CN112816448A - 一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，通过配制碳量子点和巯基乙酸修饰的碲化镉量子点(CQDs/TGA‑CdTe QDs)溶液作为比率荧光探针，将待检测的实际样品加入比率荧光探针溶液中，避光混合。在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，根据标准拟合曲线，从而定量判断食品中四环素的具体浓度。本发明以一水合柠檬酸为碳源、还原性谷胱甘肽为氮/硫源，水热法合成CQDs，并且以水热法合成红色发光的TGA‑CdTe QDs，将CQDs和TGA‑CdTe QDs按照一定比例混合在一起，制备成CQDs/TGA‑CdTe QDs比率荧光探针。所制得的比率荧光探针对四环素类抗生素的识别有较高特异性和灵敏度；可实现食品中四环素定性与定量的快速检测，为复杂体系中抗生素的快速准确定性和定量检测提供了可能。

Description

一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法
技术领域
本发明属于纳米材料制备及化学分析检测技术领域，具体涉及一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法。
背景技术
作为饲料添加剂，抗生素能很好的预防和治疗动物疾病、提高饲料转化率及促进动物生长。近年来，食品中的抗生素残留是监管机构和消费者极为关注的，因此，为确保食品安全，必须建立可靠的筛选方法来快速，选择性和灵敏地检测这些残留物。四环素类抗生素作为一种重要的抗生素，其抗菌性能好、成本低、副作用小，具有良好的治疗效果，在动物、水产品养殖中得到广泛应用。然而，四环素会导致人体牙釉质发育不全和牙齿损伤，肝损伤，肾毒性等危害，并且很难被降解，可能会在土壤、水以及肉类、蛋类和牛奶等食品中积累，并通过食物链和生态周期危害人类的健康和生态环境。对四环素类抗生素的检测手段主要有微生物检测法、免疫检测法、色谱法等。这些方法具有、特异性强、检出限低等优点，但其实验繁琐、检测费用高、耗时耗材。因此急需一种抗干扰性强，快速灵敏准确且成本低廉的四环素检测方法。
量子点尺寸与过去常用的染料分子的尺寸比较接近，因此像荧光染料一样对生物医学研究有很大用途，其中具有良好的水溶性、低毒性、成本低、生物相容性好等诸多优点，基于量子点传感器光电学性质优异，可被用作离子检测、生物标记、生化检测等方面。单一的荧光强度变化信号容易受到仪器的稳定性和背景噪声的干扰，而比率荧光探针可通过同时测量两个荧光峰的荧光强度比值，可消除环境的影响及光源波动，背景吸收等干扰，具有较大的研究潜力。
为解决食品中四环素检测的成本较高、基质干扰及实验繁琐等问题，本发明利用简单的原料水热法合成高荧光的CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针，开发了一种基于CQDs/TGA-CdTe QDs荧光猝灭的传感器，用于检测食品中四环素类抗生素残留的新方法，为复杂体系中抗生素的快速准确定性和定量检测提供了可能。
发明内容
本发明提供了一种快速准确定性和定量检测四环素类抗生素的荧光检测法，其具有操作简单、特异性强、灵敏度高等优点。
本发明以碳量子点和巯基乙酸修饰的碲化镉量子点(CQDs/TGA-CdTe QDs)溶液作为比率荧光探针，四环素类抗生素如土霉素、四环素、金霉素、强力霉素为荧光猝灭剂，两者特异性结合得到荧光“开-关”模式，利用CQDs荧光强度与TGA-CdTe QDs荧光强度的比值I414/I615与不同浓度四环素线性关系，实现四环素类抗生素的识别和定量。
为解决上述问题采取的技术方案为：
一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，具体如下：
配制碳量子点CQDs/巯基乙酸修饰的碲化镉量子点TGA-CdTe QDs的Tris-HCl缓冲液作为CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针溶液，其中，CQDs的荧光峰强度在800-1500之间，CQDs与TGA-CdTe QDs的荧光强度比值为1：(0.7～1.5)。然后将待检测的实际样品加入CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针溶液中，避光混合。在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，根据标准拟合曲线，定量判断实际样品中四环素的具体浓度。
其中，所述标准拟合曲线绘制方法如下：
