JP5188311B2 - 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 - Google Patents
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Description
前記試料とLALとの混和後において、前記試料とLALとの混和液中に光を入射するとともに該入射光の前記混和液による散乱光の強度を取得し、
前記散乱光の強度の増加率より前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法である。
少ないため、所定期間中にサンプリングされた散乱光の強度のうち最小値または、ヒストグラムの最頻値を選ぶことで、前記夾雑物からの散乱光の影響を除去することができる。
前記試料とLALとの混和液を光の入射可能に保持し、前記生理活性物質とLALとの反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における散乱光を受光し電気信号に変換するする受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から取得される前記散乱光の強度の増加率より前記試料中の前記生理活性物質の濃度を導出する導出手段と、
を備えることを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置であってもよい。
より前記試料中の前記生理活性物質の濃度を導出するようにしてもよい。そうすれば、より正確に、コアギュリンモノマー及び、モノマーが数個凝集したオリゴマーからの散乱光の増加率を取得でき、より正確に所定生理活性物質の検出及び、濃度の測定を行うことが可能となる。
応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、LALを用いた所定生理活性物質の測定法によれば、サブピコグラム/mLオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。
本発明の光源にはレーザーあるいは高輝度のLEDが用いられ、それをレンズによって絞込んで混和液に照射する。これにより、照射した部分に入射光の光エネルギーを集中させることができるので、コアギュリンモノマー及び、微小なコアギュリン凝集物といった極めて微小な粒子からも充分な強度の散乱光を発生させて検出することが可能である。
また、本発明において試料は測定容器中に内蔵している攪拌子により攪拌しており、この試料の攪拌によって、反応の均一化、反応の促進、生成されたコアギュリンモノマーの速やかなオリゴマーへの動員などが効率よく行なわれる。試料を攪拌せずに静置したばあいは比濁法と同様に最終的には試料がゲル化するために散乱光の増加が認められるが、反応初期のコアギュリンモノマー及び、微小なコアギュリン凝集物による散乱光の増加を精度よく検出することは困難な場合がある。
さらに、試料中には試薬の溶け残り、試薬の製法上残存するマイクロメータレベルの微粒子、試料の攪拌に伴う微小な気泡などが存在する。コアギュリンモノマー及び、微小なコアギュリン凝集物などから散乱する微弱な信号は、数は少ないが非常に強力な散乱光を発生させるこれらの夾雑物の散乱光に埋もれてしまうため、そのままでは測定することができない。
本発明は上記のように、取得された測定対象から発生する微弱な散乱光の時間変化の割合が作用させたエンドトキシンの濃度が高いほど大きく、濃度が低いほど小さいことに着目したものである。そのため、エンドトキシン濃度の低い試料であっても、凝集微粒子の出現やゲル化を待つまでもなく、短時間でその濃度を定量することが可能である。これは
本発明は比色法と同様微分法を利用することによる効果と言える。
く、1mm以下がさらに好ましい。入射光の波長が250nmから1200nmの範囲である一般的な光源であれば、入射光の出力密度としては50mW/mm2以上あれば充分な強度の散乱光が得られる。
0rmp以下では、試料の攪拌が充分でなく試料下方のみコアギュリンの凝集が観察される場合がある。また、この攪拌により測定対象としているコアギュリンモノマー及び、微小なコアギュリン凝集物よりも大きい微粒子(これらは、気泡あるいは、試薬中にもともと含まれている夾雑物などである)などが光源のビーム上に留まらないようにする効果があるため、データのばらつきや見かけの散乱光の増加の影響を受け難くすることができる。
ガラス製の容器(外径φ7mm、長さ50mm。以下、キュベットと略)にステンレス製の攪拌子(φ1mm、長さ5mm)を入れ、キュベット開口部にアルミホイルをして、それを何本かまとめてアルミ箔でさらに覆い、250℃、3時間加熱処理し、ガラス容器を滅菌処理した(乾熱滅菌)。これにより、容器に付着するエンドトキシンは熱分解を受け不活性化される。
