CN1815199A - 液滴流动注射装置及其定量分析方法 - Google Patents

Abstract

一种液滴流动注射装置及其定量分析方法，它包括：恒流泵、注射泵、蠕动泵、负高压控制器、化学发光仪、计算机、恒电位仪，恒流泵通过样品管和样品进管与化学发光仪相联通、通过试剂管和试剂进管与化学发光仪相联通，注射泵通过试剂管和试剂进管与化学发光仪相联通，经蠕动泵的废液管与化学发光仪相联通，负高压控制器和电位控制器通过导线与化学发光仪相连接，负高压控制器通过电缆与计算机相连接。定量分析方法包括配制试剂、制备待测样品溶液、制作标准曲线、检测样品。本发明液滴流动注射装置及其定量分析方法可用于对无机离子、有机分子、药物等的流动注射分析。

Description

液滴流动注射装置及其定量分析方法

技术领域

本发明属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域，具体涉及到材料在其中经受化学反应的装置，测试反应的进行或结果的化学发光。

背景技术

自1975年Ruzicka与Hansen首次提出了流动注射分析(Flow Injection Analysis，FIA)技术后，流动注射技术与紫外、荧光、色谱、原子光谱、质谱等检测手段联用，在分析化学领域得到了广泛的应用。流动注射技术所具有的快速、简便、低耗等特点，也正是所有分析方法所追求的目标。在结合流动注射技术的分析方法中，发光分析法显示出了分析速度快、仪器设备简单、样品消耗量少、易于实现自动化等优点，为无机物和有机物的微量和超微量分析提供了一个高灵敏度的检测手段，已被广泛地应用于化学分析、免疫分析、岩矿分析、食品检验、环境监测等领域。

在传统的流动注射分析方法中，由于通常使用载流携带样品区带并与反应试剂混合，在样品区带载运过程和与反应试剂的混合过程中，由于扩散会导致样品的稀释，使分析方法的灵敏度受到影响。当使用采样环控制进样体积时，每次进样前都需要大量的样品溶液洗涤采样环管道，增大了试剂或样品的消耗量。在传统的流动注射分析过程中，试剂通常处于连续流动的状态下，在两次进样间隙里的试剂消耗也是非常大的。当流动注射分析的检测对象是样品与试剂的反应产物时，既要求样品与试剂溶液有充分的混合，同时也要求样品与试剂的混合达到最佳混合比；在传统的流动注射中，由于流体的层流状态在管道中处于主导地位，为实现样品与试剂溶液的充分混合，需要通过编织反应器等手段来获得湍流；在顺序注射分析中则是通过溶液的往复运动来实现样品和试剂溶液的充分混合；但这些手段会带来反应产物的过度稀释，使样品-试剂的最佳混合比难以得到保证。同样，实现以上样品和试剂的充分混合过程需要一定的时间，分析方法的分析频率也受到了很大的影响。

在已公开的有关液滴分析仪器，只介绍了单个液滴的体积测量和单个液滴中荧光组分的分析，并未涉及到两个或两个以上的液滴聚并和液滴聚并反应过程。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述流动注射装置的缺点，提供一种设计合理、流路简单、操作方便、自动进样的液滴流动注射装置。

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种分析频率高、分析速度快、试样消耗少、重现性好的液滴流动注射定量分析方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括：恒流泵、注射泵、蠕动泵、负高压控制器、化学发光仪、计算机、恒电位仪，恒流泵通过样品管和样品进管与化学发光仪相联通、通过试剂管和试剂进管与化学发光仪相联通，注射泵通过试剂管和试剂进管与化学发光仪相联通，经蠕动泵的废液管与化学发光仪相联通，负高压控制器和电位控制器通过导线与化学发光仪相连接，负高压控制器通过电缆与计算机相连接。

本发明的化学发光仪为：化学发光仪壳体与暗盒上加工有相互联通的光窗，在化学发光仪壳体内设置有发光反应池，样品进管和试剂进管设置在发光反应池的上表面，在发光反应池内样品进管和试剂进管的正下方设置有电极，穿出化学发光仪壳体外的废液管与发光反应池内相联通，在暗盒内设置有通过导线与负高压控制器相连接的光电传感器。

本发明的光电传感器为光电倍增管。本发明的样品进管和试剂进管是内径为325～500μm的石英毛细管。本发明的电极为铂丝电极或铂片电极。

本发明的样品进管的管口与试剂进管的管口之间的距离为0.5～3.0mm，电极与样品进管的管口和试剂进管的管口之间的距离为0.2～2mm。

本发明的样品进管与试剂进管的夹角为30°～60°，样品进管和试剂进管与发光反应池上表面的夹角为10°～30°。

本发明的发光反应池为透明的有机或无机材料发光反应池。

采用液滴流动注射装置的定量分析方法包括下述步骤：

1、配制试剂

(1)按常规方法配制0.1mol/L氢氧化钠溶液、1.0mol/L的盐酸溶液、0.05mol/L含0.9％NaCl的Na₂CO₃-HCl缓冲溶液、0.05mol/L的硫酸溶液作为pH值控制试剂。

(2)按常规方法配制1.0×10^-2mol/L鲁米诺贮备液作为发光试剂。

(3)按常规方法配制1.0×10^-2mol/L铁氰化钾溶液、1.0mol/L过氧化氢溶液、25g/L过硫酸钾溶液、0.28mol/L钼酸铵溶液、1.2×10^-2mol/L偏钒酸铵溶液作为氧化剂。

