例的检测方法具体步骤如下：
(1)对从超市购买来的牛奶样品进行测定前处理：将5mL 1％三氯乙酸溶液加入到5mL牛奶样品中混匀，然后超声10min并在12000rpm的速度下离心5min以去除蛋白质，接着使用0.22μm的滤膜过滤上清液以去除脂肪，得到待测牛奶样品溶液；
(2)准确称取0.0481g的盐酸四环素粉末，将其置于50mL烧杯中溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至100mL配制成0.001mol/L的盐酸四环素溶液，并取一定量0.001mol/L的四环素溶液将其稀释配制成0.0001mol/L和0.00001mol/L的四环素溶液；
(3)分别往250μL硫量子点荧光探针中加入不同量的上述四环素溶液，使其体系中四环素的浓度为0.1～100.0μM，孵育1min后利用荧光光谱仪(日本岛津公司的RF-5301型荧光光谱仪，测试时激发光和发射光狭缝均为5mm，激发波长为355nm，发射波长为440nm)测定并记录不同浓度的四环素溶液对应的荧光光谱，经数据处理得到硫量子点荧光探针溶液在添加四环素抗生素溶液前后的荧光强度比值(F0/F，F0为添加四环素抗生素溶液前的荧光强度；F为添加四环素抗生素溶液后的荧光强度)，并确定荧光强度比值与四环素抗生素的浓度在(0.1～50μM)之间的线性方程；
如图2所示，TC的加入可以有效猝灭硫量子点荧光探针的荧光，且随着TC浓度(0、0.1、0.5、1、3、7、10、15、20、25、30、40、50、60、80和100μM)的增加，硫量子点荧光探针的荧光强度显著降低。如图3所示，荧光强度比值(F0/F)与TC的浓度在0.1～50μM范围内呈线性关系，线性方程为F0/F＝1.036+0.029c，线性相关系数为R2＝0.992。表明该硫量子点荧光探针可用于TC的定量检测。
(4)按照步骤(3)的方法测定并记录添加步骤(1)的待测牛奶样品溶液前后荧光强度的比值(F0/F)，然后根据步骤(3)中的线性方程计算出牛奶样品中四环素抗生素的浓度，并将不同浓度的抗生素(7μM、10μM、14μM)加入牛奶样品中进行加标测试，平行测定3次，根据加标回收率＝[(加标试样测定值-试样测定值)÷加标量]×100％的公式计算出四环素检测的加标回收率，根据相对标准偏差(RSD)＝(标准偏差÷平均值)×100％的公式计算出的相对标准偏差(RSD)。该结果如表1所示，加标回收率为92.57～105.40％，相对标准偏差(RSD)为1.34～2.45％，表明该探针在牛奶样品的TC检测中具有较高的灵敏度，在食品基质的四环素检测中应用潜力巨大。
表1牛奶样品中TC含量的测定
Figure BDA0003124686760000061
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.硫量子点作为荧光探针在四环素检测中的应用。
2.一种四环素的检测方法，其特征在于，以硫量子点作为荧光探针，根据硫量子点荧光探针在添加四环素待测样品前后的荧光强度比值与四环素浓度之间的线性关系测定待测样品中的四环素浓度。
3.根据权利要求2所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备不同浓度的盐酸四环素溶液；
S2、将不同浓度的盐酸四环素溶液加入到硫量子点荧光探针中，根据硫量子点荧光探针在添加四环素溶液前后的荧光强度比值与四环素浓度之间的关系，绘制关于荧光强度比值与四环素浓度之间线性方程；
S3、将待测样品加入到硫量子点荧光探针中，计算硫量子点荧光探针在加入待测样品前后的荧光强度比值，然后根据步骤S2中绘制的线性方程确定待测样品中的四环素浓度。
4.根据权利要求3所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，所述硫量子点荧光探针的制备方法包括以下步骤：
S21、将前驱体升华硫和稳定剂聚乙二醇400溶解于碱性溶液中；
S22、将步骤S21的混合液置于加热条件下进行搅拌反应，得到深黄色的硫量子点溶液；
S23、在搅拌条件下将H2O2溶液加入到步骤S22的硫量子点溶液中进行刻蚀，刻蚀后通过透析袋进行透析纯化，获得硫量子点荧光探针溶液。
5.根据权利要求4所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，所述搅拌反应为先以1100～1300rpm的搅拌速度加热至65～75℃，然后在65～75℃下以450～550rpm的搅拌速度搅拌反应70～75h。
6.根据权利要求4所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，所述升华硫的质量浓度为0.02～0.03g/mL，所述聚乙二醇400的体积浓度为4～8％。
7.根据权利要求4所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，步骤S3的硫量子点荧光探针溶液浓缩至原体积的13～16％后，取3mL再稀释至100mL，然后以8:1的体积比与PBS缓冲溶液混合后制备得到最终的硫量子点荧光探针。
8.根据权利要求3所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，往硫量子点荧光探针中加入盐酸四环素溶液或待测样品后孵育1～10min。
9.根据权利要求3所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，盐酸四环素溶液的浓度范围为0.1～50.0μM。
10.根据权利要求3所述的一种四环素的检测方法，其特征在于，荧光强度采用日本岛津公司的RF-5301型荧光光谱仪测试，测试时激发光和发射光狭缝均为5mm，激发波长为355nm，发射波长为440nm。
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CN115960603A (zh) * 2022-12-09 2023-04-14 山西大学 一种荧光硫量子点及其合成方法和应用
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