CN113429961B - 一种荧光探针、增强型比率荧光传感器、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光探针、增强型比率荧光传感器、方法及应用，所述的荧光探针用于检测四环素类抗生素，所述的荧光探针包括将沸石咪唑酯骨架ZIF‑8分散至三联吡啶氯化钌六水合物的水溶液中反应制得；所述的荧光探针在波长604nm处有红色荧光的发射峰，所述荧光探针对四环素类抗生素在波长512nm处产生绿色荧光的发射峰，所述荧光探针的粒径为73～83nm。将增强型比率荧光传感器用于四环素类抗生素的检测，对监控饮用水以及食品中四环素类抗生素残留具有很重要的意义和应用价值，具有灵敏、准确、快速、操作简单和便于可视化的优点。

Description

一种荧光探针、增强型比率荧光传感器、方法及应用

技术领域

本发明属于荧光检测领域，尤其涉及一种荧光探针、增强型比率荧光传感器、方法及应用。

背景技术

四环素类抗生素(TCs)是一类广谱抗生素，主要包括四环素(TET)、金霉素(CTE)、土霉素(OXY)和强力霉素(DOX)。由于其广谱抗菌作用、易获得和成本低等优点，已被广泛应用于微生物感染的预防和控制，然而，过量使用或长期低剂量使用会导致动物源食品中四环素类的残留，进而会引起人直接中毒、肝损伤、过敏反应等，还会导致环境污染、产生耐药菌等。因此，监测食品中四环素类的残留量非常有必要。

传统的检测方法包括高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、毛细管电泳法等，这些方法虽然灵敏度和特异性较高，但是需要昂贵的精密大型仪器和专业的操作人员、检测时间长、成本高。而比率荧光传感器由于其灵敏度高、特异性好、快速、易操作、成本低，且有内置参比，不仅可克服这些缺点，而且能扣除背景干扰、提高准确性。

Ru(bpy)₃ ²⁺具有光稳定性好、斯托克斯位移大等优点，是理想的参比信号。沸石咪唑酯骨架ZIF-8是常见金属有机骨架，由于多孔性、大的表面积、丰富的活性位点，已广泛用于吸附、光催化、化学传感等领域，但ZIF-8本身没有荧光或者荧光性能差，在传感器中主要用作荧光探针的载体。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明为解决四环素类抗生素快速准确检测的技术问题，提供一种荧光探针、增强型比率荧光传感器、方法及应用。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种荧光探针，所述的荧光探针用于检测四环素类抗生素，所述的荧光探针包括将沸石咪唑酯骨架ZIF-8分散至三联吡啶氯化钌六水合物的水溶液中反应制得；

所述的荧光探针在波长604nm处有红色荧光的发射峰，所述荧光探针对四环素类抗生素在波长512nm处产生绿色荧光的发射峰，所述荧光探针的粒径为73～83nm。

具体的，所述的沸石咪唑酯骨架ZIF-8与三联吡啶氯化钌六水合物的质量比为17:(12～24)。

一种增强型比率荧光传感器，所述的增强型比率荧光传感器包括上述的荧光探针，包括以下步骤：

步骤1：将溶有硝酸锌的甲醇溶液和溶有2-甲基咪唑的甲醇溶液进行混合搅拌反应，得到沸石咪唑酯骨架ZIF-8沉淀；

步骤2：将三联吡啶氯化钌六水合物溶于水中，并采用氢氧化钠调节所得溶液的pH；

步骤3：将步骤1得到的沸石咪唑酯骨架ZIF-8沉淀，分散于步骤二的溶液中，搅拌反应，经过离心、水洗、干燥得到沉淀为所述荧光探针，将所述荧光探针加入水中得到增强型比率荧光传感器，沸石咪唑酯骨架ZIF-8与三联吡啶氯化钌六水合物的质量比为17:(12～24)。

进一步的，步骤1中，所述溶有硝酸锌的甲醇溶液中的锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:(69～72)。

进一步的，步骤2中，将三联吡啶氯化钌六水合物溶于水中所得溶液的浓度为(3～6)mg/mL，溶液初始pH为8～8.3，采用氢氧化钠调节后溶液的pH为12。

一种增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的方法，所述的增强型比率荧光传感器为本发明所述的增强型比率荧光传感器的制备方法制得的增强型比率荧光传感器，所述检测四环素类抗生素的方法包括如下步骤：