将不同浓度的四环素标准溶液加入CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针溶液中，避光混合。在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，以四环素的浓度为横坐标，加入四环素后CQDs与TGA-CdTe QDs荧光强度的比值ICQDs/ITGA-CdTe QDs为纵坐标，绘制得到标准拟合曲线。
进一步地，碳量子点CQDs的制备方法如下：
将摩尔比为1：(1.0～5.0)的一水合柠檬酸和还原型谷胱甘肽溶于超纯水中，在180℃～220℃下水热反应4～8小时，将反应溶液离心、过滤、透析，得到淡黄色澄清的CQDs溶液。
巯基乙酸修饰的碲化镉量子点TGA-CdTe QDs的制备方法如下：
将氯化镉和巯基乙酸溶于水中，调节pH至10.5～11.5，然后依次加入亚碲酸钠和硼氢化钠，在180℃～220℃下水热反应30～50分钟，将产物离心、过滤、透析，得到红色发光的 TGA-CdTe QDs溶液，其中，氯化镉、巯基乙酸、亚碲酸钠与硼氢化钠的摩尔比为1：(1.0～1.5)： 0.2：0.6。
本发明中一水合柠檬酸的浓度为10～40mmol/L，一水合柠檬酸和还原性谷胱甘肽物质的量比优选为1：(2.0～3.5)，所制备的CQDs发射波长为400～430nm；氯化镉的浓度为5～20 mmol/L；氯化镉、巯基乙酸、亚碲酸钠与硼氢化钠的摩尔比为1:(1.0～1.5)：0.2：0.6，所制备的TGA-CdTe QDs的发射波长为600～630nm。
本发明中CQDs和TGA-CdTe QDs的体积比优选为1：(0.7～1.5)。
本发明中所述过滤为：通过0.22μm的微孔滤膜过滤后除去滤渣；在3500Da分子量的透析袋中，黑暗中进行透析24小时，每隔6小时换一次水。
本发明中CQDs/TGA-CdTe QDs溶液由可控制备的淡黄色澄清的CQDs溶液、红色发光的TGA-CdTe QDs溶液在稀释混合后获得，可直接使用，Tris-HCl缓冲溶液的pH范围为3.0～9.0(优选为pH＝7.0)，避光混合时间为2～10分钟(稳定在3分钟)；
本发明中荧光光谱测定条件均为激发波长为340nm，狭缝宽度为10nm，发射波长测量范围为360～680nm。
本发明中当土霉素溶液的浓度为0～5μmol，四环素溶液的浓度为0～10μmol，金霉素溶液的浓度为0～10μmol，强力霉素溶液的浓度为0～10μmol时，四环素类抗生素与CQDs溶液的荧光强度降低呈良好的线性关系；
本发明中在单独存在CQDs或TGA-CdTe QDs时，四环素对两者均无明显响应，而当两者混合作为CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针时，四环素对其有较为明显的响应，并且其特异性定量识别的抗生素为具有并四苯结构的四环素类抗生素。
本发明所述待检测的实际样品可以包含其他抗生素、生物小分子及金属离子等，CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针在牛奶、蜂蜜和尿液等实际样品中仍能快速准确定量四环素类抗生素。
本发明以CQDs和TGA-CdTe QDs作为比率荧光探针，四环素类抗生素如土霉素、四环素、金霉素、强力霉素为荧光猝灭剂，两者特异性结合得到荧光“开-关”模式，利用荧光峰强度在不同浓度四环素存在下开关状态中的差异，实现食品中四环素类抗生素的识别和定量。本发明的制备方法绿色环保，可行性高，为复杂体系中四环素类抗生素的快速准确定性和定量分析提供了新的思路。
与现有技术相比，本发明有以下优异效果：
(1)采用水热法合成高荧光蓝色碳量子点和红色的金属量子点，其制备简单，原料安全易得；(2)本发明主要以红色荧光TGA-CdTe QDs为检测荧光团，CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针可消除环境的影响及光源波动，背景吸收等干扰；(3)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针对四环素类抗生素的识别有较高特异性、灵敏度；(4)本发明可实现食品中四环素定性与定量的快速检测，为复杂体系中抗生素的快速准确定性和定量检测提供了可能。
附图说明
图1为本发明制备的CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的透射电镜图(A：CQDs；B：TGA-CdTe QDs)。
图2为本发明制备的CQDs、TGA-CdTe QDs和CQDs/TGA-CdTe QDs分别加入四环素前后的荧光发射光谱图。
图3为本发明在CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针中加入不同浓度(0，0.5μmol/L，1 μmol/L，1.5μmol/L，2μmol/L，2.5μmol/L，3μmol/L，3.5μmol/L，4μmol/L，5μmol/L)的土霉素(OTC)的荧光猝灭光谱图(A)；CQDs与TGA-CdTe QDs荧光强度比值I414/I615与土霉素浓度的关系图(B)。
