CN1338003A - 发光试样的测定方法及装置 - Google Patents
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Abstract
在本发明中,提供测定腺苷磷酸酯类来测定检体污物的方法。利用含有ATP再生酶的发光试药(33)使上述腺苷磷酸酯类发光。利用硅光电二极管(5)检测该发光量来测定污物。
Description
技术领域
本发明涉及使含有ATP再生酶的发光试药与试样起作用，来测定腺苷磷酸酯类的方法及装置。
背景技术
已知，当检测由细菌或食品引起的污染时，可利用荧光素酶及适当的试药以腺苷三磷酸(以下，称为ATP)为指标通过发光反应来测定。
但是，该光的输出极小，在现有技术中，为了得到可测定的输出，在光检测装置中利用了光电倍增管。但是，由于该光电倍增管需要高电压，故必须有电压变换装置及用于安全的对策。因而，具有除了装置变得大型之外，成本也高这样的缺点。
此外，作为光检测装置使用了雪崩光二极管也是已知的(WO 90/04775)。由于雪崩光二极管通常要求0℃～5℃的使用温度，故该装置需要用于雪崩光二极管的温度稳定系统。该系统具有与该雪崩光二极管相邻地安装的、珀尔帖(Peltier)效应型的热泵，接受来自温度控制电路的电流供给，以便对雪崩光二极管进行冷却。因而，具有装置也变得复杂，成本也高这样的缺点。
因此，本发明人着眼于不需要高电压、高电流的电源，不受温度影响的硅光电二极管。但是，该硅光电二极管的灵敏度较低，有时难以检出通常的生物发光。
另一方面，如特开平9-234099号中公开的那样，本发明人的一部分提案了题为「生物发光试药；使用了该试药的腺苷磷酸酯的定量法；以及使用了该试药的、与ATP变换反应系有关的物质的定量法」的发明。该发明为下述的方法，利用至少含有丙酮酸酯正磷酸盐二激酶(EC2.7.9.1)，(以下，称为PPDK)等的ATP再生酶的试药构成生物发光试药，通过发光反应以高灵敏度来检测腺苷磷酸酯类。
因此，本发明人进一步认真研究的结果发现，根据含有PPDK等的ATP再生酶的发光试药所产生的发光量来检测腺苷磷酸酯类，如果利用硅光电二极管测定该发光量，则可用简便的装置检测出腺苷磷酸酯类、即污物，完成了本发明。
发明的公开
按照本发明第1方面提供以下述方式进行的试药的测定方法，利用含有ATP再生酶的发光试药使腺苷磷酸酯类发光，利用硅光电二极管测定其发光量。
按照本发明第2方面还提供包含下列部件的发光试样的测定装置：收存在收存室内的检查用器具；用于对来自上述检查用器具的发光进行受光的硅光电二极管；以及基于由该硅光电二极管输出的信号，对上述发光量进行运算使之数值化的运算装置。
详细地说，提供下述污染的测定装置，包含：用于收存对污物进行取样、使该污物发光的检查用器具的收存室；用于对其射出光进行受光的硅光电二极管；以及用于测定已受光的光的运算装置，而且，具备操作面板及显示面板。
硅光电二极管为受光灵敏度比光电倍增管稍低，但与低强度的光起作用而输出可测定的电信号的半导体元件。硅光电二极管的电路部中，不需要高电压或高电流的电源，作为电源可使用电池。又，与其它一般二极管、例如雪崩光二极管相比，硅光电二极管受温度变化的影响小，不需要温度稳定装置。再，与光电倍增管相比，硅光电二极管较牢固，即使暴露在强光下也不受坏影响。因而，与现有的装置相比，本发明测定清洁度的测定装置可大幅度地实现小型化、轻量化及低成本。
本发明中使用的发光试药为含有PPDK等ATP再生酶的试药，也可附加到荧光素、荧光素酶发光试药中使用。含有ATP再生酶的发光试药不仅与ATP，还与腺苷二磷酸(以下，称为ADP)、腺苷一磷酸(以下，称为AMP)及核糖核酸(以下，称为RNA)反应而发光，而且呈现为稳定的高强度的发光。因而，可弥补与光电倍增管相比，硅光电二极管受光灵敏度稍低这样的缺点。
本申请发明中所谓的污物为包含ATP、ADP、AMP、RNA等腺苷磷酸酯类的污物，可优选地举出在清洁度检查中已检查的污物。
