KR101255420B1 - 겔 입자 측정 장치 - Google Patents

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Abstract

겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 겔 입자의 생성 개시점을 고감도로 계측한다. 겔 입자 측정 장치는 시료(S) 및 시약(R)이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀(1)과, 이 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 교반하는 교반 수단(2)과, 시료 셀(1) 내의 혼합 용액(W)에 대하여 코히어런트 광(B)을 조사시키는 코히어런트 광원(3)과, 시료 셀(1)의 외부에서 코히어런트 광원(3)의 반대측에 설치되고, 시료 셀(1) 내의 혼합 용액(W) 중을 투과한 광을 검출하는 투과광 검출 수단(4)과, 이 투과광 검출 수단(4)의 검출 출력에 기초하여 투과광의 변동 성분을 계측하는 투과광 변동 계측 수단(5)과, 이 투과광 변동 계측 수단(5)의 계측 결과에 기초하여 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 혼합 용액(W) 내의 겔 입자의 생성 상태를 적어도 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단(6)을 구비한다.

Description

겔 입자 측정 장치{GEL PARTICLE MEASURING APPARATUS}
본 발명은 겔(gel)화 반응에 의해 측정 대상의 시료 중의 엔도톡신(endotoxin)이나 β-D-글루칸 등의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치에 관한 것이다.
엔도톡신(세포내 독소)이라고 불리는 것은, 주로 그램(Gram) 염색에 물들지 않는(그램 음성) 세균류의 균체의 파편으로, 그 성분은 리포폴리사카라이드라고 불리는 지질 다당류, 구체적으로는 리피드 A(Lipid A)라고 불리는 지질과 다당쇄가 2-케토-3-데옥시옥톤산(KDO)을 개재하여 결합한 리포다당(LPS)이지만, 거기에 포함되는 리피드 A(Lipid A)라고 불리는 지질 구조 부분이 세포의 수용체와 결합하여 염증을 일으키고, 많은 경우 여러 가지 중하고 심한 임상 증상을 일으킨다. 이와 같이 엔도톡신은 패혈증이나 균혈증이라는 치사율이 높은 임상 증상의 원인으로 되는 물질이기 때문에, 체내에 들어간 엔도톡신의 추정을 하는 것은 임상적으로 요구가 높은 것이다.
또, 의약품(주사제 등)이나 의료용구(혈관 카테터(catheter) 등)는 엔도톡신에 의한 오염이 없는 것(파이로젠프리(pyrogen free))이 중요하고, 세균을 이용하여 조제한 의약품(조환(組換) 단백질, 유전자 치료에 이용하는 DNA 등)에서는, 엔도톡신을 완전히 제거하는 것이 불가결하게 되어 있다.
이 엔도톡신의 제거 확인, 혹은 구급 의학에 있어서의 계측은, 측정 시료수가 많을 뿐만 아니라, 구명 치료라는 목적에 맞는 신속성이 요구되고 있다.
패혈증 등의 치료를 위해, 엔도톡신치를 재려고 하는 연구는 예전부터 이루어져, 투구게(Limulus)의 아메바상 혈구 성분에 포함되는 인자군이 엔도톡신에 특이적으로 반응하여 겔화하는 것이 발견되고 나서, 이 리물루스의 수해물(水解物)(Limulus Amebocyte Lysate; LAL 시약 또는 리물루스 시약)을 이용하여 엔도톡신의 정량을 하는 시도가 이루어지고 있다.
최초로 리물루스 시약을 사용한 측정법은, 단지 시료로 되는 환자의 혈장을 혼합하여 정치(靜置)하고, 일정 시간 후에 전도(轉倒)하여 겔화의 유무를 용액이 굳어지는 것으로 확인하고, 겔화를 일으키기 위한 최대 희석률로 엔도톡신량을 추정하는 소위 겔화법이라고 불리는 것이었다.
그 후 겔화 반응의 과정에 있어서의 탁도 증가에 주목하여, 광학적인 계측 방법을 이용한 탁도계로, 겔화 반응에 수반하는 탁도 변화에 의해 엔도톡신 농도를 측정하는 비탁(比濁) 시간 분석법이 알려져 있다.
또, 리물루스 시약에 의한 반응 과정의 최종 단계에서 코아귤로겐(Coagulogen)이 코아귤린(Coagulin)으로 전환하는 겔화 반응을 합성 기질의 발색 반응으로 치환한 발색 합성 기질법도 이미 알려져 있다. 이것은 응고 과정에 있어서의 응고 전구 물질(코아귤로겐: Coagulogen) 대신에 발색 합성 기질(Boc-Leu-Gly-Arg-p-니트로아닐리드)을 가함으로써, 그 가수분해로 p-니트로아닐린이 유리되고, 그 황색 발색의 비색(比色)에 의해 엔도톡신 농도를 측정하는 것이다.
또한, 종래에 있어서의 겔화 반응 측정 장치 혹은 이에 관련되는 측정 장치로서는, 예를 들면 특허문헌 1, 2에 나타내는 것을 들 수 있다.
특허문헌 1은 겔화 반응 측정 장치에 관한 것은 아니지만, 혈중의 혈소판이 응집하여 덩어리로서 성장하는 과정에 대해, 혈소판의 응집괴의 크기, 수를 측정하는 것이고, 시료 셀(cell) 내의 시료에 대하여 레이저 광원으로부터의 조사광을 조사시켜, 혈소판에서 90°측방으로 산란한 산란광의 일부를 광 검출기로 검출하고, 이 검출 결과에 기초하여 혈소판의 응집괴의 크기, 수를 측정하는 것이다.
또, 특허문헌 2는 비탁 시간 분석법을 이용한 겔화 반응 측정 장치에 관한 것이고, 검체(시료)와 리물루스 시약을 혼합시킨 혼합액의 투과광 강도의 경시 변화를 측정하고, 소정 시간에 있어서의 변화량으로부터 검체의 엔도톡신 농도를 측정하는 것이다.
또한, 겔화 반응을 이용한 측정 기술은, 전술한 엔도톡신뿐만 아니라, β-D-글루칸(β-D-glucan) 등의 측정에도 이용된다.
β-D-글루칸(β-D-glucan)은 진균에 특징적인 세포막을 구성하고 있는 폴리사카라이드(다당체)이다. 이 β-D-글루칸을 측정함으로써, 칸디다나 아스페르길루스, 클립토코커스와 같은 일반의 임상에서 잘 보이는 진균뿐만 아니라, 드문 진균도 포함하는 넓은 범위에서 진균 감염증의 스크리닝(screening) 등에서 유효하다.
이 β-D-글루칸의 측정에 있어서도, 투구게의 혈구 추출 성분이 β-D-글루칸에 의해 겔화하는 것이 이용되고 있고, 상술한 겔화법이나 비탁 시간 분석법, 발색 합성 기질법에 의해 측정된다.
엔도톡신이나 β-D-글루칸의 측정 수법에는 공통점이 있고, 예를 들면 대략 같은 측정 하드웨어를 이용하여, 투구게의 혈구 추출 성분 중에서 Factor G 성분을 제거함으로써 엔도톡신에 선택적인 겔화 반응이나 발색 반응을 측정할 수 있고, 또 시료 중의 엔도톡신에 사전 처리에 의해 불활성화함으로써, β-D-글루칸에 선택적인 겔화 반응이나 발색 반응을 측정하는 것이 가능하다.
일본 특허 제3199850호 공보(실시예, 도 1) 일본 특허공개 2004-93536호 공보(발명의 실시의 형태, 도 3)
그렇지만, 종래의 겔화법, 비탁 시간 분석법 및 발색 합성 기질법에 있어서는 다음과 같은 불편이 있다.
겔화법 및 비탁 시간 분석법은, 모두 겔이 생성하는데 저농도에서는 약 90분 이상이라는 장시간을 요한다. 즉, 반응 용액의 겔화 시간은 측정 대상 시료 중의 목적 물질의 농도에 비례하지만, 겔화법 및 비탁 시간 분석법은 모두 감도의 점에서 정확한 겔화 개시 시간 등을 검출할 수 없기 때문에, 겔화 종료까지의 시간으로부터 반응량을 산출하여 겔화 시간을 기준으로 하고 있다.
가령 비탁 시간 분석법을 예로 들면, 비탁 시간 분석법은 변화가 시작되는 최초의 레벨과 변화가 도달하는 레벨에 대해서는 알 수 있지만, 각각의 변화가 시작되는 시간이나 마지막의 시간을 알기 어렵고, 최초와 최후의 레벨 사이의 일정 레벨의 변화(탁도의 증가)를 측정함으로써, 겔화 전체의 변화 관찰로 바꾼다는 정량법으로서 확립된 것이다. 그러나, 저농도의 엔도톡신으로 되면, 계 전체의 겔화가 지연되고, 그에 따라 관측하는 탁도 변화도 늦어지기 때문에 측정하기 어려워지고, 그만큼 감도가 필연적으로 둔화되어 버린다.
