KR20110045022A - 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법 및 측정 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의 생물 유래의 생리활성 물질과 LAL과의 반응을 이용하여 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 농도를 측정할 때에, 측정 시간의 대폭적인 단축이 가능한 측정 방법, 및 이를 이용한 측정 장치를 제공한다. 광원으로부터의 입사광을 시료에 집광시켜 조사하여, 프로테아제 캐스케이드의 최종산물인 코아굴린 자체(코아굴린 단량체), 및 이들이 회합하여 생긴 매우 미소한 회합물(코아굴린 응집물)과 충돌시켜 산란광을 생성시키고, 수광 소자로 검출한다. 그리고, 검출한 산란광의 초기 증가율로부터 엔도톡신의 농도를 도출한다.
Description
본 발명은 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등, LAL과의 반응에 의해 겔화하는 특성을 가지는 생물 유래의 생리활성 물질을 함유하는 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 그의 농도를 측정하기 위한 측정 방법 및 측정 장치에 관한 것이다.
엔도톡신은 그램 음성균의 세포벽에 존재하는 리포 다당으로, 가장 대표적인 발열성 물질이다. 이 엔도톡신에 오염된 수액, 주사약제, 혈액 등이 인체에 들어가면, 발열이나 쇼크 등이 중증 부작용을 야기할 우려가 있다. 이 때문에, 상기 약제 등은 엔도톡신에 의해 오염되는 일이 없도록 관리하는 것이 의무로 되어 있다.
그런데, 투구게의 혈구 추출물(이하, "LAL: Limulus amoebocyte lysate"라고도 함) 중에는 엔도톡신에 의해 활성화되는 세린 프로테아제가 존재한다. 그리고, LAL과 엔도톡신이 반응할 때에는 엔도톡신의 양에 따라 활성화된 세린 프로테아제에 의한 효소 캐스케이드에 의해, LAL 중에 존재하는 코아굴로겐이 코아굴린으로 수해되어 회합하여 불용성의 겔이 생성된다. 이 LAL의 특성을 이용하여 엔도톡신을 고감도로 검출하는 것이 가능하다.
또한, β-D-글루칸은 진균에 특징적인 세포막을 구성하고 있는 폴리사카라이드(다당체)이다. β-D-글루칸을 측정함으로써 칸디다나 아스퍼질러스, 크립토코커스와 같은 일반 임상에서 자주 볼 수 있는 진균뿐만 아니라, 드문 진균도 포함하는 광범위에서 진균 감염증의 스크리닝 등에 유효하다.
β-D-글루칸의 측정에 있어서도, 투구게의 혈구 추출 성분이 β-D-글루칸에 의해 응고(겔 응고)하는 특성을 이용하여 β-D-글루칸을 고감도로 검출하는 것이 가능하다.
이 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의, 투구게의 혈구 추출 성분에 의해 검출 가능한 생물 유래의 생리활성 물질(이하, 소정의 생리활성 물질이라고도 함)의 검출 또는 농도 측정을 행하는 방법으로서는 다양한 방법이 제안되어 있다. 그 중 하나는 소정의 생리활성 물질의 검출 또는 농도 측정(이하, 단순히 "소정의 생리활성 물질의 측정"이라고도 함)을 해야 할 시료와 LAL을 혼화한 혼화액을 정치시키고, 일정 시간 후에 용기를 전도시켜 시료의 흘러 떨어짐 유무에 의해 겔화되었는지의 여부를 판정하고, 시료에 일정 농도 이상의 엔도톡신이 포함되는지의 여부를 조사하는 반정량적인 겔화법이다. 그 밖에는 LAL과 소정의 생리활성 물질과의 반응에 의한 겔의 생성에 따른 시료의 탁함을 경시적으로 계측하여 해석하는 비탁법(turbidimetric method)이나, 효소 캐스케이드에 의해 수해되어 발색하는 합성 기질을 이용하는 비색법(calorimetric method) 등이 있다.
상기 비탁법에 의해 소정의 생리활성 물질의 측정을 행하는 경우에는 건열 멸균처리된 유리제 측정 셀에 측정 시료와 LAL과의 혼화액을 생성시킨다. 그리고, 혼화액의 겔화를 외부로부터 광학적으로 측정한다. 그러나, 비탁법에서는 특히 소정의 생리활성 물질의 농도가 낮은 시료에 있어서 LAL이 겔화되기까지 매우 많은 시간을 요하는 경우가 있다. 이에 대하여 소정의 생리활성 물질의 단시간 측정이 가능한 방법이 요구되고 있다. 그의 예로서는, 측정 시료와 LAL과의 혼화액을 예를 들면 자성 교반자를 이용하여 교반함으로써, 겔 미립자를 생성시키고, 겔 입자에 의해 산란되는 레이저광의 강도, 또는 혼화액을 투과하는 빛의 강도로부터, 시료 중의 소정의 생리활성 물질의 존재를 단시간에 측정할 수 있는 레이저 산란 입자 계측법, 또는 교반 비탁법이 제안되어 있다.
상기 다양한 방법에 의해, 소정의 생리활성 물질의 검출 시간 또는 측정 시간의 단축이나 측정 감도의 향상이 도모되고 있지만, 어느 방법이든 장점, 단점을 함께 가지고 있어, 측정 시간의 단축이나 고감도화, 방해 물질의 배제 등의 면에서 추가적인 개량이 요망되었다.
본 발명은 상술한 문제점을 감안하여 안출된 것으로서, 그의 목적으로 하는 바는 생물 유래의 생리활성 물질의 검출 또는 농도 측정에 있어서 측정 시간의 단축이 가능한 측정 방법, 및 이를 이용한 측정 장치를 제공하는 것이다.
본 발명에서 발명자는 프로테아제 캐스케이드의 최종산물인 코아굴린 자체(코아굴린 단량체), 및 이들이 회합하여 생긴 극히 미소한 회합물(코아굴린 응집물)을 직접 검출하는 것이 측정 시간의 단축으로 결부된다고 생각하였다. 또한, 빛을 소정의 생리활성 물질의 측정을 행하는 시료와 LAL과의 혼화액에 조사하여 혼화액 중의 입자와 충돌시켜 산란광을 생성시키고, 수광 소자로 검출한 산란광의 증가율로부터 소정의 생리활성 물질의 농도를 검출하거나 또는 농도를 측정하는 것을 최대의 특징으로 한다.
즉, 본 발명은 소정의 생리활성 물질과 LAL과의 혼화액에 빛을 조사하여 상기 혼화액 중의 입자와 충돌시켜 산란광을 생성시킨 경우에, 수광 소자로 검출한 산란광의 증가율은 소정의 생리활성 물질의 농도에 의존하고 있다는 발명자의 예의 연구에 의해 얻어진 새로운 식견에 기초한 것이다.
또한, 본 발명은 비색법과 같은 특수한 시약을 이용하지 않는 비탁법을 기초로 하고 있지만, 소정의 생리활성 물질에 의한 LAL의 겔화 반응의 매우 초기에 발생하는, 수용성 단백질의 코아굴로겐으로부터 소수성으로 변화된 코아굴린 단량체, 및 단량체가 몇개 응집된 올리고머를 산란광으로 검출함으로써, 비색법과 같은 미분법을 판정에 응용하는 것이다.