步骤1：配制四环素类抗生素标准溶液；

步骤2：取不同体积步骤1所配制的四环素类抗生素标准溶液，分别加入到增强型比率荧光传感器溶液中得到不同的混合溶液，所述混合溶液的pH为8.6～8.7；

步骤3：利用荧光分光光度计测定所述的不同的混合溶液的荧光光谱，记录在512nm和604nm发射波长下的荧光强度F₅₁₂和荧光强度F₆₀₄，以荧光强度F₅₁₂与荧光强度F₆₀₄的比值F₅₁₂/F₆₀₄为纵坐标，以四环素类抗生素浓度为横坐标，绘制标准曲线；

步骤4：向待测样品溶液中加入所述的增强型比率荧光传感器反应，后测定荧光强度F₅₁₂和荧光强度F₆₀₄，并计算F₅₁₂/F₆₀₄比值，通过标准工作曲线计算待测样品中四环素类抗生素的含量。

进一步的，所述的四环素类标准溶液的浓度范围为0～50μM；

所述增强型比率荧光传感器溶液的浓度为(3.7×10^-2～3.8×10^-2)g/L。

进一步的，利用荧光分光光度计测定荧光光谱时的激发波长为395nm，待测样品溶液的pH为3.24～10.46，反应时间为3分钟，反应温度为50～70℃。

进一步的，所述的荧光探针Ru@ZIF-8在波长604nm处有红色荧光的发射峰，对四环素类抗生素在波长512nm处产生绿色荧光的发射峰。

本发明所述的增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的方法用于检测饮用水、牛奶和牛肉中的四环素类抗生素的应用，对四环素类抗生素的检测线性范围为0～50μM；

所述四环素类抗生素包括四环素、金霉素、土霉素和强力霉素，对所述四环素、金霉素、土霉素和强力霉素的最低检测限分别为2.4nM，4.2nM，1.6nM和7.2nM，所述饮用水、牛奶和牛肉的加标回收率为88.9％～112.14％。

与现有技术相比，其优点与积极效果在于：

(1)本发明通过简单的混合搅拌制备荧光探针，避免了高温、高压等复杂、耗时的制备过程。

(2)本发明构建的增强型比率荧光传感器结合增强的响应信号与稳定的参比信号，与猝灭型传感器相比，增强型比率荧光传感器的准确性和抗干扰能力更好，与单信号荧光传感器相比，增强型比率荧光传感器的内置参比可有效消除系统误差，而且具有明显的荧光颜色变化，便于可视化检测。

(3)将本发明的增强型比率荧光传感器用于四环素类抗生素的检测，对监控饮用水以及食品中四环素类抗生素残留具有很重要的意义和应用价值，具有灵敏、准确、快速、操作简单和便于可视化的优点，对所述四环素、金霉素、土霉素和强力霉素的最低检测限分别为2.4nM，4.2nM，1.6nM和7.2nM，本发明传感器可应用于饮用水、牛奶和牛肉中四环素类抗生素的检测。所述饮用水、牛奶和牛肉的加标回收率为88.9％～112.14％。

附图说明

图1为本发明的荧光探针的制备示意图；

图2为本发明的荧光探针的电镜表征，其中图2A和2B分别为ZIF-8和荧光探针Ru@ZIF-8的扫描电镜图，插图为对应的透射电镜图；

图3为本发明的荧光探针的X射线光电子能谱图，其中图3A为ZIF-8和Ru@ZIF-8的元素总谱，图3B、3C和3D分别为Zn 2p、C 1s和Ru 3d的精细谱图；

图4为本发明的探针的光学表征图，其中图4A为紫外可见光谱图，图4B为荧光光谱图；

图5为本发明的比率荧光传感器检测四环素类的性能图；

图6为本发明的比率荧光传感器检测四环素类特异性的结果图，其中图6A为该传感器对不同物质响应的荧光光谱图，图6B为不同物质与该传感器混合后，发射波长512nm和604nm处的荧光强度的比值；

图7为本发明的比率荧光传感器检测四环素类的光谱图和线性关系图，其中图7A、7C、7E、7G分别为该传感器检测四环素、金霉素、土霉素和强力霉素的荧光光谱图，图7B、7D、7F、7H分别为F₅₁₂/F₆₀₄比值与四环素、金霉素、土霉素和强力霉素浓度的线性关系图(F₅₁₂和F₆₀₄表示512nm和604nm发射波长处的荧光强度)。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明，本发明中使用的原料、试剂均可以通过市面上购买。