图4为本发明在CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针中加入不同浓度(0，2μmol/L，3μmol/L，4μmol/L，5μmol/L，6μmol/L，7μmol/L，9μmol/L，10μmol/L)的四环素(TC)的荧光猝灭光谱图(A)；CQDs与TGA-CdTe QDs荧光强度比值I414/I615与四环素浓度的关系图(B)。
图5为本发明在CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针中加入不同浓度(0，1μmol/L，2μmol/L，3μmol/L，4μmol/L，5μmol/L，6μmol/L，7μmol/L，8μmol/L，10μmol/L)的金霉素(CTC)的荧光猝灭光谱图(A)；CQDs与TGA-CdTe QDs荧光强度比值I414/I615与金霉素浓度的关系图(B)。
图6为本发明在CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针中加入不同浓度(0，1μmol/L，2μmol/L，3μmol/L，4μmol/L，5μmol/L，6μmol/L，7μmol/L，8μmol/L，10μmol/L)的强力霉素(DOX)的荧光猝灭光谱图(A)；CQDs与TGA-CdTe QDs荧光强度比值I414/I615与强力霉素浓度的关系图(B)。
图7为本发明CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针中加入不同种类抗生素及生物小分子化合物(浓度为100μmol/L)的荧光强度比值谱图。
图8为本发明CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针中加入不同种类金属离子化合物(浓度为100μmol/L)及再加入四环素的荧光强度比值谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。但以下内容不应理解为是对本发明的权利要求书请求保护范围的限制。
实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯。所述的荧光光谱测定条件均为激发波长为340nm，发射波长360～670nm，狭缝宽度为10nm。
实施例1：一种用于食品中土霉素(OTC)快速检测的荧光检测法，具体步骤包括：
(1)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的制备：
称取一水合柠檬酸0.2101g(1)和还原性谷胱甘肽0.7683g(2.5)，并将其加入聚四氟乙烯内胆中，后加入40ml的超纯水，混合均匀后置于反应釜中，在200℃的电热恒温鼓风干燥箱中水热反应6小时，冷却至室温，后得到淡黄色澄清的CQDs。取氯化镉0.0916g(0.5)和巯基乙酸0.0553g(0.6)溶于100mL超纯水中，搅拌15分钟，调节pH至11.0，边充氮气边冰浴20分钟，加入0.0554g亚碲酸钠(0.1)，边充氮气边冰浴15分钟，最后加入0.0284 g硼氢化钠(0.3)，边充氮气边冰浴15分钟，然后置于反应釜中，200℃下水热反应40分钟，得到红色澄清溶液。将CQDs和TGA-CdTe QDs溶液分别在4000rpm下离心20min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液转移至3500Da分子量的透析袋中进行透析，每隔6小时换一次水，共持续透析24小时。放至4℃的冰箱备用。将CQDs用超纯水稀释104倍，TGA-CdTe QDs用超纯水稀释80倍作为储备液，置于4℃冰箱保存。其TEM图显示CQDs 和TGA-CdTe QDs溶液呈均匀分散状态，形貌为球形，CQDs的直径为2nm左右，如图1A；TGA-CdTe QDs的直径为3nm左右，如图1B。图2为本发明制备的CQDs、TGA-CdTe QDs 和CQDs/TGA-CdTe QDs分别加入四环素前后的荧光发射光谱图。可以发现，本发明中在单独存在CQDs或TGA-CdTe QDs时，四环素对两者均无明显响应，而当两者混合作为 CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针时，四环素对其有较为明显的响应，并且其特异性定量识别的抗生素为具有并四苯结构的四环素类抗生素。
(2)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针对土霉素的识别与定量分析：