본 발명은 보다 상세하게는, 시료 중에 존재하는 생물 유래의 생리활성 물질과 투구게의 혈구 추출물인 LAL을 반응시킴으로써, 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 상기 생리활성 물질의 농도를 측정하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법이며,
상기 시료와 LAL과의 혼화 후에, 상기 시료와 LAL과의 혼화액 중에 빛을 입사함과 동시에 상기 입사광의 상기 혼화액에 의한 산란광 강도를 취득하고,
상기 산란광 강도의 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법이다.
이에 따르면, 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등과 LAL과의 혼화 후에 혼화액에 빛을 입사한 경우의, 산란광 강도의 증가율을 취득함으로써 이들의 검출 및 농도 측정이 가능해진다. 따라서, 비탁법을 이용한 경우와 같이, 취득하는 물리량이 미리 정해진 임계치를 초과하는 것을 기다릴 필요가 없어져, 보다 빠른 시기에 소정의 생리활성 물질의 검출 또는 농도의 측정을 행하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명에서는 상기 산란광 강도의 증가율이 소정의 급변화를 일으키기 전에 있어서의 상기 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 농도를 측정하도록 할 수도 있다.
여기서, 본 발명에서는 소정의 생리활성 물질에 의한 LAL의 겔화 반응의 매우 초기에 발생하는, 코아굴린 단량체 및 단량체가 몇개 응집된 올리고머의 생성을 산란광에 의해 검출하고 있다. 이 검출에 대해서는, 산란 입자가 매우 작아 입사광의 파장 이하의 크기이기 때문에, 이 때의 산란광은 주로 레일리 산란에 기초하는 것으로 생각된다. 또한, 그 후에 입자가 성장하면, 산란광은 주로 미(Mie) 산란에 기초한 것으로 변화한다.
그렇게 하면, 초기의 입자계가 작은 영역에서의 레일리 산란으로부터 입자계의 성장에 따라 미 산란으로 이행함에 있어서, 산란광의 증가율이 급격히 변화하는 점이 나타난다.
이에 반해, 본 발명에서는 산란광 강도의 증가율이 소정의 급변화를 일으키기 전에 있어서의 증가율, 즉 주로 레일리 산란에 기초한 산란광의 증가율을 검출하는 것으로 했기 때문에, 보다 정확하게 소정의 생리활성 물질에 의한 LAL의 겔화 반응의 매우 초기에 발생하는 코아굴린 단량체 및 단량체가 몇개 응집된 올리고머로부터의 산란광의 증가율을 취득하는 것이 가능해진다. 그 결과, 보다 정확하게 소정의 생리활성 물질의 검출 및 농도의 측정을 행하는 것이 가능해진다.
즉, 본 발명에서 검출하는 것은 상술한 바와 같이 매우 소직경의 입자로부터의 미약한 산란광이기 때문에, 입사하는 빛의 출력 밀도는 되도록 높은 것이 바람직하다. 그리고, 출력 밀도는 50 mW/mm2 이상이면 양호한 검출이 가능함을 새롭게 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 혼화액에 입사하는 빛의 출력 밀도는 50 mW/mm2 이상인 것이 바람직하다. 이 출력 밀도는 광원의 출력으로 조정해도 상관없고, 입사광 직경을 보다 작게 좁힘으로써 조정하여도 상관없다.
또한, 본 발명에서는 상기 혼화액에 입사하는 빛의 파장은 300 nm 이상 800 nm 이하가 되도록 할 수도 있다. 즉, 레일리 산란의 산란광 강도는 입사광의 파장에 의존성을 보이고 있어 파장이 짧을수록 검출에는 유리함을 알 수 있다. 한편, 극단적으로 짧은 파장은 LAL의 기능에 악영향을 미칠 우려가 있고, 또한 광학 소자 등의 소재를 단파장에 대응시킬 필요가 생기는 등의 문제도 있을 수 있다. 이러한 상황 하에 상기와 같은 범위의 파장을 이용함으로써, 양호한 측정을 실현하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에서는 상기 산란광 강도의 증가율을 취득할 때, 소정 기간에 취득된 산란광 강도를 복수개 샘플링하여 비교하고, 그 중 최소치 또는 막대 그래프의 최빈치를 상기 기간에서의 산란광 강도로 할 수도 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 소정의 생리활성 물질에 의한 LAL의 겔화 반응의 매우 초기에 발생하는 매우 소직경의 입자로부터의 산란광 강도의 증가율을 측정한다. 한편, 혼화액 중에는 시약의 용해 잔류물, 시약의 제조 방법상 잔존하는 마이크로미터 수준의 미립자, 시료의 교반에 따른 미소한 기포 등의 협잡물이 존재하는 경우가 있다. 이들 협잡물로부터의 산란광은 수는 적지만 매우 강력하기 때문에 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물 등으로부터 산란하는 미약한 신호가 이들 협잡물로부터의 산란광에 파묻혀 측정이 불가능해지는 경우가 있다.
이에 반해, 본 발명에서는 소정 기간에 취득된 산란광 강도를 복수개 샘플링하여 비교하고, 그 중 최소치 또는 막대 그래프의 최빈치를 상기 기간에서의 산란광 강도로 하는 필터를 걸기로 하였다. 협잡물로부터의 강력한 산란광이 발생하는 빈도 자체는 적기 때문에, 소정 기간 중에 샘플링된 산란광 강도 중 최소치 또는 막대 그래프의 최빈치를 선택함으로써, 상기 협잡물로부터의 산란광의 영향을 제거할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 산란광 강도를 취득할 때, 상기 혼화액을 교반하도록 할 수도 있다.
혼화액을 교반하지 않고 정치한 경우에는 비탁법과 마찬가지로 최종적으로는 시료가 겔화하기 때문에 산란광의 증가가 보이지만, 반응 초기의 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물에 의한 산란광의 증가를 검출하는 것은 곤란한 경우가 있다. 혼화액을 교반함으로써, 반응의 균일화, 반응의 촉진, 생성된 코아굴린 단량체의 올리고머로의 신속한 동원(conversion) 등을 효율적으로 행하는 것이 가능해진다. 또한, 상술한 바와 같은 혼화액 중의 시약의 용해 잔류물, 시약의 제조 방법상 잔존하는 마이크로미터 수준의 미립자, 미소한 기포 등이 산란 영역에 정체함으로써, 산란광 강도의 예상치 못한 증가를 초래하여 측정 정밀도를 저하시키는 것을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 혼화액의 교반 속도는 300 rpm 이상 3000 rpm 이하로 할 수도 있다.
여기서, 상기 교반 속도가 너무 작으면 시료 전체의 교반을 행할 수 없다. 한편, 교반 속도가 너무 크면, 시료 중에 기포가 혼입되기 쉬워지거나, 코아굴린 단량체가 응집해 가는 과정을 저해하여 측정에 악영향을 미치는 경우가 있다. 그 때문에, 혼화액의 교반 속도를 상기 범위로 함으로써, 마이크로미터 수준의 미립자나 기포의 혼입을 양호하게 억제할 수 있음과 동시에, 코아굴린 단량체의 응집 과정을 저해하는 것을 회피할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 생물 유래의 생리활성 물질은 엔도톡신 또는 β-D-글루칸일 수도 있다.
