CN1769478A - 腺苷脱氨酶活性测定方法及腺苷脱氨酶诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本发明还涉及腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷、谷氨酸、还原型辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。

Description

腺苷脱氨酶活性测定方法及腺苷脱氨酶诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本发明还涉及用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。

腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是：腺苷(白色结晶粉末)+水(H2O) 腺苷脱氨酶 肌苷(Inosine)+氨离子(NH4+)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。

检索发现，申请号为03128092.7、申请日为2003.05.29、名称为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰氨辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰氨辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰氨辅酶或其类似物，及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰氨辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰氨辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该发明的特点在于为腺苷脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的腺苷脱氨酶试剂。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰氨辅酶氧化成氧化型烟酰氨辅酶)的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种可以克服以上现有技术缺点的腺苷脱氨酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明测定腺苷脱氨酶活性的方法步骤如下：

1)、将样品与主要由腺苷、谷氨酸、还原型辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：

腺苷+水  腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子

腺苷三磷酸+谷氨酸+氨  谷氨酰胺合成酶 腺苷二磷酸+

磷酸根+谷氨酰胺

磷酸根+丙酮酸+氧+水  丙酮酸氧化酶 乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

草酰乙酸+磷酸根

草酰乙酸+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶 苹果酸+氧化型辅酶

2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。

通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，得出腺苷脱氨酶测定结果。

以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。

这种方法应用腺苷脱氨酶偶联谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶反应连续监测法。腺苷脱氨酶酶解腺苷产生氨，再通过偶联谷氨酰胺合成酶的作用，与腺苷三磷酸及谷氨酸一起生成磷酸根，然后丙酮酸氧化酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用，最后产生草酰乙酸，再通过偶联苹果酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。虽然单磷酸盐在系统中被重复使用，但是最终的反应速率还是取决于最初的腺苷脱氨酶活性的大小所产生的初始单磷酸盐浓度决定。

用以实现本发明方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液                          40--200mmol/l

腺苷                            0.5--50mmol/l

谷氨酸                          1--30mmol/l

还原型辅酶                      0.15--0.3mmo/l

腺苷三磷酸                      1--10mmol/l

丙酮酸                          1--10mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸                1--20mmol/l

谷氨酰胺合成酶                  1000--50000U/l

丙酮酸氧化酶                    2000--20000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶          2000--20000U/l

苹果酸脱氢酶                    2000--20000U/l

稳定剂                          10--80％(总体积)

也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源氨、二氧化碳污染：

试剂I

缓冲液                          40--200mmol/l

谷氨酸                          1--30mmol/l

还原型辅酶                      0.15--0.3mmo/l

腺苷三磷酸                      1--10mmol/l

丙酮酸                          1--10mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸                1--20mmol/l

谷氨酰胺合成酶                  1000--50000U/l

丙酮酸氧化酶                    2000--20000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶          2000--20000U/l

苹果酸脱氢酶                    2000--20000U/l

稳定剂                          10--80％(总体积)

试剂II

缓冲液                          40--200mmol/l

腺苷                            0.5--50mmol/l

稳定剂                          10--50mmol/l

双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，谷氨酸、还原型辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等可以放在试剂II。试剂II其中的成分，腺苷也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。

还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源氨、二氧化碳污染，还更有利于试剂的稳定：

试剂I

缓冲液                        40--200mmol/l

谷氨酸                        1--30mmol/l

还原型辅酶                    0.15--0.3mmo/l

腺苷三磷酸                    1--10mmol/l

丙酮酸                        1--10mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸              1--20mmol/l

稳定剂                        10--50mmol/l

试剂II

缓冲液                        40--200mmol/l

谷氨酰胺合成酶                1000--50000U/l

丙酮酸氧化酶                           2000--20000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶                 2000--20000U/l

苹果酸脱氢酶                           2000--20000U/l

稳定剂                                 10--80％(总体积)

试剂III

缓冲液                                 40--200mmol/l

腺苷                                   0.5--50mmol/l

稳定剂                                 10--50mmol/l

三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，谷氨酸、还原型辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中，试剂III其中的成分，腺苷也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。

缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。

以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。

此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂盒较为理想：

缓冲液                      80--120mmol/l

腺苷                        2--10mmol/l

谷氨酸                      5--10mmol/l

还原型辅酶                  0.2--0.3mmol/l

腺苷三磷酸                  2--8mmol/l

丙酮酸                      1--10mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸            1--8mmol/l

谷氨酰胺合成酶              4000--10000U/l

丙酮酸氧化酶                6000--12000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶      6000--12000U/l

苹果酸脱氢酶                6000--20000U/l

稳定剂                      20--50％(总体积)

由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。

此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源氨、二氧化碳的污染，消除内、外源氨、二氧化碳的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源氨、二氧化碳已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试腺苷脱氨酶活性所需要的氨、二氧化碳都是产生于腺苷脱氨酶的活性。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一(单剂)

本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂盒包括：

缓冲液                      80mmol/l

腺苷                        2mmol/l

谷氨酸                      5mmol/l

还原型辅酶                  0.2mmol/l

腺苷三磷酸                  2mmol/l

丙酮酸                      1mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸            1mmol/l

谷氨酰胺合成酶              4000U/l

丙酮酸氧化酶                6000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶      6000U/l

苹果酸脱氢酶                6000U/l

稳定剂                      50％(总体积)

