JP4886785B2 - ゲル化測定装置および試料セル - Google Patents
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Description
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなどの測定対象の試料中の濃度をゲル化現象過程を検出することにより測定するゲル化測定装置および試料セルに関するものである。
エンドトキシン（細胞内毒素）とは、グラム陰性菌の細胞壁を構成するリポポリサッカライド（リン脂質と多糖類の高分子複合体）でリピドＡと呼ばれる脂質と多糖鎖が2-ケト-3-デオキシオクトン酸(ＫＤＯ)を介して結合したリポ多糖(ＬＰＳ)である。細菌の死などによって細胞壁が壊れてはじめて放出される。エンドトキシンは生体にさまざまな作用をおよぼす、特に発熱や致死的な敗血症やショックを引き起こす有害物質であり、さらに、ＤＩＣ(播種性血管内凝固症侯群)の誘因の一つであると考えられている。また、医薬品（注射剤等）や医療用具（血管カテーテル等）は内毒素による汚染がないこと（パイロジェンフリー）が重要であり、細菌を用いて調製した医薬品（組み換えタンパク質、遺伝子治療に用いるDNAなど）では内毒素を完全に除去することが不可欠となっている。
このエンドトキシンの除去確認、あるいは救急医学における計測は、測定試料数の多さばかりでなく、救命治療という目的にかなった迅速性が求められている。
１９６４年にＬｅｖｉｎとＢａｎｇが、カブトガニの血球抽出成分がエンドトキシンによって凝固（ゲル凝固）することを発見した。この現象を利用したエンドトキシン検出法はリムルステストと呼ばれ、さらにゲル化現象を測定する手法としてはゲル凝固する検体溶液の希釈倍率からエンドトキシン濃度を測定するゲル化法や、ゲル化反応に伴う濁度変化よりエンドトキシン濃度を測定する比濁法が知られている。また、凝固過程における凝固前駆物質（コアギュロゲン）の代わりに発色合成基質（Boc-Leu-Bly-Arg-p-ニトロアリニド）を加えることにより、その加水分解でｐ-ニトロアニリンが遊離され、その黄色発色の比色によりエンドトキシン濃度を測定する発色合成基質法なども知られている。
また、リムルス試薬反応の過程を光学的に測定する、特に、ゲル化反応に伴う透過光量変化を測定する比濁法に基づく測定を行なう構成が知られており、たとえば、検体とリムルス試薬を混合させた混合液の透過光強度の経時変化を測定して得られる所定時間における変化量から検体のエンドトキシン濃度を測定する構成が知られている（下記の特許文献１）。
なお、同様のゲル化反応を利用した測定技術は、エンドトキシンのみならず、β−Ｄグルカン（β−Ｄ glucan）などの測定にも利用される。
β−Ｄグルカン（β−Ｄ glucan）は真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄグルカンを測定することにより、カンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。
β−Ｄグルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ−Ｄグルカンによって凝固（ゲル凝固）することが利用されており、上記同様にゲル化法や比濁法、発色合成基質法によって測定される。
エンドトキシンやβ−Ｄグルカンの測定手法には共通点があり、たとえば、ほぼ同様の測定ハードウェアを用い、カブトガニの血球抽出成分中からＦａｃｔｏｒ Ｇ成分を除くことによりエンドトキシンに選択的なゲル化反応や発色反応が測定でき、また、試料中のエンドトキシンを前処理により不活化することにより、β−Ｄグルカンに選択的なゲル化反応や発色反応を測定することができる。
特開２００４−９３５３６号公報
従来のリムルステストにおいては、次のような問題がある。
上記のうち、ゲル化法は、リムルス試薬液に試料を加え一定温度で静置して流動性の低いゲルが生成するまでの時間を測定する方法である。また、比濁法は同様にゲル化反応に伴う濁度変化を透過光量の変化としてとらえ、透過光量が反応開始からある一定の割合だけ変化するまでの時間をゲル化時間として測定する方法である。