그렇게 하면, 가장 대표적인 발열성 물질인 엔도톡신의 검출 또는 농도 측정을 보다 정확하게 행할 수 있어, 엔도톡신에 오염된 수액, 주사약제, 혈액 등이 인체에 들어가 부작용이 야기되는 것을 억제할 수 있다. 마찬가지로, β-D-글루칸의 검출 또는 농도 측정을 보다 정확하게 행할 수 있어, 칸디다나 아스퍼질러스, 크립토코커스와 같은 일반 임상에서 자주 볼 수 있는 진균뿐만 아니라, 드문 진균도 포함하는 광범위에서 진균 감염증의 스크리닝을 보다 정확하게 행하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명은 시료 중에 존재하는 생물 유래의 생리활성 물질과 투구게의 혈구 추출물인 LAL을 반응시킴으로써, 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 상기 생리활성 물질의 농도를 측정하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치이며,
상기 시료와 LAL과의 혼화액을 빛이 입사 가능하게 유지하고, 상기 생리활성 물질과 LAL과의 반응을 진행시키는 혼화액 유지 수단과,
상기 혼화액 유지 수단 중의 혼화액에 빛을 입사하는 광 입사 수단과,
상기 입사광의 상기 혼화액에서의 산란광을 수광하여 전기 신호로 변환하는 수광 수단과,
상기 수광 수단에서 변환된 전기 신호로부터 취득되는 상기 산란광 강도의 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질의 농도를 도출하는 도출 수단
을 구비하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치일 수도 있다.
이 측정 장치에 따르면, 엔도톡신이나 β-D 글루칸 등의 소정의 생리활성 물질의 검출 또는 농도의 측정을 보다 단시간에 행하는 것이 가능해진다.
또한, 상기 도출 수단은 상기 혼화액 유지 수단에서의 상기 시료와 LAL과의 혼화 후에, 상기 증가율이 소정의 급변화를 일으키기 전에 있어서의 상기 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질의 농도를 도출하도록 할 수도 있다. 그렇게 하면, 보다 정확하게 코아굴린 단량체 및 단량체가 몇개 응집된 올리고머로부터의 산란광의 증가율을 취득할 수 있어, 보다 정확하게 소정의 생리활성 물질의 검출 및 농도의 측정을 행하는 것이 가능해진다.
또한, 그 경우에는 상기 광 입사 수단에 의해 입사되는 빛의 출력 밀도는 50 mW/mm2 이상으로 할 수도 있다. 또한, 상기 광 입사 수단에 의해 입사되는 빛의 파장은 300 nm 이상 800 nm 이하로 할 수도 있다. 이에 따르면, 보다 효율적이고 양호한 측정을 실현하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에서는 상기 수광 수단에서 변환된 전기 신호를, 소정 기간에 복수개 샘플링하여 비교하고, 그 중 최소치를 출력하는 최소치 필터 또는 막대 그래프의 최빈치를 출력하는 최빈치 필터를 추가로 구비하도록 할 수도 있다. 이에 따르면, 혼화액으로의 다양한 협잡물로부터의 산란광의 영향을 제거할 수 있어, 보다 정확하게 소정의 생리활성 물질의 검출 또는 농도 측정을 행할 수 있다.
또한, 상기 혼화액 유지 수단은 상기 혼화액을 교반하는 교반 수단을 갖도록 할 수도 있다. 그 경우에는 상기 교반 수단에 의한 상기 혼화액의 교반 속도는 300 rpm 이상 3000 rpm 이하인 것이 바람직하다. 이에 따르면, 상기 협잡물이 산란 영역에 정체함으로써, 산란광 강도의 예기치 못한 증가를 초래하여 측정 정밀도를 저하시키는 것을 억제할 수 있음과 동시에, 코아굴린 단량체의 응집 과정을 저해하는 것을 회피할 수 있다.
상기 생물 유래의 생리활성 물질은 엔도톡신 또는 β-D-글루칸일 수도 있다.
또한, 상기한 본 발명의 과제를 해결하는 수단에 대해서는 가능한 한 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서는 엔도톡신이나 β-D-글루칸 등의 생물 유래의 생리활성 물질과 LAL과의 반응을 이용하여, 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 농도를 측정할 때에 측정 시간의 단축이 가능해진다.
도 1은 본 발명의 실시예에서의 소정의 생리활성 물질의 측정계의 개략 구성을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에서 취득된 혼화액으로부터의 산란광 강도의 시간적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 5에서의, 엔도톡신 농도와 초기 산란광 강도의 증가율과의 관계를 양대수(double logarithm)로 플롯한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 6에서의, 산란광 강도의 시간 변화, 및 엔도톡신 농도와 초기 산란광 강도의 증가율과의 관계에 대한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 7에서의, β-D-글루칸 농도와 초기 산란광 강도의 증가율과의 관계를 양대수로 플롯한 그래프이다.
도 6은 엔도톡신 또는 β-D-글루칸에 의해 LAL이 겔화하는 과정, 및 그의 검출 방법에 대하여 설명하기 위한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 2에서 취득된 혼화액으로부터의 산란광 강도의 시간적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 5에서의, 엔도톡신 농도와 초기 산란광 강도의 증가율과의 관계를 양대수(double logarithm)로 플롯한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 6에서의, 산란광 강도의 시간 변화, 및 엔도톡신 농도와 초기 산란광 강도의 증가율과의 관계에 대한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 7에서의, β-D-글루칸 농도와 초기 산란광 강도의 증가율과의 관계를 양대수로 플롯한 그래프이다.
도 6은 엔도톡신 또는 β-D-글루칸에 의해 LAL이 겔화하는 과정, 및 그의 검출 방법에 대하여 설명하기 위한 개략도이다.
LAL과 엔도톡신이 반응하여 겔이 생성되는 과정은 자주 조사되고 있다. 즉, 도 6에 나타낸 바와 같이, 엔도톡신이 LAL 중의 세린 프로테아제인 C 인자에 결합하면, C 인자는 활성화되어 활성형 C 인자가 된다. 활성형 C 인자는 LAL 중의 다른 세린 프로테아제인 B 인자를 수해하여 활성화시켜 활성화 B 인자로 한다. 이 활성화 B 인자는 즉시 LAL 중의 응고 효소의 전구체를 수해하여 응고 효소로 하고, 또한 이 응고 효소가 LAL 중의 코아굴로겐을 수해하여 코아굴린을 생성한다. 그리고, 생성된 코아굴린이 서로 회합하여 불용성 겔을 추가로 생성하고, LAL 전체가 이것에 말려들어 겔화되는 것으로 생각되고 있다.
또한, 마찬가지로 β-D-글루칸이 LAL 중의 G 인자에 결합하면, G 인자는 활성화되어 활성형 G 인자가 된다. 활성형 G 인자는 LAL 중의 응고 효소의 전구체를 수해하여 응고 효소로 한다. 그 결과, 엔도톡신과 LAL과의 반응과 마찬가지로 코아굴린이 생성되고, 생성된 코아굴린이 서로 회합하여 불용성의 겔을 추가로 생성한다.
이 일련의 반응은 포유동물에 보이는 크리스마스 인자나 트롬빈 등의 세린 프로테아제를 통한 피브린 겔의 생성 과정과 유사하다. 이러한 효소 캐스케이드 반응은 극히 소량의 활성화 인자이더라도 그 후의 캐스케이드를 연쇄하여 활성화시켜 가기 때문에 매우 강한 증폭 작용을 가진다. 따라서, LAL을 이용한 소정의 생리활성 물질의 측정법에 따르면, 서브피코그램/mL 오더의 매우 미량의 소정의 생리활성 물질을 검출하는 것이 가능해지고 있다.