实验仪器：磁力搅拌器(MYP11-2，中国)，高速冷冻离心机(HC-3018R，中国)，扫描电子显微镜(Hitachi S-4800，日本)，透射电子显微镜(JEOL JEM-3010，日本)，X射线光电子能谱仪(Axis 118Ultra DLD)，紫外可见分光光度计(Shimadzu UV-2550，日本)，荧光分光光度计(Horiba Fluoromax-4，法国)。

实验试剂：2-甲基咪唑、三联吡啶氯化钌六水合物(Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O)、四环素(TET)、金霉素(CTE)、土霉素(OXY)、强力霉素(DOX)、万古霉素(VM)、硫酸新霉素(NEO)、硫酸链霉素(STR)、氨苄西林(AMP)、阿奇霉素(AZM)、氟苯尼可(FF)、头孢曲松钠(CTR)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、赖氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、葡萄糖(Glu)、乳糖(Lac)、半乳糖(Gal)均购自中国上海阿拉丁试剂有限公司。甲醇、Zn(NO₃)₂·6H₂O,NaCl,KCl,MgCl₂,AlCl₃,MnCl₂,CuCl₂,HgCl₂,CrCl₃,FeCl₂,FeCl₃,CoCl₂,NiCl₂,Na₂CO₃,Ca(NO₃)₂,ZnSO₄,NaAc and Na₃PO₄均购自天津科密欧试剂有限公司。硫酸卡那霉素(KM)、阿莫西林(AML)和红霉素(EM)购自上海国药化学试剂有限公司。超纯水(18.25MΩ·cm)用于制备所有水溶液。

本发明为了避免单信号猝灭型荧光传感器易受系统误差影响的问题，构建了一个内置参比的增强型比率荧光传感器，不仅能有效地降低干扰还有明显的荧光颜色变化，利于可视化检测。将此传感器用于四环素类抗生素的检测，对监控饮用水以及食品中抗生素残留具有很重要的意义和应用价值。

结合图1所示的增强型比率荧光传感器的制备示意图，本发明通过简单的混合搅拌制备荧光探针，即将沸石咪唑酯骨架ZIF-8分散至三联吡啶氯化钌六水合物的水溶液(含Ru(bpy)₃ ²⁺)中反应制得该荧光探针，简写为Ru@ZIF-8，荧光探针的粒径为73～83nm。而沸石咪唑酯骨架ZIF-8的制备是将含锌离子的溶液和含2-甲基咪唑的溶液混合搅拌制得，整个过程避免了高温、高压等复杂、耗时的制备过程。

在发明实施例中各制备过程中，所用到的玻璃器皿在使用前都用王水(HNO₃∶HCl＝1∶3)进行彻底浸泡清洗，并用超纯水进一步冲洗后放入烘箱中干燥备用。

本发明制备的增强型比率荧光传感器可检测的四环素类抗生素包括：四环素TET、金霉素CTE、土霉素OXY和强力霉素DOX这四种。

加标回收率是指在没有被测物质的样品基质中加入定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。

实施例1：

遵从上述技术方案，本实施例给出一种荧光探针，该荧光探针用于检测四环素类抗生素，所述的荧光探针包括将沸石咪唑酯骨架ZIF-8分散至三联吡啶氯化钌六水合物的水溶液中反应制得；

所制得的荧光探针在波长604nm处有红色荧光的发射峰，对四环素类抗生素在波长512nm处产生绿色荧光的发射峰，荧光探针的粒径为73～83nm。荧光探针与四环素类抗生素发生相互作用，会产生新的发射峰。

具体包括以下步骤：将硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于甲醇中，然后将其混合，连续搅拌1小时，将沉淀用甲醇洗3次，然后进行真空冷冻干燥，得到ZIF-8，其中锌离子和2-甲基咪唑的摩尔比为1：70；将Ru(bpy)₃ ²⁺溶于超纯水中，并将溶液pH调至12；将上述沉淀分散于上述Ru(bpy)₃ ²⁺溶液中，连续搅拌1小时后，将沉淀水洗3次，然后进行真空冷冻干燥。最终获得荧光探针Ru@ZIF-8。