(4)按常规方法配制1.0×10^-2mol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液。

(5)按常规方法配制待测的5.0×10^-3mol/L双嘧达莫标准溶液、1.0×10^-4mol/L的牛血清白蛋白标准溶液、1.0×10^-2mol/L的Cr³⁺标准溶液、1.0×10^-2mol/L的三硝基甲苯标准溶液、5.0×10^-3mol/L的敌敌畏标准溶液、5.0×10^-3mol/L的敌百虫标准溶液和5.0×10^-3mol/L的氧化乐果标准溶液。

2、制备待测样品溶液

每种待测样品配制前，应先使用标准溶液进行检测条件优选实验，确定以下实验参数如氢氧化钠浓度、或盐酸浓度、或含NaCl的Na₂CO₃-HCl缓冲浓度、或硫酸浓度，发光试剂浓度，根据上述优选参数配制样品溶液。

3、制作标准曲线

打开化学发光仪电源开关，调节光电倍增管的负高压为500～900v，增益为1～16，打开恒流泵电源开关，调节样品标准溶液与试剂溶液的流速比为0.2～1.0，样品标准溶液由恒流泵经样品管输送到样品进管口形成液滴，氧化剂溶液由恒流泵经试剂管输送到试剂进管口形成液滴，两个液滴逐渐增大，聚并成一个液滴，发生化学发光反应或由恒电位仪提供电压在电极表面发生电化学发光反应，聚并的液滴在重力作用下滴落到发光池的底部经废液管由蠕动泵泵出，光电倍增管将接收到的光信号转换成电信号进行放大输出到负高压控制器的A/D转换器，A/D转换器键输入的电信号转换成数字信号输出到计算机，以样品标准溶液的浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，用计算机绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

ΔI_CL＝kC(mol/L)+b

式中ΔI_CL为化学发光强度，C为被检测物质的浓度，k、b为常数由实验确定，计算线性相关系数和方法的检出限；

以标准溶液的浓度为横坐标，电化学发光强度为纵坐标，用计算机6绘制标准曲线，并按以下方程进行线性回归：

ΔI_ECL＝kC(mol/L)+b

式中ΔI_ECL为电化学发光强度，C为被检测物质的浓度，k、b为常数由实验确定，计算线性相关系数和方法的检出限。

4、检测样品

将标准溶液替换为样品溶液，按照标准溶液的测定步骤检测样品溶液的化学发光或电化学发光强度，光电倍增管将接收到的光信号进行放大转换成电信号输出到负高压控制器的A/D转换器，A/D转换器键输入的电信号转换成数字信号输出到计算机，计算机将输入的信号进行数据处理按照线性回归方程：

ΔI_CL＝kC(mol/L)+b

式中ΔI_CL为电化学发光强度，k、b为常数由实验确定，计算出样品中被测物质的含量；

将测得的电化学发光强度带入线性回归方程：

ΔI_ECL＝kC(mol/L)+b，

式中ΔI_ECL为电化学发光强度，k、b为常数由实验确定，计算出样品中被测物质的含量。

本发明液滴流动注射装置采用液滴聚并的表面张力，实现样品液滴与试剂液滴混合，通过调节样品溶液与试剂溶液的流速，实现了样品溶液与试剂溶液不同比例的混合进行化学发光反应或电化学发光反应，采用无载流注射样品和试剂，使所有样品和试剂都被用于分析，节约了样品和试剂消耗量，减少了废液的生成量，提高了分析频率，简化了仪器的结构，无需使用进样阀可实现定量进样、自动进样，降低了仪器成本。本发明液滴流动注射装置与现有的流动注射装置相比，具有流路简单、操作方便、自动进样、生产成本低等优点。本发明定量分析方法与现有的流动注射分析方法比较，无需液体载流，采用液滴聚并实现样品溶液与试剂溶液混合进行化学发光反应或电化学发光反应。本发明定量分析方法具有分析频率高、分析速度快、试样消耗少、重现性好、灵敏度高等优点。本发明液滴流动注射装置及其定量分析方法可用于对无机离子、有机分子、药物等的流动注射分析。

附图说明

图1是本发明液滴流动注射装置一个实施例的结构示意图。

图2是图1中化学发光仪5的结构示意图。

图3是图2中样品进管5-6和试剂进管5-7在发光反应池5-8上的联接示意图。

图4是实施例6的化学试剂流路图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

在图1中，本实施例的液滴流动注射装置由负高压控制器1、恒流泵2、注射泵4、蠕动泵3、化学发光仪5、计算机6、恒电位仪7、废液管5-10联接构成。

负高压控制器1和恒电位仪7通过导线与化学发光仪5相连接，经过恒流泵2导管与化学发光仪5相联通，经过注射泵4的导管与化学发光仪5相联通，化学发光仪5通过导线与负高压控制器1相连接，负高压控制器1内装有A/D转换器，A/D转换器通过电缆与计算机6相连接。恒流泵2、注射泵4、蠕动泵3、负高压控制器1、恒电位仪7、计算机6为市场上销售的商品。