上記いずれの方法ともゲルが生成するのに約９０分という長時間を要する。すなわち、反応溶液のゲル化時間は、測定対象の物質の濃度に比例するが、ゲル化法および比濁法共に感度の点から正確なゲル化開始時間が検出できないため、ゲル化終了までの時間から反応量を算出して、ゲル化時間の目安を得ている。したがって、ゲル化法および比濁法は共に救急を要する場合や多数の検体を測定するのに適した方法ではない。さらに、比濁法ではエンドトキシンとは無関係の非特異的濁りが生じることがあり、測定精度に欠ける。また、ゲル化法の測定限界濃度は３pg/ml、比濁法の測定限界濃度は１pg/ml程度である。
一方、発色合成基質法はゲル化法および比濁法にくらべ測定時間は３０分と短時間であるが、偽陽性反応が生じる場合があり、特異度の高い測定を行なうことが難しく、また、測定準備が煩雑であり、測定限界濃度も3pg/mlと比濁法に劣る。
本発明の課題は、上記問題を解決し、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなど、ゲル化反応により測定される物質の濃度を短時間で高感度に且つ、特異的に測定できるようにすることにある。
以上の課題を解決するため、本発明によれば、ゲル化反応によって試料中のエンドトキシン又はβ−Ｄグルカンの濃度を測定するゲル化反応測定装置において、
エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンを含む検体と該エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンによりゲル化を生じる試薬を含む溶液を収容する試料セルと、
レーザ光源からレーザ光束を前記試料セルに照射する手段と、
前記試料セル中の溶液を攪拌して微小かつ均一なゲル粒子を生成させ、前記レーザ光束中を通過させる手段と、
前記試料セル中で生成する個々のゲル粒子の前記レーザ光束による散乱光を受光する受光素子と、
前記受光素子の散乱光検出出力に基づき、ゲル粒子の径と数を時系列的に計測する計測手段と、
計測されたゲル粒子の散乱光強度あるいは径とその数を表示する手段とを備えた構成を採用した。
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また、本発明の試料セルにおいては、エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンによりゲル化を生じる試薬、および試料投入後の試料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により密閉された容器から構成される構成を採用した。
上記構成によれば、試料セル中で生成する個々のゲル粒子のレーザ光束による散乱光を受光し、その散乱光検出出力に基づき、ゲル粒子の径と数を時系列的に計測する構成を採用しており、透過光を用いた従来の比濁法に準ずる測定方式に比して、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなど、ゲル化反応により測定される物質の濃度を短時間で高感度に且つ、特異的に測定することができる。
また、試料セルを、エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンによりゲル化を生じる試薬、および試料投入後の試料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により密閉された容器から構成することにより、運搬あるいは取り扱い中にエンドトキシン又はβ−Ｄグルカンが試料中に混入することにより測定誤差を生じる可能性を低減しつつ、上記の高感度な測定を可能とする。
１１ 半導体レーザ
１２ 集光レンズ
１３ 試料セル
１４ 発光ダイオード（ＬＥＤ）
１５ マグネチックスターラー
１６ 試料溶液
１７ 受光レンズ
１８ フォトダイオードアレイ
１９ 増幅器