소정의 생리활성 물질을 정량하는 것이 가능한 측정법으로서는 상술한 바와 같이 비탁법, 및 레이저 광산란 입자 계측법을 들 수 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 이들 측정법은 이 LAL의 효소 캐스케이드 반응에 의해 생성되는 코아굴린의 회합물을 전자는 시료의 탁함으로서, 후자는 계 내에 생성되는 겔의 미립자로서 검출함으로써, 고감도의 측정이 가능하다.
특히 레이저 광산란 입자 계측법에서는 계 내에 생성된 겔의 미립자를 직접 측정하기 때문에, 비탁법보다 고감도이면서 일반적으로 LAL과 검체로 이루어지는 시료를 강제적으로 교반하기 때문에, 비탁법과 비교하여 단시간에 겔의 생성을 검출할 수 있다.
또한, 엔도톡신의 다른 측정법으로서 비색법이 있다. 이는 도 6에 나타낸 바와 같이, LAL의 효소 캐스케이드 반응을 이용하면서도, 코아굴린 겔에 의한 시료의 탁함을 측정하는 것이 아니라, 응고 효소에 의해 수해를 받아 발색하는 합성 기질을 이용하여 합성 기질을 포함한 LAL과 검체를 반응시켜 그의 흡광도 변화를 측정하는 방법이다. 이 비색법에서는 계 내에 생성되어 가는 발색 물질의 농도를 측정하기 때문에, 시료에서의 겔의 생성을 측정하는 비탁법이나 레이저 광산란 입자 계측법과 비교하면, 단시간에 저농도의 소정의 생리활성 물질을 측정할 수 있다.
비탁법은 비색법과 달리 특별한 시약이 불필요한 점과, 측정 가능한 소정의 생리활성 물질의 농도 범위가 넓은 점 등에 있어서, 현장에서의 양호한 사용 편리성이 있다는 평가가 있다. 그러나 한편으로, 비탁법은 저농도의 소정의 생리활성 물질을 측정하는 경우에는 매우 긴 시간을 요하는 문제가 있었다. 이는 비탁법이 프로테아제 캐스케이드의 최종산물인 코아굴린 그 자체의 생성량을 보는 것이 아니라, 그것이 추가로 회합하여 형성된 겔에 의해 빛의 투과율이 감소해 가는 과정을 보기 때문이다.
즉, 코아굴린의 농도가 어느 정도 이상의 농도에 도달하지 않으면 겔화는 발생하지 않기 때문에, 비탁법에 있어서 소정의 생리활성 물질이 검출되기 위해서는 겔이 생길 때까지 기다릴 필요가 있다. 이 때문에, 소정의 생리활성 물질 농도가 높은 경우에는 신속하게 필요 충분 농도의 코아굴린이 생성되어 겔화가 시작되기 때문에 측정 시간은 짧아지지만, 소정의 생리활성 물질 농도가 낮으면 겔화에 필요한 코아굴린 농도에 도달하는 데 시간이 걸려 측정 시간이 길어진다.
또한, 레이저 광산란 입자 계측법은 시료를 교반하는 점과 레이저에 의해 겔화가 아닌 입자를 검출하는 점이 비탁법으로부터의 개량점으로, 비탁법과 비교하면 측정 시간을 대폭 단축할 수 있다. 그러나, 관찰하고 있는 겔 입자가 비교적 크기 때문에(수 마이크로미터 이상), 측정 시간의 단축 정도는 비색법에는 미치지 못했다. 비탁법과 레이저 광산란 입자 계측법은 보고 있는 물리량은 다르지만, 어느 일정한 임계치를 초과한 시점을 반응의 개시점으로서 받아들인다는 점에서는 공통된다(이하, 이 방법을 편의적으로 임계치법이라고 부름).
한편, 상술한 비색법은 프로테아제 캐스케이드의 최종산물에 상당하는 합성 기질의 염색 대사물의 발색을 검출하기 때문에, 소정 시간 내의 발색 진행 정도(증가율=미분)를 검출하면 되고, 겔화가 생길 때까지 기다릴 필요가 없기 때문에 측정 시간을 단축화할 수 있다(이하, 이 방법을 미분법이라 부름). 그러나, 특수한 시약이 필요한 점, 측정 가능한 농도 범위가 좁은 점 등의 문제점이 있었다.
본 발명에서는 상술한 다양한 방법에서의 문제점을 해결하기 위해 이하의 방법을 완성시켰다. 즉, 광원으로부터의 빛을 소정의 생리활성 물질과 LAL과의 혼화액에 집광하여 조사하여, 프로테아제 캐스케이드의 최종산물인 코아굴린 자체(코아굴린 단량체), 및 이들이 회합하여 생긴 매우 미소한 회합물(코아굴린 응집물)과 충돌시켜 산란광을 생성시킨다. 그리고, 수광 소자로 검출한 산란광의 증가율을 산출함으로써, 해당 증가율과 높은 상관을 가지는 소정의 생리활성 물질의 농도를 측정한다.
이와 같이, 본 발명에서는 LAL의 겔화 자체를 검출하는 비탁법을 기초로 하고 있기 때문에, 특수한 시약을 이용하지 않고 통상적인 LAL 시약을 이용하여 저농도의 소정의 생리활성 물질을 단시간에 검출하는 것이 가능하다. 또한, 농도 측정 공정에서는 소정 시간 내의 산란광 강도의 증가율을 검출하면 되는 미분법을 채용하고 있으므로, 비색법과 마찬가지로 겔화가 생길 때까지 기다릴 필요가 없기 때문에 측정 시간을 단축화할 수 있다.
<입사광의 집광>
본 발명의 광원에는 레이저 또는 고휘도의 LED가 이용되고, 이것을 렌즈에 의해 집광하여 혼화액에 조사한다. 이에 따라, 조사한 부분에 입사광의 빛 에너지를 집중시킬 수 있기 때문에, 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물과 같은 매우 미소한 입자로부터도 충분한 강도의 산란광을 발생시켜 검출하는 것이 가능하다.
이에 반해, 레이저 포인터와 같은 폭이 있는 평행광을 시료에 입사한 경우에는 빛 에너지를 시료의 한 점에 집중하여 조사할 수 없기 때문에, 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물과 같은 매우 미소한 입자로부터 충분한 강도의 산란광을 취득할 수 없다. 그와 같은 방법은 광원을 레이저로 치환했을 뿐이며, 종래의 비탁법의 일종이라는 영역을 벗어나지 않는다.
<시료의 교반>
또한, 본 발명에서 시료는 측정 용기 중에 내장되어 있는 교반자에 의해 교반하고, 이 시료의 교반에 의해 반응의 균일화, 반응의 촉진, 생성된 코아굴린 단량체의 빠른 올리고머로의 동원 등이 효율적으로 행해진다. 시료를 교반하지 않고 정치한 경우에는 비탁법과 마찬가지로 최종적으로는 시료가 겔화하기 때문에 산란광의 증가가 보이지만, 반응 초기의 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물에 의한 산란광의 증가를 정밀도 좋게 검출하는 것은 곤란한 경우가 있다.