在图2、3中，本实施例的化学发光仪5由暗盒5-1、光电倍增管5-2、化学发光仪壳体5-3、样品管5-4、试剂管5-5、样品进管5-6、试剂进管5-7、发光反应池5-8、铂丝电极5-9、废液管5-10联接构成。化学发光仪壳体5-3与暗盒5-1用螺纹紧固联接件固定联接，化学发光仪壳体5-3的右侧和暗盒5-1的左侧加工有光窗，化学发光仪壳体5-3内的光经光窗可进入到暗盒5-1内。在化学发光仪壳体5-3内安装有发光反应池5-8。本实施例的发光反应池5-8是由聚甲基丙烯酸甲酯材料制成，侧面开有反应池光窗，反应所产生的光经过反应池光窗、光窗可进入到暗盒5-1内，发光反应池5-8的中心位置加工有直径为8mm的中心孔为反应池，在发光反应池5-8的上表面用环氧树脂固定粘接有样品进管5-6和试剂进管5-7，样品进管5-6和试剂进管5-7也可采用丙烯酸树脂或甲基丙烯酸甲酯粘接固定，样品进管5-6与样品管5-4相联通并经恒流泵2，试剂进管5-7与试剂管5-5相联通并经恒流泵2，样品进管5-6和试剂进管5-7是内径为400μm的石英毛细管，试剂进管5-7的夹角为30°，样品进管5-6与试剂进管5-7的管口距离为1.5mm，样品进管5-6与发光反应池5-8上表面的夹角为20°。在反应池的侧壁上样品进管5-6与试剂进管5-7的管口正下方1mm处固定安装有电极，本实施例的电极为铂丝电极5-9，铂丝电极5-9通过导线与恒电位仪7相连接，铂丝电极5-9用于进行电化学发光反应。在反应池底部安装有与反应池相联通的废液管5-10，废液管5-10穿出化学发光仪壳体5-3外，经蠕动泵3将发光反应池5-8内化学反应后的废液排出到化学发光仪壳体5-3外。在暗盒5-1内安装有光电倍增管5-2，光电倍增管5-2为光电传感器的一个实施例。光电倍增管5-2通过导线与负高压控制器1相连接，由负高压控制器1控制光电倍增管5-2的工作电压。样品溶液由恒流泵2加压经样品管5-4、样品进管5-6，从样品进管5-6的管口流出形成液滴，氧化剂溶液由恒流泵2加压经试剂管5-5、试剂进管5-7，从试剂进管5-7的管口流出形成液滴，样品溶液液滴和氧化剂溶液液滴增大到一定尺寸时，样品溶液液滴与氧化剂溶液液滴聚并形成一个液滴，在液滴内发生化学发光反应，光电倍增管5-2将接收到的光信号转换成电信号进行放大输出到A/D转换器，A/D将输入的电信号转换成数字信号输出到计算机6，计算机6对输入的电信号进行数据处理计算出所测物质的含量。聚并的液滴大到一定程度后掉落，由蠕动泵3加压经过废液管5-10排出到废液瓶中，在样品进管5-6的管口重新形成新的样品溶液液滴，试剂进管5-7的管口重新形成新的氧化剂溶液液滴，重复以上的过程，得到重现的发光信号。这种液滴流动注射装置，实现了样品溶液与试剂溶液不同比例的混合进行化学发光反应或电化学发光反应，采用无载流注射样品和试剂，使所有样品和试剂都被用于分析，节约了样品和试剂消耗量，减少了废液的生成量，提高了分析频率，简化了仪器的结构，无需使用进样阀可实现定量进样、自动进样，降低了仪器成本。本发明液滴流动注射装置与现有的流动注射装置相比，具有流路简单、操作方便、自动进样、生产成本低等优点。

采用本实施例的液滴流动注射装置及其定量分析方法对鲁米诺的检测步骤如下：

1、配制试剂

(1)配制氢氧化钠pH值控制试剂

按常规配制方法配制0.1mol/L的氢氧化钠溶液和0.05mol/L硫酸溶液作为pH值控制试剂。

(2)配制鲁米诺发光试剂

准确称取1.7716g鲁米诺，用0.1mol/L氢氧化钠溶液配制成1升浓度为1.0×10^-2mol/L鲁米诺发光试剂，贮于棕色瓶中，置于避光处，两周后使用。

(3)配制铁氰化钾氧化剂

准确称取3.2900g铁氰化钾，按常规配制方法配制1.0×10^-2mol/L的铁氰化钾贮备液，避光保存，使用时配制成5.0×10^-4mol/L铁氰化钾溶液。

(4)配制鲁米诺标准溶液

将(2)配制的鲁米诺溶液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液配制1.0×10^-7mol/L、3.0×10^-7mol/L、5.0×10^-7mol/L、8.0×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、2.0×10^-6mol/L、4.0×10^-6mol/L鲁米诺标准溶液。

2、制备待测的鲁米诺样品溶液

用0.1mol/L的氢氧化钠溶液和0.200克待测鲁米诺样品配制成鲁米诺样品溶液100ml，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液将所配制的样品溶液稀释到1.0×10^-7mol/L～4.0×10^-6mol/L范围内。

3、制作标准曲线

打开化学发光仪5电源开关，调节光电倍增管5-2的负高压为500v，增益为4，打开恒流泵2电源开关，调节鲁米诺标准溶液与铁氰化钾溶液的流速比为0.6，鲁米诺标准溶液由恒流泵2经样品管5-4输送到样品进管5-6口形成液滴，铁氰化钾溶液由恒流泵2经试剂管5-5输送到试剂进管5-7口形成液滴，两个液滴逐渐增大，聚并成一个液滴，鲁米诺标准溶液与铁氰化钾溶液发生化学发光反应，聚并的液滴在重力作用下滴落到发光池的底部经废液管5-10由蠕动泵3泵出，光电倍增管5-2将接收到的光信号转换成电信号进行放大输出到负高压控制器1的A/D转换器，A/D转换器键输入的电信号转换成数字信号输出到计算机6，以鲁米诺标准溶液的浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，用计算机6绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

