CN109946355A - 一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，确定待检测的目标肿瘤标志物；合成g‑C₃N₄纳米片；合成AuNPs；金电极的预处理；制备Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g‑C₃N₄复合薄膜修饰电极；电化学发光生物传感的定量分析。本发明的有益效果是基于二茂铁与三联吡啶钌之间作用，通过探针构型的转换引起电化学发光信号的改变，从而更灵敏地检测目标肿瘤标志物。该方法操作简便、无需封闭、特异性强、重现性高。

Description

一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法

技术领域

本发明属于电化学技术领域，涉及一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法。

背景技术

电化学发光技术指的是物质在电极表面发生电荷转移反应产生激发态物质，最终回到基态的光发射过程。因其兼具化学发光方法灵敏度高的优点以及电化学检测方法卓越的可控性，应用电化学发光技术的传感检测倍受关注。电化学发光物质种类繁多，例如三联吡啶钌、鲁米诺、光泽精、吖啶酯、氧化草酸酯、量子点以及金属纳米簇等等。其中，三联吡啶钌电化学发光因具有高灵敏度和宽动态检测范围的优点被广泛应用于医学和免疫分析领域。电化学发光(ECL)技术具有装置简单、重现性好、可进行原位发光、灵敏度高等优点，随着对ECL反应机理研究的日趋成熟，其在分析化学上的应用正日益受到人们的重视。电化学发光是物质在电极表面上发生电子转移反应形成激发态而发光的过程，是由电化学反应直接或间接引起的化学发光，三联吡啶钌电化学发光保留了化学发光的优点如灵敏度高、线性范围宽、观察方便、仪器简单等，又具有自身的特点，如重现性好、试剂稳定、控制容易、检测限低等，因而广泛应用于生命、食品、药物以及环境检测等方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，本发明的有益效果是基于二茂铁与三联吡啶钌之间作用，通过探针构型的转换引起电化学发光信号的改变，从而更灵敏地检测目标肿瘤标志物。该方法操作简便、无需封闭、特异性强、重现性高。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

1)确定待检测的目标肿瘤标志物；

2)合成g-C₃N₄纳米片；

3)合成AuNPs；

4)金电极的预处理；

5)制备Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g-C₃N₄复合薄膜修饰电极；

6)电化学发光生物传感的定量分析。

进一步，步骤2)通过典型的高温煅烧法制备g-C₃N₄纳米片，将5g三聚氰胺置于坩埚中，在马弗炉中加热至550℃，保持4小时，并自然冷却至室温，得到黄色固体。然后，将黄色粉末研磨成粉末，接下来，将100mg黄色粉末和100mL去离子水混合并超声8小时获得g-C₃N₄纳米片备用。

进一步，步骤3)通过柠檬酸盐还原溶液中的HAuCl₄合成AuNPs，将含有96mLH₂O和4mL 1％HAuCl₄的溶液加热回流，当溶液沸腾时，加入10mL 38.8mM柠檬酸钠溶液，将混合溶液保持沸腾15分钟后，自然冷却至室温，将产品储存在4℃，以备后续使用。

进一步，步骤4)金电极经0.05μm的α-A1₂0₃抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10min，采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5Μ硫酸中，对金电极进行循环伏安扫描，用去离子水冲洗电极，备用。

进一步，步骤5)首先将5mg g-C₃N₄和10nMAuNP与2％CS溶液混合，得到AuNPs/g-C₃N₄，2mg/mL，然后，将上述溶液与Ru(bpy)₃ ²⁺溶液混合，产物在室温下避光震摇10小时，获得Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g-C₃N₄复合物混合液，吸取5μL上述混合液滴加在预处理过的金电极上，室温下避光放置干燥，该过程重复两次。

进一步，步骤6)在含有20mM三丙胺底物的反应溶液中，扫描速率为100mV/s，在0～2.0V的电位范围内测量ECL信号，每个样品检测三次，体系的ECL信号随着溶液中Mucin I浓度的增加而逐渐降低，此外，ECL信号与Mucin I浓度的对数之间存在良好的线性关系，浓度范围为0-200ng/mL，线性回归方程为I＝-5873.81log₁₀c+13522.31，I：ECL信号强度，c：Mucin I浓度，ng/mL，相关系数为0.9932。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明检测肿瘤标志物的电化学发光方法步骤如下：