将100μL的CQDs和150μL的TGA-CdTe QDs溶液分别加入到650μL的50mmol/L、 pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将100μL不同浓度的土霉素溶液(0～5.0μmol/L)加入其中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，以 360～670nm的波长范围为横坐标，加入土霉素前后CQDs/TGA-CdTe QDs的荧光强度为纵坐标作图，如图3A，可以看出CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的荧光强度随土霉素浓度的增加逐渐减弱；以土霉素溶液的浓度为横坐标，分别以CQDs与TGA-CdTe QDs的荧光强度比值I414/I615为纵坐标作图，得到Y＝0.18979X+0.93364的拟合曲线，相关系数R2＝0.991，线性范围0～5.0μmol/L，如图3B。
(3)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针对四环素类抗生素的特异性识别：
将CQDs/TGA-CdTe QDs溶液分别加入到50mmol/L、pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后分别将不同种类的抗生素及生物小分子溶液及加入其中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集。以不同种类的抗生素及生物小分子溶液(浓度为100μmol/L)为横坐标，I414/I615为纵坐标作图，可以看出只有四环素类抗生素对CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针有明显响应，如图7。
(4)金属离子对CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针识别四环素类抗生素的干扰：
将CQDs/TGA-CdTe QDs溶液分别加入到pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，然后将四环素溶液加入其中，最后分别将不同金属离子溶液作为干扰项加入其中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集。以不同种类的金属离子溶液(浓度为 100μmol/L)为横坐标，I414/I615为纵坐标作图，可以看出金属离子对CQDs/TGA-CdTe QDs 比率荧光探针识别四环素干扰很小，几乎无明显影响，如图8。
(5)实际样品中土霉素的快速检测：
将一定量的土霉素加标到脱脂纯牛奶(5mL)中，与20mL含20mM EDTA(pH＝5.0)的缓冲液混合进行预处理。首先，向牛奶样品中加入2mL的三氯乙酸。然后，将牛奶样品脱脂，并在4℃下以4000rpm离心30分钟进行脱蛋白。再用1M的NaOH滴加到上清液中使 pH调节至7.0。最后，将上清液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，将滤液用于分析。然后将CQDs/TGA-CdTeQDs溶液加入到pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将预处理的土霉素溶液加入缓冲溶液中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集分析。
同样，将一定量的土霉素分别加入蜂蜜及尿液样品中，使用加标回收法用于此研究。如表1。
表1 CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针检测实际样品中土霉素的回收
Figure RE-GDA0002968950170000061
实施例2：一种用于食品中四环素(TC)快速检测的荧光检测法，具体步骤包括：
(1)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的制备：
称取一水合柠檬酸0.0840g(0.4)和还原性谷胱甘肽0.1229g(0.4)，并将其加入聚四氟乙烯内胆中，后加入40ml的超纯水，混合均匀后置于反应釜中，在180℃的电热恒温鼓风干燥箱中水热反应8小时，冷却至室温，后得到淡黄色澄清的CQDs。取氯化镉0.2291g(1.25)和巯基乙酸0.1152g(1.25)溶于100mL超纯水中，搅拌15分钟，调节pH至10.5，边充氮气边冰浴20分钟，加入0.0554g亚碲酸钠(0.25)，边充氮气边冰浴15分钟，最后加入0.0284g硼氢化钠(0.75)，边充氮气边冰浴15分钟，然后置于反应釜中，180℃下水热反应50分钟，得到红色澄清溶液。将CQDs和TGA-CdTe QDs溶液分别在4000rpm下离心20min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液转移至3500Da分子量的透析袋中进行透析，每隔6小时换一次水，共持续透析24小时。放至4℃的冰箱备用。将CQDs用超纯水稀释1000 倍，TGA-CdTe QDs用超纯水稀释100倍作为储备液，置于4℃冰箱保存。
