CN1896271A - 血清钾离子酶法测定试剂及方法 - Google Patents

血清钾离子酶法测定试剂及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了血清中钾离子酶法测定试剂及方法，本发明采用冠醚具有穴醚的特点与钾离子络合能力应用不同试剂的配比寻找到比较好的浓度在灵敏度、准确度、精密度方法与穴醚效果相同。采用本发明测定的效果达到与穴醚相似但测定方法简便成本大大降低。

Description

血清钾离子酶法测定试剂及方法
技术领域
本发明属于临床生化分析方法，用于血清中钾离子的测定。
背景技术
在生物化学的临床实验中，血清钾钠测定是医院里常规的分析项目。钾的正常值是3.5-5.1mmol/L，临床上常见的电解质紊乱是高血钾症。
最早钾离子的分析方法是火焰光度法。该方法的原理是，某些待测钾原子通过加热刺激被激发，当回到基态时发出具有特征波长的光。火焰中由被激发的待测钾原子产生的特征波长，辐射能的强度直接与火焰中被激发的待测钾原子的数量成正比，而被激发的待测钾原子数量直接与样本中所要测定的钾原子的浓度成正比。这种方法需要的装置复杂而且昂贵，并且要使用可燃气体。
目前医院里普遍使用的钾离子测定的方法是离子选择电极法。理想的情况是，每个电极都具有单离子选择性，使电极只对一种离子有反应。实际情况却不是这样，所有的离子选择电极都存在有干扰离子。况且，尽管能对离子特异性电极进行校正，但通常特异性仍不是绝对的，所以用电极法测得的结果也不是十分准确。而且测定成本也比较高，尤其是辅助材料及仪器比较昂贵。
近几年又出现了血清钾离子的酶法测定方法。该测定方法的理论基础是许多离子都有激活酶的作用。早在1989年南澳大利亚弗临德斯大学的Berry等利用K+依赖性丙酮酸激酶(PK)可催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸的反应原理，再借助NADH以乳酸脱氢酶(LDH)为指示酶，在340nm处监测NADH的减少，以每分钟吸光度(ΔA/min)的变化与K+含量成正比，从而建立了酶偶联连续测定钾离子的方法。鉴于NH4 +与K+激活PK的能力大致相同，作者先用谷氨酸脱氢酶(GLDH)来消除内源性NH4 +的干扰，再加入PK，并以血清中的K+为必需激活剂催化PEP转变。为消除Na+对K+测定的干扰，还在反应体系中加入了穴醚-Kryptofix-2.2.1，(简称K221)。K221的分子式为C16H32N2O5，是一种离子载体替代物，可螯合一价阳离子，可降低反应液中游离Na+浓度，从而降低对K+的干扰。离子载体也可以络合一部分K+，将其调整到一个合适的测定范围。
酶法测定不仅准确，而且更加方便，可以同其它常规检测项目一起用全自动分析仪进行检测，摆脱了原来的电极法的仪器，同时也降低了检测成本。原来的电极法不仅要另外购买仪器，而且还要经常更换电极，电解液的消耗也比较快，这些原因使电极法测定血清中的钾离子成本比较高，而采用酶法测定就不存在这些问题，所以测定成本降低很多。
发明内容
本发明目的在于提供一种采用酶法测定血清中钾离子的试剂。
本发明另一目的在于提供该试剂的测定方法。
本发明提供的血清钾离子酶法测定试剂组成如下：
  R1试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH8.05(37℃)   300mmol/L
  α-ketoglutaric acid(α-酮戊二酸)   10mmol/L
  PEP(磷酸烯醇丙酮酸环己胺盐)   2-6mmol/L
  ADP(5‘-腺苷二磷酸二钠盐)   1-10mmol/L
  GLDH(谷氨酸脱氢酶)   5-30KU/L
  15-冠-5醚   10-70mmol/L
  还原辅酶I二钠盐   0.4-0.6mmol/L
  Licl   50mmol/L
  R2试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH7.8(37℃)   50mmol/L
  Pyruvate kinase(丙酮酸激酶)   1000-5000U/L
  Mncl2   8.5mmol/L
  LDH(乳酸脱氢酶)   50-100KU/L
本发明的试剂是由稀释液和冻干品组成的。因为有些组分在水溶液中保存的时间很短，所以要冻干保存。R1和R2测试时的用量比为：2.5∶1，所以配制量比例为2.5∶1。配制过程如下：
R1：
(1)稀释液(1000ml)
Tris-Hcl buffer pH8.1(25℃)120mmol/L 1000ml，依次准确加入以下物质：
α-ketoglutaric acid
15-C-5
Licl
(2)冻干品(100ml，10倍浓缩液)
Tris-Hcl buffer pH9.0(25℃)300mmol/L 100ml，依次准确加入以下物质：
PEP
ADP
GLDH
NADH
Sucrose        10克(成型剂)
R2：
(1)稀释液(400ml)
Tris-Hcl buffer pH6.7(25℃)7.5mmol/L 400ml，依次准确加入以下物质：
Mncl2
(2)冻干品(40ml，10倍浓缩液)
Tris-Hcl buffer pH6.7(25℃)7.5mmol/L 40ml，依次准确加入以下物质：
Pyruvate kinase
LDH
Sucrose    6.8克(成型剂)
本发明利用冠醚具有穴醚的特点与钾离子络合的能力，采用不同试剂的配比寻找出以上的用于血清钾离子酶法测定试剂。
本发明的关键在于使用了一种新型的离子载体，这种载体价格便宜，它属于冠醚类物质。与Berry报道的方法不同之处在于他们使用的是一种穴醚类载体K221，而穴醚是非常昂贵的，1ml大约4000元人民币。我们使用的冠醚类载体非常便宜。经过配方的筛选，获得了比较好的测定结果。该物质的化学式如下：15-crown-5，称为：15-冠-5醚，分子式：C10H20O5。有文献报道(林自力，冠醚化合物比色测定钾钠的应用进展。)穴醚和冠醚对钾离子和钠离子的络合选择性如下：
Figure A20061002845200061
由于它们的大环结构中有空穴，加之内部的氧原子有共用电子对可与金属离子络合，故根据空穴的大小，可选择性络合不同直径的金属离子。虽然冠醚类物质络合钾离子和钠离子的能力远远不如穴醚类物质，但是我们经过大量的实验，筛选了一个比较好的浓度，在灵敏度、准确度、精密度方面获得了与使用穴醚相同的效果。
血清钾离子测定的主要试剂的典型浓度范围如下：