    ΔI_CL＝140.19C_luminol(10^-6moll^-1)-134.07

线性相关系数r＝0.9994

式中ΔI_CL为相对化学发光强度，C_luminol为鲁米诺的浓度。对3.0×10^-7mol/L的鲁米诺标准溶液进行11次测定，相对标准偏差(RSD)为1.7％。方法的检出限(3σ)为3.2×10^-8mol/L。

4、检测鲁米诺样品

将鲁米诺标准溶液替换成鲁米诺样品溶液，按照鲁米诺标准溶液的测定方法检测鲁米诺样品溶液的发光强度，化学发光仪5将接收到的光信号进行放大转换成电信号输出到计算机6，计算机6将输入的电信号进行数据处理按照线性回归方程：

     ΔI_CL＝140.19C_luminol(10^-6moll^-1)-134.07

式中ΔI_CL为化学发光强度，C_luminol为鲁米诺的浓度，计算出鲁米诺样品中鲁米诺的含量为98％。

实施例2

在本实施例中，样品进管5-6和试剂进管5-7是内径为325μm的石英毛细管，电极为铂片电极，样品进管5-6的管口与试剂进管5-7的管口之间的距离为0.5mm，样品进管5-6与试剂进管5-7的夹角为60°，样品进管5-6和试剂进管5-7与发光反应池5-8上表面的夹角为10°，发光反应池5-8为透明的硅玻璃材料发光反应池5-8。其它零部件以及零部件的联接关系与实施例1相同。

实施例3

在本实施例中，样品进管5-6和试剂进管5-7是内径为500μm的石英毛细管，电极为铂片电极，样品进管5-6的管口与试剂进管5-7的管口之间的距离为2.0mm，样品进管5-6与试剂进管5-7的夹角为45°，样品进管5-6和试剂进管5-7与发光反应池5-8上表面的夹角为30°，发光反应池5-8为透明的硅玻璃材料发光反应池5-8。其它零部件以及零部件的联接关系与实施例1相同。

实施例4

采用本发明实施例1液滴流动注射装置及其定量分析方法对药物双嘧达莫的检测步骤如下：

1、配制试剂

(1)配制氢氧化钠pH值控制试剂

与实施例1相同。

(2)配制鲁米诺发光试剂

与实施例1相同。

(3)配制铁氰化钾氧化剂

与实施例1相同。

(4)配制双嘧达莫标准溶液

用0.025mol/L的盐酸溶液配制5.0×10^-3mol/L双嘧达莫储备溶液。用该储备溶液配制鲁米诺浓度均为1.0×10^-4mol/L、NaOH浓度均为0.1mol/L，双嘧达莫浓度分别为1.0×10^-9mol/L、5.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、3.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、7.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L的双嘧达莫标准溶液。

2、制备双嘧达莫样品溶液

取市售双嘧达莫片剂20片(标示量为25.0mg/片)，准确称量后研细混匀，求得每片平均质量。称取相当于一片的量，用0.025mol/L的盐酸溶液配制成双嘧达莫样品溶液，配制方法与双嘧达莫标准溶液的配制方法相同，配制成浓度为1.0×10^-9mol/L～1.0×10^-7mol/L的双嘧达莫样品溶液。

3、制作标准曲线

打开化学发光仪5电源开关，调节光电倍增管5-2的负高压为500v，增益为8，打开恒流泵2电源开关，调节双嘧达莫标准溶液与铁氰化钾溶液的流速比为0.2，双嘧达莫标准溶液由恒流泵2经样品管5-4输送到样品进管5-6口形成液滴，铁氰化钾溶液由恒流泵2经试剂管5-5输送到试剂进管5-7口形成液滴，两个液滴逐渐增大，聚并成一个液滴，鲁米诺标准溶液与铁氰化钾溶液发生化学发光反应，以双嘧达莫标准溶液的浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，用计算机6绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

ΔI_CL＝3548.3C(10^-8mol/L)-276.4

其线性相关系数r＝0.9991

式中ΔI_CL为化学发光强度，C为双嘧达莫的浓度。对5.0×10^-9mol/L的双嘧达莫标准溶液进行11次测定，相对标准偏差(RSD)为1.3％。方法的检出限(3σ)为3.2×10^-10mol/L。

4、检测双嘧达莫样品

在步骤3中，将双嘧达莫标准溶液替换成双嘧达莫样品溶液，按照双嘧达莫标准溶液的测定方法检测双嘧达莫样品溶液的发光强度，计算机6按照线性回归方程：

ΔI_CL＝3548.3C(10^-8mol/L)-276.4

式中ΔI_CL为化学发光强度，计算出样品中双嘧达莫的含量，并做回收实验，检测结果见下表1。

                                表1双嘧达莫检测结果

样品编号	测定量(m/mg)	加入量(m/mg)	测定总量(m/mg)	回收率(％)
					123	26.225.925.7	10.010.010.0	35.836.335.9	96104102

通过本实施例实验结果说明，采用本发明液滴流动注射装置及其定量分析方法可用于微量药物双嘧达莫的定量分析。

实施例5

采用本发明实施例1液滴流动注射装置及其定量分析方法测定药物双嘧达莫与牛血清白蛋白的交互作用的步骤如下：

1、配制试剂

(1)配制pH值控制试剂

按常规配制方法分别配制0.1mol/L的氢氧化钠溶液和0.05mol/L含0.9％NaCl的Na₂CO₃-HCl缓冲溶液。

(2)配制鲁米诺发光试剂

与实施例1相同。

(3)配制铁氰化钾氧化剂

与实施例1相同。

(4)配制双嘧达莫标准溶液和牛血清白蛋白标准溶液

用0.025mol/L的盐酸溶液配制5.0×10^-3mol/L双嘧达莫储备溶液。用该储备溶液配制鲁米诺浓度均为1.0×10^-4mol/L、NaOH浓度均为0.1mol/L，双嘧达莫浓度分别为1.0×10^-9mol/L、5.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、3.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、7.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L双嘧达莫标准溶液。