(2)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针对四环素的识别与定量分析：
将100μL的CQDs和125μL的TGA-CdTe QDs溶液分别加入到675μL的50mmol/L、 pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将100μL不同浓度的四环素溶液(0～10.0μmol/L)加入其中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，以 360～670nm的波长范围为横坐标，加入四环素前后CQDs/TGA-CdTe QDs的荧光强度为纵坐标作图，如图4A，可以看出CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的荧光强度随四环素浓度的增加逐渐减弱；以四环素溶液的浓度为横坐标，分别以CQDs与TGA-CdTe QDs的荧光强度比值I414/I615为纵坐标作图，得到Y＝0.13313X+0.81108的拟合曲线，相关系数R2＝0.996，线性范围0～10.0μmol/L，如图4B。
(3)实际样品中四环素的快速检测：
将一定量的四环素加标到脱脂纯牛奶(5mL)中，与20mL含20mM EDTA(pH＝5.0)的缓冲液混合进行预处理。首先，向牛奶样品中加入2mL的三氯乙酸。然后，将牛奶样品脱脂，并在4℃下以4000rpm离心30分钟进行脱蛋白。再用1M的NaOH滴加到上清液中使 pH调节至7.0。最后，将上清液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，将滤液用于分析。然后将 CQDs/TGA-CdTeQDs溶液加入到pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将预处理的四环素溶液加入缓冲溶液中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集分析。
将一定量的四环素分别加入蜂蜜及尿液样品中，使用加标回收法用于此研究。如表2。
表2 CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针检测实际样品中四环素的回收
Figure RE-GDA0002968950170000071
Figure RE-GDA0002968950170000081
实施例3：一种用于食品中金霉素(CTC)快速检测的荧光检测法，具体步骤包括：
(1)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的制备：
称取一水合柠檬酸0.3362g(1.6)和还原性谷胱甘肽2.1856g(8)，并将其加入聚四氟乙烯内胆中，后加入40ml的超纯水，混合均匀后置于反应釜中，在220℃的电热恒温鼓风干燥箱中水热反应4小时，冷却至室温，后得到淡黄色澄清的CQDs。取氯化镉0.3665g(2)和巯基乙酸0.2765g(3)溶于100mL超纯水中，搅拌15分钟，调节pH至11.5，边充氮气边冰浴20分钟，加入0.0554g亚碲酸钠(0.4)，边充氮气边冰浴15分钟，最后加入0.0284g 硼氢化钠(1.2)，边充氮气边冰浴15分钟，然后置于反应釜中，220℃下水热反应30分钟，得到红色澄清溶液。将CQDs和TGA-CdTe QDs溶液分别在4000rpm下离心20min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液转移至3500Da分子量的透析袋中进行透析，每隔6小时换一次水，共持续透析24小时。放至4℃的冰箱备用。将CQDs用超纯水稀释1.5×104倍，TGA-CdTe QDs用超纯水稀释150倍作为储备液，置于4℃冰箱保存。
(2)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针对金霉素的识别与定量分析：
将100μL的CQDs和70μL的TGA-CdTe QDs溶液分别加入到730μL的50mmol/L、 pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将100μL不同浓度的金霉素溶液(0～10.0μmol/L)加入其中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，以 360～670nm的波长范围为横坐标，加入金霉素前后CQDs/TGA-CdTe QDs的荧光强度为纵坐标作图，如图5A，可以看出CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的荧光强度随金霉素浓度的增加逐渐减弱；以金霉素溶液的浓度为横坐标，分别以CQDs与TGA-CdTe QDs的荧光强度比值I414/I615为纵坐标作图，得到Y＝0.12772X+0.9296的拟合曲线，相关系数R2＝0.996，线性范围0～10.0μmol/L，如图5B。