对所获得的荧光探针采用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、X射线光电子能谱仪、紫外可见分光光度计、荧光光度计、紫外灯进行检测分析，检测方法均为常规操作：

利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对初始ZIF-8和荧光探针Ru@ZIF-8的形貌进行表征。参阅图2A(ZIF-8)和2B(荧光探针Ru@ZIF-8)，ZIF-8和Ru@ZIF-8形貌及大小基本一致，其中，ZIF-8粒径为72.63～83.05nm，Ru@ZIF-8粒径为73.8～82.38nm，表明掺杂Ru(bpy)₃ ²⁺对ZIF-8形貌基本没有影响。

利用X射线光电子能谱仪对ZIF-8和荧光探针Ru@ZIF-8的化学元素及化学键进行表征。由图3A可见，与ZIF-8总谱相比，Ru@ZIF-8总谱中增加了Ru 3d；由图3B可见，ZIF-8和Ru@ZIF-8的Zn 2p精细谱中特征峰位置一致；由图3C可见，对C1s精细谱进行分峰拟合，由于C1s和Ru 3d的能谱高度重叠，Ru@ZIF-8中除了C-C、C-N和C＝C的特征峰外，还有Ru 3d的特征峰；由图3D可见，Ru 3d精细谱拟合为Ru 3d_3/2和Ru 3d_5/2两个特征峰，拟合结果与理论值一致。上述X射线光电子能谱分析结果表明，荧光探针Ru@ZIF-8的成功制备，且ZIF-8原有的化学结构未破坏。

利用紫外可见分光光度计对ZIF-8、Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O和荧光探针Ru@ZIF-8的水溶液吸收光谱进行收集：取一定量的待测液，置于两面透光的石英比色皿中，将比色皿置于紫外可见分光光度计的样品槽内，开始检测200-800nm波长范围的紫外可见吸收强度，得到紫外可见吸收光谱见图4A。

由图4A可见Ru@ZIF-8的吸收光谱包含了ZIF-8和Ru(bpy)₃ ²⁺各自的特征峰，同样也表明该荧光探针的成功制备，ZIF-8溶液为无色，而Ru(bpy)₃ ²⁺和Ru@ZIF-8的溶液的颜色为淡黄色。

利用荧光分光光度计对ZIF-8、Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O和荧光探针Ru@ZIF-8的水溶液的荧光光谱进行收集：取一定量的待测液，置于四通光的石英比色皿中，检测其荧光强度和波长，得到荧光激发发射光谱见图4B。荧光分光光度计参数设置激发波长为395nm，狭缝宽度皆为5nm。

从图4B的图谱可以看出，ZIF-8无荧光发射峰，Ru(bpy)₃ ²⁺和Ru@ZIF-8的最大发射峰均位于604nm。

此外，参阅图4B中的插图，在紫外灯(365nm)照射下，ZIF-8(图中标号①)无荧光，而Ru(bpy)₃ ²⁺(图中标号②)和Ru@ZIF-8(图中标号③)的溶液均呈现红色荧光(插图从左到右依次对应ZIF-8、Ru(bpy)₃ ²⁺和Ru@ZIF-8的水溶液)。

下述实施例中使用的荧光探针均为实施例1制备得到的。

实施例2

本实施例给出一种增强型比率荧光传感器及制备方法，该增强型比率荧光传感器包括实施例1所述的荧光探针，包括以下步骤：

步骤1：将溶有硝酸锌的甲醇溶液和溶有2-甲基咪唑的甲醇溶液进行混合搅拌反应，得到沉淀，即为沸石咪唑酯骨架ZIF-8；；

步骤2：将三联吡啶氯化钌六水合物溶于水中，并采用氢氧化钠调节所得溶液的pH；调节pH是为了使其便于与ZIF-8复合；

将三联吡啶氯化钌六水合物溶于水中所得溶液的浓度为(3～6)mg/mL，溶液初始pH为8～8.3，采用氢氧化钠调节后溶液的pH为12。

步骤3：将步骤1得到的沸石咪唑酯骨架ZIF-8沉淀，分散于步骤2的溶液中，搅拌反应，经过离心、水洗、干燥得到沉淀为所述荧光探针，将所述荧光探针加入水中得到增强型比率荧光传感器，浓度为(3.7×10^-2～3.8×10^-2)g/L。

步骤1中，溶有硝酸锌的甲醇溶液中的锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:(69～72)，在本实施例中为1：70。