따라서, 겔화법 및 비탁 시간 분석법은 모두 구급을 요하는 경우나 다수의 검체를 측정하는데 적합한 방법이라고 하기는 어렵다. 또한, 비탁 시간 분석법에서는, 엔도톡신과는 무관계인 비특이적 탁함이 발생하는 일이 있고, 측정 정밀도가 부족하다는 염려가 있다. 또, 겔화법의 측정 한계 농도는 3pg/ml, 비탁 시간 분석법의 측정 한계 농도는 1pg/ml 정도이다.
또한, 겔화 반응 측정 장치에 적용되는 비탁 시간 분석법으로서, 만일 특허문헌 1에 나타내는 산란 측광법을 적용했다고 해도, 겔화 전체의 변화 관찰로 바꾼 정량법인 이상, 상술한 문제는 해결할 수 없다.
한편, 발색 합성 기질법은 겔화법 및 비탁 시간 분석법에 비해 측정 시간이 약 30분 정도로 단시간이지만, 위(僞)양성 반응이 발생하는 경우가 있고, 특이도가 높은 측정을 행하는 것이 어렵고, 또 측정 준비가 번잡하고, 측정 한계 농도도 3pg/ml로 비탁 시간 분석법에 떨어진다.
본 발명은 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액이 졸(sol)상으로부터 겔(gel)상으로 상전이하는 타이밍(timing)에 관계되는 겔 입자의 생성 상태를 고감도로 계측하는 겔 입자 측정 장치를 제공하는 것이다.
청구항 1에 관계되는 발명은, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서, 일방으로부터 타방에 걸쳐 광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀(cell)과, 이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과, 상기 시료 셀의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대하여 코히어런트(coherent) 광을 조사시키는 코히어런트 광원과, 상기 시료 셀의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원의 반대측에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중을 투과한 광을 검출하는 투과광 검출 수단과, 이 투과광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 투과광의 변동 성분을 계측하는 투과광 변동 계측 수단과, 이 투과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 2에 관계되는 발명은, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서, 일방으로부터 타방에 걸쳐 광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀과, 이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과, 상기 시료 셀의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사시키는 코히어런트 광원과, 상기 시료 셀의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원의 반대측에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중을 투과한 광을 검출하는 투과광 검출 수단과, 이 투과광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 투과광의 변동 성분을 계측하는 투과광 변동 계측 수단과, 이 투과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 상태를 적어도 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비하고, 투과광 검출 수단과 시료 셀 사이에는, 겔 입자에서 산란한 위상이 어긋난 산란광 중 투과광 검출 수단을 향하는 성분이 제거되는 산란광 제거 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 3에 관계되는 발명은, 청구항 1 또는 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 겔 입자 생성 판별 수단이 투과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 투과광의 변동 변위가 안정 상태로부터 불안정 상태로 변화하는 변화점을 겔 입자의 출현 타이밍인 생성 개시 시점으로서 판별하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 4에 관계되는 발명은, 청구항 1 또는 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 코히어런트(coherent) 광원이 레이저 광원인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 5에 관계되는 발명은, 청구항 1 또는 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 시료 셀이 셀 용기 내에 시료 및 시약 용액이 직접 교반 가능한 교반 수단을 내장한 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 6에 관계되는 발명은, 청구항 1 또는 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 시료 셀이 항온조 내에 설치되는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 7에 관계되는 발명은, 청구항 1 또는 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 겔 입자 생성 판별 수단에 의한 판별 결과가 표시되는 표시 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 8에 관계되는 발명은, 청구항 1 또는 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 겔 입자 생성 판별 수단이 겔 입자의 생성 상태에 기초하여 시료 중의 목적 물질을 정량하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 9에 관계되는 발명은, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서, 광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀과, 이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과, 상기 시료 셀의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사시키는 코히어런트 광원과, 상기 시료 셀의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원과는 다른 부위에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중을 통과한 광을 검출하는 통과광 검출 수단과, 이 통과광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 통과광의 변동 성분을 계측하는 통과광 변동 계측 수단과, 이 통과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 10에 관계되는 발명은, 청구항 9에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 겔 입자 생성 판별 수단이 통과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 통과광의 변동 변위가 안정 상태로부터 불안정 상태로 변화하는 변화점을 겔 입자의 출현 타이밍인 생성 개시 시점으로서 판별하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 11에 관계되는 발명은, 청구항 9에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 코히어런트 광원이 상기 시료 셀의 중심쪽을 통과하도록 상기 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사하고, 통과광 검출 수단이 시료 셀 내의 상기 혼합 용액 내를 통과하는 코히어런트 광원으로부터의 광 중 산란광을 검출하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 12에 관계되는 발명은, 청구항 9에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 코히어런트 광원이 상기 시료 셀의 중심쪽을 통과하도록 상기 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사하고, 통과광 검출 수단이 시료 셀 내의 상기 혼합 용액 내를 통과하는 코히어런트 광원으로부터의 광 중 투과광 및 산란광을 검출하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 13에 관계되는 발명은, 청구항 1 또는 9에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 있어서, 측정 대상인 목적 물질이 엔도톡신이고, 이것을 겔화하는 시약이 리물루스 시약인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치이다.
청구항 1에 관계되는 발명에 의하면, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액을 투과하는 투과광의 변동 성분에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 겔 입자의 생성 상태를 고감도로 계측할 수가 있다.
청구항 2에 관계되는 발명에 의하면, 투과광 검출 수단에서의 검출 정밀도를 보다 향상시킬 수가 있고, 그만큼 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 겔 입자의 생성 상태를 고감도로 계측할 수가 있다.
청구항 3에 관계되는 발명에 의하면, 겔 입자의 출현 타이밍을 판별함으로써 시료 중의 목적 물질의 농도를 신속히 정량할 수가 있다.
청구항 4에 관계되는 발명에 의하면, 코히어런트 광원을 간단히 제공할 수가 있다.
청구항 5에 관계되는 발명에 의하면, 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액을 보다 확실히 교반할 수가 있어 겔 입자의 생성 조건을 갖출 수가 있다.
청구항 6에 관계되는 발명에 의하면, 항온 환경 하에서 겔화 반응을 안정적으로 진행시킬 수가 있다.
청구항 7에 관계되는 발명에 의하면, 겔 입자 생성 판별 수단의 판별 결과를 눈으로 볼 수가 있다.
청구항 8에 관계되는 발명에 의하면, 시료 중의 목적 물질 발생을 직접적으로 정량할 수가 있다.
청구항 9에 관계되는 발명에 의하면, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액을 통과하는 통과광의 변동 성분에 기초하여, 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 겔 입자의 생성 상태를 고감도로 측정할 수가 있다.
청구항 10에 관계되는 발명에 의하면, 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 측정함에 즈음하여, 겔 입자의 출현 타이밍을 고감도로 계측할 수가 있다.
청구항 11에 관계되는 발명에 의하면, 시료 셀 내의 혼합 용액을 통과하는 산란광의 변동 성분에 기초하여, 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 겔 입자의 생성 상태를 고감도로 계측할 수가 있다.
청구항 12에 관계되는 발명에 의하면, 시료 셀 내의 혼합 용액을 통과하는 투과광 및 산란광의 변동 성분에 기초하여, 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 겔 입자의 생성 상태를 고감도로 계측할 수가 있다.
청구항 13에 관계되는 발명에 의하면, 시료 중의 목적 물질로서의 엔도톡신의 정량에 적용할 수가 있다.
도 1은 본 발명이 적용되는 겔 입자 측정 장치의 실시의 형태의 개요를 나타내는 설명도이다.
도 2의 (a)는 겔화 반응을 모식적으로 나타내는 설명도, (b)는 겔화 반응의 진행 공정 I~III을 나타내는 설명도, (c)는 겔화 반응의 진행 공정에 있어서의 반응 시간과 투과 광도의 관계를 나타내는 설명도이다.
도 3은 리물루스 시약을 이용했을 때의 엔도톡신의 겔화 반응 과정을 모식적으로 나타내는 설명도이다.
도 4의 (a)는 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 정면 설명도, (b)는 그 평면 설명도이다.
도 5는 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 데이터 해석 처리의 일례를 나타내는 플로우차트이다.
도 6은 실시의 형태 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 일례를 나타내는 설명도이다.
도 7은 실시의 형태 3에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 일례를 나타내는 설명도이다.
도 8은 실시의 형태 4에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 일례를 나타내는 설명도이다.
도 9는 실시예 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 여러 가지 엔도톡신 농도(ETX 농도)에 대하여 반응 시간마다의 투과 광도를 측정한 결과를 나타내는 그래프도이다.
도 10은 도 9에 나타내는 그래프도를 이용한 검량선(檢量線) 작성예를 나타내는 설명도이다.
도 11의 (a)는 실시예 2에 관계되는 겔 입자 장치를 이용하여 소정의 엔도톡신 농도(ETX 농도)에 대하여 반응 시간마다의 투과 광도에 대응하는 탁도를 2회 측정한 결과를 나타내는 그래프도, (b)는 동 장치를 이용하여 소정의 ETX 농도에 대하여 반응 시간마다의 산란 광도에 대응하는 산란도를 2회 측정한 결과를 나타내는 그래프도이다.