２０ ＡＤ変換器
２１ コンピュータ
２２ フォトダイオード
２５ スターラーバー（攪拌棒）
７７ ピンホール
８５ 演算増幅器
８７ 絶対値回路
９０＿１、９０＿２〜９０＿ｎ ウインドコンパレータ
９１＿１、９１＿２〜９１＿ｎ カウンタ
１３１ 容器
１３２ 密閉部材
１３３ リムルス試薬
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１３３ リムルス試薬
以下、本発明を実施するための最良の形態の一例として、エンドトキシンの濃度をリムルス試薬を用いたゲル化反応を検出することにより測定する測定装置に関する実施例を示す。
図１に本発明を採用した測定装置の構成を示す。図１において、半導体レーザ１１から照射される散乱光強度測定のためのレーザ光は集光レンズ１２によってシート光にコリメートされ、試料セル１３（たとえばガラス製）内の内壁近傍に照射される。また、透過光測定のため、発光ダイオード（ＬＥＤ）１４の光を試料セル１３に照射し、その透過光をフォトダイオード２２により受光する。
試料セル１３内の試料溶液１６は、微小かつ均一なゲル粒子を生成させるため、３７℃の一定温度に保たれスターラーバー（攪拌棒）２５およびマグネチックスターラー１５によって１０００ｒｐｍで回転攪拌される。
試料溶液１６中のゲル粒子からの散乱光は、受光レンズ１７を介して複数の受光素子のフォトダイオードからなるフォトダイオードアレイ１８によって測定され、測定結果は電気信号として出力される。
フォトダイオードアレイ１８のフォトダイオードには、統計学的にゲル粒子１個のみが測定できる観察領域からの散乱光を受光できる受光面積のものを用いる。フォトダイオードアレイ１８の出力は増幅器１９により電流電圧変換された後、ＡＤ変換器２０によりＡＤ変換され、コンピュータ２１に入力される。また、フォトダイオード２２が検出する透過光も不図示の同様の増幅／ＡＤ変換を経てコンピュータ２１に入力される。
デジタル信号に変換された散乱光測定信号は、たとえばパーソナルコンピュータのハードウェアなどを用いて構成したコンピュータ２１により信号処理される。コンピュータ２１は、不図示のキーボード、マウスなどの操作装置、測定結果表示用のディスプレイ、あるいはさらにプリンタなどの出力装置、他の装置と測定結果あるいは測定に関する情報を入出力するネットワークインターフェースなどが含まれる。
図４は、図１の散乱光測定系の構成を詳細に示している。
試料溶液からの散乱光は図１のレンズ１７を介してフォトダイオードアレイ１８を構成する複数の受光素子のフォトダイオード１８ａ〜１８ｄによって電気信号として測定される。各々のフォトダイオードの前部には、測定対象のゲル粒子１個のみが測定できる観察領域からの散乱光を受光するためにピンホール７７が配置される。フォトダイオード１８ａ〜１８ｄの出力は増幅器１９により電流電圧変換、増幅後、ＡＤ変換器２０によりＡＤ変換されてコンピュータ２１に入力される。
なお、各ピンホール７７のサイズを決定するために必要な測定対象のゲル粒子１個のサイズはあらかじめ行なった測定結果から統計的に演算して決定することができる。
コンピュータ２１では、ゲル粒子の粒径に応じて設けられた複数のコンパレータにより散乱光強度信号のレベルが識別され、コンパレータから出力信号をカウンタにより計数することにより所定の粒径のゲル粒子が何個あったかが測定される。その場合、ゲル粒子の一部がピンホール７７の縁部を通過することにより誤って計測されるゲル粒子の粒径は、統計的確率論と標準粒子の測定結果からとの式を用いたコンピュータの測定ソフトによって補正される。
図５は、ゲル化測定過程において、図４のフォトダイオード１８ａ〜１８ｄで測定される散乱光強度信号の変化状態を示す。ゲル粒子からの散乱光は、粒子の大きさに相関したピーク信号８３ａ〜８３ｄとして測定され、試料溶液の他の部分からの散乱光はバックグランド信号８４ａ〜８４ｄとして測定される。