  R1试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH8.05(37℃)   300mmol/L
  α-ketoglutaric acid(α-酮戊二酸)   10mmol/L
  PEP(磷酸烯醇丙酮酸环己胺盐)   2-6mmol/L
  ADP(5‘-腺苷二磷酸二钠盐)   1-10mmol/L
  GLDH(谷氨酸脱氢酶)   5-30KU/L
  15-冠-5醚   10-70mmol/L
  还原辅酶I二钠盐   0.4-0.6mmol/L
  Licl   50mmol/L
  R2试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH7.8(37℃)   50mmol/L
  Pyruvate kinase(丙酮酸激酶)   1000-5000U/L
  Mncl2   8.5mmol/L
  LDH(乳酸脱氢酶)   50-100KU/L
附表：
用冠醚配制钾离子测定试剂与用穴醚配制钾离子测定试剂性能比较：
  冠醚配制钾离子测定试剂   穴醚配制钾离子测定试剂
  线性重复性准确度灵敏度稳定性两种试剂相关性   1-8mmol/L范围内呈线性批内(n＝20)CV(％)＜4±5％OD/mmol/L＝0.0482-8℃环境下可稳定1年Y＝1.0602X-0.147   1-8mmol/L范围内呈线性批内(n＝20)CV(％)＜5±5％OD/mmol/L＝0.0172-8℃环境下可稳定1年r＝0.9892
附图说明
图1为用冠醚配制钾离子测定试剂与用穴醚配制钾离子测定试剂测定临床样本(n＝26)相关性比较：
x轴为用穴醚配制的试剂测定临床样本的结果；
y轴为用冠醚配制的试剂测定临床样本的结果。
有益效果
酶法测定不仅准确，而且更加方便，可以同其它常规检测项目一起用全自动分析仪进行检测，摆脱了原来的电极法的仪器，同时也降低了检测成本。原来的电极法不仅要另外购买仪器，而且还要经常更换电极，电解液的消耗也比较快，这些原因使电极法测定血清中的钾离子成本比较高，而采用酶法测定就不存在这些问题，所以测定成本降低很多。
具体实施方式
实施例：
1.血清钾离子测定试剂组成：
  R1试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH8.05(37℃)   300mmol/L
  α-ketoglutaric acid(α-酮戊二酸)   10mmol/L
  PEP(磷酸烯醇丙酮酸环己胺盐)   3mmol/L
  ADP(5‘-腺苷二磷酸二钠盐)   3mmol/L
  GLDH(谷氨酸脱氢酶)   20KU/L
  15-冠-5醚   70mmol/L
  还原辅酶I二钠盐   0.6mmol/L
  Licl   50mmol/L
  R2试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH7.8(37℃)   50mmol/L
  Pyruvate kinase   3000U/L
  Mncl2   8.5mmol/L
  LDH   50KU/L
测试程序：
仪器：全自动或半自动生化分析仪；
温度：37℃；比色杯：1ml；
主波长：主340nm；副波长：405nm；
方法：两点速率法；
操作：
  空白   标准   样品
  双蒸水标准样品R1   70μL1000μL 70μL1000μL 70μL1000μL
  混匀，于37℃孵育5min，然后加
  R2   400μL   400μL   400μL
充分混合，于37℃孵育0.5min，读A1，2min之后读A2，吸光度的变化ΔA＝A2-A1。
计算：
使用高低两个标准，以吸光度的变化值对相对应的标准品的浓度值作标准曲线，样品的浓度可以根据样品吸光度的变化值从标准曲线上查出。
标准品是用氯化钠和氯化钾配制的标准溶液，为了使标准品和临床样本相近，所以要加入氯化钠。配制方法如下：8mmol/LKCl，140mmol/LNaCl溶液(1#)和140mmol/L NaCl溶液(2#)各1000ml，然后按下表将两个溶液按一定体积混合，就可以得到钾试剂盒的高低标准品。
  KCl浓度mmol/L(理论浓度)  2   6
  1#溶液体积(ml)  250   750
  2#溶液体积(ml)  750   250
因为通过计算所得的浓度不是很准确，需要用电极法来测定准确浓度，然后再用Randox的质控品验证。
2.血清钾离子测定试剂组成：
  R1试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH8.05(37℃)   300mmol/L
  α-ketoglutaric acid(α-酮戊二酸)   10mmol/L
  PEP(磷酸烯醇丙酮酸环己胺盐)   2mmol/L
  ADP(5‘-腺苷二磷酸二钠盐)   2mmol/L
  GLDH(谷氨酸脱氢酶)   20KU/L
  15-冠-5醚   10mmol/L
  还原辅酶I二钠盐   0.4mmol/L
  Licl   50mmol/L
  R2试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH7.8(37℃)   50mmol/L
  Pyruvate kinase   5000U/L
  Mncl2   8.5mmol/L
  LDH   100KU/L
3.血清钾离子测定试剂组成：
  R1试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH8.05(37℃)   300mmol/L
  α-ketoglutaric acid(α-酮戊二酸)   10mmol/L
  PEP(磷酸烯醇丙酮酸环己胺盐)   6mmol/L
  ADP(5‘-腺苷二磷酸二钠盐)   6mmol/L
  GLDH(谷氨酸脱氢酶)   30KU/L
  15-冠-5醚   30mmol/L
  还原辅酶I二钠盐   0.5mmol/L
  Licl   50mmol/L
  R2试剂   浓度(MMOL/L)
  三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH7.8(37℃)   50mmol/L
  Pyruvate kinase   1000U/L
  Mncl2   8.5mmol/L
  LDH   100KU/L
其测定方法同实施例1。
本发明所用试剂均能在市场上买到。