도 12의 (a)는 실시예 3에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 여러 가지 엔도톡신 농도(ETX 농도)에 대하여 반응 시간마다의 투과 광도에 대응하는 탁도를 측정한 결과를 나타내는 그래프도, (b)는 동 장치를 이용하여 여러 가지 ETX 농도에 대하여 반응 시간마다의 산란 광도에 대응하는 산란도를 측정한 결과를 나타내는 그래프도이다.
도 13의 (a)는 실시예 4에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 이용하여 여러 가지 엔도톡신 농도(ETX 농도)에 대하여 반응 시간마다의 투과 광도에 대응하는 탁도를 측정한 결과를 나타내는 그래프도, (b)는 동 장치를 이용하여 여러 가지 ETX 농도에 대하여 반응 시간마다의 산란 광도에 대응하는 산란도를 측정한 결과를 나타내는 그래프도이다.
도 14는 실시예 5에 관계되는 겔 입자 장치를 이용하여 소정의 엔도톡신 농도(ETX 농도)에 대하여 반응 시간마다의 산란 광도를 1회 측정한 결과를 나타내는 그래프도이다.
◎ 실시의 형태의 개요
도 1은 본 발명이 적용된 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 개요를 나타내는 설명도이다.
동 도에 있어서, 겔 입자 측정 장치는 겔화 반응에 의해 시료(S) 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 것으로서, 일방으로부터 타방에 걸쳐 광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료(S) 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약(R)이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀(1)과, 이 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액(W)을 교반하는 교반 수단(2)과, 상기 시료 셀(1)의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)에 대하여 코히어런트 광(coherent light)(Bm)을 조사시키는 코히어런트 광원(3)과, 상기 시료 셀(1)의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원(3)의 반대측에 설치되고, 상기 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 중을 투과한 광(Bm)을 검출하는 투과광 검출 수단(4)과, 이 투과광 검출 수단(4)의 검출 출력에 기초하여 투과광의 변동 성분을 계측하는 투과광 변동 계측 수단(5)과, 이 투과광 변동 계측 수단(5)의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액(W) 내의 겔 입자의 생성 상태를 적어도 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단(6)을 구비한 것이다.
이러한 기술적 수단에 있어서, 본건의 목적 물질은, 소정의 시약 사이에 겔화 반응하고, 겔 입자가 생성되는 것이면 널리 포함한다. 예를 들면 엔도톡신이나 β-D-글루칸을 들 수 있고, 이 경우의 소정의 시약으로서는 리물루스 시약을 들 수 있다.
또, 시료 셀(1)은 모두가 투과성 부재로 구성되어 있어도 좋지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 광(Bm)이 투과하는 부분에 적어도 투과부를 가지고 있으면 좋다.
또, 측정 조건을 일정하게 유지한다는 관점에서 보면, 이 시료 셀(1)은 항온조(8) 내에 설치되는 태양이 바람직하다.
또한, 교반 수단(2)으로서는, 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)에 대하여 교반 작용을 주는 것이면 널리 포함하고, 내장하여 직접적으로 교반하는 태양은 물론이고, 에어(air)에 의한 교반 작용을 주거나 진탕에 의한 교반 작용을 주는 등 적당히 선정해도 지장이 없다.
여기서, 교반 수단(2)의 교반의 정도는, 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 전체가 겔화하는 것을 억제하는 것인 것을 요한다.
특히, 교반 수단(2)에 의한 교반 동작을 확실히 행한다는 관점에서 보면, 시료 셀(1)은 셀 용기 내에 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)이 직접 교반 가능한 교반 수단(2)을 내장한 것인 것이 바람직하다.
또, 코히어런트(coherent) 광원(3)은 코히어런트 광을 조사하는 것이면 레이저 광원에 의한 레이저광에 한정되지 않고, 예를 들면 나트륨 램프의 광과 같은 단색광을 핀홀(pinhole)에 통과시킴으로써도 제작 가능하다.
또, 투과광 검출 수단(4)으로서는, 코히어런트 광원(3)으로부터의 광 중 시료(S) 및 시약(R) 용액 중을 투과하는 투과광을 주로 검출하는 것이면 좋다. 이 경우 겔 입자에서 산란한 산란광의 일부가 미광(迷光)으로서 투과광 검출 수단(4)에 검출될 가능성이 있지만, 검출 출력의 대부분이 투과광 성분이기 때문에, 미광 성분이 일부에 포함되어 있어도 좋고, 미광 성분에 의한 영향을 회피한다는 관점에서 보면, 미광 성분에 대해서 제거하는 수법을 채용하거나, 혹은 투과광 변동 계측 수단(5)으로 보정하는 등을 해도 좋다.
여기서, 미광 성분에 대해서 제거하는 수법으로서는, 투과광 검출 수단(4)과 시료 셀(1) 사이에는 겔 입자에서 산란한 위상이 어긋난 산란광 중 투과광 검출 수단(4)을 향하는 성분이 제거되는 산란광 제거 수단(7)을 구비하고 있는 태양이 바람직하다. 이 산란광 제거 수단(7)으로서는, 산란광 성분을 커트(cut)하여 투과광 성분만을 통과시키는 편광 필터(filter)를 들 수 있다.
또한, 투과광 변동 계측 수단(5)으로서는, 투과광 검출 수단(4)의 검출 출력에 기초하여 투과광의 변동 성분을 계측하는 것이면 좋고, 예를 들면 검출 출력을 평균화 또는 스무딩(smoothing)함과 아울러 필터링(filtering)화하는 수법을 들 수 있다.
또, 겔 입자 생성 판별 수단(6)으로서는, 상기 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액(W) 내의 겔 입자의 생성 상태를 적어도 판별하는 것을 널리 포함한다.
그리고, 「겔 입자의 생성 상태를 판별한다」란, 겔 입자의 생성 상태에 관한 정보를 직접 판별하는 것은 물론, 겔 입자의 생성 상태에 기초하여 판별 가능한 정보(예를 들면 목적 물질의 정량 정보)를 판별하는 것도 포함하는 것이다.
여기서, 겔 입자의 생성 상태란, 겔 입자의 생성 개시(출현) 시점, 생성 과정의 변화, 생성 종료 시점, 생성량 등을 널리 포함하는 것이기 때문에, 본건에서는, 상기 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍이 적어도 포함되어 있으면, 다른 사항을 포함하고 있어도 지장이 없다.
특히, 겔 입자의 생성 개시 시점을 판별하는데는, 투과광 변동 계측 수단(5)의 계측 결과에 기초하여 투과광의 변동 변위가 안정 상태로부터 불안정 상태로 변화하는 변화점을 겔 입자의 출현 타이밍으로서 판별하도록 하면 좋다.
또, 투과광 변동 계측 수단(5)에 의한 계측 결과를 눈으로 본다는 관점에서 보면, 투과광 변동 계측 수단(5)에 의한 계측 결과가 표시되는 표시 수단(9)을 구비하고 있는 것이 바람직하다.
다음에, 도 1에 나타내는 겔 입자 측정 장치의 작동에 대하여 설명한다.
먼저, 겔화 반응을 도 2 (a)에 모식적으로 나타낸다.
동 도에 있어서, 시료(S)의 목적 물질(St)에 대해 특이적으로 반응하는 시약(R)이 존재하면, 시료(S) 중의 목적 물질(St)의 농도에 의존한 비율로, 그 목적 물질(St)이 시약(R)과 특이적으로 반응하는 현상이 일어난다. 이 반응 과정에 있어서, 시약(R)은 목적 물질(St)의 자극을 받아 소정의 인자가 활성화하고, 이에 기인하여 소정의 효소가 활성화하는 타이밍에서 예를 들면 수용성의 단백질이 효소에 의한 분해 반응으로 불용성의 단백질로 전환하고, 겔 입자(G)의 출현에 이르는 것이 일어난다.
보다 구체적으로는, 엔도톡신을 예로 들어 엔도톡신의 겔화 반응 과정을 모식적으로 나타내면 도 3과 같다.
동 도에 있어서, (1)에 나타내는 엔도톡신의 자극이 리물루스 시약에 전해지면, 먼저 (2)에 나타내듯이, 인자 C(Factor C)가 활성화되어 활성화 인자 C(Activated Factor C)로 되고, 다음에 활성화 인자 C의 작용에 의해, (3)에 나타내듯이, 인자 B(Factor B)가 활성화되어 활성화 인자 B(Activated Factor B)로 된다. 이후 활성화 인자 B의 작용에 의해, (4)에 나타내듯이, Pro-Clotting 효소가 Clotting 효소로 되고, (5)에 나타내듯이, 이 Clotting 효소가 Coagulogen(수용성 단백질)을 분해하여 Coagulin(불용성 단백질)으로 생성된다. 이 Coagulin(불용성 단백질)은 교반에 의해 전체의 겔화가 저해되면 겔 입자(G)로서 출현하고, 정치(靜置)하면 (6)에 나타내듯이 중합화·겔화한다.