半導体レーザー(出力10mW、波長655nm)に適宜レンズを組み合わせて、レーザー光を絞り込んで照射できる照明光学系(試料への入射口の直径は0.2mm)を作成した。この場合の入射光の出力密度は、約80mW/mm2である。0.01EU/mLのエンドトキシンを含有する試料をLAL(リムルスES−II シングルテストワコー:和光純薬製)と混合し、続いて製造例1にて製造したキュベット内部に入れた。これを図1に示したようなマグネチックスターラー12により試料中のステンレス製攪拌子11を回転せしめ、混和液を攪拌可能なホルダ部にセットした。この例ではキュベットが試料セル4として用いられている。
半導体レーザー(出力10mW、波長655nm)に適宜レンズを組み合わせ、レーザー光をレーザーポインタ状に平行光にして照射できる光学系(試料への入射口の直径は3.0mm)を作成した。実施例1とはこの光源光学系の条件のみが異なり、他の条件は同一で処理を行い、散乱光の時系列変化を取った。なお、この場合の入射光の出力密度は、約0.35mW/mm2である。
てより傾きの大きいBの相へと続いていく。それに対して、実施例2では、Aの相はほとんど観察されず、遅れて発生するBの相が主となって観察される。実施例1、2ともに、作用させているエンドトキシンの濃度など、光源2以外の測定条件は同一であるため、実施例2では、微小な粒子から充分な散乱光を取得することができないために試料中に進行している変化を検出することができないと考えられる。なお実施例1の曲線における屈曲点は本実施例において所定の急変化を起こす点に相当する。
実施例1と同条件で、ただし、試料の攪拌を行わずに散乱光の時系列変化を取った。その結果、攪拌を行わない場合であっても、コアギュリンモノマー及び、微小なコアギュリン凝集物が時間とともに増加していく様子を得ることができた。しかしながら、取得されるデータはばらつきが大きく、また、光源2のビーム上に目的の微小粒子よりも大きな粒子が存在した場合、同じ位置に長い時間留まってしまうため、データに対し最小値フィルタ処理などを行ったとしても見かけの散乱光が非常に高く出てしまう場合があった。そのような場合は、微弱な散乱光が増加していく現象を正しく評価することができなかった。これに対し試料を攪拌した場合には、これらの大型粒子は速やかにビーム上に留まることなく、速やかに外れるために正しい評価が可能となった。
実施例1で使用した光源2及び入射光学系3を用い、実施例1とは散乱光のフィルタ処理の方式が平均値フィルタを使用しているほかは同一の条件で処理を行い、散乱光の時系列変化を取った。平均値フィルタには、受光素子6で受光した光電位を増幅回路7で適宜増幅した後にアナログディジタル変換(10ビット)し、これを20ミリ秒ごとに25回行い、得られた25データの平均値を出力するという方法を用いた。
実施例1に示した方法で、エンドトキシン濃度を種々に変化させた希釈系列を作成し、エンドトキシン濃度とコアギュリンモノマー、ならびに、微小なコアギュリン凝集物による散乱光の初期の増加率の関係を調べた。その結果、エンドトキシン濃度が低いほど増加率が小さく、濃度が高いほど増加率が大きいことが分かった。エンドトキシン濃度と初期散乱光の増加率の関係を両対数でプロットすると図3のように直線関係が得られた。横軸はエンドトキシン濃度(EU/mL)、縦軸は初期微小散乱光増加率(初期の散乱光の増加曲線の傾き)を示している。
実施例1に示した方法で、散乱光の受光素子6をホトダイオードから、CCDエリアセンサに置き換えた装置を作り、実施例5と同様にエンドトキシン濃度と散乱光の初期増加率の関係を調べた。図4(b)にはその結果を示す。図4(b)において横軸はエンドトキシン濃度(EU/mL)、縦軸は初期微小散乱光増加率(初期の散乱光の増加曲線の傾き)を示している。
図4(a)においては同時に、散乱光の強度の時間変化についても掲載した。図4(a)において横軸は時間(分)、縦軸はCCDエリアセンサの出力より得られた散乱光強度である。CCDエリアセンサを用いても、図2中のAの相と同様に初期散乱光が直線的に増加した後、屈曲点を経てさらに大きな増加率の相(図2中の楕円Bの相)で変化していく様子が分かる。
実施例1に示した方法と同等の方法で、エンドトキシンの代わりにβ-D-グルカンを用いて検討を行った。LAL試薬としてはβ−グルカン テストワコー(和光純薬製)を用いた。β-D-グルカン濃度を種々にした希釈系列を作成し、β-D-グルカン濃度とコアギュリンモノマー、ならびに、微小なコアギュリン凝集物による散乱光の初期の増加率の関係を調べた。その結果、β-D-グルカン濃度が低いほど増加率が小さく、濃度が高いほど増加率が大きいことが分かった。β-D-グルカン濃度と初期散乱光の増加率の関係を両対数でプロットすると図5のように直線関係が得られた。図5において横軸はβ-D-グルカン濃度(pg/mL)、縦軸は初期微小散乱光増加率(初期の散乱光の増加曲線の傾き)を示している。
2・・・光源
3・・・入射光学系
4・・・試料セル
5・・・出射光学系
6・・・受光素子
7・・・増幅回路
8・・・ノイズ除去フィルタ
9・・・演算装置
10・・・表示器
11・・・攪拌子
12・・・マグネチックスターラー
Claims (14)