<노이즈의 제거(필터링)>
또한, 시료 중에는 시약의 용해 잔류물, 시약의 제조 방법상 잔존하는 마이크로미터 수준의 미립자, 시료의 교반에 따른 미소한 기포 등이 존재한다. 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물 등으로부터 산란하는 미약한 신호는 수는 적지만 매우 강력한 산란광을 발생시키는 이들 협잡물의 산란광에 파묻혀 버리기 때문에, 그대로는 측정할 수 없다.
본 발명에서는, 예를 들면 소정 기간에 취득된 산란광 강도를 복수개 샘플링하여 비교하고, 그 중 최소치, 또는 막대 그래프의 최빈치를 상기 기간에서의 산란광 강도로 하는 필터를 사용함으로써 협잡물의 영향을 배제하여 목적 물질의 미약한 산란광을 얻기로 한다.
<본 발명과 임계치법의 조합>
본 발명은 상기와 같이, 취득된 측정 대상으로부터 발생하는 미약한 산란광의 시간 변화의 비율이, 작용시킨 엔도톡신의 농도가 높을수록 크고, 농도가 낮을수록 작은 것에 주목한 것이다. 이 때문에, 엔도톡신 농도가 낮은 시료이더라도 응집 미립자의 출현이나 겔화를 기다릴 것까지도 없이 단시간에 그의 농도를 정량하는 것이 가능하다. 이는 본 발명은 비색법과 마찬가지로 미분법을 이용함에 따른 효과라 할 수 있다.
그러나, 소정의 생리활성 물질의 농도가 압도적으로 고농도인 경우에는 코아굴로겐 단량체, 및 코아굴로겐 올리고머 등의 목적 물질로부터의 미약한 산란광의 증가율을 충분히 관측하여 끝내는 것보다 빨라, 이들이 더 회합한 마이크로미터 수준의 코아굴로겐 중합체가 형성되게 되는 경우가 있다. 그와 같은 경우에는 측정 대상으로부터 발생하는 미약한 산란광의 증가율을 산출할 수 없는 것도 상정된다. 따라서, 그와 같은 경우에는 산란광 강도가 어느 수준을 초과한 시간을 가지고 농도를 산출하는 임계치법을 적용할 수도 있다. 이와 같이 경우에 따라 분류하여 미분법과 임계치법의 이점을 조합함으로써 동시에 광범위한 농도의 측정이 가능해진다.
이하에, 본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태를 예시적으로 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 이하에 나타내는 형태로 한정되는 것은 아니다.
도 1에는 본 실시 형태에서의 소정의 생리활성 물질의 측정계 (1)의 개략 구성을 나타낸다. 측정계 (1)에 사용되는 광원 (2)로는 레이저나 초고휘도 LED 등이 이용된다. 광원 (2)로부터 조사된 빛은 입사 광학계 (3)에서 좁혀지고, 시료 셀 (4)에 입사한다. 이 시료 셀 (4)에는 소정의 생리활성 물질의 측정을 해야 할 시료와 LAL 시약의 혼화액이 유지되어 있다. 시료 셀 (4)에 입사한 빛은 혼화액 중의 입자(코아굴로겐 단량체, 및 코아굴로겐 올리고머 등의 측정 대상)로 산란된다.
시료 셀 (4)의, 입사 광축의 측방에는 출사 광학계 (5)가 배치되어 있다. 또한, 출사 광학계 (5)의 광축의 연장 상에는 시료 셀 (4) 내의 혼화액 중의 입자로 산란되어 출사 광학계 (5)에서 좁혀진 산란광을 수광하여 전기 신호로 변환하는 수광 소자 (6)이 배치되어 있다. 수광 소자 (6)에는 수광 소자 (6)에서 광전 변환된 전기 신호를 증폭하는 증폭 회로 (7)이 전기적으로 접속되어 있다. 또한, 증폭 회로 (7)에 의해 증폭된 전기 신호로부터 노이즈를 제거하기 위한 필터 (8), 노이즈가 제거된 후의 전기 신호로부터 산란광의 증가율을 연산하고, 또한 소정의 생리활성 물질의 농도를 도출하는 연산 장치 (9), 및 결과를 표시하는 표시기 (10)이 구비되어 있다.
측정계 (1)에서는 측정 대상이 작기 때문에, 측정 대상으로부터의 산란광은 레일리 산란에 의하는 것으로 생각된다. 그 경우, 산란광 강도 ks는 이하와 같이 표시된다.
여기서 n은 입자수, d는 입경, m은 반사계수, λ는 입사광의 파장이다. 따라서, 광원 (2)에서의 파장이 짧을수록 측정에는 유리하다. 그러나, LAL은 고농도의 단백질을 포함하고 있기 때문에, 극단적으로 짧은 파장은 LAL의 기능에 악영향을 미칠 뿐만 아니라, 광학적으로 이들 단파장을 투과시키는 특별한 소재 등을 필요로 하기 때문에 실용적이지 않다.
따라서, 입사광의 파장을 특별히 한정할 필요는 없지만, 250 nm 이상 1200 nm 이하의 범위가 바람직하다. 나아가, 300 nm 이상 800 nm 이하의 범위가 바람직하다. 입사광의 파장이 300 nm 이상 800 nm 이하의 범위이면, 충분히 효율적으로 산란광을 얻는 것이 가능하고, LAL의 기능에도 전혀 영향이 없고, 일반적인 소재의 광학 부품을 사용할 수 있다. 또한, 이들 광원을 시료에 집광시킬 때에는 혼화액 중의 미소한 입자(코아굴로겐 단량체, 및 코아굴로겐 올리고머 등의 측정 대상)로부터의 산란광이 충분한 강도를 가질 필요가 있다. 따라서, 시료 셀 (4)에 입사하는 빛의 빔폭(빔 직경)은 3 mm 이하가 바람직하고, 1 mm 이하가 더욱 바람직하다. 입사광의 파장이 250 nm 이상 1200 nm 이하의 범위인 일반적인 광원이면, 입사광의 출력 밀도로서는 50 mW/mm2 이상 있으면 충분한 강도의 산란광이 얻어진다.
다음으로, 산란광을 수광하는 수광 소자 (6)으로서는 노이즈가 낮으면서 미약한 산란광을 검출할 수 있을 필요가 있다. 따라서, 수광 소자 (6)로서는, 포토다이오드, 포토트랜지스터, 및 이들을 다수 조립한 어레이, 및 포토멀티플라이어 등을 들 수 있다.
또한, 상기 외에도 CCD(전하 결합 소자)나 C-MOS(상보형 금속 산화막 반도체 소자)에 의한 라인 센서, 영역 센서 등을 사용할 수도 있다. 이들 수광 소자 (6)에서 취득된 산란광 강도는 마이크로미터 수준의 미립자로부터 얻어지는 산란광 강도에 비하여 매우 미약하기 때문에, 통상적으로 저항기나 연산 증폭기 등에 의한 증폭 회로 (7)을 적어도 1단 이상 조립하여 증폭할 필요가 있다.
다음으로, 시료나 시약에 협잡하는 미립자의 영향을 제거하기 위한 필터 (8)로서는, 1) 근접하는 시간(소정 기간 중)의 몇 점 정도의 산란광 강도를 샘플링하여 비교하고, 그 중 최소치를 출력하는 최소치 필터 또는 막대 그래프의 최빈치를 출력하는 최빈치 필터, 2) 협잡물의 산란광은 대상물질의 산란광의 발생에 비하여 드물게 발생하기 때문에, 이것을 전자 회로적으로 제거하는 주파수 필터, 3) 경시적인 전위 변화를 취득하여 협잡물을 디지털로 제거하는 디지털 필터 등을 들 수 있다. 이들 필터 중 적어도 1개 이상을 사용함으로써 협잡물의 영향을 배제하여 목적 물질의 미약한 산란광을 얻을 수 있다.