즉, 시료(S)의 목적 물질(St)이 엔도톡신인 경우에는, 혼합 용액(W)에 대하여 일정한 교반 상태를 줌으로써 혼합 용액(W) 전체의 겔화를 저해하면서, 이 상태에서 리물루스 시약(R)에 엔도톡신의 자극이 전해지면, Clotting 효소의 주위에 Coagulin(불용성 단백질)의 겔 입자(G)를 산출시키는 것이 가능하고, Coagulin(불용성 단백질)이 겔 입자(G)로서 생성된 후에, 겔 입자(G)가 순차 생성되는 반응 과정을 거친다는 것이 이해된다.
또, 리물루스 시약(R)에 엔도톡신의 자극이 전해지는 속도(리물루스 반응 속도)는 엔도톡신 농도에 의존적이고, 엔도톡신 농도가 높을수록 리물루스 반응 속도가 빠르고, Coagulin(불용성 단백질)으로 이루어지는 겔 입자(G)의 출현 타이밍이 빠르다는 것을 알아냈다.
따라서, 투과광 변화를 정밀도 좋게 검출하도록 하면, 겔 입자(G)의 생성 개시점으로서 상기 Coagulin(불용성 단백질)으로 이루어지는 겔 입자(G)의 출현 타이밍을 파악하는 것이 가능하고, 본 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 측정 원리의 기본이다.
이러한 겔 입자 측정 장치의 측정 원리는, 예를 들면 종전의 겔화법이나 비탁 시간 분석법의 측정 원리(리물루스 시약(R)에 의한 반응 과정에 있어서, 정치한 조건하, 활성화된 효소의 영향으로 최종적으로 겔화하기에 이르고, 이 겔화한 상태를 탁도에 의해 측정하는 태양)와는 완전히 상위한 것이다.
여기서, 겔 입자 측정 장치의 측정 원리를 도 2 (b)에 모식적으로 나타낸다.
본 실시의 형태의 겔 입자 측정 장치에서는, 도 2 (b)의 공정 I에 나타내듯이, 시료(S) 및 시약(R) 용액의 혼합 용액(W)에 겔 입자가 없는 경우(혼합 용액(W)이 졸상인 경우에 상당)에는, 도시 외의 코히어런트 광원으로부터 투과광(Bm1)은 겔 입자에 의해 차단되는 일이 없기 때문에, 그 투과광(Bm1)의 투과 광도는 대략 일정하게 유지된다(도 2 (c) I 공정 P1 참조).
그리고, 도 2 (b)의 공정 II에 나타내듯이, 시료(S) 및 시약(R) 용액의 혼합 용액(W)에 겔 입자(G)가 생성 개시하기 시작한 경우(혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하기 시작한 경우에 상당), 예를 들면 엔도톡신의 경우의 Coagulin(불용성 단백질)의 겔 입자(G)가 산출되기 시작하면, 도시 외의 코히어런트 광원으로부터 투과광(Bm2)은 산출된 Coagulin(불용성 단백질)으로 이루어지는 겔 입자(G)의 존재에 의해 일부 차단되기 때문에, 그 투과광(Bm2)의 투과 광도는 대략 일정한 레벨로부터 감쇠 경향으로 변화하려고 한다(도 2 (c) II 공정 P2 참조).
이후 도 2 (b)의 공정 III에 나타내듯이, 시료(S) 및 시약(R) 용액의 혼합 용액(W)에 겔 입자(G)의 생성이 점차 진행해 가는 경우에는, 도시 외의 코히어런트 광원으로부터 투과광(Bm3)은 순차 생성되는 많은 겔 입자(G)의 존재에 의해 차단되기 때문에, 그 투과광(Bm3)의 투과 광도는 감쇠 변화점(P2)을 경계로 순차 감쇠해 간다(도 2 (c) III 공정 P3 참조).
상술한 실시의 형태에서는, 혼합 용액(W)을 투과하는 투과광의 변동 성분에 기초하여, 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 겔 입자의 생성 상태를 적어도 판별하는 태양이 나타나 있다.
그렇지만, 상술한 작용은 혼합 용액(W)의 투과광에 있어서 현저히 발생하지만, 투과광 이외의 산란광에 의해서도 발생한다는 것이 판명되었다.
이 점을 가미하면, 도 1에 나타내는 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치로서는, 겔화 반응에 의해 시료(S) 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서, 광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료(S) 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약(R)이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀(1)과, 이 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액(W)을 교반하는 교반 수단(2)과, 상기 시료 셀(1)의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)에 대하여 코히어런트 광을 조사시키는 코히어런트 광원(3)과, 상기 시료 셀(1)의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원(3)과는 다른 부위에 설치되고, 상기 시료 셀(1) 내의 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W) 중을 통과한 광을 검출하는 통과광 검출 수단(도시하지 않음)과, 이 통과광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 통과광의 변동 성분을 계측하는 통과광 변동 계측 수단(도시하지 않음)과, 이 통과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액(W) 내의 겔 입자의 생성 상태를 적어도 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단(6)을 구비한 것을 들 수 있다.
본 태양에 있어서는, 시료 셀(1) 내의 혼합 용액(W) 중을 통과하는 통과광 중, 통과광 검출 수단에 의한 검출 대상으로 되는 통과광은 투과광에 한정하지 않고 산란광도 포함한다.
또, 본 태양에 있어서, 겔 입자 생성 판별 수단(6)의 대표적 태양으로서는, 통과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 통과광의 변동 변위가 안정 상태로부터 변화하기 시작하는 변화점을 겔 입자의 출현 타이밍으로서 판별하는 것을 들 수 있다.
또한, 통과광 검출 수단이 통과광으로서 산란광을 검출하는 태양에서 바람직한 태양으로서는, 코히어런트 광원(3)은 시료 셀(1)의 중심쪽을 통과하도록 혼합 용액(W)에 대하여 코히어런트 광을 조사하고, 통과광 검출 수단은 시료 셀(1) 내의 혼합 용액(W) 내를 통과하는 코히어런트 광원(3)으로부터의 광 중 산란광을 검출하도록 하면 좋다.
여기서, 통과광 검출 수단으로서는, 산란광을 검출하는 위치이면 임의의 위치에 설치해도 지장이 없지만, 산란 광도를 충분히 확보할 수 있고, 또한 설치의 용이성을 고려하면, 시료 셀(1)을 사이에 두고 코히어런트 광원(3)의 반대측 영역에 설치하는 태양이 바람직하다.
또, 통과광 검출 수단이 통과광으로서 투과광 및 산란광을 검출하는 태양에서 바람직한 태양으로서는, 코히어런트 광원(3)은 시료 셀(1)의 중심쪽을 통과하도록 혼합 용액(W)에 대하여 코히어런트 광을 조사하고, 통과광 검출 수단은 시료 셀(1) 내의 혼합 용액(W) 내를 통과하는 코히어런트 광원(3)으로부터의 광 중 투과광 및 산란광을 검출하도록 하면 좋다.
여기서, 통과광 검출 수단으로서는, 투과광 및 산란광을 검출하는 위치이면 임의의 위치에 설치해도 지장이 없지만, 산란 광도를 충분히 확보할 수 있고, 또한 설치의 용이성을 고려하면, 시료 셀(1)을 사이에 두고 코히어런트 광원(3)의 반대측 영역에 투과광 검출 수단(4)과 함께 설치하는 태양이 바람직하다.
이하, 첨부 도면에 나타내는 실시의 형태에 기초하여 이 발명을 보다 상세히 설명한다.
◎ 실시의 형태 1
본 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치는, 도 4 (a), (b)에 나타내듯이, 예를 들면 시료(S)의 목적 물질로서의 엔도톡신의 농도를 리물루스 시약을 이용한 겔화 반응으로 측정하는 것이다.
동 도에 있어서, 부호 10은 예를 들면 투명성 수지 재료 또는 유리 재료로 일체적으로 성형된 시료 셀이고, 엔도톡신을 포함하는 시료(S) 및 리물루스 시약(R)으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 수용하는 것이다.
여기서, 본 실시의 형태에서는, 시료 셀(10)은 예를 들면 상부가 개구하고 또한 횡단면 원형의 바닥 있는 통체로 이루어지고, 예를 들면 측정 스테이지(stage)의 개폐 덮개(도시 외)의 개폐 동작에 의해 상부 개구를 개폐하도록 되어 있다.
또, 본 실시의 형태에서는, 시료 셀(10)은 항온조(15) 내에 배치되어 시료(S) 및 시약(R) 용액으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 일정한 항온 환경(예를 들면 37℃) 하에 두어, 측정 조건을 일정하게 하도록 되어 있다.
또, 부호 20은 시료 셀(10) 내의 혼합 용액(W)을 교반하는 교반 장치이고, 예를 들면 혼합 용액(W)에 대하여 일정한 교반 상태를 주어 혼합 용액(W) 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 되어 있다.
