KR20130076796A - 겔 입자 측정 장치 - Google Patents

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Abstract

＜과제＞
겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 겔 입자의 생성 개시 시점을 현상이 발생하는 용매 중에서 광감쇠를 최소한으로 억제하여 고감도로 계측한다.
＜해결 수단＞
시료(S) 및 시약(R)이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀(1)과, 혼합 용액(W)을 교반하는 교반 수단(2)과, 혼합 용액(W)에 대해서 코히어런트인 광(Bm)을 조사시키는 입사 광원(3)과, 시료 셀(1)의 외부에서 입사 광원(3)과 동일한 측에 설치되고, 시료 셀(1) 내의 혼합 용액(W) 중에서 산란한 광 중 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 후방 산란광 검출 수단(4)과, 후방 산란광 검출 수단(4)의 검출 출력에 기초하여 후방 산란광의 변동 성분을 계측하는 산란광 변동 계측 수단(5)과, 산란광 변동 계측 수단(5)의 계측 결과에 기초하여 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 타이밍에 관련되는 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단(6)을 구비한다.

Description

겔 입자 측정 장치{GEL PARTICLE MEASUREMENT DEVICE}
본 발명은 겔화 반응에 의해 측정 대상 시료 중의 엔도톡신(endotoxin)이나 β－D－글루칸(β－D－glucan) 등의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치에 관한 것으로서, 특히 겔 입자가 출현하기 시작하는 시점을 고감도로 측정하는 것을 기도한 겔 입자 측정 장치에 관한 것이다.
엔도톡신(내독소)으로 불리는 것은 주로 그램 염색에 물들지 않는(그램 음성) 세균류의 균체의 막 성분의 일부로, 그 성분은 리포폴리사카라이드로 불리는 지방질 다당류, 구체적으로는 리피드 A(Lipid A)로 불리는 지방질과 다당쇄가 2－케토-3－데옥시옥톤산(KDO)을 개재하여 결합한 리포다당(LPS)이지만, 그에 포함되는 리피드 A(Lipid A)로 불리는 지방질 구조 부분이, 감염에 의해 사람의 체내에 들어갔을 때에 세포의 수용체와 결합하여 염증을 일으켜, 많은 경우 여러 가지 위독한 임상 증상을 일으킨다. 이와 같이, 엔도톡신은 사람에 있어서 패혈증이나 균혈증이라는 치사율이 매우 높은 임상 증상의 원인으로 되는 물질이기 때문에, 체내에 들어간 엔도톡신의 추정을 하는 것은 임상적으로 요구가 높은 것이다.
또, 의약품(주사제 등)이나 의료용구(혈관 카테터(catheter) 등)는 엔도톡신에 의한 오염이 없는 것(파이로젠 프리(pyrogen free))이 중요하고, 세균을 이용하여 조제한 의약품(재조합 단백질, 유전자 치료에 이용하는 DNA 등)이나 식품 첨가물·화장품 등에서는 엔도톡신을 적정하게 제거 또는 제어하는 것이 불가결하게 되어 있다.
이 엔도톡신의 제거 확인, 혹은 구급 의학에 있어서의 계측은, 측정 시료수의 많음뿐만이 아니라 구명 치료라는 목적에 맞는 신속성이 요구되고 있다.
패혈증 등의 치료를 위해, 엔도톡신값을 측정하려는 연구는 옛날부터 이루어져, 투구게(Limulus)의 아메바상 혈구 성분에 포함되는 인자군이, 엔도톡신에 특이적으로 반응하고, 응집괴로 되어 상처를 틀어막는다는 현상이 발견되고 나서, 이 리물루스의 수해물(水解物)(Limulus Amebocyte Lysate； LAL 시약 또는 리물루스 시약)을 이용하여 엔도톡신의 정량을 하는 시도가 이루어지고 있다.
최초로 리물루스 시약을 사용한 측정법은, 단지 시료로 되는 환자의 혈장을 혼합하여 정치(靜置)하고, 일정 시간 후에 전도하여 혼합 용액의 겔화의 유무를 용액이 굳어지는 것으로 확인하고, 겔화를 일으키기 위한 최대 희석률로 엔도톡신량을 추정하는 소위 겔화법으로 불리는 반(半)정량의 측정법이었다.
그 후 겔화 반응의 과정에 있어서의 탁도 증가에 주목하여, 광학적인 계측 방법을 이용한 탁도계로, 정치한 혼합 용액의 겔화 반응에 수반하는 탁도 변화에 의해 엔도톡신 농도를 정량 측정하는 비탁(比濁) 시간 분석법이 알려져 있다.
또, 리물루스 시약에 의한 반응 과정의 최종 단계에서 코아귤로겐(Coagulogen)이 코아귤린(Coagulin)으로 전환하는 겔화 반응을 합성 기질의 발색 반응으로 치환한 발색 합성 기질법도 이미 알려져 있다. 이것은 응고 과정에 있어서의 응고 전구 물질(코아귤로겐： Coagulogen) 대신에 발색 합성 기질(Boc-Leu-Gly-Arg-p-니트로아닐리드)을 가함으로써, 그 가수분해로 p-니트로아닐린이 유리되고, 그 황색 발색의 비색(比色)에 의해 엔도톡신 농도를 측정하는 것이다.
또한, 종래에 있어서의 겔화 반응 측정 장치 혹은 이것에 관련되는 측정 장치로서는, 예를 들면 특허문헌 1~3에 나타내는 것을 들 수 있다.
특허문헌 1은 겔화 반응 측정 장치에 관한 것은 아니지만, 혈중의 혈소판이 응집하여 덩어리로서 성장하는 과정에 대해, 혈소판의 응집괴의 크기, 수를 측정하는 것이고, 시료 셀 내의 시료에 대해서 레이저 광원으로부터의 조사광을 조사시켜, 혈소판에서 90°측방으로 산란한 산란광의 일부를 광 검출기로 검출하고, 이 검출 결과에 기초하여 혈소판의 응집괴의 크기, 수를 측정하는 것이다.
또, 특허문헌 2는 비탁 시간 분석법을 이용한 겔화 반응 측정 장치에 관한 것이고, 검체(시료)와 리물루스 시약을 혼합시킨 혼합액의 투과광 강도의 경시 변화를 측정하여, 소정 시간에 있어서의 변화량으로부터 검체의 엔도톡신 농도를 측정하는 것이다.
또한, 특허문헌 3은 겔화 반응에 의해 측정되는 엔도톡신 등의 물질의 농도를 측정하는 겔화 측정 장치에 관한 것이고, 시료 셀 중에서 생성되는 개개의 겔 입자의 레이저 광속(光束)에 의한 산란광을 수광하는 수광 소자와, 상기 수광 소자의 산란광 검출 출력에 기초하여, 겔 입자의 직경과 수를 시계열적으로 계측하는 계측 수단을 가지는 것이다.
특허문헌 1~3은 모두 레이저 광원으로부터의 조사광 중 시료 셀 내에서 산란한 광 중, 레이저 광원이 설치된 측과는 다른 측, 예를 들면 레이저 광원과는 반대측의 전방을 향해 투과한 전방 산란광, 혹은 레이저 광원에 대해서 측방을 향해 산란한 측방 산란광을 검출하고, 이 검출 결과에 기초하여 측정 대상인 혈소판의 응집괴나 엔도톡신 농도를 측정하려는 것이다.
또한, 겔화 반응을 이용한 측정 기술은 전술한 엔도톡신뿐만 아니라 β－D－글루칸(β－D－glucan) 등의 측정에도 이용된다.
β－D－글루칸(β－D－glucan)은 진균류에 특징적인 세포막을 구성하고 있는 폴리사카라이드(다당체)이다. 이 β－D－글루칸을 측정함으로써, 칸디다나 아스페르길루스, 크립토코커스와 같은 일반 임상에서 잘 보이는 진균류뿐만 아니라, 드문 진균류도 포함하는 광범위로 진균류 감염증의 스크리닝 등에서 유효하다.
이 β－D－글루칸의 측정에 있어서도, 투구게의 혈구 추출 성분이 β－D－글루칸에 의해 겔화하는 것이 이용되고 있고, 상술한 겔화법이나 비탁 시간 분석법, 발색 합성 기질법에 의해 측정된다.
엔도톡신이나 β－D－글루칸의 측정 수법에는 공통점이 있고, 예를 들면 대략 동일한 측정 하드웨어를 이용하여, 투구게의 혈구 추출 성분 중에서 β－D－글루칸 특이적으로 반응하는 Factor G 성분을 제거함으로써 엔도톡신에 선택적인 겔화 반응이나 발색 반응을 측정할 수 있고, 또 시료 중의 엔도톡신에 사전 처리에 의해 불활성화함으로써, β－D－글루칸에 선택적인 겔화 반응이나 발색 반응을 측정하는 것이 가능하다.
일본 특허 제3199850호 공보(실시예, 도 1) 일본 특허공개 2004－93536호 공보(발명의 실시의 형태, 도 3) 국제공개 WO2008/038329호(발명을 실시하기 위한 최선의 형태, 도 1)
그렇지만, 종래의 겔화법, 비탁 시간 분석법 및 발색 합성 기질법에 있어서는 다음과 같은 문제가 있다.
겔화법 및 비탁 시간 분석법은 모두 겔이 생성되는데 저농도에서는 약 90분 이상이라는 장시간을 요한다. 즉, 반응 용액의 겔화 시간은 측정 대상 시료 중의 목적 물질의 농도에 비례하지만, 겔화법 및 비탁 시간 분석법은 모두 감도의 점에서 정확한 겔화 개시 시간 등을 검출할 수 없기 때문에, 어느 정도의 겔화가 진행될 때까지의 시간부터 반응량을 산출하여 겔화 시간의 기준으로 하고 있다.
비탁 시간 분석법을 예로 들면, 비탁 시간 분석법은 시약의 조제에 의해 변화가 시작되는 최초의 농도 레벨의 탁도와 변화가 종료되는 농도 레벨의 탁도에 대해서는 알 수 있지만, 각각의 변화가 시작되는 시간이나 종료의 시간을 알기 어렵고, 최초와 최후 레벨 사이의 일정 레벨의 변화 도달(탁도의 증가)을 측정함으로써, 겔화 전체의 변화 관찰로 바꾼다고 하는 것으로 정량법으로서 확립된 것이다. 그러나, 저농도의 엔도톡신으로 되면, 계 전체의 겔화가 지체되고, 그에 따라 관측하는 탁도 변화도 늦어지기 때문에 측정하기 어려워져, 그만큼 감도가 필연적으로 둔하게 되어 버린다.