또한, 이들 필터 (8)을 통과한 후의 측정 대상으로부터의 미약한 산란광은 전항의 증폭 회로 (7)에 의해, 측정 개시 시점에 있어서 이미 큰 값을 가지고 있는 경우가 있다. 이 때문에, 이것을 베이스 라인으로 하여 제거하고, 또한 이것을 적절히 증폭하는 등 하여 해석에 사용할 수도 있다.
다음으로, 측정 대상으로부터 얻어진 미약한 산란광 강도로부터 연산 장치 (9)에 있어서 소정의 생리활성 물질의 농도를 산출하는 수단으로서는 이하의 것을 생각할 수 있다. 즉, 기지 농도의 소정의 생리활성 물질의 희석 계열을 제조하고, 각 시료에 대하여 1) 횡축에 시간, 종축에 산란광 강도를 플롯했을 때의 그의 기울기로서 얻어지는, 산란광 강도의 증가율(미분법), 2) 각 시각의 산란광 강도로부터 초기의 산란광 강도를 차감하고, 그의 차분이 미리 결정된 임계치를 초과한 시각(임계치법)을 구한다. 그리고, 소정의 생리활성 물질의 농도와 이들 값의 관계식(검량선)을 산출하고, 소정의 생리활성 물질의 농도가 알려져 있지 않은 시료에서 얻어진 값을 미분법으로 얻어진 검량선과 임계치법으로 얻어진 검량선 중 어느 하나 또는 양쪽에 적용시킨다. 이것에 의해 소정의 생리활성 물질의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 효율적으로 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물 등을 생성하기 위해 시료를 교반하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 실시 형태에서는 시료 셀 (4)에는 외부로부터 전자력을 미치게 함으로써 회전하고, 시료로서의 혼화액을 교반하는 자석 교반 막대(교반자) (11)이 구비되어 있고, 시료 셀 (4)의 외부의 측정계 (1)에는 자석 교반기 (12)가 구비되어 있다. 이들에 의해, 교반 유무 및 교반 속도의 조정이 가능하도록 되어 있다.
여기서, 교반 속도가 너무 작으면 시료 전체의 교반을 행할 수 없다. 한편, 속도가 너무 크면, 시료 중에 기포가 쉽게 혼입되거나, 코아굴린 단량체가 응집되어 가는 과정을 저해하여 측정에 악영향을 초래하는 경우가 있다. 이 때문에, 교반 속도는 100 rpm 내지 5,000 rpm이 바람직하고, 또한 300 rpm 이상 3,000 rpm 이하의 범위가 바람직하다. 2,000 rpm 이상에서는 응집의 억제가 관찰되는 경우가 있고, 또한 500 rpm 이하에서는 시료의 교반이 충분하지 않아 시료의 아래쪽에만 코아굴린의 응집이 관찰되는 경우가 있다. 또한, 이 교반에 의해 측정 대상으로 하고 있는 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물보다 큰 미립자(이들은 기포 또는 시약 중에 원래 포함되어 있는 협잡물 등임) 등이 광원의 빔 상에 멈추지 않도록 하는 효과가 있기 때문에, 데이터의 변동이나 겉보기 산란광의 증가의 영향을 잘 받지 않게 할 수 있다.
<제조예 1>
유리제 용기(외경 φ 7 mm, 길이 50 mm. 이하, 큐벳이라 약칭)에 스테인리스제 교반자(φ 1 mm, 길이 5 mm)를 넣고, 큐벳 개구부에 알루미늄 호일로 피복하여, 이것을 몇 개 합쳐 알루미늄박으로 추가로 피복하고, 250℃에서 3시간 가열 처리하여 유리 용기를 멸균 처리하였다(건열 멸균). 이에 따라, 용기에 부착되는 엔도톡신은 열 분해를 받아 불활성화된다.
<실시예 1>
반도체 레이저(출력 10 mW, 파장 655 nm)에 적절히 렌즈를 조합하여, 레이저광을 집광하여 조사할 수 있는 조명 광학계(시료로의 입사구의 직경은 0.2 mm)를 제조하였다. 이 경우의 입사광의 출력 밀도는 약 80 mW/mm2이다. 0.01 EU/mL의 엔도톡신을 함유하는 시료를 LAL(리물루스 ES-II 싱글 테스트 와코: 와코 쥰야꾸 제조)와 혼합하고, 계속해서 제조예 1에서 제조한 큐벳 내부에 넣었다. 이것을 도 1에 나타낸 바와 같은 자석 교반기 (12)에 의해 시료 중의 스테인리스제 교반자 (11)을 회전시키고, 혼화액을 교반 가능한 홀더부에 세팅하였다. 이 예에서는 큐벳이 시료 셀 (4)로 이용되고 있다.
시료의 교반은 1,000 rpm으로 행하였다. 또한, 이 홀더부는 LAL의 겔화 반응을 진행시키기 위해 37℃로 보온되어 있다. 상기 광원 (2)로부터의 입사광을 LAL 시약과 엔도톡신이 들어 있는 시료에 조사하고, 광원의 광축과 90도의 방향으로 설치한 수광 소자 (6)에 의해 시료 중에 생성되는 코아굴린 단량체, 및 미소한 코아굴린 응집물로부터 발생하는 측방 산란광을 수광하였다. 측방 산란의 수광 소자 (6)으로서는 포토다이오드를 이용하였다.
수광한 산란광 성분에는 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물로부터 발생하는 미약한 산란광 외에도 시료 중의 미립자(시약의 용해 잔류물, 시약에 원래 들어 있는 미립자, 미소한 기포 등)로부터 발생하는 강력한 산란광을 포함하고 있다. 이 때문에, 필터 (8)로서의 최소치 필터를 이용하여 이들 협잡물의 산란광을 제거하여, 산란광의 시계열 변화를 취하였다. 최소치 필터는 수광 소자 (6)에서 수광한 광 전위를 증폭 회로 (7)에서 적절히 증폭한 후에 아날로그 디지털 변환(10 비트)하고, 이것을 20밀리초마다 25회 행하고, 얻어진 25 데이터 중 최소의 값을 얻는 방식을 이용하였다. 여기서 20밀리초는 본 실시예에서의 소정 기간에 상당한다.
<실시예 2>
반도체 레이저(출력 10 mW, 파장 655 nm)에 적절히 렌즈를 조합하고, 레이저광을 레이저 포인터형으로 평행광으로 하여 조사할 수 있는 광학계(시료로의 입사구의 직경은 3.0 mm)를 제조하였다. 실시예 1과는 이 광원 광학계의 조건만이 다르고, 다른 조건은 동일하게 처리를 행하여, 산란광의 시계열 변화를 취하였다. 또한, 이 경우의 입사광의 출력 밀도는 약 0.35 mW/mm2이다.