특히, 본 예에서는, 교반 장치(20)는 시료 셀(10) 내의 저벽에 내장된 자성체로 이루어지는 교반봉(스터러 바(stirrer bar))(21)과, 시료 셀(10)의 저벽 외부에 설치되고 또한 상기 교반봉(21)에 대하여 자력에 의한 교반력을 작용시키는 교반 구동원(마그네틱 스터러(magnetic stirrer)(22)를 구비하고 있다.
또한, 부호 30은 시료 셀(10)의 옆둘레벽의 일방측에 설치되고 또한 코히어런트 광을 조사하는 레이저 광원이고, 40은 시료 셀(10)을 사이에 두고 레이저 광원(30)의 반대측에 설치되어 레이저 광원(30)으로부터의 투과광(B)을 검출하는 투과광 검출기이다. 이 투과광 검출기(40)로서는 예를 들면 포토다이오드(photodiode) 등의 광학 부품을 널리 이용할 수가 있다.
본 실시의 형태에서는, 레이저 광원(30)으로부터의 코히어런트 광(Bm)은 도 4 (b)에 나타내듯이, 시료 셀(10)의 대략 직경 부분을 횡단하는 경로를 따라 조사되고 있고, 그 광 직경은 생성되는 겔 입자경(예를 들면 0.5~20μm 정도)에 대하여 충분히 큰 값(예를 들면 1mm 정도)으로 설정된다.
한편, 투과광 검출기(40)는 레이저 광원(30)으로부터의 투과광(Bm)의 광속(光束) 영역을 검출 가능한 검출면을 가지고, 투과광 검출기(40)의 검출 정밀도는 투과광(Bm)의 통과 면적 내에 존재하는 1 내지 수개의 겔 입자의 유무에 의한 투과 광량 변화를 검출 가능한 정도로 설정된다.
또한, 본 실시의 형태에서는, 시료 셀(10)과 투과광 검출기(40) 사이에 편광 필터(50)가 설치되어 있다. 이 편광 필터(50)는 레이저 광원(30)으로부터의 광(Bm)중 혼합 용액(W) 내에서 생성된 겔 입자(G)에 의해 산란한 산란광에서 투과광 검출기(40)를 향하는 성분의 미광(迷光)을 제거하는 것이다. 이 편광 필터(50)에 의한 미광 제거 원리는, 레이저 광원(30)으로부터의 코히어런트 광(Bm)이 겔 입자(G)에서 산란하면, 그 산란광의 위상이 어긋나는 것을 이용하여, 투과광(Bm)의 위상 이외의 위상 성분의 미광 성분을 커트(cut)하도록 한 것이다.
또한, 레이저 광원(30), 투과광 검출기(40)와 시료 셀(10) 사이에는 광로나 조사광 직경을 결정함에 있어서 필요에 따라서 집광렌즈, 미러(mirror) 등의 광학 부품을 배치해도 좋은 것은 물론이다.
부호 60은 투과광 검출기(40)로부터의 검출 출력을 받아들여, 예를 들면 도 5에 나타내는 데이터 해석 처리를 실행하는 데이터 해석 장치, 70은 데이터 해석 장치(60)에서 해석된 해석 결과를 표시하는 디스플레이다.
이 데이터 해석 장치(60)는 CPU, ROM, RAM, I/O 인터페이스 등을 포함하는 컴퓨터 시스템으로 구성되어 있고, 예를 들면 ROM 내에 도 5에 나타내는 데이터 해석 처리 프로그램을 미리 저장해 두고, 투과광 검출기(40)로부터의 검출 출력에 기초하여 CPU에서 데이터 해석 처리 프로그램을 실행하는 것이다.
또한, 투과광 검출기(40)로부터의 검출 출력은 예를 들면 도시 외의 증폭기에 의해 전류 전압 변환된 후, AD 변환기에 의해 AD 변환되어 데이터 해석 장치(60)에 받아들여진다.
다음에, 본 실시의 형태에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 작동에 대하여 설명한다.
본 실시의 형태에 있어서, 도 4 (a), (b)에 나타내는 겔 입자 측정 장치의 시료 셀(10)에 엔도톡신을 포함하는 시료(S) 및 리물루스 시약(R)를 투입한 후, 측정 스테이지(stage)의 도시 외의 개폐 덮개를 닫은 후에 도시 외의 스타트 스위치(start switch)를 온(on) 조작하여, 겔 입자 측정 장치에 의한 측정 시퀀스(sequence)가 개시된다.
이 측정 시퀀스는 교반 장치(20)로 시료 셀(10) 내의 시료(S) 및 리물루스 시약(R)으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 교반한다. 이 때문에 혼합 용액(W) 전체로서는 겔화하는 것이 억제된다.
또한, 측정 시퀀스는 레이저 광원(30)으로부터 광(Bm)을 조사하고, 시료 셀(10) 내의 혼합 용액(W)을 통과한 투과광(Bm)을 투과광 검출기(40)로 검출함과 아울러, 투과광 검출기(40)의 검출 출력을 데이터 해석 장치(60)에 받아들인다.
한편, 시료 셀(10) 내에서는 리물루스 시약(R)에 엔도톡신의 자극이 전해져, 도 3에 나타내는 것 같은 리물루스 반응이 일어나고, 혼합 용액(W) 전체의 겔화가 억제된 상태에서 겔 입자(G)가 순차 생성되어 간다.
본 실시의 형태에서는, 레이저 광원(30)으로부터의 광(Bm)의 통과 면적 내에 겔 입자(G)가 예를 들면 하나 생성된 타이밍이 겔 입자(G)의 생성 개시점으로서 파악되어 있고, 투과광의 감쇠 변화점의 타이밍으로 되는 것이다.
이러한 반응 과정에 있어서, 데이터 해석 장치(60)는 예를 들면 도 5에 나타내듯이, 투과광 검출기(40)로부터의 검출 출력을 투과 광량 데이터(디지털 데이터)로서 읽어들인 후, 평균화·필터링화 처리를 행하여 투과 광량 데이터의 변동 성분을 계측한다.
다음에, 투과 광량 데이터의 변동 성분에 기초하여 투과광의 감쇠 변화점(도 2의 P2에 상당)을 추출하고, 미리 규정되어 있는 검량선(檢量線)을 참조함으로써 시료(S)의 엔도톡신 농도(ETX 농도)를 결정하여, 디스플레이(70)에 표시한다.
본 예에서는 검량선은 엔도톡신 농도(ETX 농도)와 투과광의 감쇠 변화점에 이를 때까지의 시간 역치(threshold value)의 관계를 나타내는 것이고, 투과광의 감쇠 변화점의 시간과 검량선의 상관에 기초하여 엔도톡신 농도(ETX 농도)가 결정된다. 또, 디스플레이(70)에는 엔도톡신 농도(ETX 농도) 이외에, 투과 광량 데이터의 시계열 데이터, 투과 광량 데이터의 변동 성분의 시계열 계측 데이터 등의 데이터가 전환 표시되게 되어 있다.
또한, 검량선의 작성법에 있어서는, 후술하는 실시예에서 구체예를 나타낸다.
이와 같이 본 실시의 형태에 있어서는, 겔 입자 측정 장치는 시료(S) 및 리물루스 시약(R)으로 이루어지는 혼합 용액(W)을 소정의 항온 환경 하에서 교반하고, 혼합 용액(W) 중에 산생(産生)하는 Coagulin 입자로 이루어지는 겔 입자(G)의 출현에 의해 투과광이 일부 차단되어 감광하는 것을 검출하여, 겔화의 개시 시기를 포착하려고 하는 것이다.
특히, 본 예에서는 투과광 검출기(40)의 검출 정밀도를 고감도로 하기 위해, 레이저광이라는 코히어런트(coherent)이고 강한 광을 이용하고, 또 미세한 변화를 검출하기 위해, 저농도에서의 변화에서는, 특히 산란한 미광이 Coagulin 입자로 이루어지는 겔 입자(G)에 부딪혀 위상이 어긋나는 것을 이용하여, 편광 필터(50)에서 미광 성분이 제거되기 때문에, 투과광 검출기(40)에는 레이저 광원(30)으로부터의 투과광 성분만이 입사하게 되어, 그만큼 투과광 변화가 정확히 검출된다.
◎ 변형 형태
본 실시의 형태에서는, 시료 셀(10)은 예를 들면 측정 스테이지의 개폐 덮개로 상부 개구를 개폐하도록 하고 있지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 시료 셀(10)의 셀 용기 내에 교반봉(21) 및 리물루스 시약(R)를 미리 수용하여, 상부 개구를 도시 외의 밀폐 부재로 밀폐하도록 해도 좋다. 이러한 시료 셀(10)은 겔 입자 측정 장치의 부속품이나 측정 키트(kit)로서 사용자에 공급하도록 하면 좋다.