- 試料中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるLALとを反応させることで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記試料とLALとの混和後において、前記試料とLALとの混和液中に光を入射するとともに該入射光の前記混和液による散乱光の強度を取得し、
前記散乱光の強度の増加率が所定の急変化を起こす前における前記増加率より前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは濃度を測定することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。 - 前記混和液に入射する光の出力密度は50mW/mm2以上であることを特徴とする請求項1に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記混和液に入射する光の波長は300nm以上800nm以下であることを特徴とする請求項1または2に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記散乱光の強度の増加率を取得する際には、所定期間に取得された散乱光の強度を複数個サンプリングして比較し、そのうちの最小値または、ヒストグラムの最頻値を前記期間における散乱光の強度とすることを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記散乱光の強度を取得する際には、前記混和液を攪拌することを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記混和液の攪拌速度は、300rpm以上3000rpm以下であることを特徴とする請求項5に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−D−グルカンであることを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 試料中に存在する生物由来の生理活性物質とカブトガニの血球抽出物であるLALとを
反応させることで、前記試料中の前記生理活性物質を検出しまたは前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定装置であって、
前記試料とLALとの混和液を光の入射可能に保持し、前記生理活性物質とLALとの反応を進行させる混和液保持手段と、
前記混和液保持手段中の混和液に光を入射する光入射手段と、
前記入射光の前記混和液における散乱光を受光し電気信号に変換する受光手段と、
前記受光手段において変換された電気信号から取得される前記散乱光の強度の増加率より前記試料中の前記生理活性物質の濃度を導出する導出手段と、
を備え、
前記導出手段は、前記混和液保持手段における前記試料とLALとの混和後であって前記反応の開始後であって前記増加率が所定の急変化を起こす前における前記増加率より前記試料中の前記生理活性物質の濃度を導出することを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定装置。 - 前記光入射手段により前記混和液に入射される光の出力密度は50mW/mm2以上であることを特徴とする請求項8に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
- 前記光入射手段により前記混和液に入射される光の波長は300nm以上800nm以下であることを特徴とする請求項8または9に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
- 前記受光手段において変換された電気信号を、所定期間に複数個サンプリングして比較し、そのうちの最小値を出力する最小値フィルタまたは、ヒストグラムの最頻値を出力する最頻値フィルタをさらに備えることを特徴とする請求項8から10のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
- 前記混和液保持手段は、前記混和液を攪拌する攪拌手段を有することを特徴とする請求項8から11のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
- 前記攪拌手段による前記混和液の攪拌速度は、300rpm以上3000rpm以下であることを特徴とする請求項12に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
- 前記生物由来の生理活性物質は、エンドトキシンまたはβ−D−グルカンであることを特徴とする請求項8から13のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定装置。
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