そこでこのバックグランド信号の影響をなくするために、図６に示すように、２個の受光素子のフォトダイオード１８ａ、１８ｂからの各々の出力信号がそれぞれ演算増幅器８５に入力され減算される。これによりバックグランド信号が相殺され、８６で示すようにゲル粒子のみからの散乱光強度変化のみが測定される。このバックグランド信号が除去された信号は絶対値回路８７に入力される。絶対値回路８７の出力は符号８８に示すように、バックグランドのないピーク信号だけの信号となる。
この絶対値回路からの出力信号はそれぞれウインドコンパレータ９０＿１、９０＿２．．．９０＿ｎに入力され、そのレベルが識別される。各コンパレータはゲル粒子の粒径に対応したレベル比較を行なうので、コンパレータの各出力はゲル粒子の粒径に対応した信号となっている。この信号がそれぞれカウンタ９１＿１、９１＿２．．．９１＿ｎでカウントされ、その粒径のゲル粒子の数が計数される。この計数されたデータは演算回路９２に（あるいはコンピュータ２１に直接）入力され、後述のゲル粒子の測定処理に用いられる。
図１のコンピュータ２１によりゲル粒子の散乱光強度あるいは径とその数を計測し、ディスプレイに表示出力するとともに、式
Ｘ＝Σ（ωk・Ｐk） （１）
（ただし、ωkは散乱強度Ｐkの粒子に付加する重み係数）により、時間当たりの総散乱強度Xtを演算し、不図示のディスプレイにより結果を表示する。
Ｘ＝Σ（ωk・Ｐk） （１）
（ただし、ωkは散乱強度Ｐkの粒子に付加する重み係数）により、時間当たりの総散乱強度Xtを演算し、不図示のディスプレイにより結果を表示する。
また、測定目的の物質を含む検体とゲル化を生じる試薬を含む溶液を試料セル１３に入れ、測定を開始した後、一定以上の総散乱強度Xtが計測されるまでの時間TL（遅延時間）と、このTLと試料液中の測定対象物質の量（濃度）との相関より目的の物質の濃度をコンピュータにより演算し、表示する。
さらに、ゲル化反応で生成するゲル粒子の生成速度V（V=ｄXt／ｄｔ）の最大値Vmaxと、このVmaxと試料液中の測定対象物質の量（濃度）との相関より目的の物質の濃度をコンピュータにより演算し、表示する。
また、ゲル化反応で生成するゲル粒子の最大生成量Xmaxと試料液中の測定対象物質の量（濃度）との相関より目的の物質の濃度をコンピュータにより演算し、表示する。
以下、本発明を採用した測定装置を用いたエンドトキシンの測定例を示す。
図２Aに、エンドトキシン 0.00ｐｇ／ｍｌを含む試料の測定結果を、図２Bにエンドトキシン０.３１ｐｇ／ｍｌを含む試料の測定結果を、図２Cにエンドトキシン１.２５ｐｇ／ｍｌを含む試料の測定結果を、図２Dにエンドトキシン ５.00ｐｇ／ｍｌを含む試料の総散乱光強度、および透過率の測定結果を示す。
この測定においては、図１の装置の試料セル１３にエンドトキシンを含む試料とリムルス試薬を投入し、撹拌を開始するとともに、その間、フォトダイオードアレイ１８〜増幅器１９〜ＡＤ変換器２０〜コンピュータ２１により、散乱光測定を行なう。また、同一の試料に対して、従来の比濁法における測定を検証するために、発光ダイオード（ＬＥＤ）１４〜フォトダイオード２２を用いて透過光測定を行なう。
測定期間中、コンピュータ２１は、ゲル化反応に伴うゲル粒子の総散乱強度Ｘｔの時系列的変化をディスプレイに表示する。また、一定以上の総散乱強度Ｘｔが計測されるまでの時間ＴＬ、ゲル粒子の生成速度の最大値Ｖｍａｘおよびゲル化反応で生成するゲル粒子の最大生成量Ｘｍａｘとを演算し、ディスプレイに表示する。さらに、試料の透過率変化も同時に測定、演算し、ディスプレイに表示する。
図２Ａに見られるように、エンドトキシンを含まない試料において、透過率は徐々に減少している。したがって、従来の透過率を測定する比濁法ではエンドトキシンとは無関係の非特異的濁りが検出される問題となって現われる。その一方で、図２Ａの試料から本装置で測定された総散乱光強度は全く変化しておらず、総散乱光強度を利用する本発明のレーザ粒子散乱計測では、非特異的濁りを測定しないことが判る。図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄの各試料の測定においても、上記のような非特異的濁りが比濁法では透過率の減少を介して検出されてしまう。