또, 본 태양의 시료 셀(10)에의 시료(S)의 도입법으로서는, 예를 들면 밀폐 부재에 주사바늘과 같은 천공구로 천공하고, 이 천공을 통하여 시료(S)를 주입하도록 한 것을 들 수 있다. 또한, 시료(S)의 도입을 용이하게 행하기 위해, 시료 셀(10) 내가 대기압에 대하여 소정의 부압 레벨을 유지하도록 밀폐 부재의 밀폐 사양을 설정해도 좋다.
또, 본 실시의 형태에서는, 1검체(시료(S))분의 시료 셀(10)에 대한 겔 입자 측정 장치를 나타내고 있지만, 복수의 검체(시료)를 동시에 처리한다는 요청 하에서는, 예를 들면 복수의 시료 셀을 일체화한 멀티 시료 셀을 준비하고, 각 시료 셀에 대응하여 각각 레이저 광원(30), 투과광 검출기(40)를 배치하여, 복수의 검체(시료)를 동시에 측정할 수 있도록 하면 좋다.
또한, 실시의 형태 1에서는, 측정 대상의 물질을 엔도톡신으로 하는 것이 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 같은 측정 하드웨어로, 또한 동일 내지는 유사한 리물루스 시약을 이용하여 측정 대상의 물질을 β-D-글루칸으로 하는 것도 가능하다.
또, 반응에 의해 입자 혹은 입자의 중합이 생기는 물질의 반응을 예민하게 측정하는 것도 가능하다.
◎ 실시의 형태 2
도 6 (a), (b)는 실시의 형태 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 주요부를 나타낸다.
동 도에 있어서, 실시의 형태 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치는, 시료 셀(10) 내에 엔도톡신을 포함하는 시료(S) 및 리물루스 시약(R)를 수용하고, 이들의 혼합 용액(W)을 교반 장치(20)(교반봉(21), 교반 구동원(22))로 교반함과 아울러, 레이저 광원(30)으로부터의 광(Bm＇)을 혼합 용액(W) 내에 조사하고, 리물루스 반응으로 생성되는 겔 입자(G)에서 측방으로 산란한 산란광의 일부를 산란광 검출기(140)로 검출하고, 이 산란광 검출기(140)의 검출 출력을 데이터 해석 장치(60)에 받아들여, 겔 입자(G)의 산생(産生) 시기를 연산 처리하는 것이다.
이 실시의 형태 2에 관계되는 겔 입자 측정 장치에 의하면, 원래 산란광은 투과광에 비해 비율이 적고, 그 일부밖에 계측할 수 없기 때문에, 가능한 한 산란광의 감쇠를 억제하는 것이 필요하게 된다. 그래서, 이 실시의 형태 2에 있어서는, 산란광의 감쇠를 막기 위해서, 엄밀한 광학 회로가 필요하고, 도 6 (b)에 나타내듯이, 시료 셀(10)의 혼합 용액(W)의 표면에서 직각인 위치 관계로 되는 입사, 산란 반사 각도를 얻도록 레이저 광원(30) 및 산란광 검출기(140)를 설치하여, 산란광을 계측하는 것이 필요하다. 이 때문에 시료 셀(10)도 감쇠가 적은 용기 두께(k)가 얇은 특수한 용기 구조를 채용하거나, 또 레이저 광원(30), 산란광 검출기(140)의 설치 정밀도를 매우 높게 설정하도록 유의하는 것이 필요하다.
이 점, 실시의 형태 1에서는, 투과광 성분은 많아 원래 확보할 수가 있을 뿐만 아니라, 시료 셀(10)의 용기 구조로서 특히 특수한 구조를 쓰지 않고, 용기 두께가 두꺼운 튼튼한 것을 사용할 수가 있고, 또 시료 셀(10)에 대한 레이저 광원(30), 투과광 검출기(40)의 설치도 시료 셀(10)의 대략 직경 방향을 향해 직선상으로 대향시키면 좋고, 시료 셀(10)의 교환에 수반하는 설치 정밀도를 어느 정도 러프(rough)하게 하는 것도 가능하다.
◎ 실시의 형태 3
도 7 (a), (b)는 실시의 형태 3에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 주요부를 나타낸다.
동 도에 있어서, 실시의 형태 3에 관계되는 겔 입자 측정 장치는, 시료 셀(10) 내에 엔도톡신을 포함하는 시료(S) 및 리물루스 시약(R)를 수용하고, 이들의 혼합 용액(W)을 교반 장치(20)(교반봉(21), 교반 구동원(22))로 교반함과 아울러, 시료 셀(10)의 중심쪽을 통과하도록 레이저 광원(30)으로부터의 광(Bm)을 혼합 용액(W) 내에 조사하고, 리물루스 반응으로 생성되는 겔 입자(G)에서 시료 셀(10)을 사이에 두고 레이저 광원(30)의 반대측을 향해 투과 산란한 산란광의 일부를 산란광 검출기(140)로 검출하고, 이 산란광 검출기(140)의 검출 출력을 데이터 해석 장치(60)에 받아들여, 겔 입자(G)의 산생 시기를 연산 처리하는 것이다.
본 태양에 있어서는, 시료 셀(10)의 혼합 용액(W)이 졸상으로부터 겔상으로 상전이할 때에 겔 입자(G)가 생성되었다고 하면, 산란광 검출기(140)에는 겔 입자(G)의 존재에 의해 투과 산란한 산란광(정확히는 투과광의 진행 방향과는 다른 방향으로 산란한 광)의 일부가 검출된다. 여기서, 산란광 검출기(140)의 감도로서는, 산란광은 겔 입자가 생성되지 않는 경우에는 생기지 않는 것이고, 겔 입자가 생성됨으로써 생기는 것이기 때문에, 겔 입자가 생기기 시작했을 때의 산란광 레벨을 감지할 수 있는 것을 선정해 두면 좋다.
그리고, 산란광 검출기(140)로 검출된 산란광 출력은 데이터 해석 장치(60)에 받아들여지고, 산란광의 변동 성분에 기초하여 산란광 출력의 시작 변화점을 판별하여, 시작 변화점 시기를 겔 입자(G)의 산생 시기로서 연산하는 것이다.
또, 본 태양에 있어서, 산란광 검출기(140)는 적어도 하나 있으면 좋지만, 복수 설치하여 검출 출력을 평균화하거나, 복수의 산란광 검출기(140) 중 하나를 겔 입자(G)의 산생 시기를 판별하기 위해서 사용하고, 다른 산란광 검출기(140)를 다른 겔 입자(G)의 생성 상태 판별을 위해서 사용하도록 하는 등 적당히 선정해도 지장이 없다.
또한, 본 실시의 형태에서는, 산란광 검출기(140)는 도 7 (b)에 실선으로 나타내듯이, 시료 셀(10)을 사이에 두고 레이저 광원(30)과 반대측에 설치되어 있지만, 도 7 (b)에 가상선으로 나타내듯이, 예를 들면 시료 셀(10)의 주위 중 레이저 광원(30) 위치에 대하여 약 90°정도 변위한 부위에 산란광 검출기(140＇)를 설치하고, 레이저 광원(30)으로부터의 조사광(Bm) 중 혼합 용액(W) 내의 겔 입자(G)에서 측방으로 산란한 산란광을 산란광 검출기(140＇)로 검출하도록 해도 좋지만, 이 측방 산란광 성분은 도 7 (b)에 실선으로 나타내는 투과 산란광 성분에 비해 보다 적기 때문에, 산란광 검출기(140)에 비해 산란광 검출기(140＇)의 감도를 보다 높이는 것이 바람직하다.
◎ 실시의 형태 4
도 8 (a), (b)는 실시의 형태 4에 관계되는 겔 입자 측정 장치의 주요부를 나타낸다.
동 도에 있어서, 실시의 형태 4에 관계되는 겔 입자 측정 장치는, 시료 셀(10) 내에 엔도톡신을 포함하는 시료(S) 및 리물루스 시약(R)를 수용하고, 이들의 혼합 용액(W)을 교반 장치(20)(교반봉(21), 교반 구동원(22))로 교반함과 아울러, 시료 셀(10)의 중심쪽을 통과하도록 레이저 광원(30)으로부터의 광(Bm)을 혼합 용액(W) 내에 조사하고, 리물루스 반응으로 생성되는 겔 입자(G)에서 시료 셀(10)을 사이에 두고 레이저 광원(30)의 반대측을 향하는 통과광 중, 겔 입자(G)를 투과하는 투과광의 일부를 투과광 검출기(40)로 검출함과 아울러, 투과광과는 별도로 겔 입자(G)에서 투과 산란한 산란광의 일부를 산란광 검출기(140)로 검출하고, 각 광 검출기(40, 140)의 검출 출력을 데이터 해석 장치(60)에 받아들여, 겔 입자(G)의 산생 시기를 연산 처리하는 것이다.
