CN1197973C - 肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物制剂技术领域。本发明公开了一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒。该试剂盒是一种体外诊断试剂，用来测定人血清中α-L-岩藻糖苷酶(AFU)活性，对原发性肝癌的诊断、监护以及肝硬化的监护具有广泛的临床意义。本发明提供了制备方法。
Description
技术领域
本发明属生物制剂技术领域，具体涉及一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒。
背景技术
血清中α-L-岩藻糖苷酶(AFU)测定用于肝癌诊断，已有近二十年历史(早期用于岩藻糖苷贮积症诊断，八十年代起用于肝癌诊断)，但测定试剂中的关键试剂——底物，一直采用对硝基苯-α-L-岩藻吡喃糖苷(PNPF)。PNPF制成测定溶液后，化学性质十分稳定，保存和使用十分方便，但其最大缺陷在于反应产物PNP的解离常数pKa值(7.0)远高于AFU酶反应的最适pH值(约5)，在pH5时不能显色。因此，市场上用PNPF作底物制成的试剂盒，存在着以下无法克服的缺点：
1.由于产物PNP在反应过程中不显色，不能采用酶分析中最合理的连续监测法，只能采用两点法，即在反应一定时间后加入终止液，终止酶反应并使反应产物显色，进行比色测定；
2.由于终止液加入前后，反应液的成份、各成份的浓度和溶液pH等，都会发生显著改变，因此每例测定必须加做样品空白，既增加操作程序，而且必然引入新的误差；
3.反应时间长。经典的以PNP为底物的两点法，反应时间长达一小时，发展到今天的自动化方法，尚需300秒。对酶分析来说，有失测定反应初速度的理想条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：
1.改变PNPF两点法不能采用连续监测法的状况，研制以2-氯对硝基苯-α-L-岩藻吡喃糖苷(CNPF)为底物的连续监测法试剂盒；
2.重点解决CNPF在液体状态下稳定性差的问题，研制稳定的液体型AFU(CNPF)连续监测法试剂盒，显著提高方法的实用性和技术水准，广泛适应各大小实验室的需要；
3.通过优选，使酶反应条件更臻合理。
本发明提供了一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒。本发明的试剂盒是由试剂1和试剂2组成的，其中试剂1为(浓度以毫摩尔浓度(mmol/L)或重量/体积百分比(W/V)表示)：
柠檬酸三钠 55.5-300mmol/L
或Na2HPO4 74.8-300mmol/L
CAPSO 0-300mmol/L
NaAc 200-300mmol/L
NaN3 0-0.1％(W/V)
NaH2PO4 0-300mmol/L
试剂2为(浓度以毫摩尔浓度(mmol/L)或重量/体积百分比(W/V)表示)：
柠檬酸 10.6-300mmol/L
HAc 12.6-300mmol/L
HCl 0-300mmol/L
苯甲酸 0-12mmol/L
NaN3 0-0.1％(W/V)
CNPF 0.1-2％(W/V)
本发明的另一所要解决的技术问题是提供了上述肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒的研制方法，该方法包括下列步骤：
1.用不同种类、不同浓度、不同pH的缓冲系统，测定同份样品中AFU活性，初选出相对满意的缓冲系统；实验研究中各物质浓度范围如下：
柠檬酸三钠 0-300mmol/L 柠檬酸 0-300mmol/L
Na2HPO4 0-300mmol/L HAc 0-300mmol/L
NaAc 0-300mmol/L HCl 0-300mmol/L
3-环己氨2-羟-1-丙烷磺酸钠(CAPSO)0-300mmol/L
苯甲酸 0-12mmol/L NaH2PO4 0-300mmol/L
NaN3 0-0.1％(W/V) CNPF 0-2％(W/V)