本申请发明中所谓的ATP再生酶，只要是对于从AMP生成ATP的反应起触媒作用的酶就什么都可以。例如，可举出磷酰烯醇丙酮酸酯连接酶(EC2.7.9.2)。又，也可把腺苷酸激酶(EC2.7.4.3)与丙酮酸酯激酶(EC2.7.1.40)组合使用，从AMP生成ATP。可优选地使用PPDK。
本发明中使用的PPDK为在镁金属离子存在下与AMP、磷酰烯醇丙酮酸及焦磷酸起作用，对生成ATP、丙酮酸及焦磷酸的反应起触媒作用的酶。其理化性质及制法是已知的，可容易地得到(参照特开平9-234099号)。
作为含有ATP再生酶的发光试药，例如把PPDK附加到包含荧光素、荧光素酶及金属盐的发光试药中使用，但是，如果同时附加磷酰烯醇丙酮酸及焦磷酸则可得到更好的效果。通过使用这种试药，除了测定作为污物指标分量的ATP之外还能同时测定AMP，并能以高灵敏度检测少量的污物。如果在含有上述ATP再生酶的发光试药中还并用对于从ADP生成ATP的反应起触媒作用的酶和/或RNA分解酶，则除了ATP及AMP的检测之外还能同时测定ADP及RNA，也能检测更少量的污物。
在实施本发明时，用棉棒擦被试验表面的污物，把上述棉棒浸入到含有用于从细菌类等污物中提取ATP、ADP、AMP或RNA等腺苷磷酸酯类的界面激活剂的提取试药中。把这样得到的取样液与含有PPDK等ATP再生酶的发光试药混合，用污染测定装置测定从该已混合的发光试药中发出的发光量，由此，可检测检体的污染。较为理想的是，如果使用棉棒、提取试药及发光试药已形成为一体的清洁度检查用器具、即擦取检查用器具就能更简便地进行检查。
如果用具备了含有该PPDK等ATP再生酶的发光试药的擦取检查用器具来构成装置，就能提供小型化、轻量化、低成本且灵敏度高的清洁度检查方法。即，用擦取检查用器具的棉棒擦进行试验的检体表面，把该棉棒浸入到该器具中具备的提取试药中，使所得到的试样液与同样在该器具中具备的、含有PPDK等ATP再生酶的发光试药反应，连擦取检查用器具一起设置在清洁度检查装置中，从所得到的发光量来测定污物的量。
这样，由于在本发明中作为发光试药使用了含有PPDK等ATP再生酶的发光试药，故发光较强且稳定，即使使用硅光电二极管也能检测其发光，可使装置小型化、轻量化、
附图的简单说明
图1为示出污染的测定装置的概略剖面图；
图2为示出运算装置具体例的框图；
图3为具有显示面板及操作面板的污染测定装置的正视图；以及
图4为详细地示出了擦取检查用器具的剖面图。
用于实施发明的最佳形态
以下，基于附图，详细地说明本发明较为理想的几个实施例。
图1中，污染测定装置1具有作为外壳的本体2。在该本体2内收存：擦取污物进行生物发光反应的擦取检查用器具3；使该擦取检查用器具3的发光聚光的聚光透镜4；使来自该透镜4的光变换成电信号的硅光电二极管5；以及对于来自该硅光电二极管的电信号进行处理的运算装置46。
如图3所示，在上述本体2上设置了操作面板7及显示面板8。如图2所示，这些操作面板7及显示面板8与运算部46电连接。操作面板7指示测定用的规格。显示面板8显示测定结果。
本体2具有用于收存擦取检查用器具3的收存室9。把擦取检查用器具3放置在设置于上述收存室9内的台式构件10上，使之总是保持为恒定位置。配置在擦取检查用器具3背面上的反射镜11使更大的发光量通过聚光透镜4传送给硅光电二极管5。
图2示出图1所示污染测定装置1的电功能框图。
图2中，污染测定装置1具有：电源电路部41；放大器42；A/D变换部43；运算部46；显示部8；操作部7；以及外部接口47。
电源电路部41可接受直流电源及交流电源此二者。
放大器42用于根据擦取检查用器具3发光的强弱、即来自硅光电二极管5的电信号的强弱，对其输出进行电压变换及放大。由A/D变换部43对于由该放大器42输出的信号进行数字化、供给运算部46。
运算部46由CPU44及存储器构成。CPU44把由硅光电二极管5输出的信号数值化并使显示部8显示其数值，或者与预先存储在存储器45中的污染度数据进行比较运算、把数值比该污染度阈值高的情况作为有清洗的必要性加以判断并使显示部8显示这个意思。
操作部7进行测定数据的保存、或将该数据通过外部接口47朝向打印机的发送、或朝向遥远地点的发送，或者进行朝向存储器45的数据输入。