본 태양에 있어서, 데이터 해석 장치(60)는 각 광 검출기(40, 140)로부터의 검출 출력을 시간 경과와 함께 연산해도 좋고, 혹은 적어도 어느 검출 출력에 대해서는, 투과 광도 또는 산란 광도에 기초하여 변화하는 파라미터(parameter)(예를 들면 탁도) 등으로 변환하여 연산해도 좋다.
또, 본 태양에 있어서는, 레이저 광원(30)은 하나로 좋고, 각 광 검출기(40, 140)는 적어도 하나씩 설치되어 있으면 좋지만, 필요에 따라서 각 광 검출기(40, 140)를 복수 설치하도록 해도 좋다.
이러한 태양의 겔 입자 측정 장치에 의하면, 투과광 검출기(40)로부터는 투과광의 변동 성분이 검출되고, 또한 산란광 검출기(140)로부터는 산란광의 변동 성분이 검출되기 때문에, 데이터 해석 장치(60)는 각 광 검출기(40, 140)로부터의 투과광 또는 산란광의 변동 성분에 기초하여 시료 셀(10)의 혼합 용액(W) 내에 있어서의 겔 입자(G)의 산생 시기를 판별할 수가 있지만, 양자의 데이터를 가미함으로써 겔 입자(G)의 산생 시기를 보다 정확히 판별 가능하다.
또한, 본 태양에 있어서는, 양방의 광 검출기(40, 140)를 이용하여 겔 입자(G)의 산생 시기를 판별하는 태양에 한정되는 것은 아니고, 어느 일방의 광 검출기(40 또는 140)를 이용하여 겔 입자(G)의 산생 시기를 판별하고, 타방의 광 검출기(140 또는 40)를 이용하여 겔 입자(G)의 산생 시기 이외의 겔 입자(G)의 생성 상태를 판별하도록 해도 좋다. 또, 산란광을 검출하는 산란광 검출기(140)에 대해서는, 실시의 형태 3과 마찬가지로, 측방으로 산란한 산란광을 검출하는 산란광 검출기(140＇)를 이용하도록 해도 좋은 것은 물론이다.
<실시예>
◎ 실시예 1
본 실시예는 실시의 형태 1에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 보다 구현화한 것이다.
여기서, 실시예 1의 조건은 이하와 같다.
ㆍ레이저 광원(30): 적색광 또는 녹색광
ㆍ투과광 검출기(40): 포토다이오드(photodiode)
ㆍ교반봉(스터러 바(stirrer bar))(21)의 회전수: 1000rpm
ㆍ항온 조건: 37℃
본 실시예에서는 여러 가지 엔도톡신 농도(10ㆍ1ㆍ0.1pg/ml)의 시료를 첨가했을 때의 리물루스 시약에 대하여, 겔 입자 측정 장치로 투과 광도의 변화를 조사한 것이다.
도 9는 10pg/ml는 2회, 1pg/ml, 0.1pg/ml의 각각의 시간 경과에 따른 투과 광도를 그린 것이다.
동 도에 있어서, 각 조건의 투과 광도의 변화는, 모두 대략 일정한 레벨을 유지하는 부분이 어느 시간이 되어 감쇠 저하하는 경향을 나타내고 있다. 이 투과 광도의 감쇠 변화점은 겔 입자의 생성 개시점(겔화 개시 시간)에 상당하고, 겔화 개시시에 의한 감광(減光)을 의미하는 것이라고 상정된다.
이 겔화 개시시를 구하기 위해, 본 실시예에서는 도 9의 그래프에 있어서, 매뉴얼(manual)로, 일정 투과 광도의 부분을 근사한 직선과 투과 광도가 감쇠 경사해 가는 변화 부분을 근사한 직선의 교점을 구하여, 각각 겔화 개시 시간(반응 시간) t1(10), t2(10), t(1), t(0.1)을 구하였다.
본 예에서는, 10pg/ml: t1(10)=16(min.)
t2(10)=19(min.)
1pg/ml: t(1)=28(min.)
0.1pg/ml: t(0.1)=70(min.)
였다.
덧붙여서, 와코순약공업주식회사제의 비탁 시간 분석법을 채용한 엔도톡신 키트(겔화 반응 측정 장치)를 이용하여, 엔도톡신 농도와 겔화 시간을 조사한 바, 이하와 같은 결과가 얻어졌다.
엔도톡신 농도(pg/ml) 겔화 시간(min.)
0.1 123.7
0.5 56.3
1.0 41.8
10.0 18.0
또한, 본 실시예에서는, 도 9의 그래프로부터 구한 겔화 개시 시간 t1(10), t2(10), t(1), t(0.1)의 값을 이용하여 검량선을 작성하도록 하였다.
본 실시예의 검량선은, X축을 엔도톡신 농도인 ETX 농도(log 변환), Y축을 겔화 개시 시간(log 변환)으로 하면, 직선 관계가 얻어지고, 상관 계수 - 0.9804라는 높은 상관이 나타나, 이 검량선의 유용성이 증명된다.
◎ 실시예 2
본 실시예는 실시의 형태 4에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 구현화한 것이다.
여기서, 실시예 2의 조건은 이하와 같다.
ㆍ레이저 광원(30): 청색, 20mW
ㆍ투과광 검출기(40): 포토다이오드
ㆍ산란광 검출기(140): 포토다이오드
ㆍ교반봉(스터러 바)(21)의 회전수: 1000rpm
ㆍ항온 조건: 37℃
본 실시예는 소정의 엔도톡신 농도(10pg/ml)의 시료를 첨가했을 때의 리물루스 시약에 대하여, 투과 광도 및 산란 광도의 변화를 2회 조사한 것이다. 또한, 본 실시예에서는 투과 광도에 대해서는, 투과 광도에 대응하는 파라미터로서 탁도에 의한 연산 결과가 표시되게 되어 있고, 산란 광도에 대해서는, 산란 광도에 대응하는 파라미터로서 산란도에 의한 연산 결과가 표시되게 되어 있다.
도 11 (a)는 엔도톡신 농도 10pg/ml의 시료를 리물루스 시약에 첨가했을 때의 시간 경과에 따른 투과 광도에 대응하는 탁도를 그린 것이다.
도 11 (b)는 엔도톡신 농도 10pg/ml의 시료를 리물루스 시약에 첨가했을 때의 시간 경과에 따른 산란 광도에 대응하는 산란도를 그린 것이다.
도 11 (a)에 의하면, 투과 광도에 대응하는 탁도의 변화는 대략 일정한 레벨을 유지하는 부분이 어느 시간이 되어 감쇠 저하하는 경향을 나타내고 있다. 이 투과 광도에 대응하는 탁도의 감쇠 변화점은 겔 입자의 생성 개시점(겔화 개시 시간)에 상당하고, 겔화 개시시에 의한 감광(減光)에 수반하는 탁도 저하를 의미하는 것이라고 상정된다.
한편, 도 11 (b)에 의하면, 산란 광도에 대응하는 산란도는 대략 일정 레벨을 유지하는 부분이 어느 시간이 되어 증가 상승하는 경향을 나타내고 있다. 이 산란도의 증가 변화점은 겔 입자의 생성 개시점(겔화 개시 시간)에 상당하고, 겔화 개시시에 의한 산란에 수반하는 산란도 증가를 의미하는 것이라고 상정된다.
또한, 도 11 (b)에 나타내는 산란 광도에 대응하는 산란도의 증가 변화점은, 도 11 (a)에 나타내는 투과 광도에 대응하는 탁도의 감쇠 변화점보다도 약간 지연이 보이지만, 이것은 광 검지기(40 또는 140)에 도달하는 투과광 또는 산란광의 도달 시간 차이에 의한 것이라고 추측된다.
◎ 실시예 3
본 실시예는 실시예 2와 마찬가지로, 실시의 형태 4에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 구현화한 것이다.
여기서, 실시예 3의 조건은 실시예 2와 대략 동일하지만, 레이저 광원(30)이 40mW의 청색 다이오드가 이용되고 있다.
본 실시예에서는 여러 가지 엔도톡신 농도(10ㆍ1ㆍ0.1ㆍ0.001pg/ml)의 시료를 첨가했을 때의 리물루스 시약에 대하여, 겔 입자 측정 장치로 투과 광도에 대응하는 탁도 및 산란 광도에 대응하는 산란도의 변화를 조사한 것이다.
도 12 (a)는 여러 가지 엔도톡신 농도의 시료를 리물루스 시약에 첨가했을 때의 시간 경과에 따른 투과 광도에 대응하는 산란도를 그린 것이다.
도 12 (b)는 여러 가지 엔도톡신 농도의 시료를 리물루스 시약에 첨가했을 때의 시간 경과에 따른 산란 광도에 대응하는 탁도를 그린 것이다.
여기서, 도 12 (a)에 의하면, 각 엔도톡신 농도의 시료에 대하여 투과 광도에 대응하는 탁도의 변화는 대략 일정한 레벨을 유지하는 부분이 어느 시간이 되어 감쇠 저하하는 경향을 나타내고 있다. 이 투과 광도에 대응하는 탁도의 감쇠 변화점은 겔 입자의 생성 개시점(겔화 개시 시간)에 상당하고, 겔화 개시시에 의한 감광에 수반하는 탁도 저하를 의미하는 것이라고 상정되지만, 각 투과 광도에 대응하는 탁도의 감쇠 변화점(겔 입자의 생성 개시점)은 엔도톡신 농도가 높을수록 빠르다는 것이 이해된다.