따라서, 겔화법 및 비탁 시간 분석법은 모두 구급을 요하는 경우나 다수의 검체를 측정하는데 적합한 방법이라고 하기는 어렵다. 또한, 비탁 시간 분석법에서는 엔도톡신과는 무관계의 비특이적 탁함이 발생하는 경우가 있어, 측정 정밀도가 떨어질 염려가 있다. 또, 겔화법의 측정 한계 농도는 3pg/ml, 비탁 시간 분석법의 측정 한계 농도는 1pg/ml 정도이다.
또한, 겔화 반응 측정 장치에 적용되는 비탁 시간 분석법으로서, 만일 특허문헌 1에 나타내는 산란 측광법을 적용하였다고 해도, 겔화 전체의 변화 관찰로 바꾼 정량법인 이상 상술한 문제는 해결할 수 없다.
한편, 발색 합성 기질법은 겔화법 및 비탁 시간 분석법에 비해 측정 시간이 약 30분 정도로 단시간이지만, 임상 시료 등 천연물에 있어서의 측정에서는, 혼재하는 비특이적 단백 분해 효소에 의한 위(僞)양성 반응이 발생하는 경우가 있어, 특이도가 높은 측정을 행하는 것이 어렵고, 또 측정 준비가 번잡하고, 측정 한계 농도도 3pg/ml로 비탁 시간 분석법에 떨어진다.
본 발명은 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 겔 입자의 생성 개시 시점을 현상이 발생하는 용매 중에서 광감쇠를 최소한으로 억제하여 고감도로 계측할 수가 있는 겔 입자 측정 장치를 제공하는 것이다.
청구항 1에 관계되는 발명은, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서, 적어도 일부에 광이 입사되는 입사부를 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀과, 이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과, 상기 시료 셀의 입사부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대해서 코히어런트(coherent)인 광을 조사시키는 입사 광원과, 상기 시료 셀의 입사부의 외부에서 상기 입사 광원과 동일한 측에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중에서 산란한 광 중 상기 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 후방 산란광 검출 수단과, 이 후방 산란광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 산란광의 변동 성분을 계측하는 산란광 변동 계측 수단과, 이 산란광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 시점에 관련되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 2에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 입사 광원은 레이저 광원인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 3에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 시료 셀은 셀 용기 내에 시료 및 시약 용액을 직접 교반 가능한 교반 수단을 내장한 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 4에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 시료 셀은 항온조 내에 설치되는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 5에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 시료 셀은 그 자체 또는 그 주위에, 입사 광원으로부터의 조사광 중 상기 혼합 용액 중에서 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분 이외의 투과 또는 산란으로 생기는 미광(迷光) 성분이 제거시켜지는 미광 제거 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 6에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 겔 입자 생성 판별 수단에 의한 판별 결과가 표시되는 표시 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 7에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 후방 산란광 검출 수단은 입사 광원으로부터 시료 셀에 입사되는 입사광을 둘러싸는 링상 검출면을 가지는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 8에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 후방 산란광 검출 수단은, 입사 광원으로부터 시료 셀에 입사되는 입사광을 둘러싸는 광투과성 섬유속(束)으로 이루어지는 도광 부재를 가지고, 이 도광 부재의 일단을 광도입면으로서 기능시킴과 아울러, 상기 도광 부재의 타단에 대응하여 검출면을 배치하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 9에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 상기 혼합 용액 내에서 산란한 광 중 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 후방 산란광 검출 수단인 제1의 산란광 검출 수단과, 상기 혼합 용액 내에서 산란한 광 중 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분 이외의 산란광 성분을 검출하는 제2의 산란광 검출 수단과, 이들 후방 산란광 검출 수단에 의한 검출 출력에 기초하여 각각의 산란광의 변동 성분을 계측하는 산란광 변동 계측 수단을 가지고, 상기 겔 입자 생성 판별 수단은 제1의 산란광 검출 수단의 검출 출력의 변동 성분의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점을 판별하고, 제1의 산란광 검출 수단 및 제2의 산란광 검출 수단의 검출 출력 또는 제2의 산란광 검출 수단의 검출 출력의 변동 성분의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점 이외의 겔 입자의 생성 상태 정보를 판별하는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 10에 관계되는 발명은, 청구항 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 측정 대상인 목적 물질이 엔도톡신이고, 이것을 겔화하는 시약이 리물루스 시약인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 1에 관계되는 발명에 의하면, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에서 산란하는 산란광 중 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광의 변동 성분에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 시점에 관련되는 겔 입자의 생성 개시 시점을 현상이 발생하는 용매 중에서 광감쇠를 최소한으로 억제하여 고감도로 측정할 수가 있다.
청구항 2에 관계되는 발명에 의하면, 입사 광원을 간단하게 제공할 수가 있다.
청구항 3에 관계되는 발명에 의하면, 시료 및 시약 용액을 보다 확실히 교반할 수가 있어 겔 입자의 생성 조건을 갖출 수가 있다.
청구항 4에 관계되는 발명에 의하면, 항온 환경하에서 겔화 반응을 안정적으로 진행시킬 수가 있다.
청구항 5에 관계되는 발명에 의하면, 후방 산란광 검출 수단에서 후방 산란광 성분 이외의 투과 또는 산란으로 생기는 미광 성분이 오류 검출되는 사태를 유효하게 회피할 수가 있다.
청구항 6에 관계되는 발명에 의하면, 겔 입자 생성 판별 수단의 판별 결과를 눈으로 볼 수가 있다.
청구항 7에 관계되는 발명에 의하면, 후방 산란광 검출 수단에 의한 후방 산란 성분의 검출 정밀도를 보다 향상시킬 수가 있다.
청구항 8에 관계되는 발명에 의하면, 간단한 구성의 후방 산란광 검출 수단으로 후방 산란광 성분을 효율적으로 검출할 수가 있다.
청구항 9에 관계되는 발명에 의하면, 제2의 산란광 검출 수단을 이용하지 않는 태양에 비해, 후방 산란광의 변동 성분에 더하여, 후방 산란광 이외의 산란광의 변동 성분도 계측 가능하기 때문에, 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점에 더하여 다른 겔 입자의 생성 상태 정보를 보다 정확하게 판별할 수가 있다.
청구항 10에 관계되는 발명에 의하면, 엔도톡신의 정량에 적용할 수가 있다.
도 1은 본 발명이 적용되는 겔 입자 측정 장치의 실시의 형태의 개요를 나타내는 설명도이다.
도 2 (a)는 겔화 반응을 모식적으로 나타내는 설명도, (b)는 겔화 반응의 진행 공정 I~Ⅲ을 나타내는 설명도, (c)는 겔화 반응의 진행 공정에 있어서의 반응 시간과 산란광 강도의 관계를 나타내는 설명도이다.
도 3은 리물루스 시약을 이용했을 때의 엔도톡신의 겔화 반응 과정을 모식적으로 나타내는 설명도이다.
도 4 (a)는 겔 입자에 코히어런트 광(coherent light)이 조사되었을 때의 산란광의 산란 방향을 나타내는 설명도, (b)는 겔 입자의 입자경의 변화에 수반하는 산란광의 광도 분포를 나타내는 설명도이다.
도 5는 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 나타내는 설명도이다.
도 6 (a)는 실시의 형태 1에서 이용되는 레이저 광원, 후방 산란광 검출기의 구성예를 나타내는 설명도, (b)는 (a)의 일부 단면 평면 설명도이다.
도 7 (a)는 실시의 형태 1에서 이용되는 시료 셀을 나타내는 분해 사시도, (b)는 그 단면 설명도이다.
도 8은 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 데이터 해석 처리의 일례를 나타내는 흐름도이다.
도 9 (a)는 기존의 엔도톡신 농도의 시료에 대해서 후방 산란 측광에 의한 겔 입자의 검출예를 나타내는 설명도, (b)는 (a)의 결과를 이용한 검량선 작성예를 나타내는 설명도이다.
도 10 (a), (b)는 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 변형 형태를 나타내는 설명도이다.
도 11은 실시의 형태 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 나타내는 설명도이다.
도 12 (a)는 표준품 엔도톡신을 가한 물 시료에 대해, 실시예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광한 실측 데이터예를 나타내는 설명도, (b)는 (a)와 마찬가지의 표준품 엔도톡신을 가한 물 시료에 대해, 비교예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광과 동시에 전방 산란 측광한 실측 데이터예를 나타내는 설명도, (c)는 (a)와 마찬가지의 표준품 엔도톡신을 가한 물 시료에 대해, 비교예 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광과 동시에 전방 투과광의 실측 데이터예를 나타내는 설명도이다.
도 13 (a)는 임상의 전혈용혈(全血溶血) 시료에 표준품의 엔도톡신을 가한 시료에 대해, 실시예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광한 실측 데이터예를 나타내는 설명도, (b)는 (a)와 마찬가지의 임상의 전혈용혈 시료에 표준품의 엔도톡신을 가한 시료에 대해, 비교예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광과 동시에 전방 산란 측광한 실측 데이터예를 나타내는 설명도, (c)는 (a)와 마찬가지의 임상의 전혈용혈 시료에 표준품의 엔도톡신을 가한 시료에 대해, 비교예 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광과 동시에 전방 투과광의 실측 데이터예를 나타내는 설명도이다.
도 14 (a)는 임상의 전혈용혈 시료에 대해, 실시예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광한 실측 데이터예를 나타내는 설명도, (b)는 (a)와 마찬가지의 임상의 전혈용혈 시료에 대해, 비교예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광과 동시에 전방 산란 측광한 실측 데이터예를 나타내는 설명도, (c)는 (a)와 마찬가지의 임상의 전혈용혈 시료에 대해, 비교예 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광과 동시에 전방 투과광의 실측 데이터예를 나타내는 설명도이다.
도 15 (a)는 실시예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 후방 산란 측광의 실측 데이터예를 나타내는 설명도, (b)는 (a)의 실측 데이터에 대해 3데이터마다 평활화(smoothing) 처리한 데이터예를 나타내는 설명도, (c)는 (a)의 실측 데이터에 대해 5데이터마다 평활화 처리한 데이터예를 나타내는 설명도이다.
도 16은 혈액 응고 반응에서의 본건 발명의 적용예를 나타내는 설명도이다.
도 17 (a), (b)는 항원 항체 반응에서의 본건 발명의 적용예를 나타내는 설명도이다.