(3)实际样品中金霉素的快速检测：
将一定量的金霉素加标到脱脂纯牛奶(5mL)中，与20mL含20mM EDTA(pH＝5.0)的缓冲液混合进行预处理。首先，向牛奶样品中加入2mL的三氯乙酸。然后，将牛奶样品脱脂，并在4℃下以4000rpm离心30分钟进行脱蛋白。再用1M的NaOH滴加到上清液中使 pH调节至7.0。最后，将上清液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，将滤液用于分析。然后将 CQDs/TGA-CdTeQDs溶液加入到pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将预处理的金霉素溶液加入缓冲溶液中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集分析。
将一定量的金霉素分别加入蜂蜜及尿液样品中，使用加标回收法用于此研究。如表3。
表3 CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针检测实际样品中金霉素的回收
Figure RE-GDA0002968950170000091
实施例4：一种用于食品中强力霉素(DOX)快速检测的荧光检测法，具体步骤包括：
(1)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的制备：
称取一水合柠檬酸0.1576g(0.75)和还原性谷胱甘肽0.5762g(1.875)，并将其加入聚四氟乙烯内胆中，后加入30ml的超纯水，混合均匀后置于反应釜中，在200℃的电热恒温鼓风干燥箱中水热反应6小时，冷却至室温，后得到淡黄色澄清的CQDs。取氯化镉0.1145g(0.625)和巯基乙酸0.691g(0.75)溶于50mL超纯水中，搅拌15分钟，调节pH至11.0，边充氮气边冰浴20分钟，加入0.0277g亚碲酸钠(0.125)，边充氮气边冰浴15分钟，最后加入0.0142g硼氢化钠(0.375)，边充氮气边冰浴15分钟，然后置于反应釜中，200℃下水热反应40分钟，得到红色澄清溶液。将CQDs和TGA-CdTe QDs溶液分别在4000rpm下离心20min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将滤液转移至3500Da分子量的透析袋中进行透析，每隔6小时换一次水，共持续透析24小时。放至4℃的冰箱备用。将CQDs 用超纯水稀释104倍，TGA-CdTe QDs用超纯水稀释100倍作为储备液，置于4℃冰箱保存。
(2)CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针对强力霉素的识别与定量分析：
将100μL的CQDs和100μL的TGA-CdTe QDs溶液分别加入到700μL的50mmol/L、 pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将100μL不同浓度的强力霉素溶液(0～10.0μmol/L)加入其中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，以 360～670nm的波长范围为横坐标，加入强力霉素前后CQDs/TGA-CdTe QDs的荧光强度为纵坐标作图，如图6A，可以看出CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针的荧光强度随强力霉素浓度的增加逐渐减弱；以强力霉素溶液的浓度为横坐标，分别以CQDs与TGA-CdTe QDs的荧光强度比值I414/I615为纵坐标作图，得到Y＝0.09858X+0.91825的拟合曲线，相关系数R2＝0.992，线性范围0～10.0μmol/L，如图6B。
(3)实际样品中强力霉素的快速检测：
将一定量的强力霉素加标到脱脂纯牛奶(5mL)中，与20mL含20mM EDTA(pH＝5.0)的缓冲液混合进行预处理。首先，向牛奶样品中加入2mL的三氯乙酸。然后，将牛奶样品脱脂，并在4℃下以4000rpm离心30分钟进行脱蛋白。再用1M的NaOH滴加到上清液中使 pH调节至7.0。最后，将上清液通过0.22μm的微孔滤膜过滤，将滤液用于分析。然后将 CQDs/TGA-CdTe QDs溶液加入到pH＝7.0的Tris-HCl缓冲液中，最后将预处理的强力霉素溶液加入缓冲溶液中，将其避光混合3分钟，在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集分析。