步骤2中，Ru(bpy)₃ ²⁺的溶液的浓度为4.5mg/mL，初始pH约为8.25。

步骤3中，沸石咪唑酯骨架ZIF-8与三联吡啶氯化钌六水合物的质量比为17:(12～24)。在本实施例中为17:18。

可以为：将硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于甲醇中，然后将其混合，连续搅拌1小时，将沉淀用甲醇洗3次，然后进行真空冷冻干燥，其中锌离子和2-甲基咪唑的摩尔比为1：70；将三联吡啶氯化钌六水合物溶于超纯水中，并将溶液pH调至12；将上述沉淀分散于上述三联吡啶氯化钌六水合物的水溶液中，连续搅拌1小时后，将沉淀水洗3次，然后进行真空冷冻干燥。在后续检测应用时，将其溶于超纯水中，配制传感器Ru@ZIF-8溶液，浓度为3.75×10^{- 2}g/L。

实施例3

本实施例验证实施例2制备的增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的可行性和特异性。

以四环素(TET)为四环素类抗生素的代表，进行增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的可行性测试，具体实验操作：

将100μLZIF-8溶液置于2mL离心管中，加入1μL浓度为10mM的四环素标准液，用超纯水定容至1mL，混匀后反应3分钟，作为对照组一；

将100μL实施例2中的Ru@ZIF-8溶液置于2mL离心管中，用超纯水定容至1mL，作为对照组二；

将100μL实施例2中的Ru@ZIF-8溶液置于2mL离心管中，加入1μL浓度为10mM的四环素标准液，用超纯水定容至1mL，混匀后反应3分钟；

将上述三种混合液分别置于四面通光的石英比色皿中，测定荧光光谱，激发波长设置为395nm，狭缝宽度为5nm。

如图5所示，三个曲线分别表示ZIF-8对四环素TET的荧光响应、Ru@ZIF-8的荧光光谱和Ru@ZIF-8对四环素TET的荧光响应。ZIF-8自身没有荧光发射峰，见图4B。当ZIF-8中加入四环素后，即对照组一，在波长512nm处有明显的发射峰，因此，ZIF-8对四环素有增强型的荧光响应。Ru@ZIF-8在波长604nm处有红色荧光的发射峰，当四环素加入后，Ru@ZIF-8不仅在波长604nm处的发射峰保持稳定，而且在波长512nm处产生新的绿色的发射峰。如图5中的插图(从左到右)，上述三种混合液在紫外灯照射下分别呈现绿色、红色、橙色的荧光。以上结果表明，传感器Ru@ZIF-8对四环素有很好的荧光响应，可用于四环素的荧光检测。

本实施例还验证了Ru@ZIF-8对四环素类的特异性，具体如下：

本实施例检测了Ru@ZIF-8对14种抗生素、9种小分子、14种阳离子和9种阴离子的荧光响应情况。

14种抗生素分别为：四环素(TET)、金霉素(CTE)、土霉素(OXY)、强力霉素(DOX)、万古霉素(VM)、硫酸卡那霉素(KM)、硫酸新霉素(NEO)、硫酸链霉素(STR)、阿莫西林(AML)、氨苄西林(AMP)、阿奇霉素(AZM)、红霉素(EM)、氟苯尼可(FF)、头孢曲松钠(CTR)；

9种小分子分别为：天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、赖氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、葡萄糖(Glu)、乳糖(Lac)、半乳糖(Gal)；

14种阳离子分别为：Na⁺,K⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Al³⁺,Zn²⁺,Mn²⁺,Cu²⁺,Hg²⁺,Cr³⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Co^{2 +},Ni²⁺；

9种阴离子分别为：Cl^-,HCO₃ ^-,CO₃ ^2-,NO₂ ^-,NO₃ ^-,SO₃ ^2-,SO₄ ^2-,PO₄ ^3-,Ac^-。

具体操作步骤：分别配制10mM上述46种物质的溶液，取多份100μL实施例2中得到的Ru@ZIF-8溶液于2mL离心管中，分别加入1μL抗生素、10μL小分子、10μL阳离子或10μL阴离子，用超纯水定容至1mL，混匀后反应3分钟，测定荧光光谱，激发波长设置为395nm，狭缝宽度为5nm。