◎ 실시의 형태의 개요
도 1은 본 발명이 적용된 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 개요를 나타내는 설명도이다.
동 도에 있어서, 겔 입자 측정 장치는 겔화 반응에 의해 시료(S) 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 것으로서, 적어도 일부에 광이 입사되는 입사부를 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료(S) 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약(R)이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀(1)과, 이 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액(W)을 교반하는 교반 수단(2)과, 상기 시료 셀(1)의 입사부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)에 대해서 코히어런트인 광(Bm)을 조사시키는 입사 광원(3)과, 상기 시료 셀(1)의 입사부의 외부에서 상기 입사 광원(3)과 동일한 측에 설치되고, 상기 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 중에서 산란한 광 중 상기 입사 광원(3)측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 후방 산란광 검출 수단(4)과, 이 후방 산란광 검출 수단(4)의 검출 출력에 기초하여 산란광의 변동 성분을 계측하는 산란광 변동 계측 수단(5)과, 이 산란광 변동 계측 수단(5)의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 시점에 관련되는 상기 혼합 용액(W) 내의 겔 입자(G)의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단(6)을 구비한 것이다.
이러한 기술적 수단에 있어서, 본건의 목적 물질은 소정의 시약과의 사이에서 겔화 반응하여 겔 입자가 생성되는 것이면 널리 포함한다. 예를 들면 엔도톡신이나 β－D－글루칸을 들 수 있고, 이 경우의 소정의 시약으로서는 리물루스 시약을 들 수 있다.
또, 시료 셀(1)은 적어도 일부에 광이 입사되는 입사부를 가지는 것이면 좋고, 그 형상은 원통상 주벽(周壁)을 가지는 것에 한정되지 않고, 다각형상 주벽을 가지는 것이라도 좋다.
또한, 입사부로부터 입사된 광 중 후방 산란광 검출 수단(4)측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 이외의 산란광, 투과광 등의 광이 시료 셀(1)의 내벽에서 반사 산란하면, 그 반사 산란광의 일부가 미광으로서 후방 산란광 검출 수단(4)에 잘못하여 포착될 염려가 있기 때문에, 이러한 검출에 영향을 주는 미광이 생기지 않는 구성을 채용하는 것이 바람직하다.
또, 측정 조건을 일정하게 유지한다는 관점에서 보면, 이 시료 셀(1)은 항온조(7) 내에 설치되는 태양이 바람직하다.
또한, 교반 수단(2)으로서는 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)에 대해서 교반 작용을 주는 것이면 널리 포함하고, 내장하여 직접적으로 교반하는 태양은 물론, 공기에 의한 교반 작용을 주거나 진탕에 의한 교반 작용을 주는 등 적당히 선정해도 지장 없다.
여기서, 교반 수단(2)의 교반의 정도는, 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 전체가 겔화하는 것을 억제하는 것인 것을 요한다.
특히, 교반 수단(2)에 의한 교반 동작을 확실히 행한다는 관점에서 보면, 시료 셀(1)은 셀 용기 내에 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 직접 교반 가능한 교반 수단(2)을 내장한 것인 것이 바람직하다.
또, 입사 광원(3)은 코히어런트인 광을 조사하는 것이면 레이저 광원에 의한 레이저광에 한정되지 않고, 예를 들면 나트륨 램프의 광과 같은 단색광을 핀홀에 통과시키는 것에 의해서도 구성할 수 있는 외에, 고휘도 LED와 필터를 이용하여 구성해도 좋다.
또, 후방 산란광 검출 수단(4)으로서는, 입사 광원(3)으로부터 시료 셀(1) 내에 입사된 광(Bm)에서 시료(S) 및 시약(R) 용액 중에서 산란한 광 중 입사 광원(3)측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 것이면 좋다. 이 경우 후방 산란광 검출 수단(4)으로서는, 입사 광원(3)으로부터의 입사광의 주위에서 상기 후방 산란광 성분을 직접 검출하는 태양이라도 좋고, 혹은 입사 광원(3)으로부터의 입사광의 주위의 광을 모아, 유리 섬유 등의 도광 부재로 임의의 장소까지 이끌어 검출하는 태양이라도 좋다. 또, 입사 광원(3)으로부터 입사된 광에서 혼합 용액(W) 중에서 입사 광원(3)측 방향으로 돌아가지 않는 투과광 또는 산란광 성분이 미광으로서 후방 산란광 검출 수단(4)에 검출되지 않게, 미광 성분을 제거하는 미광 제거 수단(8)(시료 셀(1)의 주벽 내 또는 외부에 광흡수재를 설치하거나 시료 난반사시키는 구조)을 채용하는 것이 바람직하다.
또한, 산란광 변동 계측 수단(5)으로서는, 후방 산란광 검출 수단(4)의 검출 출력에 기초하여 산란광의 변동 성분을 계측하는 것이면 좋고, 예를 들면 검출 출력을 평균화 또는 평활화함과 아울러 필터링화하는 수법을 들 수 있다.
또, 겔 입자 생성 판별 수단(6)으로서는, 상기 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 타이밍에 관련되는 상기 혼합 용액(W) 내의 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 것을 널리 포함한다.
그리고, 「겔 입자의 생성 상태를 판별한다」란, 겔 입자의 생성 상태에 관한 정보를 직접 판별하는 것은 물론, 겔 입자의 생성 상태에 기초하여 판별 가능한 정보(예를 들면 목적 물질의 정량 정보)를 판별하는 것도 포함하는 것이다.
여기서, 겔 입자의 생성 상태란, 겔 입자의 생성 개시(출현) 시점, 생성 과정의 변화, 생성 종료 시점, 생성량 등을 널리 포함하는 것이기 때문에, 본건에서는 상기 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 타이밍이 적어도 포함되어 있으면, 다른 사항을 포함하고 있어도 지장 없다.
또, 산란광 변동 계측 수단(5)에 의한 계측 결과를 눈으로 본다는 관점에서 보면, 산란광 변동 계측 수단(5)에 의한 계측 결과가 표시되는 표시 수단(9)을 구비하고 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 실시의 형태에서는, 상술한 후방 산란광 검출 수단(4)을 제1의 산란광 검출 수단으로 하고, 또한 상기 혼합 용액(W) 내에서 산란한 광 중 입사 광원(3)측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분 이외의 산란광 성분을 검출하는 제2의 산란광 검출 수단(10)과, 이들 후방 산란광 검출 수단(4, 10)에 의한 검출 출력에 기초하여 각각의 산란광의 변동 성분을 계측하는 산란광 변동 계측 수단(5)을 가지고, 상기 겔 입자 생성 판별 수단(6)은, 제1의 산란광 검출 수단(4)의 검출 출력의 변동 성분의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액 내의 겔 입자(G)의 생성 개시 시점을 판별하고, 제1의 산란광 검출 수단(4) 및 제2의 산란광 검출 수단(10)의 검출 출력 또는 제2의 산란광 검출 수단(10)의 검출 출력의 변동 성분의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액(W) 내의 겔 입자(G)의 생성 개시 시점 이외의 겔 입자(G)의 생성 상태 정보를 판별하도록 해도 좋다.
다음에, 도 1에 나타내는 겔 입자 측정 장치의 작동에 대해서 설명한다.
먼저, 겔화 반응을 도 2 (a)에 모식적으로 나타낸다.
동 도에 있어서, 시료(S)의 목적 물질(St)에 대해 특이적으로 반응하는 시약(R)이 존재하면, 시료(S) 중의 목적 물질(St)의 농도에 의존한 비율에서, 그 목적 물질(St)이 시약(R)과 특이적으로 반응하는 현상이 일어난다. 이 반응 과정에 있어서, 시약(R)은 목적 물질(St)의 자극을 받아 소정의 인자가 활성화하고, 이것에 기인하여 소정의 효소가 활성화하는 타이밍에서 예를 들면 수용성의 단백질이 효소에 의한 분해 반응에서 불용성의 단백질로 전환하여, 겔 입자(G)의 출현에 이르는 일이 일어난다.
보다 구체적으로는, 엔도톡신을 예로 들어 엔도톡신의 겔화 반응 과정을 모식적으로 나타내면 도 3과 같다.
동 도에 있어서, (1)에 나타내는 엔도톡신의 자극이 리물루스 시약에 전해지면, 먼저 (2)에 나타내듯이, 인자 C(Factor C)가 활성화되어 활성화 인자 C(Activated Factor C)로 되고, 이어서 활성화 인자 C의 작용에 의해, (3)에 나타내듯이, 인자 B(Factor B)가 활성화되어 활성화 인자 B(Activated Factor B)로 된다. 이후 활성화 인자 B의 작용에 의해, (4)에 나타내듯이, Pro-Clotting 효소가 Clotting 효소로 되고, (5)에 나타내듯이, 이 Clotting 효소가 Coagulogen(수용성 단백질)을 분해하여 Coagulin(불용성 단백질)으로 생성된다. 이 Coagulin(불용성 단백질)은 이 조건하에서 교반이 행해지면 전체의 겔화가 저해되는데 수반하여 겔 입자(G)로서 출현하고, 한편 여기서 정치하면 (6)에 나타내듯이, 용액계 전체가 중합화·겔화를 일으킨다.
즉, 시료(S)의 목적 물질(St)이 엔도톡신인 경우에는, 혼합 용액(W)에 대해서 일정한 교반 상태를 줌으로써 혼합 용액(W) 전체의 겔화를 저해하면서, 이 상태에서 리물루스 시약(R)에 엔도톡신의 자극이 전해지면, Clotting 효소의 주위에 Coagulin(불용성 단백질)의 겔 입자(G)를 산출시키는 것이 가능하고, Coagulin(불용성 단백질)이 겔 입자(G)로서 생성된 후에, 겔 입자(G)가 순차 생성되는 반응 과정을 거치는 것이 이해된다.
또, 리물루스 시약(R)의 반응이 흐름(cascade)에 엔도톡신의 자극이 전해지는 속도(리물루스 반응 속도)는 엔도톡신 농도에 의존적이고, 엔도톡신 농도가 높을수록 리물루스 반응 속도가 빠르고, Coagulin(불용성 단백질)으로 이루어지는 겔 입자(G)의 출현 타이밍이 빠른 것을 알아냈다.
따라서, 산란광 변화를 정밀도 좋게 검출하도록 하면, 겔 입자(G)의 생성 개시 시점으로서 상기 Coagulin(불용성 단백질)으로 이루어지는 겔 입자(G)의 출현 타이밍을 파악하는 것은 가능하고, 본 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 측정 원리의 기본이다.