一般に、比濁法では比濁時間分析法という手法が採用されており、透過率がある一定の値（ゲル化判定閾値）になるまでの時間（ゲル化時間）とエンドトキシン濃度の相関より、試料中のエンドトキシン量を測定している。この手法の欠点は、ゲル化判定閾値を小さく設定すると、低濃度のエンドトキシンの測定が不可能となり、また、ゲル化判定閾値を大きく設定すると非特異的濁りをエンドトキシン量として誤って測定し、測定精度が悪くなる問題がある。たとえば図２Ｂにおいて、ゲル化判定閾値を透過率７０％と小さく設定すると、低濃度のエンドトキシン０．３１ｐｇ／ｍｌの測定値を求めることが不可能となる。或いは、透過率が７０％に達するまで測定時間を延長し、エンドトキシン濃度を求めることも可能であるが、測定に長時間を要する。
また、たとえば図２Ａにおいて、ゲル化判定閾値を透過率９０％と大きく設定すると、低濃度のエンドトキシンを短時間に測定することができるが、非特異的濁りをエンドトキシン量として誤って測定してしまう。このように、比濁時間分析法は、精度と測定時間が相反する手法であるといえる。
これに対して、本発明のように総散乱光強度を測定する手法を採用することで、非特異的濁りの発生に影響されることなく、短時間で精度の高いエンドトキシン測定を実現することができる。
図３Ａ〜図３Ｃに上記エンドトキシン測定において演算、表示された総散乱強度Ｘｔの遅延時間ＴＬおよびその逆数１／ＴＬ、最大生成速度Ｖｍａｘとエンドトキシン濃度との測定結果を示す。
図３Ａにおいて、遅延時間ＴＬとエンドトキシン濃度０．０３１ｐｇ／ｍｌ、０．０６３ｐｇ／ｍｌ、０．１２５ｐｇ／ｍｌ、０．２５ｐｇ／ｍｌ、０．５０ｐｇ／ｍｌ、１．０ｐｇ／ｍｌおよび２．０ｐｇ／ｍｌとの関係は負の傾きの直線関係にある。
また、図３Ｂに示すように遅延時間の逆数１／ＴＬとエンドトキシン濃度は正の傾きの直線関係にあり、さらに、図３Ｃにおいて最大生成速度Ｖｍａｘとエンドトキシン濃度０．３１ｐｇ／ｍｌ、０．６３ｐｇ／ｍｌ、１．２５ｐｇ／ｍｌ、２．５ｐｇ／ｍｌ、５．０ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌとの関係は負の傾きの直線関係にある。
以上に示したように、本発明の測定装置では、０．０３１ｐｇ／ｍｌと極めて低濃度のエンドトキシンの測定が可能である。また、本発明の測定装置によれば、従来技術の比濁法の最小測定感度が０．３ｐｇ／ｍｌであるのに比して、１０倍の高感度測定が可能となる。また、本発明の測定装置では、エンドトキシン０．３ｐｇ／ｍｌの測定時間は約３０分であり、従来技術の比濁法に比べ３分の１の短時間で測定ができる。すなわち、本発明の測定技術によれば、ゲル化反応により測定されるエンドトキシンの濃度を短時間で高感度に且つ、特異的に測定することが可能となる。
なお、上記実施例では、試料セル１３にリムルス試薬と試料をそれぞれ投入する旨説明した。
しかしながら、上述のように本発明では従来技術より約１０倍程度、測定感度が高いため、試料セル廻りの構造を工夫してエンドトキシン・フリーの度合を高めておく必要があると考えられる。
すなわち、エンドトキシンは通常環境中においても多く存在しており、試薬製造工程中、あるいは測定操作中に幾許かのエンドトキシンが試料セル内に混入する可能性は決して否めない。
したがって、たとえば、試料セル１３の一端がリムルス試薬と試料をそれぞれ投入できるように開放されている、あるいは開閉可能となっているような従来技術で想定されていたエンドトキシン・フリーのレベルでは、本発明の測定装置がエンドトキシンを含まない検体でも混入したエンドトキシンの影響でエンドトキシン陽性を検出する可能性がある。
そこで、図７に示すように、試料セル１３を、樹脂やガラスなどから成る容器１３１中にスターラーバー（攪拌棒）２５と、必要量のリムルス試薬１３３を収容し、上部を密閉部材１３２で密閉した構成が考えられる。
密閉部材１３２の様式は任意であるが、もちろん運搬中や取り扱いの過程でエンドトキシンが混入しないような仕様の部材を用いる。