Claims (4)

1.一种血清钾离子酶法测定试剂的组成如下： R1试剂 浓度(MMOL/L) 三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH 8.05(37℃) 300mmol/L α-ketoglutaric acid (α-酮戊二酸) 10mmol/L PEP(磷酸烯醇丙酮酸环己胺盐) 2-6mmol/L ADP(5‘-腺苷二磷酸二钠盐) 1-10mmol/L GLDH(谷氨酸脱氢酶) 5-30KU/L 15-冠-5醚 10-70mmol/L 还原辅酶I二钠盐 0.4-0.6mmol/L Licl 50mmol/L
R2试剂  浓度(MMOL/L) 三羟甲基氨基甲烷缓冲液 pH 7.8(37℃)  50mmol/L Pyruvate kinase  1000-5000U/L Mncl2  8.5mmol/L LDH  50-100KU/L
。
2.根据权利要求1所述的血清钾离子酶法测定试剂，其特征在于冠醚为15-冠-5醚。
3.根据权利要求1所述的血清钾离子酶法测定试剂，其特征在于采用两点速率法，操作程序如下：     空白     标准     样品 双蒸水     70μL 标准     70μL 样品     70μL R1     1000μL     1000μL     1000μL 混匀，于37℃孵育5min，然后加 R2     400μL     400μL     400μL 充分混合，于37℃孵育0.5min，读A1，2min之后读A2，吸光度的变化ΔA＝A2-A1。
计算：
使用高低两个标准，以吸光度的变化值对相对应的标准品的浓度值作标准曲线，样品的浓度可以根据样品吸光度的变化值从标准曲线上查出。
4.根据权利要求1所述的血清钾离子酶法测定试剂的用途用于测定血清中的钾离子。
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