이러한 겔 입자 측정 장치의 측정 원리는, 예를 들면 종전의 겔화법이나 비탁 시간 분석법의 측정 원리(리물루스 시약(R)에 의한 반응 과정에 있어서, 정치한 조건하, 활성화된 Clotting 효소의 영향으로 최종적으로 겔화하기에 이르고, 이 겔화하는 과정을 탁도에 의해 정량 측정하는 태양)와는 완전히 상위한 것이다.
여기서, 겔 입자 측정 장치의 측정 원리를 도 2 (b)에 모식적으로 나타낸다.
본 실시의 형태의 겔 입자 측정 장치에서는, 도 2 (b)의 공정 I에 나타내듯이, 시료(S) 및 시약(R) 용액의 혼합 용액(W)에 겔 입자가 없는 경우(혼합 용액(W)이 졸상인 경우에 상당)에는, 도시 외의 입사 광원으로부터 조사광(Bm1)은 겔 입자에 의해 차단되지 않기 때문에, 그 조사광(Bm1)이 겔 입자에 의해 산란하지 않고, 당연하지만 입사 광원(3)측의 후방으로 돌아가는 후방 산란광 성분은 없다. 이 때문에 후방 산란광 검출 수단(4)으로 검출되는 산란광 강도는 대략 0으로 유지된다(도 2 (c) I 공정 P1 참조).
그리고, 도 2 (b)의 공정 Ⅱ에 나타내듯이, 시료(S) 및 시약(R) 용액의 혼합 용액(W)에 겔 입자(G)가 생성 개시하기 시작한 경우(혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하기 시작한 경우에 상당), 예를 들면 엔도톡신의 경우의 Coagulin(불용성 단백질)의 겔 입자(G)가 산출되기 시작하면, 도시 외의 입사 광원으로부터 조사광(Bm2)은 산출된 Coagulin(불용성 단백질)으로 이루어지는 겔 입자(G)의 존재에 의해 일부 차단되기 때문에, 그 조사광(Bm2)이 산란하게 되어, 그 산란광 중 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분이 후방 산란광 검출 수단(4)에 검출되게 된다. 이 때문에 후방 산란광 검출 수단(4)에 의한 검출 출력이 안정 영역인 0레벨로부터 일어서 변화하려고 한다(도 2 (c) Ⅱ 공정 P2 참조). 이 경우 입사광이 부딪히는 시료 셀(1) 직후의 후방 산란광은 용매에 의한 감쇠를 거의 받지 않고 검출된다.
이후 도 2 (b)의 공정 Ⅲ에 나타내듯이, 시료(S) 및 시약(R) 용액의 혼합 용액(W)에 겔 입자(G)의 생성이 점차 진행되어 가는 경우에는, 도시 외의 입사 광원으로부터 조사광(Bm3)은 순차 생성되는 많은 겔 입자(G)의 존재에 의해 산란 정도가 점차 증가하게 되고, 후방 산란광 검출 수단(4)에 검출되는 입사 광원측의 후방으로 돌아가는 후방 산란광 성분도 점차 증가한다. 이 때문에 후방 산란광 검출 수단(4)에 의한 검출 출력이 순차 증가해 가고, 후방 산란광 검출 수단(4)으로 검출되는 산란광 강도는 변화점 P2를 경계로 순차 증가하여 변화해 간다(도 2 (c) Ⅲ 공정 P3 참조). 한편, 어느 정도 강도가 증가하면, 전방이나 측방 산란도 용매에 의한 감쇠 이상으로 강도가 올라 검출되게 된다. 그러나 초기의 산란은 감쇠에 의해 검출되지 않고, 시료 셀(1) 직후에서의 후방 산란 검출에 뒤처진다.
상술한 실시의 형태에서는, 혼합 용액(W) 중에 조사된 조사광(Bm)의 후방 산란광의 변동 성분에 기초하여, 타방향의 산란에 비해 유의하게 빨리 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 타이밍에 관련되는 겔 입자의 생성 개시 시점(도 2 (b) Ⅱ 공정 P2에 상당)을 판별하는 태양이 나타나 있다.
일반적으로, 임상 시료에 있어서의 엔도톡신 측정은, 특히 구명 구급이라는 목적하에서는, 간편하고 빨리 측정할 수 있는 것이 제일로 요구된다.
종래법인 비탁 시간법에서 문제로 되어 있던 사항인 ‘감도의 악화에 의한 측정 불량’과 ‘측정 시간의 길이에 의한 불편’은 상술한 측정 방식으로 보다 확실히 해소된다.
즉, 본 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치는, 원리적으로, 균일하게 시료 및 리물루스 시약으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 교반함으로써, 균일한 반응하, 혼합 용액계 전체적으로서가 아니라, 국소에서의 미소한 겔 입자를 발생시키고, 그것을 레이저광과 같은 코히어런트인 균일한 광을 쬠으로써 산란을 일으키게 하여, 그것을 검출함으로써, 엔도톡신이 가해진 것에 의한 겔 입자의 출현이라는 졸상으로부터 겔상으로의 상변화에 관련되는 상변화점을 검출하고, 그 상변화점에 이를 때까지의 시간을 측정함으로써, 리물루스 시약에 있어서의 엔도톡신의 양을 추량(推量)하는 것이 가능하게 되는 것이다.
요약하면, 본 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치는, 혼합 용액계 전체의 변화(겔화)를 따르지 않고, 상변화를 일으킬 때까지의 타이밍(겔 입자의 생성 개시 시점)이 엔도톡신에 의존적인 반응인 것에 착안하여 구성된 것이고, 이에 의해 종래법인 비탁 시간법에 비해 엔도톡신을 빨리 검출할 수가 있는 것이다.
특히, 본 실시의 형태에서는, 산란광 중 입사 광원측의 후방으로 돌아가는 후방 산란광 성분에 착안하고 있는데, 이 이유는 이하와 같다.
일반적으로, 도 4 (a)에 나타내듯이, 입자에 예를 들면 레이저광 등의 코히어런트인 균일한 광(코히어런트 광)이 조사된 모델을 상정하면, 코히어런트 광은 입자의 존재에 의해 산란하는 것은 널리 알려져 있다. 이러한 산란 현상에 있어서, 입자의 크기와 산란광의 관계에 대해서 조사한 바, 단일광의 입사에 의해 생기는 산란광의 강도 및 방향성은 예를 들면 도 4 (b)에 나타내는 것 같은 관계를 볼 수 있다. 동 도에 있어서, 산란 현상으로서는 입자에 대해서 입사한 광과 동방향으로 발생하는 전방 산란, 입사한 광과 직각 방향으로 발생하는 측방 산란, 그리고 입사광과 반대 방향으로 발생하는 후방 산란이 있다.
이러한 산란 현상에 있어서는, 발생하는 에너지는 차치하고 입자의 크기와 산란의 방향을 생각하면, 입자가 커질수록 전방 산란이 주로 되고, 입자가 작으면 후방 산란을 포함한 전방위에의 산란이 관찰된다. 이러한 관찰 결과로부터 보면, 큰 입자를 파악하는데는 전방 산란이 유리하다고 할 수 있다. 한편, 무의 상태로부터 발생하여 성장한다는 현상하에서, 최초로 발생하는 작은 입자를 빨리 파악하기 위해서는, 어느 방향에서도 좋다고는 할 수 있지만, 에너지가 작은 것을 생각하면, 입자가 존재하는 용매 중에 있어서의 산란광의 감쇠를 고려했을 때에는, 그 감쇠가 적은(용매의 영향에 의한 흡수가 적은) 후방 산란이 적합하다고 생각된다.
특히, 본 실시의 형태에서의 겔 입자 측정 장치는, 무로부터 생성되는 입자(겔화라는 상변위)를 파악하기 때문에, 가능한 한 빨리 발생하는 미소한 입자를 검출한다는 목적에, 시료 셀 직후에서의 후방 산란에 의한 겔 입자 검출은 다른 어떠한 방향의 산란 검출보다도 뛰어난 것으로 추측된다.
이와 같이, 리물루스 시약에 의한 상변화에 의해 출현하는 미소 입자를, 빨리 감도 좋게 검출하는 것을 목적으로 하여, 후방 산란에 의한 검출 방식을 채용함으로써 상기 상변화의 타이밍을 측정하려고 하는 것이다.
요컨대, 미소 입자 출현에 의해 발생하는 산란광 중 후방 산란광 성분을 검출하는 방식은, 작은 입자를 빨리 검출할 수 있는 것과, 입자가 부유하는 용매에 의한 감쇠 없이 산란광을 검출할 수가 있는 것의 두 가지가 뛰어난 점이다. 또, 입사 광원으로부터의 입사광이 통과하는 광로를 기본적으로 설정할 필요가 없기 때문에, 장치의 기구도 보다 간단한 것으로 할 수가 있는 것도 뛰어난 점의 하나이다.
이하, 첨부 도면에 나타내는 실시의 형태에 기초하여 이 발명을 보다 상세하게 설명한다.
◎ 실시의 형태 1
본 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치는, 엔도톡신을 포함하는 시료가 주입되는 시료 셀(100)을 가지고, 예를 들면 시료의 목적 물질로서의 엔도톡신의 농도를 리물루스 시약을 이용한 겔화 반응에서 측정하는 것이다.
－겔 입자 측정 장치－
본 실시의 형태에 있어서, 겔 입자 측정 장치는 도 5에 나타내듯이 구성되어 있다.
동 도에 있어서, 시료 셀(100)은 미리 정해진 측정 스테이지에 설치되는데, 본 실시의 형태에서는, 항온조(115) 내에 배치되어 시료(S) 및 시약(도시하지 않음)으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 일정한 항온 환경(예를 들면 37℃)하에 두어, 측정 조건을 일정하게 하도록 되어 있다.
또, 부호 120은 시료 셀(100) 내의 혼합 용액(W)을 교반하기 위해서 시료 셀(100) 내의 자성 교반봉(121)을 구동하는 교반 구동 장치이고, 예를 들면 혼합 용액(W)에 대해서 일정한 교반 상태를 주어, 혼합 용액(W)을 균일하게 교반하면서 혼합 용액(W) 전체가 겔화하는 것을 억제하게 되어 있다.
특히, 본 예에서는, 교반 구동 장치(120)는 시료 셀(100) 내의 저벽에 내장된 자성체로 이루어지는 교반봉(stirrer bar)(121)에 대해서 자력에 의한 교반력을 작용시키는 교반 구동원(magnetic stirrer)으로서 구성되어 있다.