光谱图可参阅附图6A，只有四环素类抗生素(四环素TET、金霉素CTE、土霉素OXY和强力霉素DOX)能明显增强512nm处的发射峰，参阅附图6B，除四环素类抗生素以外的其他物质与空白对照组相似，其F₅₁₂/F₆₀₄比值较小，而加入四环素类抗生素的比值变化显著高于其他物质。以上结果表明，本发明构建的增强型比率荧光传感器具有良好的特异性，可用于四环素类抗生素的检测。

实施例4：增强型比率荧光传感器对四环素类抗生素的灵敏度测试

本实施例给出一种增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的方法，增强型比率荧光传感器为实施例2的增强型比率荧光传感器的制备方法制得的增强型比率荧光传感器，检测四环素类抗生素的方法包括如下步骤：

步骤1：配制四环素类抗生素标准溶液；

步骤2：取不同体积步骤1所配制的四环素类抗生素标准溶液，分别加入到增强型比率荧光传感器溶液中得到不同的混合溶液，所述混合溶液的pH为8.6～8.7，具体为8.66；

步骤3：利用荧光分光光度计测定所述的不同的混合溶液的荧光光谱，记录在512nm和604nm发射波长下的荧光强度F₅₁₂和荧光强度F₆₀₄，以荧光强度F₅₁₂与荧光强度F₆₀₄的比值F₅₁₂/F₆₀₄为纵坐标，以四环素类抗生素浓度为横坐标，绘制标准曲线；

步骤4：向待测样品溶液中加入所述的增强型比率荧光传感器反应，后测定荧光强度F₅₁₂和荧光强度F₆₀₄，并计算F₅₁₂/F₆₀₄比值，通过标准工作曲线计算待测样品中四环素类抗生素的含量。

四环素类抗生素标准溶液的浓度范围为0～50μM。

利用荧光分光光度计测定荧光光谱时的激发波长为395nm，待测溶液的pH为3.24～10.46，反应时间为3分钟，反应温度为50～70℃。

在本实施例中，具体包括以下步骤：以四环素类抗生素TET为例，配制10mM TET的标准溶液；取多份100μL实施例2中得到的Ru@ZIF-8于2mL离心管中，分别加入不同体积的TET溶液，用超纯水定容至1mL，以保证TET的终浓度依次为0、0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5、7.5、10、15、20、30、40、50μM，混匀后，在60℃下反应3分钟，测定荧光光谱，激发波长设置为395nm，狭缝宽度为5nm。

其他CTE，OXY和DOX四环素类抗生素检测方法与TET的相同。

光谱图可参阅附图7A、7C、7E和7G，在0～50μM范围内，随着四环素类抗生素浓度的增加，检测体系在512nm处的荧光F₅₁₂逐渐增强，604nm处的荧光强度F₆₀₄基本保持不变，以其比值F₅₁₂/F₆₀₄为纵坐标，以四环素类浓度为横坐标，绘制标准曲线，参阅附图7B、7D、7F和7H。

图7的光谱图和线性关系图说明：四环素类抗生素能够有效增强检测体系在波长512nm处的发射峰，而与604nm处的荧光无响应，因此可以利用F₅₁₂/F₆₀₄的值和四环素类抗生素浓度之间的关系，实现对测试样品中四环素类抗生素的检测。

该增强型比率荧光传感器对四环素类抗生素的检测线性范围均为0～50μM，对四环素、金霉素、土霉素和强力霉素的最低检测限分别为2.4，4.2，1.6和7.2nM。

实施例5：检测四环素类抗生素的增强型比率荧光传感器的应用

本实施例以饮用水、牛奶和牛肉作为实际样品，在饮用水、牛奶和牛肉样品中分别加入浓度为0.5、5和20μM的四环素类抗生素作为加标样品，充分混合后，加标样品在4℃保持过夜。

饮用水样品不进行前处理，直接使用。牛奶和牛肉样品需进行前处理，包括：对于牛奶样品，2mL稀释2倍，与2mL 3％三氯乙酸水溶液混合，涡旋振荡1分钟，超声处理20分钟，然后离心(10000rpm，10分钟)，再用0.22μm过滤器过滤，上清液保存备用。对于牛肉样品，取1g牛肉切碎研磨后，与2mL 3％三氯乙酸水溶液混合，涡旋振荡5分钟，然后离心(10000rpm，10分钟)，再用NaOH(1M)溶液将上清液调节至中性。