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应：

腺苷+水  腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子

腺苷三磷酸+谷氨酸+氨  谷氨酰胺合成酶 腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酰胺

磷酸根+丙酮酸+氧+水  丙酮酸氧化酶 乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮  酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

草酰乙酸+磷酸根

草酰乙酸+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶 苹果酸+氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。

本实施例应用腺苷脱氨酶偶联谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶反应连续监测法。腺苷脱氨酶酶解腺苷产生氨，再通过偶联谷氨酰胺合成酶的作用，与腺苷三磷酸及谷氨酸一起生成磷酸根，然后丙酮酸氧化酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用，最后产生草酰乙酸，再通过偶联苹果酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。

实施例二(双剂)

本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有：

试剂I

缓冲液                        100mmol/l

谷氨酸                        8mmol/l

还原型辅酶                    0.25mmol/l

腺苷三磷酸                    5mmol/l

丙酮酸                        6mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸              5mmol/l

谷氨酰胺合成酶                 7000U/l

丙酮酸氧化酶                   9000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶         9000U/l

苹果酸脱氢酶                   13000U/l

稳定剂                         50％(总体积)

试剂II

缓冲液                         100mmol/l

腺苷                           6mmol/l

稳定剂                         20mmol/l

测定腺苷脱氨酶活性时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

具体测定步骤为：

腺苷+水  腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子

腺苷三磷酸+谷氨酸+氨  谷氨酰胺合成酶 腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酰胺

磷酸根+丙酮酸+氧+水  丙酮酸氧化酶 乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮  酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

草酰乙酸+磷酸根

草酰乙酸+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶 苹果酸+氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。

各反应步骤的反应时间控制在15分钟。

实施例三(三剂)

本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三剂，有：

试剂I

缓冲液                        120mmol/l

谷氨酸                        10mmol/l

还原型辅酶                    0.3mmol/l

腺苷三磷酸                    8mmol/l

丙酮酸                        10mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸              8mmol/l

稳定剂                        20mmol/l

试剂II

缓冲液                        120mmol/l

谷氨酰胺合成酶                10000U/l

丙酮酸氧化酶                  12000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶        12000U/l

苹果酸脱氢酶                  20000U/l

稳定剂                        50％(总体积)

试剂III

缓冲液                        120mmol/l

腺苷                          10mmol/l

稳定剂                        20mmol/l

在全自动生化分析仪上设定：温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

具体测定步骤为：

腺苷+水  腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子

腺苷三磷酸+谷氨酸+氨  谷氨酰胺合成酶 腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酰胺

磷酸根+丙酮酸+氧+水  丙酮酸氧化酶 乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

草酰乙酸+磷酸根

草酰乙酸+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶 苹果酸+氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。

各反应步骤的反应时间控制在20分钟。

实施例四

本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有：

试剂I

缓冲液                        100mmol/l

谷氨酸                        10mmol/l

还原型辅酶                    0.3mmol/l

腺苷三磷酸                    4mmol/l

丙酮酸                        10mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸              2mmol/l

稳定剂                        20mmol/l

试剂II

缓冲液                        100mmol/l

腺苷                          5mmol/l

谷氨酰胺合成酶              8000U/l

丙酮酸氧化酶                10000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶      8000U/l

苹果酸脱氢酶                12000U/l

稳定剂                      50％(总体积)

在生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应：

腺苷+水  腺苷脱氨酶 肌苷+氨离子

腺苷三磷酸+谷氨酸+氨  谷氨酰胺合成酶 腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酰胺

磷酸根+丙酮酸+氧+水  丙酮酸氧化酶 乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

草酰乙酸+磷酸根

草酰乙酸+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶 苹果酸+氧化型辅酶

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。

总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。

Claims (9)

1.一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，步骤如下：

1)、将样品与主要由腺苷、谷氨酸、还原型辅酶、腺苷三磷酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：

腺苷+水   腺苷脱氨酶  肌苷+氨离子

腺苷三磷酸+谷氨酸+氨   谷氨酰胺合成酶  腺苷二磷酸+

                                磷酸根+谷氨酰胺

磷酸根+丙酮酸+氧+水   丙酮酸氧化酶  乙酰磷酸+

                           二氧化碳+过氧化氢

二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸   磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

                               草酰乙酸+磷酸根

草酰乙酸+还原型辅酶   苹果酸脱氢酶  苹果酸+氧化型辅酶

2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。

2.根据权利要求1所述测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于：所述步骤2)为，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。

3、根据权利要求1或2所述测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于：温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。

4、根据权利要求1或2所述测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于：被测样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。

5.一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，由以下成分组成：

缓冲液                         40--200mmol/l

腺苷                           0.5--50mmol/l

谷氨酸                         1--30mmol/l

还原型辅酶                     0.15--0.3mmo/l

腺苷三磷酸                     1--10mmol/l

丙酮酸                         1--10mmol/l

磷酸烯醇式丙酮酸               1--20mmol/l

谷氨酰胺合成酶                 1000--50000U/l

丙酮酸氧化酶                   2000--20000U/l

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶         2000--20000U/l

苹果酸脱氢酶                   2000--20000U/l

稳定剂                         10--80％(总体积)

6.根据权利要求5所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂、双剂或三剂。

7.根据权利要求5或6所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。

8.根据权利要求5或6所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。

9、根据权利要求5或6所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于：所述还原型辅酶是NADPH、NADH或thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。