또한, 부호 130은 시료 셀(100)의 측주벽의 외측에 설치되고 또한 코히어런트인 광을 조사하는 레이저 광원이다.
본 예에 있어서, 레이저 광원(130)으로부터의 코히어런트인 광(Bm)은, 도 6 (a), (b)에 나타내듯이, 시료 셀(101)의 대략 직경 부분을 횡단하는 경로를 따라 조사되고 있고, 그 광경(d)은 생성되는 겔 입자경(예를 들면 0.2~2㎛ 정도)에 대해서 충분히 큰 값(예를 들면 5~20㎛ 정도)으로 설정된다.
또, 부호 140은 시료 셀(100)의 외부에서 레이저 광원(130)과 동일한 측에 설치되고, 레이저 광원(130)으로부터의 조사광(Bm)이 시료 셀(100) 내의 혼합 용액 중에 생긴 겔 입자에서 산란한 광 중 레이저 광원(130)측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 후방 산란광 검출기이다.
본 예에서는 후방 산란광 검출기(140)는 중앙부에 통공(142)이 개설된 통상(筒狀)의 검출기 본체(141)를 가지고, 이 검출기 본체(141)의 통공(142)에는 레이저 광원(130)으로부터 시료 셀(100) 내에 조사된 조사광을 통과시키도록 함과 아울러, 이 검출기 본체(141)의 시료 셀(100)의 측주벽 외면에 대향하여 링상 검출면(143)을 설치하고, 또한 이 검출기 본체(141) 내의 일부에는 링상 검출면(143)으로 검출된 산란광이 감지 가능한 포토다이오드 등의 수광 소자(도시하지 않음)를 조립해 넣도록 한 것이다.
여기서, 후방 산란광 검출기(140)의 검출 정밀도는, 레이저 광원(130)으로부터의 조사광(Bm)의 통과 면적 내에 1 내지 수개의 겔 입자의 유무에 의한 후방 산란 광량 변화를 검출 가능한 정도로 설정되어 있다.
또한, 후방 산란광 검출기(140)의 링상 검출면(143)은 시료 셀(100)의 측주벽 외면에 대해서 접촉 또는 비접촉 배치되어도 좋지만, 후방 산란광 성분의 검출성을 양호하게 유지한다는 관점에서 보면, 접촉 배치하는 태양이 바람직하다.
또한, 본 실시의 형태에서는, 시료 셀(100)의 외부에서 시료 셀(100)을 사이에 두고 상기 레이저 광원(130)의 반대측에는 미광 제거 부재(150)가 설치되어 있다.
이 미광 제거 부재(150)는 레이저 광원(130)으로부터 시료 셀(100) 내에 조사된 조사광(Bm)이 그대로 투과하여 시료 셀(100)의 반대측 주벽에 도달한 영역 및 그 주변 영역에 대응하여 광흡수재를 배치한 것이다.
이와 같이 시료 셀(100)의 일부에 미광 제거 부재(150)를 설치한 이유는 이하와 같다. 즉, 레이저 광원(130)으로부터의 조사광이 예를 들면 겔 입자에서 산란한 광 중 레이저 광원(130)측으로 돌아오는 후방 산란광 성분 이외의 산란광 성분, 혹은 발생한 겔 입자의 주위를 그대로 투과하는 투과광 성분은, 시료 셀(100) 내벽 등에서 반사되어 후방 산란광 검출기(140)를 향하는 미광 성분으로 될 수 있지만, 이들 중에서 특히 지향성이 높은 미광 성분이 투과광 성분 및 투과광 성분과 동일한 방향을 향하는 산란광 성분이기 때문에, 이들에 대응한 개소에 미광 제거 부재(150)를 설치하도록 한 것이다.
부호 160은 후방 산란광 검출기(140)로부터의 검출 출력을 취해 넣어, 예를 들면 도 8에 나타내는 데이터 해석 처리를 실행하는 데이터 해석 장치, 170은 데이터 해석 장치(160)로 해석된 해석 결과를 표시하는 디스플레이다.
이 데이터 해석 장치(160)는 CPU, ROM, RAM, I/O 인터페이스 등을 포함하는 컴퓨터 시스템으로 구성되어 있고, 예를 들면 ROM 내에 도 8에 나타내는 데이터 해석 처리 프로그램을 미리 격납해 두고, 후방 산란광 검출기(140)로부터의 검출 출력에 기초하여 CPU에서 데이터 해석 처리 프로그램을 실행하는 것이다.
또한, 후방 산란광 검출기(140)로부터의 검출 출력은 예를 들면 도시 외의 증폭기에 의해 전류 전압 변환된 후, AD 변환기에 의해 AD 변환되어 데이터 해석 장치(160)에 취해 넣어진다.
＜시료 셀의 구성예＞
다음에, 본 실시의 형태에서 이용되는 시료 셀(100)의 구성예, 및 시료 셀(100)에의 교반봉(121), 시료(S)의 도입예를 도 7 (a), (b)에 기초하여 상술한다.
동 도에 있어서, 시료 셀(100)은 예를 들면 유리 재료로 일체적으로 성형되고 또한 상부가 개구한 횡단면 원형의 바닥 있는 통상 용기(101)로 이루어지고, 그 상부에 플랜지부(102)를 형성함과 아울러, 이 플랜지부(102)의 하부에 잘록부(103)를 형성하고, 플랜지부(102) 및 잘록부(103)에는 소경공부(小徑孔部)(104)를 형성하고, 이 소경공부(104)보다 큰 직경의 대경공간부(105)를 내부에 형성한 것이다.
그리고, 이 시료 셀(100) 내에는 엔도톡신을 포함하는 시료와 겔화 반응을 일으키는 시약(106)이 예를 들면 동결 건조 분말상으로 미리 무균적이고 무엔도톡신적(“endotoxin free” 혹은 “pyrogen free”라고 일반적으로는 일컬어지고 있다)으로 수용됨과 아울러, 자성 재료를 이용한 교반봉(121)이 미리 수용된다.
또한, 이 시료 셀(100)의 소경공부(104)에는 고무 등의 탄성 재료로 이루어지는 밀봉 마개(108)가 끼워져 있다. 이 밀봉 마개(108)는 단면 대략 T자상으로 성형되어 있고, 그 두부(108a)가 시료 셀(100)의 플랜지부(102)에 놓이고, 그 각부(脚部)(108b)가 소경공부(104)에 밀접(密接)한 상태로 삽입되어 있다. 또한, 밀봉 마개(108)의 각부(108b)의 일부에는 절결(切缺)(108c)이 설치되어 있다.
또, 시료 셀(100)의 플랜지부(102) 및 밀봉 마개(108)의 두부(108a)는 예를 들면 알루미늄제의 캡상의 보지(保持) 커버(109)로 덮이고, 이 보지 커버(109)는 시료 셀(100)의 플랜지부(102)의 주벽에 끼워져, 밀봉 마개(108)를 외측으로부터 둘러싸 보지하게 되어 있다. 그리고, 이 보지 커버(109)의 예를 들면 중앙에는 밀봉 마개(108)의 두부(108a)에 면하여 공부(孔部)(109a)가 형성되어 있다.
또, 시료 셀(100)은, 도 7 (a), (b)에 나타내듯이, 통상 용기(101)의 소경공부(104)를 개방한 상태에서 시약(106) 및 교반봉(121)을 수용하고, 이 상태에서 통상 용기(101)의 소경공부(104)를 밀봉 마개(108)로 밀봉함과 아울러, 이 밀봉 마개(108)을 보지 커버(109)로 덮도록 한 것이다.
이러한 시료 셀(100)은 겔 입자 측정 장치의 부속품이나 측정 키트(kit)로서 사용자에게 공급된다.
그리고, 본 태양의 시료 셀(100)의 통상 용기(101)에의 시료(S)의 도입법으로서는, 예를 들면 보지 커버(109)의 공부(109a)를 이용하여 밀봉 마개(108)에 주사바늘과 같은 천공구(도시하지 않음)로 천공하고, 이 천공을 통해서 주입기(도시하지 않음)로 시료(S)를 주입하도록 한 것을 들 수 있다. 또한, 시료(S)의 도입을 용이하게 하기 위해, 통상 용기(101) 내가 대기압에 대해서 소정의 부압 레벨을 유지하도록 밀봉 마개(108)의 밀봉 사양을 설정해도 좋다.
다음에, 본 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 작동에 대해서 설명한다.
본 실시의 형태에 있어서, 도 5에 나타내듯이, 시료 셀(100)에 엔도톡신을 포함하는 시료(S)를 주입한 후, 도시 외의 스타트 스위치를 온 조작하면, 겔 입자 측정 장치에 의한 측정 시퀀스(sequence)가 개시된다.
이 측정 시퀀스는 교반 구동 장치(120)로 교반봉(121)이 회전되어, 시료 셀(100) 내의 시료(S) 및 리물루스 시약으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 교반한다. 이 때문에 혼합 용액(W) 전체가 균일하게 교반됨과 아울러, 혼합 용액(W) 전체로서는 겔화하는 것이 억제된다.
또한, 측정 시퀀스는 레이저 광원(130)으로부터 코히어런트인 광(Bm)을 시료 셀(100) 내의 혼합 용액(W)에 조사하고, 혼합 용액(W) 중에서 산란한 광 중 레이저 광원(130)측 방향을 향하는 후방 산란광 성분을 후방 산란광 검출기(140)로 검출함과 아울러, 후방 산란광 검출기(140)의 검출 출력을 데이터 해석 장치(160)에 취해 넣는다.
한편, 시료 셀(100) 내의 혼합 용액(W) 중에서는, 리물루스 시약에 엔도톡신의 자극이 전해져, 도 3에 나타내는 것 같은 리물루스 반응이 일어나고, 혼합 용액(W) 전체의 겔화가 억제된 상태에서 겔 입자(G)가 순차 생성되어 간다.
본 실시의 형태에서는, 레이저 광원(130)으로부터의 코히어런트인 광(Bm)의 통과 면적 내에 겔 입자(G)가 예를 들면 1개 생성되었을 때에, 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 변화하는 상변화점의 타이밍에 관련되는 겔 입자(G)의 생성 개시 시점으로서 파악되는 것이다.
이러한 반응 과정에 있어서, 데이터 해석 장치(160)는, 예를 들면 도 8에 나타내듯이, 후방 산란광 검출기(140)로부터의 검출 출력을 산란 광량 데이터(디지털 데이터)로서 읽어들인 후, 평균화·필터링화 처리를 행하여 산란 광량 데이터의 변동 성분을 계측한다.