按照实施例4所述，将样品前处理液与荧光探针Ru@ZIF-8混合，在60℃下反应3分钟，利用荧光分光光度计测定荧光光谱，记录在波长512nm和604nm处的荧光强度。

表1增强型比率荧光传感器检测饮用水、牛奶和牛肉的加标回收率

检测结果见表1，饮用水、牛奶和牛肉的加标回收率均为88.90％～112.14％，说明样品基质对该比率传感器的分析能力没有影响或影响不大。因此，由于优异的稳定性，特异性和适用性，本发明提出的增强型比率荧光传感器可以很好地满足在实际样品中快速检测四环素类抗生素残留的需求。

Claims (4)

1.一种增强型比率荧光传感器的制备方法，其特征在于，所述的增强型比率荧光传感器包括荧光探针，所述的荧光探针在波长604 nm处有红色荧光的发射峰，所述荧光探针对四环素类抗生素在波长512 nm处产生绿色荧光的发射峰，所述荧光探针的粒径为73~83nm；

该制备方法包括以下步骤：

步骤1：将溶有硝酸锌的甲醇溶液和溶有2-甲基咪唑的甲醇溶液进行混合搅拌反应，得到沸石咪唑酯骨架ZIF-8沉淀；步骤1中，所述溶有硝酸锌的甲醇溶液中的锌离子与2-甲基咪唑的摩尔比为1:（69~72）；

步骤2：将三联吡啶氯化钌六水合物溶于水中，并采用氢氧化钠调节所得溶液的pH；步骤2中，将三联吡啶氯化钌六水合物溶于水中所得溶液的浓度为（3~6）mg/mL，溶液初始pH为8~8.3，采用氢氧化钠调节后溶液的pH为12；

步骤3：将步骤1得到的沸石咪唑酯骨架ZIF-8沉淀，分散于步骤2的溶液中，搅拌反应，经过离心、水洗、干燥得到沉淀为所述荧光探针，将所述荧光探针加入水中得到增强型比率荧光传感器，沸石咪唑酯骨架ZIF-8与三联吡啶氯化钌六水合物的质量比为17:（12~24）。

2.一种增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述的增强型比率荧光传感器为权利要求1所述的增强型比率荧光传感器的制备方法制得的增强型比率荧光传感器，所述检测四环素类抗生素的方法包括如下步骤：

步骤1：配制四环素类抗生素标准溶液；

步骤2：取不同体积步骤1所配制的四环素类抗生素标准溶液，分别加入到增强型比率荧光传感器溶液中得到不同的混合溶液，所述混合溶液的pH为8.6~8.7；所述的四环素类标准溶液的浓度范围为0～50 μM；所述增强型比率荧光传感器溶液的浓度为（3.7×10^-2~3.8×10^-2）g/L；

步骤3：利用荧光分光光度计测定所述的不同的混合溶液的荧光光谱，利用荧光分光光度计测定荧光光谱时的激发波长为395 nm，待测样品溶液的pH为3.24~10.46，反应时间为3分钟，反应温度为50~70℃；记录在512 nm和604 nm发射波长下的荧光强度F₅₁₂和荧光强度F₆₀₄，以荧光强度F₅₁₂与荧光强度F₆₀₄的比值F₅₁₂/F₆₀₄为纵坐标，以四环素类抗生素浓度为横坐标，绘制标准曲线；

步骤4：向待测样品溶液中加入所述的增强型比率荧光传感器反应，后测定荧光强度F₅₁₂和荧光强度F₆₀₄，并计算F₅₁₂/F₆₀₄比值，通过标准工作曲线计算待测样品中四环素类抗生素的含量。

3.如权利要求2所述的增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的方法，其特征在于，所述的荧光探针Ru@ZIF-8在波长604 nm处有红色荧光的发射峰，对四环素类抗生素在波长512 nm处产生绿色荧光的发射峰。

4.如权利要求2或3任一权利要求所述的增强型比率荧光传感器检测四环素类抗生素的方法用于检测饮用水、牛奶和牛肉中的四环素类抗生素的应用，对四环素类抗生素的检测线性范围为0～50 μM；

所述四环素类抗生素选自四环素、金霉素、土霉素和强力霉素，对所述四环素、金霉素、土霉素和强力霉素的最低检测限分别为2.4 nM，4.2 nM，1.6 nM和7.2 nM，所述饮用水、牛奶和牛肉的加标回收率为88.9%～112.14%。