실시예 1 및 실시예 2의 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 있어서 횡축은 시간(분), 종축은 포토다이오드의 출력으로부터 얻어진 산란광 강도이다. 실시예 1에서는 도면 중의 타원으로 둘러싼 A의 부분과 같이, 반응 초기부터 산란광이 증가해 가는 상이 존재하고, 그 후, 굴곡점을 거쳐 보다 기울기가 큰 B의 상으로 어어져 간다. 그에 반해 실시예 2에서는 A의 상은 거의 관찰되지 않고, 늦게 발생하는 B의 상이 주가 되어 관찰된다. 실시예 1, 2 모두 작용시키고 있는 엔도톡신의 농도 등, 광원 (2) 이외의 측정 조건은 동일하기 때문에, 실시예 2에서는 미소한 입자로부터 충분한 산란광을 취득할 수 없기 때문에 시료 중에 진행되고 있는 변화를 검출할 수 없는 것으로 생각된다. 또한, 실시예 1의 곡선에서의 굴곡점은 본 실시예에 있어서 소정의 급변화를 일으키는 점에 상당한다.
이와 같이, 검출 대상인 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집체의 산란광을 취득하기 위해서는, 고출력의 레이저와 같은 광원 (2)를 충분히 시료에 집광시켜 조사하여 충분한 출력 밀도를 확보할 필요가 있다.
<실시예 3>
실시예 1과 동일한 조건으로, 다만, 시료의 교반을 행하지 않고 산란광의 시계열 변화를 취하였다. 그 결과, 교반을 행하지 않는 경우이더라도 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물이 시간과 함께 증가해 가는 모습을 얻을 수 있었다. 그러나, 취득되는 데이터는 변동이 크고, 또한 광원 (2)의 빔 상에 목적하는 미소 입자보다 큰 입자가 존재한 경우, 동일 위치에 오랜 시간 머무르기 때문에, 데이터에 대하여 최소치 필터 처리 등을 행했다 하더라도 겉보기 산란광이 매우 높게 나오는 경우가 있었다. 그와 같은 경우에는 미약한 산란광이 증가해 가는 현상을 정확하게 평가하는 것이 곤란하였다. 이에 반해 시료를 교반한 경우에는 이들 대형 입자는 빠르게 빔 상에 머무르는 일 없이 빠르게 떨어지기 때문에 정확한 평가가 가능해졌다.
<실시예 4>
실시예 1에서 사용한 광원 (2) 및 입사 광학계 (3)을 이용하여, 실시예 1과는 산란광의 필터 처리 방식이 평균치 필터를 사용하고 있는 것 외에는 동일한 조건으로 처리를 행하여 산란광의 시계열 변화를 취하였다. 평균치 필터에는 수광 소자 (6)에서 수광한 광 전위를 증폭 회로 (7)에서 적절히 증폭한 후에 아날로그 디지털 변환(10 비트)하고, 이것을 20 밀리초마다 25회 행하고, 얻어진 25 데이터의 평균치를 출력하는 방법을 이용하였다.
그 결과, 얻어진 데이터는 목적 미립자보다 큰 입자의 산란광의 영향을 크게 받아, 미약한 산란광이 증가해가는 현상을 정확하게 평가하는 것이 곤란하였다. 코아굴린 단량체 및 미소한 코아굴린 응집물 등의 목적하는 미립자보다 큰 입자로서는, 혼화액 중에 혼입하게 된 미소한 기포나 시약의 용해 잔류물, 나아가 시약의 제조 공정에서 제거되지 않는 세포 단편 등을 들 수 있다. 이들 입자의 출현은 혼화액마다 다르기 때문에, 평균치법을 이용하는 한 적절히 제거할 수 없다고 생각된다.
다음으로, 일반적인 필터 성능을 시험하기 위해, 측정 대상물의 모의적인 시료, 즉 중성 지방(0.0002％ 인트라리피드)과 폴리스티렌 라텍스 입자(φ 1 μm, 중량 백분율 0.0025％)의 혼합물을 이용하여 이하의 필터 (8)의 성능을 조사하였다. 필터 (8)은 각각 수광 소자 (6)에서 수광한 광 전위를 증폭 회로 (7)에서 적절히 증폭한 후에 아날로그 디지털 변환(10 비트)하고, 이것을 20밀리초마다 25회 행하고, 얻어진 25 데이터로부터, 1) 값이 큰 순서대로 재배열하여 13번째의 값을 출력하는 중앙치 필터, 2) 평균치를 출력하는 평균치 필터, 3) 최소치를 출력하는 최소치 필터, 4) 최대치를 출력하는 최대치 필터이다. 6초마다 이들 필터를 통과시켜 값을 출력하고, 5분간의 총 50 데이터로부터, 각각의 필터 처리에 의해 얻어지는 수치의 평균치(수치는 증폭 회로 (7)에서 증폭한 후의 전압치), 및 표준편차를 구한 바, 표 1과 같은 결과가 되었다.
이 결과는 어디까지나 모의 시료의 결과이지만, 최소치 필터가 목적 물질의 미소한 산란광을 구하기 위해서는 가장 적합한 것이 이하의 이유로부터 분명하다. 1) 평균치가 다른 필터에 비하여 낮지만, 이는 강도가 작은 목적 물질의 산란광을 주로 출력하고 있기 때문이다. 2) 표준편차가 다른 필터보다 작지만, 이는 협잡하는 큰 미립자의 산란광의 영향을 잘 받지 않음을 나타내고 있다. 한편, 최대치 필터는 목적 물질의 산란광이 아닌 협잡하는 미립자의 신호를 주로 출력하고 있기 때문에 평균치가 크고, 표준편차도 크다. 또한, 평균치 필터는 목적 물질의 미약 산란광과 협잡하는 미립자의 산란광 둘 다의 평균치를 출력하기 때문에, 최소치 필터와 최대치 필터의 중간적인 값을 나타낸다. 또한, 중앙치 필터도 평균치 필터와 동등한 결과로서, 성능적으로 우수하다고는 할 수 없다.
또한, 데이터의 샘플링수가 적은 경우에는 상술한 최소치 필터를 이용하는 것이 유효하다고 생각되지만, 연속하여 샘플링하는 경우에는 데이터수가 많기 때문에, 막대 그래프를 작성할 수 있다. 그와 같은 경우에는 막대 그래프의 가장 빈도가 큰 (피크의 존재 개소) 값을 출력하는 최빈치 필터를 이용함으로써도, 협잡하는 큰 미립자의 산란광의 영향을 배제하는 것이 가능하다.
또한, 최소치 필터의 변형예로서, 샘플링한 데이터 중 작은 쪽의 특정 순서의 값이나 그의 평균치를 출력하는 것도 생각할 수 있다. 예를 들면, 25개의 데이터를 취득하여 소팅을 행하여 하위 6의 데이터 중, 최하위는 사용하지 않고 나머지 5 데이터의 평균치를 출력하는 필터 등도 유효하게 기능한다.
<실시예 5>
실시예 1에 나타낸 방법으로, 엔도톡신 농도를 다양하게 변화시킨 희석 계열을 제조하여, 엔도톡신 농도와 코아굴린 단량체, 및 미소한 코아굴린 응집물에 의한 산란광의 초기의 증가율의 관계를 조사하였다. 그 결과, 엔도톡신 농도가 낮을수록 증가율이 작고, 농도가 높을수록 증가율이 큰 것을 알 수 있었다. 엔도톡신 농도와 초기 산란광의 증가율의 관계를 양대수로 플롯하면 도 3과 같이 직선 관계가 얻어졌다. 횡축은 엔도톡신 농도(EU/mL), 종축은 초기 미소 산란광 증가율(초기의 산란광의 증가곡선의 기울기)을 나타내고 있다.