1)确定待检测的目标肿瘤标志物Mucin I。

2)合成g-C₃N₄纳米片；

通过高温煅烧法制备g-C₃N₄纳米片。将5g三聚氰胺接地并置于坩埚中，在马弗炉中加热至550℃，保持4小时，并自然冷却至室温，得到黄色固体。然后，将黄色粉末研磨成粉末。接下来，将100mg黄色粉末和100mL去离子水混合并超声8小时，获得g-C₃N₄纳米片备用。

3)合成AuNPs；

通过柠檬酸盐还原溶液中的HAuCl₄合成AuNPs。将含有96mLH₂O和4mL1％HAuCl₄的反应溶液加热回流，当溶液沸腾时，加入10mL 38.8mM柠檬酸钠溶液。将混合溶液保持沸腾15分钟，自然冷却至室温得产品，储存在4℃以备后续使用。

4)金电极的预处理：金电极经0.05μm的α-A1₂O₃抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10min。采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5Μ硫酸中，对金电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。

5)制备Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g-C₃N₄复合薄膜修饰电极。首先，将5mg g-C₃N₄和10nMAuNP与2％CS溶液混合，得到AuNPs/g-C₃N₄(2mg/mL)。然后，将上述溶液与Ru(bpy)₃ ²⁺溶液混合，室温下避光保持震摇10小时。吸取5μL Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g-C₃N₄的混合液滴加在金电极上，最后，获得Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g-C₃N₄复合膜修饰电极，室温下避光放置干燥，该过程重复两次。

6)电化学发光生物传感器的定量分析：

在含有20mM三丙胺(TPA)底物的反应溶液中，扫描速率为100mV/s，在0～2.0V的电位范围内测量ECL信号，每个样品检测三次。体系的ECL信号随着溶液中Mucin I浓度的增加而降低。ECL信号与Mucin I浓度的对数之间存在良好的线性关系，浓度线性范围为0-200ng/mL。线性回归方程为I＝-5873.81log₁₀c+13522.31(I：ECL信号)和c：Mucin I浓度，ng/mL)，相关系数为0.9932。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，如更换电极种类，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，其特征在于按照以下步骤进行：

1)确定待检测的目标肿瘤标志物；

2)合成g-C₃N₄纳米片；

3)合成AuNPs；

4)金电极的预处理；

5)制备Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g-C₃N₄复合薄膜修饰电极；

6)电化学发光生物传感的定量分析。

2.按照权利要求1所述一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤2)通过典型的高温煅烧法制备g-C₃N₄纳米片，将5g三聚氰胺接地并置于坩埚中，在马弗炉中加热至550℃，保持4小时，并自然冷却至室温，得到黄色固体。然后，将黄色粉末研磨成粉末，接下来，将100mg黄色粉末和100mL去离子水混合并超声8小时以供g-C₃N₄纳米片用于下一次使用。

3.按照权利要求1所述一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤3)通过柠檬酸盐还原溶液中的HAuCl₄合成AuNPs，使含有96mLH₂O和4mL1％HAuCl₄的反应液加热回流，当溶液沸腾时，加入10mL38.8mM柠檬酸钠溶液，将混合液保持沸腾15分钟，然后自然冷却至室温，将产品储存在4℃以备后续使用。

4.按照权利要求1所述一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤4)金电极经0.05μm的α-A1₂O₃抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10min，采用三电极系统检测，工作电极为金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5Μ硫酸中，对金电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。

5.按照权利要求1所述一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤5)首先将5mg g-C₃N₄和10nMAuNP与2％CS溶液混合，得到AuNPs/g-C₃N₄，2mg/mL，然后，将上述溶液与Ru(bpy)₃ ²⁺溶液混合，将产物在室温下在黑暗中保持摇动10小时，获得Ru(bpy)₃ ²⁺/AuNPs/g-C₃N₄混合液，吸取5μL上述混合液滴加在金电极上，室温下避光放置干燥，该过程重复两次。

6.按照权利要求1所述一种检测肿瘤标志物的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤6)在含有20mM三丙胺的反应溶液中，扫描速率为100mV/s，在0～2.0V的电位范围内测量ECL信号，每个样品检测三次，取其平均值。ECL信号随着Mucin I浓度的增加而降低，此外，ECL信号与Mucin I浓度的对数之间存在良好的线性关系，浓度范围为0-200ng/mL，线性回归方程为I＝-5873.81log₁₀c+13522.31，I：ECL信号，c：Mucin I浓度，ng/mL，相关系数为0.9932。