准确称取0.1650g牛血清白蛋白，用含0.9％NaCl和0.05mol/L Na₂CO₃-HCl缓冲溶液配制成100mL牛血清白蛋白标准溶液。使用时用0.05mol/L含0.9％NaCl的Na₂CO₃-HCl缓冲溶液配制成1.0×10^-6mol/L牛血清白蛋白标准溶液。

2、制备待测的双嘧达莫和牛血清白蛋白样品溶液

分别取5mL浓度为1.0×10^-9mol/L、5.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、3.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、7.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L的双嘧达莫标准溶液与5mL 1.0×10^-6mol/L的牛血清白蛋白溶液在37C结合1小时，用离心机14000转/分钟离心20分钟，取上清液配成鲁米诺浓度为1.0×10^-4mol/L、NaOH浓度为0.1mol/L的游离双嘧达莫样品溶液。

3、制作标准曲线

与实施例4相同。

4、检测样品

将步骤3中的双嘧达莫标准溶液替换为步骤2中的游离双嘧达莫样品溶液，双嘧达莫含量的检测与实施例4的步骤4完全相同。由Scatchard方程

r/[A]＝nK-rK

计算结合位点数和结合常数。式中[A]为未结合(游离)药物的浓度，n为结合比，r为一个蛋白质分子上的结合位点数，K为结合常数。

由Scatchard方程计算得到，双嘧达莫与牛血清白蛋白结合位点数为6.04，结合常数为2.20×10⁵(mol/L)^-1。

实施例6

采用本发明实施例1液滴流动注射装置及其定量分析方法对测定指甲中Cr³⁺含量检测步骤如下：

1、配制试剂

(1)配制氢氧化钠pH值控制试剂

与实施例1相同。

(2)按常规方法配制1.0×10^-2mol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液。，使用时用二次水稀释成1.0×10^-4mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液

(3)配制过氧化氢氧化剂

按常规方法配制0.1mol/L过氧化氢溶液，使用时用二次水稀释成浓度为6.0×10^-3mol/L的过氧化氢溶液。

(4)配制鲁米诺发光试剂

准确称取1.7716g鲁米诺，用0.1mol/L氢氧化钠溶液配制成1升浓度为1.0×10^-2mol/L鲁米诺发光试剂储备液，贮于棕色瓶中，置于避光处，两周后使用。

使用时配制成氢氧化钠浓度为0.01mol/L，乙二胺四乙酸二钠浓度为1.0×10^-4mol/L，鲁米诺浓度为5.0×10^-5mol/L的发光试剂。

(5)配制Cr³⁺标准溶液

准确称取0.2665g经105℃干燥的CrCl₃·6H₂O，于100mL烧杯中，加入0.1mL浓度为1mol/L H₂SO₄溶液，加水溶解，定容至100mL容量瓶中，此溶液浓度为1×10^-2mol/L，作为贮备液，冰箱保存，使用时用二次蒸馏水逐级稀释，并加入2.0mol/L的溴化钾溶液，使溴化钾最终浓度为0.5mol/L，配置成1.0×10^-7mol/L、3.0×10^-7mol/L、5.0×10^-7mol/L、8.0×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、2.0×10^-6mol/L、4.0×10^-6mol/L的Cr³⁺标准溶液。

2、制备待测的Cr³⁺样品溶液

洗净的指甲干燥后称重，置于坩埚中在电炉上碳化至无烟，转至马弗炉中800℃灼烧12小时，取出，冷却后加水润湿灰分，在电炉上蒸干，再转入800℃马弗炉中灰化12～24小时直至灰分呈白色，取出冷却，用盐酸分5次将灰分洗入烧杯中，最后一次在60℃洗涤，合并洗涤液，过滤，加入1mL 30％的H₂O₂，蒸干，用pH值为3.0的稀盐酸稀释成5ml，制成Cr³⁺样品溶液。

3、制作标准曲线

打开化学发光仪5电源开关，调节光电倍增管5-2的负高压为500v，增益为4，打开恒流泵2、注射泵4电源开关。鲁米诺发光试剂和Cr³⁺标准溶液由恒流泵2经三通T混合后再经样品管5-4输送到样品进管5-6口形成液滴，过氧化氢由注射泵4经试剂管5-5输送到试剂进管5-7口形成液滴，调节鲁米诺发光试剂-Cr³⁺标准溶液的混合溶液与过氧化氢氧化剂的流速比为1.0；两个液滴逐渐增大，聚并成一个液滴，发生化学发光反应。以Cr³⁺标准溶液的浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，用计算机6绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

$\mathrm{\Δ}{I}_{\mathrm{CL}}=5245.8C_{{\mathrm{Cr}}^{3+}}(10^{-6}\mathrm{mol}/L)-1603.1,$

标准曲线的线性相关系数r＝0.9990

式中ΔI_CL为相对化学发光强度，C_Cr3+为Cr³⁺的浓度，对5.0×10^-7mol/L的Cr³⁺标准溶液进行11次测定，相对标准偏差(RSD)为1.5％，方法的检出限(3σ)为1.1×10^-8mol/L。