在上述擦取检查用器具3中，作为发光试药只要能够利用PPDK等ATP再生酶的，就什么样的结构都可以，作为一例示于图4。
图4中，擦取检查用器具3主要由检体取样器12及作成试管状的发光试药容器13构成。该检体取样器12由：检体擦取器14；提取液容器15；作成管状的检体取样器12的取样器本体16构成。
利用例如由铝箔形成的密封材料18把发光试药容器13的开口部17封闭，密闭发光试药容器13。
检体擦取器14由棉棒21及保持该棉棒21的保持构件22构成。上述棉棒21由棒状的棉轴19及在其下端部形成为卵状而设置的棉部20构成。
上述保持构件22具有下段的小直径部23及上段的大直径部24。在小直径部23与大直径部24的边界上形成了台阶部25。该台阶部25与上述取样器本体16的上端部26适当接触，使检体取样器14在取样器本体16中向下运动时总是停止在一定的位置上。
检体取样器14以装卸自由的方式安装于取样器本体16内。为了在用上述棉棒21对检体表面进行了擦取后对污物进行取样，把该检体取样器14安装于取样器本体16内。
把用于提取通过擦检体而附着于棉棒21的棉部20上的污物的提取液32封入上述提取液容器15内。在该提取液容器15的上下端部进行了开口，在用密封材料27把下部密封后注入上述提取液32，其次，用密封材料28把上部密封、封入提取液32。该密封材料27、28是由利用上述棉棒21的按压容易破开的程度的材料、例如铝箔形成的。
检体取样器12的取样器本体16由上下端部开放的管状构件构成。在该取样器本体16的下方内壁面上形成了作成环状的凸起部29。在该凸起部29的下方延伸设置了与该凸起部29一体形成的飞散防止部30。把上述发光试药容器13向上方推上去，由此，利用飞散防止部30的锐角部31破开密封材料18。由棉部20提取的污物与提取液一起落入发光试药容器13中而被送出，进行发光反应，检测污物。
其次，说明上述擦取检查用器具3的作用。
首先，从取样器本体16拔出检体擦取器14，利用棉部20擦检体表面对污物进行取样。其次，在把对污物进行了取样的检体擦取器14插入到取样器本体16内之后，把发光试药容器13推上去把该容器13的密封材料18推到飞散防止部30的锐角部31上、把该密封材料18戳破。
其次，如果压下检体擦取器14，则棉棒21破开密封材料28，棉部20进入提取液容器15的内部。在检体擦取器14的保持构件22的台阶部25与取样器本体16的上端部26适当接触之前，还压下上述检体擦取器14，利用棉棒21破开密封材料27。
其后，使整个擦取检查用器具3在上下方向上轻轻地摇动，上述提取液32落入发光试药容器13内，发光试药33与含有细菌或污物的提取液32混合，该部分例如通过发光反应而发光。然后，把擦取检查用器具3安装到污染测定装置1的收存室9内，来测定发光量、即污物的量。
在本发明中，作为上述擦取检查用器具3中的发光试药33，使用含有PPDK等ATP再生酶的发光试药。
以上，示出了检体擦取之例，但是，作为另一例，也可以做成把成为检查对象的液体、固体、粉末等投入到收存了试药的试管内，以便测定其污物的量。
又，本发明的装置，作为试样不仅能测定生物发光的，还能测定化学发光或荧光的试样。
其次，示出实施例，以数值方式示出本申请发明的效果。酶的单位为国际单位。
实施例1
含有PPDK的发光试药的组成：
DETA(乙二胺四醋酸盐) 1.0mM
二硫苏糖醇 1.0mM
硫酸铵 3.75mM
焦磷酸 0.3mM
磷酰烯醇丙酮 2.1mM
荧光素 0.75mM
硫酸镁 7.5mM
BSA(牛血清白朊) 0.5％
蔗糖 5.0％
荧光素酶 2.5mg/ml
PPDK 1.5U/ml
腺苷磷酸脱氨基酶 0.05U/ml
HEPES(50mM) pH7.8
提取试药的组成：
氯化苄叉毒芹 0.02％
HEPES(10mM) pH7.8
把上述组成的、含有PPDK的发光试药冷冻干燥后封入图4所示的擦取检查用器具3的发光试药容器13内，同时，把上述组成的提取试药封入提取液容器15内(有PPDK)。
另一方面，把从上述组成中只去除了PPDK的发光试药冷冻干燥后同样封入发光试药容器内。但是，把与上述相同的提取试药设置在提取液容器15内(无PPDK)。