試料セル１３内への測定試料（検体）の導入は、たとえば密閉部材１３２を注射針などで穿孔して注入するなどの方式が考えられる。あるいは測定試料（検体）の導入を容易にするため、試料セル１３内が大気圧に対して一定の負圧レベルを保つように密閉部材１３２の密閉仕様を決定しておいてもよい。
もちろん、図７のような試料セル１３は、一定のエンドトキシン・フリー・レベルを達成した製造環境で組立てられるのはいうまでもない。
図７に示すように構成した試料セル１３は、図１、図４〜図６に示した測定装置の付属品や製品ファミリーの一部を構成するたとえば測定キットのような製品としてユーザに供給することができ、その場合、所定のエンドトキシン・フリー・レベルを満たした測定環境を容易に形成することができ、精度の高い測定結果を安定して達成することができる。
なお、図７では、１検体（試料）ぶんのみの試料セルの構成を示したが、同様の構成を多数、一体化し、多数の検体（試料）を同時に測定できるような製品を構成することも容易である。その場合、図１に示した測定装置側の構成も複数の各試料セルに対応した数、必要になるのはいうまでもない。
また、以上の実施例では、測定対象の物質をエンドトキシンと考えたが、同じ測定ハードウェアを、同様ないし類似のリムルス試薬を用いたβ−Ｄグルカンの測定など、ゲル化現象過程を検出する同様の測定処理に応用できることはいうまでもない。
本発明は、リムルス試薬を用いたエンドトキシンやβ−Ｄグルカンなどの測定対象の試料中の濃度をゲル化現象過程を検出することにより測定する種々の測定装置において実施することができる。
Claims (7)
- ゲル化反応によって試料中のエンドトキシン又はβ−Ｄグルカンの濃度を測定するゲル化反応測定装置において、
エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンを含む検体と該エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンによりゲル化を生じる試薬を含む溶液を収容する試料セルと、
レーザ光源からレーザ光束を前記試料セルに照射する手段と、
前記試料セル中の溶液を攪拌して微小かつ均一なゲル粒子を生成させ、前記レーザ光束中を通過させる手段と、
前記試料セル中で生成する個々のゲル粒子の前記レーザ光束による散乱光を受光する受光素子と、
前記受光素子の散乱光検出出力に基づき、ゲル粒子の径と数を時系列的に計測する計測手段と、
計測されたゲル粒子の散乱光強度あるいは径とその数を表示する手段とを備えたことを特徴とするゲル化反応測定装置。 - 前記受光素子が測定粒子のほぼ１個からの散乱光を受光するように構成されることを特徴とする請求項１に記載のゲル化反応測定装置。
- 複数個の受光素子が設けられ、その受光素子に対応した散乱光が同時に測定されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のゲル化反応測定装置。
- 前記受光素子の一対からの出力を減算して有効信号の割合を増大させることを特徴とする請求項３に記載のゲル化反応測定装置。
- 前記計測手段は、式
Ｘ＝Σ（ωk・Ｐk）
（ただし、ωkは散乱強度Ｐkの粒子に付加する重み係数）から時間ｔ当たりのゲル粒子数Ｘｔを求めることを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載のゲル化反応測定装置。 - 請求項１〜５に記載のゲル化反応測定装置で用いられる前記試料セルにおいて、エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンによりゲル化を生じる試薬、および試料投入後の試料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により密閉された容器から構成されることを特徴とする試料セル。
- エンドトキシン又はβ−Ｄグルカンの含有レベルが所定以下の環境において、前記試薬および前記攪拌手段の封入が行なわれることを特徴とする請求項６に記載の試料セル。
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