4、样品的检测

在步骤3中，将Cr³⁺标准溶液换成Cr³⁺样品溶液，按照Cr³⁺标准溶液的测定方法检测Cr³⁺样品溶液的发光强度，计算机6按照线性回归方程：

$\mathrm{\Δ}{I}_{\mathrm{CL}}=5245.8C_{{\mathrm{Cr}}^{3+}}(10^{-6}\mathrm{mol}/L)-1603.1$

计算出Cr³⁺样品中Cr³⁺的含量。检测结果见下表2。

                         表2Cr³⁺样品测定结果

Cr3+样品编号	Cr3+含量(μg/g)	Cr3+样品编号	Cr3+含量(μg/g)
				1234	1.551.160.42.07	5678	1.931.632.651.41

实施例7

采用本发明实施例1液滴流动注射装置及其定量分析方法对水果和蔬菜上氧化乐果农药残留量的检测步骤如下：

1、配制试剂

(1)配制氢氧化钠和硫酸溶液pH值控制试剂

按常规配制方法分别配制0.1mol/L的氢氧化钠溶液和0.05mol/L硫酸溶液。

(2)配制鲁米诺发光试剂

准确称取1.7716g鲁米诺，用0.1mol/L氢氧化钠溶液配制成1升浓度为1.0×10^-2mol/L鲁米诺发光发光试剂，贮于棕色瓶中，置于避光处，两周后使用。

使用时用配制成氢氧化钠0.05mol/L的5.0×10^-4mol/L的鲁米诺溶液。

(3)配制氧化剂

按常规配制方法分别配制25g/L的过硫酸钾溶液、0.28mol/L的钼酸铵溶液和1.2×10^-2mol/L偏钒酸铵溶液作为氧化剂。

(4)配制氧化乐果标准溶液

按常规配制方法配制5.0×10^-3mol/L的氧化乐果溶液。取5ml该氧化乐果溶液、5ml的0.05mol/L硫酸溶液、5ml的25g/L过硫酸钾溶液混合反应25分钟，用水稀释成25ml作为经过处理的氧化乐果溶液。

使用时分别取0.28mol/L钼酸铵0.2mL、1.2×10^-2mol/L偏钒酸铵0.42mL、0.05mol/L硫酸1.0mL，将钼酸铵溶液、偏钒酸铵溶液、硫酸溶液和2ml经过处理的氧化乐果溶液分别配制成含氧化乐果1.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L、5.0×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、2.5×10^-6mol/L的氧化乐果标准溶液。

2、制备氧化乐果样品溶液

取20克水果或蔬菜，用100mL二次水浸泡20分钟后，按照标准溶液配制方法配制成氧化乐果样品溶液。

3、制作标准曲线

在实施例4的制作标准曲线步骤中，用氧化乐果标准溶液替换双嘧达莫标准溶液，鲁米诺发光试剂替换铁氰化钾，调氧化乐果标准溶液与鲁米诺发光试剂的流速比为0.8，以氧化乐果标准溶液的浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，用计算机6绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

ΔI_CL＝123.22C(10^-8mol/L)+1554.8

线性相关系数r＝0.9994

式中ΔI_CL为化学发光强度，C为氧化乐果标准溶液的浓度。对5.0×10^-8mol/L的氧化乐果标准溶液进行11次测定，相对标准偏差(RSD)为1.7％。方法的检出限(3σ)为2.5×10^-9mol/L。

4、检测氧化乐果样品

在步骤3中，将氧化乐果标准溶液替换成氧化乐果样品溶液，按照氧化乐果标准溶液的测量方法检测氧化乐果样品溶液的发光强度，计算机6按照线性回归方程：

ΔI_CL＝123.22C(10^-8mol/L)+1554.8

式中ΔI_CL为化学发光强度，计算出样品中氧化乐果的含量，与GB5537-85方法的测定结果相比，检测结果基本一致。检测结果见下表3。

                     表3水果或蔬菜上氧化乐果的含量测定结果

氧化乐果样品编号	化学发光法测定结果(10-8mol/L)	GB5537-85测定结果(10-8mol/L)
			12345	10.5075.363.533.13105.45	10.6875.25GB5537-85法无法检出GB5537-85法无法检出106.82

实施例8

采用本发明实施例1液滴流动注射装置及其定量分析方法对水果和蔬菜上敌百虫农药残留量的检测步骤如下：

1、配制试剂

(1)配制氢氧化钠和硫酸溶液pH值控制试剂

与实施例7相同。

(2)配制鲁米诺发光试剂

与实施例7相同。

(3)配制氧化剂

与实施例7相同。

(4)配制敌百虫标准溶液

配制方法与实施例7相同。将氧化乐果替换成敌百虫，配制成含敌百虫2.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L、5.0×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、3.0×10^-6mol/L的敌百虫标准溶液。

2、制备敌百虫样品溶液

与实施例7制备氧化乐果样品溶液的步骤完全相同。

3、制作标准曲线

与实施例7制作标准曲线相同，用计算机6绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

ΔI_CL＝196.76C(10^-8mol/L)+1824.8

线性相关系数r＝0.9997

式中ΔI_CL为化学发光强度，C为敌百虫标准溶液的浓度。对5.0×10^-8mol/L的敌百虫标准溶液进行11次测定，相对标准偏差(RSD)为2.7％。方法的检出限(3σ)为6.7×10^-9mol/L。

4、检测敌百虫样品

检测方法与实施例5检测氧化乐果样品完全相同，计算出样品中敌百虫的含量，与GB5537-85方法的测定结果相比，检测结果基本一致。检测结果见下表4。

                   表4水果或蔬菜上敌百虫的含量测定结果

样品编号	化学发光法测定结果(10-8mol/L)	GB5537-85法测量结果(10-8mol/L)
			12345	40.7095.363.5336.139.62	40.8995.25GB5537-85法无法检出3645GB5537-85法无法检出