2.对初选出的缓冲系统，逐一完成缓冲液浓度和pH对酶活性的影响试验，以及各系统中底物CNPF的稳定性实验，进一步缩小缓冲系统的可选范围；
3.择优选用能提高CNPF稳定性的缓冲系统，实验求出该系统中酶反应产物CNP的摩尔吸光度(ε)，并求出该系统中CNPF浓度对AFU活性的影响曲线，在此基础上确定下一步实验的CNPF的浓度范围；制备在此范围内不同CNPF浓度的缓冲系统，经过对血清AFU活性测定，用Linewear-Burk双倒数作图法，求出在该系统中AFU对CNPF的米氏常数Km值；结合CNPF浓度对AFU活性的影响曲线，确定试剂中CNPF的配制浓度；
4.经过上述选择，配制成选定的缓冲系统和底物浓度的试剂，经37℃加热试验，并通过与其他糖苷类试剂的比较，进一步确定CNPF在该系统中的稳定性；
5.作重复性试验和线性试验；
本发明的试剂盒既可作稳定的双试剂(试剂1和试剂2)直接使用，也可将试剂1与试剂2按4∶1的比例混合，作稳定的单试剂直接使用。通常，本发明的试剂盒采用连续监测法，必要时也可加用终止液，改为两点比色法。检测参数为：
主波长 405nm 次波长 600nm
光径 1cm 温度 37℃
延滞时间 90秒 监测时间 90秒
试剂1 200μl 试剂2 50μl
样品 25μl 计算因数 3207
如改用单试剂操作，只需将试剂1与试剂2按规定比例混合均匀，即得稳定的液体单试剂。
如所用仪器不含有405nm波长，可将主/次波长改为410nm/600nm，计算因数改为3337，其余测定参数不变。
本发明的试剂盒是一种体外诊断试剂，用来测定人血清(体液)中α-L-岩藻糖苷酶(AFU)活性，对原发性肝癌的诊断和监护，以及监护肝硬化病人是否并发肝癌，独具价值。本发明的试剂盒既适用于全自动生化分析仪，也适用于半自动生化分析仪，需要时还可改为手工操作使用，操作十分简便，适用于各种实验室，市场前景广阔。
具体实施方式
实施例1液体双试剂之组成
试剂1：
0.1mol/L柠檬酸三钠 555ml
0.2mol/LCAPSO 100ml
NaAc 20.5g
NaN3 1g
NaCl 7.3g
H2O加至 1000ml
试剂2：
0.1mol/L柠檬酸 445ml
1mol/L HAc 63ml
NaN3 1g
CNPF 1.0g
H2O加至 1000ml
实施例2
试剂1：
0.2mol/L Na2HPO4 467.5ml
0.2mol/LCAPSO 100ml
NaAc 20.5g
NaN3 1g
NaCl 7.3g
H2O加至 1000ml
试剂2：
0.1mol/L柠檬酸 532.5ml
1mol/L HAc 63ml
NaN3 1g
CNPF 1.0g
H2O加至 1000ml
实施例3
试剂1：
0.2mol/L Na2HPO4 374ml
NaAc 16.4g
NaN3 1g
NaCl 5.85g
H2O加至 1000ml
试剂2：
0.1mol/L柠檬酸 106ml
1mol/L HAc 12.6ml
CNPF 3.5g
H2O加至 1000ml
Claims (2)
1、一种肝癌诊断、监护及肝硬化监护试剂盒，其特征在于该试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1为(浓度以毫摩尔浓度(mmol/L)或重量/体积百分比(W/V)表示)：
柠檬酸三钠 55.5-300mmol/L
或Na2HPO4 74.8-300mmol/L
CAPSO 0-300mmol/L
NaAc 200-300mmol/L
NaN3 0-0.1％(W/V)
NaH2PO4 0-300mmol/L
试剂2为(浓度以毫摩尔浓度(mmol/L)或重量/体积百分比(W/V)表示)：
柠檬酸 10.6-300mmol/L
HAc 12.6-300mmol/L
HCl 0-300mmol/L
苯甲酸 0-12mmol/L
NaN3 0-0.1％(W/V)
CNPF 0.1-2％(W/V)
2、根据权利要求1所述的一种肝癌诊断监护及肝硬化监护试剂盒，其特征在于该试剂盒为由试剂1与试剂2按4∶1的比例混合而成的液体型单试剂。
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