作为由食品引起的污物标本，在把擦取检查用器具3的棉棒21浸入到用超纯水把市售的酵母精、牛肉精、麦芽精、啤酒及牛乳稀释成各浓度液体内之后，压入棉棒保持器，把棉棒头部浸入到提取试药内，又压入棉棒保持器，把溶入了污物的提取试药送入到加入了发光试药的冷冻干燥物的发光试药容器13内，使之进行发光。
其次，连擦取检查用器具3一起设置在使用了硅光电二极管的污染测定装置1中，测定了发光量。用相对发光量RLU来表示测定值，其结果示于表1。
表1
使用了硅光电二极管的污物测定装置
产生的各试样的测定值
| 取样 | 试样的浓度(％) | 发光量测定值 | |
| 有PPDK | 无PPDK | ||
| 酵母精牛肉精麦芽精啤酒牛乳 | 0.010.0010.1101 | 1117125237453116 | 00008 |
从表1可知，在使用了不包含PPDK的发光试药的情况(无PPDK)下，由于只得到ATP引起的发光量。此外，发光量急剧衰减而不稳定，故在大多数情况下测定值为0。另一方面，在含有PPDK的发光试药的情况(有PPDK)下，由于除了ATP之外、还得到了食品中大量包含的AMP引起的发光、发光量也稳定，故能够以高灵敏度来测定污物。
实施例2
为了分配米饭把使用过的饭与在水里轻轻洗涮，用在实验例1中使用了的擦取检查用器具3的棉棒21擦取其表面的约10cm2，同样使其发光并测定发光量。无PPDK的情况的测定值为0，但有PPDK的情况的测定值为834RLU。
实施例3
在包装咖啡提取液的装置中，在水里轻轻清洗分注口附近之后，用在实验例1中使用了的擦取检查用器具3的棉棒21擦取该分注口表面的约10cm2，同样使其发光并测定发光量。无PPDK的情况的测定值为0，但有PPDK的情况的测定值为675RLU。
实施例4
在中国汤面的制造装置中，在水里轻轻清洗切断面条的切刀之后，用在实验例1中使用了的擦取检查用器具3的棉棒21擦取该切刀表面的约10cm2，同样使其发光并测定发光量。无PPDK的情况的测定值为0，但有PPDK的情况的测定值为1660RLU。
实施例5
在实施例1中，把含有PPDK的发光试药的组成的试药的情况定为有PPDK，把从该组成中只去除了PPDK的组成的发光试药的情况定为无PPDK。把有PPDK及无PPDK各200μl分别取样到试管中，并附加了用超纯水把市售的乌龙茶稀释成0.01％的各100μl。将其设置在污染测定装置1中，测定了发光量。用相对发光量RLU来表示测定值。无PPDK的情况的测定值为6RLU，但有PPDK的情况的测定值为618RLU。
工业上利用的可能性
如上所述，可以把本发明的污染测定装置构成为，把发光量测定装置、棉棒、提取试药及发光试药全部收存在携带用外壳内，可以搬运，作为清洁度检查用整套工具是有用的。
可以把上述发光量测定装置应用于其它多种试样的试验，例如食品工业中的原料及最终制品的试验、试药、水质及临床用试样等的试验中。
Claims (7)
1.一种发光试样的测定方法，其特征在于，利用含有ATP再生酶的发光试药使腺苷磷酸酯类发光，利用硅光电二极管测定其发光量。
2.根据权利要求1中所述的发光试样的测定方法，其特征在于，上述ATP再生酶为丙酮酸酯正磷酸盐二激酶。
3.一种发光试样的测定装置，其特征在于，包含：
收存在收存室内的检查用器具；
用于对来自上述检查用器具的发光进行受光的硅光电二极管；以及
基于由上述硅光电二极管输出的信号，对上述发光量进行运算使之数值化的运算装置。
4.根据权利要求3中所述的发光试样的测定装置，其特征在于，上述检查用器具为擦取检查用器具。
5.根据权利要求3中所述的发光试样的测定装置，其特征在于，上述检查用器具为试管。
6.根据权利要求4中所述的发光试样的测定装置，其特征在于，上述擦取检查用器具具有含有ATP再生酶的发光试药。
7.根据权利要求6中所述的发光试样的测定装置，其特征在于，上述ATP再生酶为丙酮酸酯正磷酸盐二激酶。
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