实施例9

采用本发明实施例1液滴流动注射装置及其定量分析方法对人体皮肤上和土壤中的三硝基甲苯含量的检测步骤如下：

1、配制试剂

(1)配制氢氧化钠和硫酸溶液pH值控制试剂

与实施例7相同。

(2)配制鲁米诺发光试剂

与实施例7相同。

(3)按常规方法配制1.0×10^-2mol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液。使用时用二次水稀释成1.0×10^-4mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液。

(4)配制三硝基甲苯标准溶液

称取经无水乙醇重结晶的三硝基甲苯0.1000g于100mL烧杯中，用10ml无水乙醇全部溶解后，加水稀释，定容至100mL棕色容量瓶中，配制成三硝基甲苯贮备液，冰箱保存。在乙二胺四乙酸二钠浓度均为1.0×10^-4mol/L时，配制成三硝基甲苯浓度分别为5.0×10^-9mol/L、8.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、3.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、7.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L的三硝基甲苯标准溶液。

2、制备待测的皮肤上和土壤中的三硝基甲苯样品溶液

对人接触三硝基甲苯(TNT)两天后的手指，用蘸有丙酮的脱脂棉反复擦洗手指，用丙酮分五次浸泡，合并浸泡液，用离心机3500转/分钟离心15分钟，取上清液，蒸干后用无水乙醇稀释至5毫升。按照步骤1配制三硝基甲苯标准溶液的方法制备成皮肤上三硝基甲苯样品溶液

称取爆炸现场的土样1～3克，用20毫升苯分三次浸取，合并浸泡液，用分液漏斗分液，蒸干后用无水乙醇稀释至5毫升。按照步骤1配制三硝基甲苯标准溶液的方法制备成土壤中三硝基甲苯样品溶液。

3、制作标准曲线

打开化学发光仪5电源开关，调节光电倍增管5-2的负高压为600v，增益为4，打开恒流泵2和恒电位仪7的电源开关，调节恒电位仪7的电位为-0.650v，调节恒流泵2使鲁米诺溶液和三硝基甲苯溶液的流速比1，三硝基甲苯标准溶液由恒流泵2经样品管5-4输送到样品进管5-6口形成液滴，鲁米诺由恒流泵2经试剂管5-5输送到试剂进管5-7口形成液滴，两个液滴逐渐增大，聚并成一个液滴，并浸没电极，电极为长1厘米、直径0.3毫米的铂丝，恒电位仪7为电极提供-0.650v的电压，在电极表面发生电化学发光反应，三硝基甲苯在铂丝电极5-9上发生电化学反应，反应方程式如下：

由第一步电还原反应生成的自由基产物与鲁米诺发生化学反应，产生强的电化学发光信号被化学发光仪5的管电倍增管接收。

以三硝基甲苯标准溶液的浓度为横坐标，电化学发光强度为纵坐标，用计算机6绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

ΔI_ECL＝30.594C_TNT(mol/L)+297.28

其线性相关系数r＝0.9963

式中ΔI_ECL为电化学发光强度，C_TNT为三硝基甲苯溶液的浓度。对8.0×10^-9mol/L的三硝基甲苯标准溶液进行11次测定，相对标准偏差(RSD)为3.1％。方法的检出限(3σ)为3.9×10^-11mol/L。

4、样品的检测

将标准溶液分别换成步骤2制备的皮肤上三硝基甲苯样品溶液、土壤中三硝基甲苯样品溶液，按照三硝基甲苯标准溶液的测定方法检测三硝基甲苯样品溶液的发光强度，计算机6按照线性回归方程：

ΔI_ECL＝30.594C_TNT(mol/L)+297.28

计算出样品中三硝基甲苯的含量，与GB/T 13905-92方法所测的结果对照，检测结果基本一致。检测结果见下表4、表5。

             表4接触三硝基甲苯两天后测量手指表皮三硝基甲苯残留的测量结果

样品编号	电化学发光法测定结果(μg/mL)	GB/T 13905-92测定结果(μg/mL)	相对偏差(％)
				123	5.012.212.4	4.812.812.2	+4.2-6.1+1.6

                             表5土壤中三硝基甲苯残留的测量结果

样品编号	电化学发光法测定结果(μg/mL)	GB/T 13905-92测定结果(μg/mL)	相对偏差(％)
				12	3046	2850	+7.1+8.0

Claims (8)

1、一种液滴流动注射装置，其特征在于它包括：恒流泵(2)、注射泵(4)、蠕动泵(3)、负高压控制器(1)、化学发光仪(5)、计算机(6)、恒电位仪(7)，恒流泵(2)通过样品管(5-4)和样品进管(5-6)与化学发光仪(5)相联通、通过试剂管(5-5)和试剂进管(5-7)与化学发光仪(5)相联通，注射泵(4)通过试剂管(5-5)和试剂进管(5-7)与化学发光仪(5)相联通，经蠕动泵(3)的废液管(5-10)与化学发光仪(5)相联通，负高压控制器(1)和电位控制器通过导线与化学发光仪(5)相连接，负高压控制器(1)通过电缆与计算机(6)相连接。

2、按照权利要求1所述的液滴流动注射装置，其特征在于所说的化学发光仪(5)为：化学发光仪壳体(5-3)与暗盒(5-1)上加工有相互联通的光窗，在化学发光仪壳体(5-3)内设置有发光反应池(5-8)，样品进管(5-6)和试剂进管(5-7)设置在发光反应池(5-8)的上表面，在发光反应池(5-8)内样品进管(5-6)和试剂进管(5-7)的正下方设置有电极，穿出化学发光仪壳体(5-3)外的废液管(5-10)与发光反应池(5-8)内相联通，在暗盒(5-1)内设置有通过导线与负高压控制器(1)相连接的光电传感器。