이어서, 산란 광량 데이터의 변동 성분에 기초하여, 후방 산란광 검출기(140)로 검출된 산란 광량 데이터의 증가 변화점(도 2 (c) Ⅱ 공정 P2에 상당)을 추출하고, 미리 규정되어 있는 검량선을 참조함으로써 시료(S)의 엔도톡신 농도(ETX 농도)를 결정하여 디스플레이(170)에 표시한다.
본 예에서는 검량선은 엔도톡신 농도(ETX 농도)와 산란 광량 데이터의 증가 변화점에 이를 때까지의 시간 역치의 관계를 나타내는 것이고, 산란 광량 데이터의 증가 변화점에 이르는 시간과 검량선의 상관에 기초하여 엔도톡신 농도(ETX 농도)가 결정된다. 또, 디스플레이(170)에는 엔도톡신 농도(ETX 농도) 이외에, 산란 광량 데이터의 시계열 데이터, 산란 광량 데이터의 변동 성분의 시계열 계측 데이터 등의 데이터가 전환 표시되게 되어 있다.
＜검량선의 작성예＞
여기서, 본 실시의 형태에서 채용된 검량선의 작성예에 대해서 설명한다.
본 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 미리 정해진 실험 조건을 예를 들면 이하와 같이 정하고, 여러 가지 엔도톡신 농도(예를 들면 10, 1, 0.1pg/ml)의 샘플 시료를 첨가했을 때의 리물루스 시약에 대해서, 겔 입자 측정 장치로 후방 산란광 검출기(140)에 의한 산란 광도(산란 광량 데이터)의 변화를 조사한 것이다.
본 예에서 이용되는 실험 조건은 이하와 같다.
ㆍ레이저 광원(130)： 적색광 또는 청색광
ㆍ후방 산란광 검출기(140)： 포토다이오드
ㆍ교반봉(stirrer bar)(121)의 회전수： 1000rpm
ㆍ항온 조건： 37℃
도 9 (a)는 엔도톡신 농도 10pg/ml, 1pg/ml, 0.1pg/ml의 샘플 시료에 대한 산란광 강도에 대해 각각의 시간 경과에 따라 그린 것이다. 또한, 도 9 (a)의 종축은 산란광 강도(U)(그래프 중의 최대 산란광 강도 스케일을 Uy로 표기), 횡축은 반응 시간(그래프 중의 최대 반응 시간 스케일을 tx［예를 들면 100min］로 표기)을 나타낸다.
동 도에 있어서, 각 조건의 산란광 강도의 변화는 모두 대략 0의 일정한 레벨을 유지하는 부분이 어느 시간이 되어 증가하는 경향을 나타내고 있다. 이 산란광 강도의 증가 변화점은 겔 입자의 생성 개시 시점(엔도톡신을 포함하는 샘플 시료가 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 타이밍)에 상당하고, 겔화 개시시에 의한 증광을 의미하는 것으로 상정된다.
이 겔화 개시시를 구하기 위해서, 본 실시의 형태에서는, 도 9 (a)의 그래프에 있어서, 수동으로, 일정 산란 광도 부분을 근사한 직선(통상은 0)과 산란광 강도가 증가 경사져 가는 변화 부분을 근사한 직선의 교점을 구하여, 각각 겔화 개시 시간(반응 시간) t(10), t(1), t(0.1)을 구하였다.
또한, 본 실시의 형태에서는, 도 9 (a)의 그래프로부터 구한 겔화 개시 시간 t(10), t(1), t(0.1)의 값을 이용하여 검량선을 작성하도록 하였다(도 9 (b) 참조).
도 9 (b)에 있어서, 검량선은, X축을 엔도톡신 농도인 ETX 농도(log 변환), Y축을 겔화 개시 시간으로 하여 각 겔화 개시 시간값을 그리고, 이들 값에 대해서 최소자승법에 의한 직선을 그림으로써 구해지는 것이다. 이때 각 엔도톡신 농도의 샘플 시료에 대한 겔화 개시 시간값으로는 직선 관계가 얻어져 상관계수가 높은 상관이 나타난다.
또한, 본 실시의 형태에서 구한 검량선의 일례를 나타내면 이하와 같다.
엔도톡신 농도(pg/ml) 겔화 개시 시간(min.)
　　 　10pg/ml： t(10)=12(min.)
　　　　 1pg/ml： t(1)=20(min.)
　 　0.1pg/ml： t(0.1)=27(min.)
이에 반해, 와코순약공업주식회사제의 비탁 시간 분석법을 채용한 엔도톡신 키트(겔화 반응 측정 장치)를 이용하여, 엔도톡신 농도와 겔화 시간을 조사한 바, 이하와 같은 결과가 얻어졌다.
엔도톡신 농도(pg/ml) 겔화 시간(min.)
　　　 10.0　　　　　 　　18.0
　　　 　1.0　　　　　 　 41.8
　　　 　0.5　　　 　　 　 56.3
　　　 　0.1　　　 　 123.7
이와 같이, 본 실시의 형태에 있어서는, 겔 입자 측정 장치는 시료(S) 및 리물루스 시약으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 소정의 항온 환경하에서 교반하고, 혼합 용액(W) 중에 산생(産生)하는 Coagulin 입자로 이루어지는 겔 입자(G)의 출현에 의해 조사광(Bm)이 일부 차단되어 산란하는 광 중 레이저 광원(130)측의 후방으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하여, 겔화의 개시 시기를 포착하려고 하는 것이다.
즉, 본 실시의 형태에서는 후방 산란광 성분을 검출하는 방식을 채용하고 있는데, 다른 산란광 성분을 검출하는 방식에 비해, 겔 입자의 생성 개시 시점을 파악하는데 있어서 유효하다.
특히, 본 예에서는 후방 산란광 검출기(140)의 검출 정밀도를 고감도로 하기 위해, 레이저광이라는 코히어런트이고 강한 광을 이용하고, 또 미세한 변화를 검출하기 위해, 저농도에서의 변화에서는 특히 산란한 광 중 후방 산란광 이외의 산란광과 겔 입자의 주위를 그대로 투과한 투과광이 미광으로서 후방 산란광 검출기(140)측을 향하지 않도록, 미광 제거 부재(150)로 미광이 제거되기 때문에, 후방 산란광 검출기(140)에는 레이저 광원(130)으로부터의 조사광(Bm) 중 겔 입자에서 산란한 후방 산란광 성분만이 입사하게 되어, 그만큼 후방 산란광 변화가 정확하게 검출된다.
◎ 변형 형태
본 실시의 형태에서는 시료 셀(100)의 외부에서 당해 시료 셀(100)을 사이에 두고 레이저 광원(130)과 반대측에 미광 제거 부재(150)를 배치하도록 하고 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 도 10 (a)에 나타내듯이, 시료 셀(100)의 주위를 둘러싸도록 통상 커버(151)를 설치하고, 이 통상 커버(151)의 내면을 예를 들면 흑색의 광흡수재로 덮음과 아울러, 통상 커버(151)의 일부에는 후방 산란광 검출기(140)를 장착하기 위한 부착공(152)을 개설하고, 이 부착공(152)에 후방 산란광 검출기(140)를 장착하고, 후방 산란광 검출기(140)의 통공(142)을 통해서 레이저 광원(130)으로부터의 조사광(Bm)을 통과시키도록 해도 좋다.
또, 본 실시의 형태에서는 시료 셀(100)은 투과성이 있는 재료로 구성되어 있지만, 시료 셀(100) 내의 혼합 용액(W) 중에서의 광의 투과를 거의 요구하지 않기 때문에, 시료 셀(100) 중 레이저 광원(130) 및 후방 산란광 검출기(140)의 설치 개소에 대응한 일부만 투과성을 가지는 입사부로 해 두면, 시료 셀(100)의 다른 부위에 대해서는 비투과성의 재료로 구성해도 좋고, 비투과성의 도료를 도포하도록 해도 좋다.
또한, 본 실시의 형태에서는 레이저 광원(130)과 후방 산란광 검출기(140)를 별개의 유니트로서 구성하고 있지만, 예를 들면 도 10 (b)에 나타내듯이, 레이저 광원(130)의 주위를 둘러싸도록 도광 부재로서의 다수의 광투과성 유리 섬유(145)를 묶어, 각 유리 섬유(145)의 시료 셀(100)측의 일단부를 광도입면(146)으로서 기능시킴과 아울러, 각 유리 섬유(145)의 타단부에 대향하여 검출면이 배치되도록 후방 산란광 검출기(140)를 설치하고, 레이저 광원(130), 후방 산란광 검출기(140) 및 도광 부재로서의 유리 섬유(145)를 이용하여 광학 검출 유니트를 일체적으로 구성하도록 해도 좋다.
또, 미광 제거 부재(150)는 시료 셀(100)의 외부에 설치하는 태양에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 도 10 (b)에 나타내듯이, 시료 셀(100)의 내벽 주면(周面)에 미광 제거 부재(150)로서 미소 조면(155)을 형성하고, 이 미소 조면(155)에서 레이저 광원(130)으로부터 조사된 조사광 중 미광 성분을 난반사시킴으로써 감쇠시키도록 해도 좋다.
또한, 본 실시의 형태에서는 미광 제거 부재(150)를 설치하고 있지만, 반드시 미광 제거 부재(150)를 이용할 필요는 없고, 예를 들면 미리 미광 성분이 어느 정도 영향을 줄지를 기존의 엔도톡신 농도의 샘플 시료를 이용하여 실측하고, 이 실측값에 기초하여 예를 들면 후방 산란광 검출기(140)에 의한 검출 출력으로부터 실측한 미광 성분을 보정하도록 해도 좋다.
또, 본 실시의 형태에서는 1검체(시료(S))분의 시료 셀(100)에 대한 겔 입자 측정 장치를 나타내고 있지만, 복수의 검체(시료)를 동시에 처리한다는 요청하에서는, 예를 들면 복수의 시료 셀(100)을 일체화한 멀티 시료 셀을 준비하고, 각 시료 셀에 대응하여 각각 레이저 광원(130), 후방 산란광 검출기(140)를 배치하고, 복수의 검체(시료)를 동시에 측정할 수 있도록 하면 좋다.
또한, 실시의 형태 1에서는 측정 대상 물질을 엔도톡신으로 하는 것이 개시되어 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 동일한 측정 하드웨어로, 또한 동일 내지는 유사한 리물루스 시약을 이용하여, 측정 대상 물질을 β－D－글루칸으로 하는 것도 가능하다.