将一定量的强力霉素分别加入蜂蜜及尿液样品中，使用加标回收法用于此研究。如表4。
表4 CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针检测实际样品中强力霉素的回收
Figure RE-GDA0002968950170000101
经实验证明，将上述制得的CQDs荧光探针溶液用于四环素定量分析同样具有很好的特异性识别和回收效果。

Claims (9)

1.一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，具体如下：
配制碳量子点CQDs/巯基乙酸修饰的碲化镉量子点TGA-CdTe QDs的Tris-HCl缓冲液作为CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针溶液，其中，CQDs的荧光峰强度在800-1500之间，CQDs与TGA-CdTe QDs的荧光强度比值为1：(0.7～1.5)。然后将待检测的实际样品加入CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针溶液中，避光混合。在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，根据标准拟合曲线，定量判断实际样品中四环素的具体浓度。
其中，所述标准拟合曲线绘制方法如下：
将不同浓度的四环素标准溶液加入CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针溶液中，避光混合。在激发波长为340nm的条件下进行荧光光谱数据的采集，以四环素的浓度为横坐标，加入四环素后CQDs与TGA-CdTe QDs荧光强度的比值ICQDs/ITGA-CdTeQDs为纵坐标，绘制得到标准拟合曲线。
2.根据权利要求1所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，
碳量子点CQDs的制备方法如下：
将摩尔比为1：(1.0～5.0)的一水合柠檬酸和还原型谷胱甘肽溶于超纯水中，在180℃～220℃下水热反应4～8小时，将反应溶液离心、过滤、透析，得到淡黄色澄清的CQDs溶液。
巯基乙酸修饰的碲化镉量子点TGA-CdTe QDs的制备方法如下：
将氯化镉和巯基乙酸溶于水中，调节pH至10.5～11.5，然后依次加入亚碲酸钠和硼氢化钠，在180℃～220℃下水热反应30～50分钟，将产物离心、过滤、透析，得到红色发光的TGA-CdTe QDs溶液，其中，氯化镉、巯基乙酸、亚碲酸钠与硼氢化钠的摩尔比为1：(1.0～1.5)：0.2：0.6。
3.根据权利要求2所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，一水合柠檬酸的浓度为10～40mmol/L，所制备的CQDs溶液发射波长为400～430nm；氯化镉的浓度为5～20mmol/L，所制备的TGA-CdTe QDs的发射波长为600～630nm。
4.根据权利要求2所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，将制得的淡黄色澄清的CQDs溶液、红色发光的TGA-CdTe QDs溶液按体积比1：(0.7～1.5)混合，稀释100倍即获得CQDs/TGA-CdTe QDs比率荧光探针溶液。
5.根据权利要求1所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，Tris-HCl缓冲溶液的pH范围为3.0～9.0，优选为pH＝7.0，避光混合时间为2～10分钟。
6.根据权利要求1所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，荧光光谱测定中狭缝宽度为10nm，发射波长测量范围为360～680nm。
7.根据权利要求1所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，当土霉素溶液的浓度为0～5μmol，四环素溶液的浓度为0～10μmol，金霉素溶液的浓度为0～10μmol，强力霉素溶液的浓度为0～10μmol时，四环素类抗生素与CQDs/TGA-CdTe QDs荧光强度比值I414/I615降低呈良好的线性关系。
8.根据权利要求1所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，所述四环素为具有并四苯结构的四环素类抗生素。
9.根据权利要求1所述一种用于食品中四环素快速检测的荧光检测法，其特征在于，所述待检测的实际样品可以为牛奶、蜂蜜和尿液等。
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