3、按照权利要求2所述的液滴流动注射装置，其特征在于：所说的光电传感器为光电倍增管(5-2)；所说的样品进管(5-6)和试剂进管(5-7)是内径为325～500μm的石英毛细管；所说的电极为铂丝电极(5-9)或铂片电极。

4、按照权利要求2或3所述的液滴流动注射装置，其特征在于：所说的样品进管(5-6)的管口与试剂进管(5-7)的管口之间的距离为0.5～3.0mm，电极与样品进管(5-6)的管口和试剂进管(5-7)的管口之间的距离为0.2～2mm。

5、按照权利要求3所述的液滴流动注射装置，其特征在于：所说的样品进管(5-6)与试剂进管(5-7)的夹角为30°～60°，样品进管(5-6)和试剂进管(5-7)与发光反应池(5-8)上表面的夹角为10°～30°。

6、按照权利要求4所述的液滴流动注射装置，其特征在于：所说的样品进管(5-6)与试剂进管(5-7)的夹角为30°～60°，样品进管(5-6)和试剂进管(5-7)与发光反应池(5-8)上表面的夹角为10°～30°。

7、按照权利要求2或5所述的液滴流动注射装置，其特征在于：所说的发光反应池(5-8)为透明的有机或无机材料发光反应池(5-8)。

8、一种使用权利要求1的定量分析方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)配制试剂

①按常规方法配制0.1mol/L氢氧化钠溶液、1.0mol/L的盐酸溶液、0.05mol/L含0.9％NaCl的Na₂CO₃-HCl缓冲溶液、0.05mol/L的硫酸溶液作为pH值控制试剂。

②按常规方法配制1.0×10^-2mol/L鲁米诺贮备液作为发光试剂。

③按常规方法配制1.0×10^-2mol/L铁氰化钾溶液、1.0mol/L过氧化氢溶液、25g/L过硫酸钾溶液、0.28mol/L钼酸铵溶液、1.2×10^-2mol/L偏钒酸铵溶液作为氧化剂。

④按常规方法配制1.0×10^-2mol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液。

⑤按常规方法配制待测的5.0×10^-3mol/L双嘧达莫标准溶液、1.0×10^-4mol/L的牛血清白蛋白标准溶液、1.0×10^-2mol/L的Cr³⁺标准溶液、1.0×10^-2mol/L的三硝基甲苯标准溶液、5.0×10^-3mol/L的敌敌畏标准溶液、5.0×10^-3mol/L的敌百虫标准溶液和5.0×10^-3mol/L的氧化乐果标准溶液。

(2)制备待测样品溶液

每种待测样品配制前，应先使用标准溶液进行检测条件优选实验，确定以下实验参数如氢氧化钠浓度、或盐酸浓度、或含NaCl的Na₂CO₃-HCl缓冲浓度、或硫酸浓度，发光试剂浓度，根据上述优选参数配制样品溶液。

(3)制作标准曲线

打开化学发光仪(5)电源开关，调节光电倍增管(5-2)的负高压为500～900v，增益为1～16，打开恒流泵(2)电源开关，调节样品标准溶液与试剂溶液的流速比为0.2～1.0，样品标准溶液由恒流泵(2)经样品管(5-4)输送到样品进管(5-6)口形成液滴，氧化剂溶液由恒流泵(2)经试剂管(5-5)输送到试剂进管(5-7)口形成液滴，两个液滴逐渐增大，聚并成一个液滴，发生化学发光反应或由恒电位仪(7)提供电压在电极上发生电化学发光反应，聚并的液滴在重力作用下滴落到发光池的底部经废液管(5-10)由蠕动泵(3)泵出，光电倍增管(5-2)将接收到的光信号进行放大转换成电信号输出到负高压控制器1的A/D转换器，A/D转换器键输入的电信号转换成数字信号输出到计算机(6)，以样品标准溶液的浓度为横坐标，化学发光强度为纵坐标，用计算机(6)绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

ΔI_CL＝kC(mol/L)+b

式中ΔI_CL为化学发光强度，C为被检测物质的浓度，k、b为常数由实验确定，计算线性相关系数和方法的检出限；

以标准溶液的浓度为横坐标，电化学发光强度为纵坐标，用计算机(6)绘制标准曲线，并得到下述的线性回归方程：

ΔI_ECL＝kC(mol/L)+b

式中ΔI_ECL为电化学发光强度，C为被检测物质的浓度，k、b为常数由实验确定，计算线性相关系数和方法的检出限。

(4)检测样品

将标准溶液替换为样品溶液，按照标准溶液的测定步骤检测样品溶液的化学发光或电化学发光强度，光电倍增管(5-2)将接收到的光信号进行放大转换成电信号输出到负高压控制器(1)的A/D转换器，A/D转换器键输入的电信号转换成数字信号输出到计算机(6)，计算机(6)将输入的信号进行数据处理按照线性回归方程：

ΔI_CL＝kC(mol/L)+b

式中ΔI_CL为电化学发光强度，k、b为常数由实验确定，计算出样品中被测物质的含量；

将测得的电化学发光强度带入线性回归方程：

ΔI_ECL＝kC(mol/L)+b，

式中ΔI_ECL为电化学发光强度，k、b为常数由实验确定，计算出样品中被测物质的含量。

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