◎ 실시의 형태 2
도 11은 본 발명이 적용된 겔 입자 측정 장치의 실시의 형태 2의 주요부를 나타낸다. 또한, 실시의 형태 1과 동일한 구성 요소에 대해서는 실시의 형태 1과 동일한 부호를 붙이고 그 상세한 설명은 생략한다.
동 도에 있어서, 겔 입자 측정 장치는 실시의 형태 1과 대략 마찬가지로, 시료 셀(100)의 외부에 레이저 광원(130)을 가지고, 이 레이저 광원(130)과 동일한 측에 상기 후방 산란광 검출기(140)를 설치한 것이지만, 실시의 형태 1과 달리 시료 셀(100)의 외부에서 예를 들면 시료 셀(100)을 사이에 두고 상기 후방 산란광 검출기(제1의 산란광 검출기에 상당)(140)와는 반대측에 제2의 산란광 검출기(180)를 설치하고, 제1의 산란광 검출기(140)뿐만 아니라 제2의 산란광 검출기(180)의 검출 출력을 데이터 해석 장치(160)에 취해 넣고, 제1의 산란광 검출기(140)에 의한 검출 출력에 기초하여 실시의 형태 1과 마찬가지로 겔 입자의 생성 개시 시점을 판별함과 아울러, 제2의 산란광 검출기(180)에 의한 검출 출력(전방 산란광 출력)에 기초하여 겔 입자의 생성 개시 시점 이외의 겔 입자의 생성 상태 정보(예를 들면 겔 입자의 생성량 등)를 판별하도록 한 것이다.
본 예에서는 제2의 산란광 검출기(180)에 있어서, 후방 산란광 성분 이외의 산란광 성분을 검출하도록 하고 있지만, 제2의 산란광 검출기(180)에는 예를 들면 투과광 성분도 합쳐서 검출될 가능성이 있기 때문에, 데이터 해석에 즈음하여, 제2의 산란광 검출기(180)의 검출 대상으로서 투과광 성분을 제거하고 싶다는 요청이 있는 경우에는, 산란광 성분과 투과광 성분은 위상이 어긋나는 것을 이용하여 편향 필터(190)를 설치하고, 투과광 성분을 제거하도록 하면 좋다.
또, 이러한 편향 필터(190)를 이용하지 않는 경우에는, 제2의 산란광 검출기(180)는 투과광 성분이 포함된 산란광 성분을 검출하게 되지만, 데이터 해석 장치(160)측에서 투과광 성분이 포함되는 것을 고려하여 산란광 성분을 해석하도록 해도 좋고, 혹은 데이터 해석 장치(160)측에서 투과광 성분을 제거하도록 보정한 후에 산란광 성분을 해석하도록 해도 좋다.
또한, 제2의 산란광 검출기(180)는 기본적으로 산란광 성분을 단독 혹은 투과광 성분과 함께 검출하는 것이지만, 예를 들면 산란광 성분 제거용의 편향 필터를 개재시키도록 하면, 산란광 성분을 포함하지 않는 투과광 성분만을 해석하는 것도 가능하다.
또, 본 예에서는 제1의 산란광 검출기(140)에 의한 검출 출력을 이용하여 겔 입자의 생성 개시 시점을 판별하고, 제2의 산란광 검출기(180)를 이용하여 겔 입자의 생성 개시 시점 이외의 겔 입자의 생성 상태 정보를 판별하도록 하고 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 제1의 산란광 검출기(140) 및 제2의 산란광 검출기(180) 양방의 검출 출력을 이용하여 겔 입자의 생성 개시 시점 이외의 겔 입자의 생성 상태 정보를 판별하도록 해도 좋다. 이 경우 제1의 산란광 검출기(140) 및 제2의 산란광 검출기(180)의 검출 출력의 차분 정보를 이용함으로써, 예를 들면 산란광과 시료에 유래하는 비특이적인 탁도의 증가나 미광의 발생, 또는 시료 용매에 유래하는 산란광의 흡수에 의한 감쇠의 정도로부터 시료 용매의 성질을 검량할 수 있게 되어, 겔 입자의 생성 상태 정보를 보다 상세히 해석하는 것이 가능하다.
또한, 본 실시의 형태에서는 제2의 산란광 검출기(180)는 제1의 산란광 검출기(140)에 대해서 시료 셀(100)의 반대측에 설치되어 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 제2의 산란광 검출기(180)의 설치 개소는 제1의 산란광 검출기(140)와 다른 부위이면 임의의 부위에 설치해도 지장 없다. 예를 들면 제1의 산란광 검출기(140)에 대해서 시료 셀(100)의 주위 방향으로 90°치우친 부위에 설치하도록 하면, 도 4 (b)에 나타내는 측방 산란광을 검출하는 것이 가능하다.
실시예
◎ 실시예 1
본 실시예 1은 물 또는 전혈(全血) 용액에 기존 농도의 엔도톡신을 첨가한 시료 샘플을 복수 준비하고, 각 시료 샘플에 대해, 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 구현화한 모델 장치를 이용하여 후방 산란광의 변화를 시계열로 측정한 것이다.
본 예에 있어서의 시료 샘플은 이하와 같다.
시료 샘플 I=물에 표준품 엔도톡신 10pg/ml를 첨가한 시료 샘플
시료 샘플 Ⅱ=전혈용혈 시료에 표준품 엔도톡신 10pg/ml를 첨가한 시료 샘플
시료 샘플 Ⅲ=전혈용혈 시료에 엔도톡신을 첨가하지 않는 시료 샘플
시료 샘플 I~Ⅲ에 대한 결과를 도 12 (a), 도 13 (a), 도 14 (a)에 나타낸다.
또한, 각 도의 종축은 상대 산란광 강도, 횡축은 시간(sec.)이다.
◎ 비교예 1
본 비교예 1은 실시예 1에서 이용되는 시료 샘플 I, Ⅱ, Ⅲ과 마찬가지의 시료 샘플에 대해, 실시의 형태 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 구현화한 모델 장치(편향 필터(190) 장비)를 이용하여, 후방 산란광과는 반대측의 전방을 향하는 전방 산란광의 변화를 시계열로 측정한 것이다.
시료 샘플 I~Ⅲ에 대한 결과를 도 12 (b), 도 13 (b), 도 14 (b)에 나타낸다.
또한, 각 도의 종축은 상대 산란광 강도, 횡축은 시간(sec.)이다.
◎ 비교예 2
본 비교예 2는 실시예 1에서 이용되는 시료 샘플 I, Ⅱ, Ⅲ과 마찬가지의 시료 샘플에 대해, 실시의 형태 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 구현화한 모델 장치를 이용하여, 후방 산란광과는 반대측의 전방을 향하는 투과광(본 예에서는 전방 산란광을 포함한다)의 변화를 시계열로 측정한 것이다.
시료 샘플 I~Ⅲ에 대한 결과를 도 12 (c), 도 13 (c), 도 14 (c)에 나타낸다.
또한, 각 도의 종축은 상대 산란광 강도, 횡축은 시간(sec.)이다.
＜실시예 1과 비교예 1, 2의 대비＞
실시예 1과 비교예 1을 대비해 보면, 모두 비교예 2에 있어서의 투과광 감소로부터 본 시료 샘플의 상변화의 타이밍과 비교하여, 비교예 1에 관계되는 전방 산란광에 의한 시료 샘플의 상변화의 타이밍에 상당하는 겔화 개시 시점(산란 광도의 증가 변화점)은, 실시예 1에 관계되는 후방 산란광에 의한 시료 샘플의 상변화의 타이밍에 상당하는 겔화 개시 시점(산란 광도의 증가 변화점)보다도 검출 개시가 늦는 경향(약 10~40초)이 보인다.
또, 임상 시료 그 자체에 동일한 저농도의 엔도톡신 측정의 데이터(도 14 (a)~ (c) 참조)를 보면, 예를 들면 비교예 2의 경우에는 시료 샘플 Ⅲ 중에 있어서 불명한 침전이나 응집 등에 의한 방해로, 투과 광량에 의한 정량은 어렵고, 겔화 개시 시간은 물론이고 시료 샘플 Ⅲ의 혼합 용액계의 반응도 판정할 수 없는 상태이지만, 비교예 1의 전방 산란광에 의한 검출 방식에서는 겔화 개시 시점이 현저하게 검출되어 있다.
그러나, 비교예 1의 전방 산란광에 의한 검출 방식에서는, 시료 용액을 통과하는 과정에서 산란광 성분이 감쇠하기 때문에, 겔 입자의 발생에 대한 검출 타이밍이 실시예 1(14 (a))에 비해 늦어질 뿐만 아니라, 겔 입자의 성장에 대한 검출 타이밍도 늦어지는 결과, 전방 산란광에 의한 검출 방식은 후방 산란광에 의한 검출 방식에 비해 현저하게 늦는(약 200~300초) 것이 분명하고, 그만큼 후방 산란광에 의한 방식의 우위성이 이해된다. 이 경향은 저농도 엔도톡신(즉 겔 입자 발생이 적은 시료)에 있어서 더 현저하다.
◎ 실시예 2
본 실시예는 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 데이터 해석 처리의 하나인 평균화 처리의 구체적인 예를 나타낸다.
도 15 (a)는 후방 산란광 검출기(140)로 후방 산란광의 변화를 그린 실측값 데이터(BS)이다(도 14 (a)에 상당).
도 15 (a)에 있어서 실측값 데이터의 전후 3점을 평균화한 평활화 처리(Smooth3)를 도 15 (b)에, 또 도 15 (a)에 있어서 실측값 데이터의 전후 5점을 평균화한 평활화 처리(Smooth5)를 도 15 (c)에 각각 나타낸다.
도 15 (b)에 의하면 실측값 데이터보다도 폭이 좁은 데이터군으로 되고, 또한 도 15 (c)에 의하면 도 15 (b)보다도 더 폭이 좁은 데이터군으로 모이는 것이 이해된다.
이와 같이, 실측값 데이터가 어느 폭으로 흩어졌다고 해도, 소망의 평활화 처리를 함으로써 실측값 데이터를 평균화하는 것이 가능하게 되고, 데이터 해석 처리에 즈음하여 유효하다는 것이 이해된다.