한편, 도 12 (b)에 의하면, 각 엔도톡신 농도의 시료에 대하여 산란 광도에 대응하는 산란도는 대략 일정 레벨을 유지하는 부분이 어느 시간이 되어 증가 상승하는 경향을 나타내고 있다. 이 산란도의 증가 변화점은 겔 입자의 생성 개시점(겔화 개시 시간)에 상당하고, 겔화 개시시에 의한 산란에 수반하는 산란도 증가를 의미하는 것이라고 상정되지만, 각 산란도의 증가 변화점(겔 입자의 생성 개시점)은 엔도톡신 농도가 높을수록 빠르다는 것이 이해된다.
그리고, 이들 결과로부터, 실시예 1에서 나타낸 것과 대략 같이 하여 겔화 개시점인 겔화 개시 시간을 이용하여 검량선을 작성하는 것이 가능하다. 이 경우 투과광, 산란광의 변동 성분을 양방 고려하여 겔화 개시점을 판별하도록 하면, 노이즈(noise) 등에 의한 외란을 배제하는 것이 가능하게 되어, 그만큼 겔화 개시점의 판별이 보다 정확하게 된다.
◎ 실시예 4
본 실시예는 실시예 3과 마찬가지로, 실시의 형태 4에 관계되는 겔 입자 측정 장치를 구현화한 것이지만, 실시예 3과 달리, 레이저 광원이 40mW의 적색 다이오드가 이용되고 있다. 또한, 본 실시예의 조건은 실시예 3과 대략 동일하다.
본 실시예에서는 실시예 3과 마찬가지로, 여러 가지 엔도톡신 농도(10ㆍ1ㆍ0.1ㆍ0.001pg/ml)의 시료를 첨가했을 때의 리물루스 시약에 대하여, 겔 입자 측정 장치로 투과 광도에 대응하는 탁도 및 산란 광도에 대응하는 산란도의 변화를 조사한 것이다.
결과를 도 13 (a), (b)에 나타낸다.
도 13 (a)는 여러 가지 엔도톡신 농도의 시료를 리물루스 시약에 첨가했을 때의 시간 경과에 따른 투과 광도에 대응하는 탁도를 그린 것이다.
한편, 도 12 (b)는 여러 가지 엔도톡신 농도의 시료를 리물루스 시약에 첨가했을 때의 시간 경과에 따른 산란 광도에 대응하는 산란도를 그린 것이다.
이들에 의하면, 레이저 광원(30)의 차이는 있지만, 실시예 3과 대략 동일한 결과가 얻어지고, 상술한 검량선 등의 작성에 이용 가능하다는 것이 확인되었다.
◎ 실시예 5
본 실시예는 실시의 형태 3에 관계되는 겔 입자 측정 장치(산란광 검출기(140＇)를 사용한 태양)를 보다 구현화한 것이다.
본 실시예는 실시예 2의 조건과 대략 동일한 조건을 이용하여 소정의 엔도톡신 농도(10pg/ml)의 시료를 첨가했을 때의 리물루스 시약에 대하여, 측방 산란 광도의 변화를 1회 조사한 것이다.
결과를 도 14에 나타낸다.
도 14는 엔도톡신 농도 10pg/ml의 시료를 리물루스 시약에 첨가했을 때의 시간 경과에 따른 측방 산란 광도를 그린 것이다.
동 도에 의하면, 측방 산란 광도도 대략 일정 레벨을 유지하는 부분이 어느 시간이 되어 증가 상승하는 경향을 나타내고 있다. 이 산란 광도의 증가 변화점은 겔 입자의 생성 개시점(겔화 개시 시간)에 상당하고, 겔화 개시시에 의한 산란에 수반하는 광도 증가를 의미하는 것이라고 상정된다.
<산업상의 이용 가능성>
본 발명은 리물루스 시약을 이용한 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등을 측정 대상으로 하는 겔 입자 측정 장치를 시작으로 하여, 겔화 반응에 의해 겔 입자가 생성 가능한 목적 물질 또는 기존 입자의 중합이 발생하는 반응 과정을 측정 대상으로 하는 측정 장치에 널리 적용된다.
1…시료 셀(cell) 2…교반 수단
3…코히어런트(coherent) 광원 4…투과광 검출 수단
5…투과광 변동 계측 수단 6…겔(gel) 입자 생성 판별 수단
7…산란광 제거 수단 8…항온조
9…표시 수단 S…시료
R…시약 W…혼합 용액
Bm…광

Claims (13)

  1. 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서,
    일방으로부터 타방에 걸쳐 광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀과,
    이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과,
    상기 시료 셀의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사시키는 코히어런트 광원과,
    상기 시료 셀의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원의 반대측에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중을 투과한 광을 검출하는 투과광 검출 수단과,
    이 투과광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 투과광의 변동 성분을 계측하는 투과광 변동 계측 수단과,
    이 투과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  2. 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서,
    일방으로부터 타방에 걸쳐 광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀과,
    이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과,
    상기 시료 셀의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사시키는 코히어런트 광원과,
    상기 시료 셀의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원의 반대측에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중을 투과한 광을 검출하는 투과광 검출 수단과,
    이 투과광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 투과광의 변동 성분을 계측하는 투과광 변동 계측 수단과,
    이 투과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 상태를 적어도 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비하고,
    투과광 검출 수단과 시료 셀 사이에는, 겔 입자에서 산란한 위상이 어긋난 산란광 중 투과광 검출 수단을 향하는 성분이 제거되는 산란광 제거 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    겔 입자 생성 판별 수단은 투과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 투과광의 변동 변위가 안정 상태로부터 불안정 상태로 변화하는 변화점을 겔 입자의 출현 타이밍인 생성 개시 시점으로서 판별하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    코히어런트 광원은 레이저 광원인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    시료 셀은 셀 용기 내에 시료 및 시약 용액이 직접 교반 가능한 교반 수단을 내장한 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    시료 셀은 항온조 내에 설치되는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    겔 입자 생성 판별 수단에 의한 판별 결과가 표시되는 표시 수단을 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    겔 입자 생성 판별 수단은 겔 입자의 생성 상태에 기초하여 시료 중의 목적 물질을 정량하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  9. 겔화 반응에 의해 시료 중의 목적 물질을 입자화하여 측정하는 겔 입자 측정 장치로서,
    광이 투과하는 투과부를 적어도 가지고, 측정 대상인 목적 물질이 포함되는 시료 및 상기 목적 물질의 겔화를 일으키는 시약이 포함되는 용액을 수용하는 시료 셀과,
    이 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 전체가 겔화하는 것을 억제하도록 상기 혼합 용액을 교반하는 교반 수단과,
    상기 시료 셀의 투과부의 외부에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사시키는 코히어런트 광원과,
    상기 시료 셀의 투과부의 외부에서 상기 코히어런트 광원과는 다른 부위에 설치되고, 상기 시료 셀 내의 시료 및 시약 용액으로 이루어지는 혼합 용액 중을 통과한 광을 검출하는 통과광 검출 수단과,
    이 통과광 검출 수단의 검출 출력에 기초하여 통과광의 변동 성분을 계측하는 통과광 변동 계측 수단과,
    이 통과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 상기 혼합 용액이 졸상으로부터 겔상으로 상전이하는 타이밍에 관계되는 상기 혼합 용액 내의 겔 입자의 생성 개시 시점이 적어도 포함되는 겔 입자의 생성 상태를 판별하는 겔 입자 생성 판별 수단을 구비한 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    겔 입자 생성 판별 수단은 통과광 변동 계측 수단의 계측 결과에 기초하여 통과광의 변동 변위가 안정 상태로부터 불안정 상태로 변화하는 변화점을 겔 입자의 출현 타이밍인 생성 개시 시점으로서 판별하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  11. 제9항에 있어서,
    코히어런트 광원은 상기 시료 셀의 중심쪽을 통과하도록 상기 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사하고,
    통과광 검출 수단은 시료 셀 내의 상기 혼합 용액 내를 통과하는 코히어런트 광원으로부터의 광 중 산란광을 검출하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  12. 제9항에 있어서,
    코히어런트 광원은 상기 시료 셀의 중심쪽을 통과하도록 상기 혼합 용액에 대하여 코히어런트 광을 조사하고,
    통과광 검출 수단은 시료 셀 내의 상기 혼합 용액 내를 통과하는 코히어런트 광원으로부터의 광 중 투과광 및 산란광을 검출하는 것인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
  13. 제1항 또는 제9항에 있어서,
    측정 대상인 목적 물질이 엔도톡신이고, 이것을 겔화하는 시약이 리물루스 시약인 것을 특징으로 하는 겔 입자 측정 장치.
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