＜산업상의 이용 가능성＞
본 발명은 리물루스 시약을 이용한 엔도톡신이나 β－D－글루칸 등을 측정 대상으로 하는 겔 입자 측정 장치를 비롯하여, 겔화 반응에 의해 겔 입자가 생성 가능한 목적 물질을 측정 대상으로 하는 측정 장치에 널리 적용된다.
예를 들면 혈액 응고 반응이나 항원 항체 반응에 있어서 적용하는 것이 가능하다.
－혈액 응고 반응(도 16)－
혈장 중의 프로트롬빈은 여러 가지 혈액 응고 인자의 활성화를 거쳐 트롬빈으로 되고, 피브린이 응집한다.
이 점에 대해서 보충하면, 혈장의 응고계는 이하의 개시기, 증폭기, 전파기를 거쳐 진행한다.
＜개시기＞
(외인성 경로)
혈액 응고 캐스케이드(cascade)에 있어서, 세포가 상해를 받으면, 조직 인자가 제VⅡa 인자(제VⅡ 인자가 활성화한 것)와 결합한다.
여기서, 제VⅡa 인자는 제IX 인자를 활성화하여 제IXa 인자로 한다. 또, 제IXa 인자는 제X 인자를 활성화하여 제Xa 인자로 한다.
(내인성 경로)
혈액이 음으로 대전한 고체(예를 들면, 암석이나 모래)에 접하면, 프리칼리크레인과 고분자량 키니노겐이 제XⅡ 인자를 활성화하여 제XⅡa 인자로 한다. 또, 제XⅡa 인자는 제XI 인자를 활성화하여 제XIa 인자로 한다. 또, 제XIa 인자는 제IX 인자를 활성화하여 제IXa 인자로 한다.
＜증폭기＞
트롬빈은 제XI 인자를 활성화하여 제XIa 인자로 한다. 제XIa 인자는 제IX 인자를 활성화하여 제IXa 인자로 한다. 또, 트롬빈 자체도 제V 인자와 제VⅢ 인자를 활성화시켜 각각 제Va 인자, 제VⅢa 인자로 한다. 또한 트롬빈은 혈소판을 활성화하여 제XIa 인자, 제Va 인자, 제VⅢa 인자를 혈소판 표면에 결합시킨다.
＜전파기＞
혈소판 표면에 결합한 제VⅢa 인자와 제IXa 인자는 제X 인자를 활성화하여 혈소판 표면에 결합시킨다. 또, 혈소판 표면에 결합한 제Xa 인자와 제XIa 인자는 프로트롬빈을 순차로 트롬빈으로 변화시킨다. 또한, 대량의 트롬빈이 혈장 중의 피브리노겐을 분해하여 피브린 모노머로 한다. 피브린 모노머는 제XⅢ 인자에 의해 가교되어 피브린 폴리머로 되고, 다른 혈구를 말려들게 하여 혈병(딱지)으로 된다.
이것은 생체에 있어서는 혈액 응고로 상처를 막는 등 유용한 반응이지만, 한편 미소한 응집괴가 혈류 중에 발생하면, 혈전으로 되어 여러 가지 미소 혈관을 막아 뇌경색·심근경색·폐색전 등 위독한 임상 증상을 일으킨다. 따라서, 임상적으로 ‘응집을 일으키기 쉬움’을 구하는 것은 이 발생을 예지하는데 있어서 중요한 것으로 된다. 종래 응집 시간의 연장은 ‘피가 멈추지 않는다’는 걱정 하에 측정되고 있었지만, ‘피가 굳어지기 쉬운’ 것은 측정하는 방법이 확립되어 있지 않다. 그것을 적당한 희석된 혈장과, 일정량의 응집을 촉진하는 시약(예를 들면 ADP·콜라겐·에피네프린 등)과 혼합함으로써 응집의 정도를 측정하는 것이, 이 입자 계측의 방법으로 가능하다고 예상된다.
이 때문에 본 예에서는, 시료 셀(100) 내에 자성 교반봉(121)과 함께, 일정량의 ADP 등을 무균적으로 넣어 동결 건조 등의 처리를 행한 시료 셀(100)을 제작함으로써, 임상 현장에 있어서 적당하게 희석한 혈장을, 상부의 밀봉 마개(108)를 통하여 도입하고, 응집괴의 발생 시간 즉 겔화 개시 시간을 실시의 형태 1과 마찬가지의 겔 입자 측정 장치로 측정함으로써, 응집능의 정도를 측정하는 것이 가능하게 된다.
－항원 항체 반응(도 17)－
도 17 (a)에 나타내듯이, 여러 가지 항원(300)에 대한 특이 항체(310)는 회합함으로써 불용성의 침전으로서 그 항원(300)의 불활성화를 촉진시키고, 생체의 방어 작용을 담당하고 있다. 한편 이 현상을 이용하여, 특이 항체(310)를 미리 준비해 두면, 발생하는 침전은 존재하는 항원(300)의 양에 비례하기 때문에, 여러 가지 항원(300)을 정량하는 방법이 고안되어 있다. 그러나, 침전시키는(또는 항원 항체의 회합을 촉진하는)데는 시간이 걸리기 때문에, 여러 가지 검출법이나 예민한 검출 장치가 개발되어 왔다. 항원 항체 반응의 침전 형성을 겔화의 입자 형성으로 파악하면, 입자를 안정하게 형성시키고, 그것을 계측하는 겔 입자 측정 장치는 응용 가능하다고 생각된다.
특히, 도 17 (b)에 나타내듯이, 항체(330)를 수지 등의 미크로비즈(320) 등에 결합시키고, 그 비즈 표면에서 항원(300)과의 사이에 항원 항체 반응을 일으키게 하는 타입의 검출 반응에는, 입자 형성의 패턴이 변화함으로써 파악하는 것은 용이하고, 그 방법에도 응용할 수 있다.
그 때문에 시료 셀(100)에는, 자성 교반봉(121)과 함께, 일정량의 항체(330) 또는 미크로비즈(320)에 결합시킨 항체 용액을 무균적으로 넣어 둔다. 이 경우 항체(330)의 활성을 보지할 필요로부터, 동결 건조가 아니라 용액으로서 보존하는 편이 좋다고 생각된다. 측정을 행하는 경우에는, 일정하게 희석한 혈장 등 검액을 상부의 밀봉 마개(108)를 통하여 도입하고, 항원 항체 반응에 의한 응집괴의 발생 속도를, 예를 들면 실시의 형태 1의 겔 입자 측정 장치로 측정한다. 특히, 겔 입자 생성의 속도로서 파악하기 때문에 투과광의 감소 속도를 계측한다.
실시의 형태 1에서 나타낸 엔도톡신 활성 반응, 혈액 응고 반응, 항원 항체 반응의 3가지 사용 방법에서 공통되는 것은, 물에 균일하게 녹아 있는 분자가 회합하여 불용성의 입자로 되는 반응을 파악하여 정량하려고 하는 것이지만, 가용성으로부터 불용성으로 될 때, 반응의 편향(반응의 중심으로 되는 효소 등의 주위에 반응 분자가 국부적으로 부족한) 현상이 생긴다. 올바르게 반응을 진행시켜 그 속도를 측정하기 위해서는, 이 편향이 이론적으로는 ‘0(제로)’이 아니면 안된다. 그 해결법은 ‘교반한다’라는 것이 된다. 이 측정법의 중심은, 용액을 균일하게 교반하고, 입자 형성을 안정하게 행하게 하는 것을 의도한 것에 있다.
1…시료 셀 2…교반 수단
3…입사 광원
4…후방 산란광 검출 수단(제1의 산란광 검출 수단)
5…산란광 변동 계측 수단 6…겔 입자 생성 판별 수단
7…항온조 8…미광 제거 수단
9…표시 수단 10…제2의 산란광 검출 수단
G…겔 입자 S…시료
R…시약 W…혼합 용액
Bm…광

Claims (10)

  1. 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서,
    적어도 일부에 광이 입사되는 입사부를 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀과,
    이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과,
    상기 시료 셀의 입사부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대해서 코히어런트인 광을 조사시키는 입사 광원과,
    상기 시료 셀의 입사부의 외부에서 상기 입사 광원과 동일한 측에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중에서 산란한 광 중 상기 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 후방 산란광 검출 수단과,
    이 후방 산란광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 산란광의 변동 성분을 계측하는 산란광 변동 계측 수단과,
    이 산란광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상변화하는 시점에 관련되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    입사 광원은 레이저 광원인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    시료 셀은, 셀 용기 내에 시료 및 시약 용액을 직접 교반 가능한 교반 수단을 내장한 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    시료 셀은 항온조 내에 설치되는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  5. 제1항에 있어서,
    시료 셀은, 그 자체 또는 그 주위에, 입사 광원으로부터의 조사광 중 상기 혼합 용액 중에서 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분 이외의 투과 또는 산란으로 생기는 미광 성분이 제거시켜지는 미광 제거 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  6. 제1항에 있어서,
    겔 입자 생성 판별 수단에 의한 판별 결과가 표시되는 표시 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  7. 제1항에 있어서,
    후방 산란광 검출 수단은, 입사 광원으로부터 시료 셀에 입사되는 입사광을 둘러싸는 링상 검출면을 가지는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    후방 산란광 검출 수단은, 입사 광원으로부터 시료 셀에 입사되는 입사광을 둘러싸는 광투과성 섬유속으로 이루어지는 도광 부재를 가지고, 이 도광 부재의 일단을 광도입면으로서 기능시킴과 아울러, 상기 도광 부재의 타단에 대응하여 검출면을 배치하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 혼합 용액 내에서 산란한 광 중 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분을 검출하는 후방 산란광 검출 수단인 제1의 산란광 검출 수단과,
    상기 혼합 용액 내에서 산란한 광 중 입사 광원측 방향으로 돌아가는 후방 산란광 성분 이외의 산란광 성분을 검출하는 제2의 산란광 검출 수단과,
    이들 후방 산란광 검출 수단에 의한 검출 출력에 기초하여 각각의 산란광의 변동 성분을 계측하는 산란광 변동 계측 수단을 가지고,
    상기 겔 입자 생성 판별 수단은, 제1의 산란광 검출 수단의 검출 출력의 변동 성분의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점을 판별하고,
    제1의 산란광 검출 수단 및 제2의 산란광 검출 수단의 검출 출력 또는 제2의 산란광 검출 수단의 검출 출력의 변동 성분의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점 이외의 겔 입자의 생성 상태 정보를 판별하는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  10. 제1항에 있어서,
    측정 대상인 목적 물질이 엔도톡신이고, 이것을 겔화하는 시약이 리물루스 시약인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
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