<실시예 6>
실시예 1에 나타낸 방법으로, 산란광의 수광 소자 (6)을 포토다이오드로부터 CCD 영역 센서로 대체한 장치를 제조하여, 실시예 5와 마찬가지로 엔도톡신 농도와 산란광의 초기 증가율의 관계를 조사하였다. 도 4(b)에는 그 결과를 나타낸다. 도 4(b)에 있어서 횡축은 엔도톡신 농도(EU/mL), 종축은 초기 미소 산란광 증가율(초기의 산란광의 증가곡선의 기울기)을 나타내고 있다.
도 4(a)에서는 동시에, 산란광 강도의 시간 변화에 대해서도 게재하였다. 도 4(a)에 있어서 횡축은 시간(분), 종축은 CCD 영역 센서의 출력으로부터 얻어진 산란광 강도이다. CCD 영역 센서를 이용하더라도, 도 2 중의 A의 상과 마찬가지로 초기 산란광이 직선적으로 증가한 후, 굴곡점을 거쳐 더 큰 증가율의 상(도 2 중의 타원 B의 상)에서 변화해 가는 모습을 알 수 있다.
<실시예 7>
실시예 1에 나타낸 방법과 동등한 방법으로, 엔도톡신 대신에 β-D-글루칸을 이용하여 검토를 행하였다. LAL 시약으로서는 β-글루칸 테스트 와코(와코 쥰야꾸 제조)를 이용하였다. β-D-글루칸 농도를 다양하게 한 희석 계열을 제조하여, β-D-글루칸 농도와 코아굴린 단량체, 및 미소한 코아굴린 응집물에 의한 산란광의 초기의 증가율의 관계를 조사하였다. 그 결과, β-D-글루칸 농도가 낮을수록 증가율이 작고, 농도가 높을수록 증가율이 큰 것을 알 수 있었다. β-D-글루칸 농도와 초기 산란광의 증가율의 관계를 양대수로 플롯한 결과 도 5과 같이 직선 관계가 얻어졌다. 도 5에 있어서 횡축은 β-D-글루칸 농도(pg/mL), 종축은 초기 미소 산란광 증가율(초기의 산란광의 증가곡선의 기울기)을 나타내고 있다.
여기서, 도 1에 나타낸 바와 같은 소정의 생리활성 물질의 측정계 (1)을 일체로 한 측정 장치를 구성할 수도 있다. 그와 같이 했을 경우, 소정의 생리활성 물질의 시료와 LAL의 혼화액을 시료 셀 (4)에 도입하여 측정 개시 지시를 하는 것만으로, 상기한 바와 같은 측정을 자동적으로 행하는 것도 가능해진다. 또한, 연산 장치 (9)에서는 도 3, 도 4, 도 5에서 얻어진 검량선과, 혼화액으로부터의 산란광으로부터 얻어지는 증가율로부터, 소정의 생리활성 물질의 농도를 연산하고, 표시기 (10)에 의해 결과를 자동적으로 표시하도록 할 수도 있다.
그 경우, 시료 셀 (4)는 혼화액 유지 수단에, 광원 (2) 및 입사 광학계 (3)은 광 입사 수단에, 출사 광학계 (5) 및 수광 소자 (6)은 수광 수단에, 연산 장치 (9)는 도출 수단에 상당한다. 또한, 교반자 (11)과 자석 교반기 (12)는 교반 장치에 상당한다.
또한, 본 발명에 따른 상기 실시예에 관하여, 1) 비탁법에서 이용되는 일반적인 리물루스 시약을 그대로 사용할 수 있다. 2) 측정계(측정 장치)의 구성을 단순하게 할 수 있고, 다채널화(8 내지 16 ch)도 비교적 용이하다. 3) 특수한 시약을 이용하는 비색법과 동일 정도의 시간으로 측정 완료가 가능한 등의 장점을 들 수 있다.
1: 측정계
2: 광원
3: 입사 광학계
4: 시료 셀
5: 출사 광학계
6: 수광 소자
7: 증폭 회로
8: 노이즈 제거 필터
9: 연산 장치
10: 표시기
11: 교반자
12: 자석 교반기
2: 광원
3: 입사 광학계
4: 시료 셀
5: 출사 광학계
6: 수광 소자
7: 증폭 회로
8: 노이즈 제거 필터
9: 연산 장치
10: 표시기
11: 교반자
12: 자석 교반기
Claims (16)
- 시료 중에 존재하는 생물 유래의 생리활성 물질과 투구게의 혈구 추출물인 LAL을 반응시킴으로써, 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 상기 생리활성 물질의 농도를 측정하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법이며,
상기 시료와 LAL과의 혼화 후에, 상기 시료와 LAL과의 혼화액 중에 빛을 입사함과 동시에 상기 입사광의 상기 혼화액에 의한 산란광 강도를 취득하고,
상기 산란광 강도의 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법. - 제1항에 있어서, 상기 산란광 강도의 증가율이 소정의 급변화를 일으키기 전에 있어서의 상기 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혼화액에 입사하는 빛의 출력 밀도는 50 mW/mm2 이상인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼화액에 입사하는 빛의 파장은 300 nm 이상 800 nm 이하인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산란광 강도의 증가율을 취득할 때, 소정 기간에 취득된 산란광 강도를 복수개 샘플링하여 비교하고, 그 중 최소치 또는 막대 그래프의 최빈치를 상기 기간에 있어서의 산란광 강도로 하는 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산란광 강도를 취득할 때, 상기 혼화액을 교반하는 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 혼화액의 교반 속도는 300 rpm 이상 3000 rpm 이하인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 유래의 생리활성 물질은 엔도톡신 또는 β-D-글루칸인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 방법.
- 시료 중에 존재하는 생물 유래의 생리활성 물질과 투구게의 혈구 추출물인 LAL을 반응시킴으로써, 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질을 검출하거나 또는 상기 생리활성 물질의 농도를 측정하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치이며,
상기 시료와 LAL과의 혼화액을 빛이 입사 가능하게 유지하고, 상기 생리활성 물질과 LAL과의 반응을 진행시키는 혼화액 유지 수단과,
상기 혼화액 유지 수단 중의 혼화액에 빛을 입사하는 광 입사 수단과,
상기 입사광의 상기 혼화액에 있어서의 산란광을 수광하여 전기 신호로 변환하는 수광 수단과,
상기 수광 수단에서 변환된 전기 신호로부터 취득되는 상기 산란광 강도의 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질의 농도를 도출하는 도출 수단
을 구비하는 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치. - 제9항에 있어서, 상기 도출 수단은 상기 혼화액 유지 수단에 있어서의 상기 시료와 LAL과의 혼화 후에, 상기 증가율이 소정의 급변화를 일으키기 전에 있어서의 상기 증가율로부터 상기 시료 중의 상기 생리활성 물질의 농도를 도출하는 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 광 입사 수단에 의해 상기 혼화액에 입사되는 빛의 출력 밀도는 50 mW/mm2 이상인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광 입사 수단에 의해 상기 혼화액에 입사되는 빛의 파장은 300 nm 이상 800 nm 이하인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수광 수단에서 변환된 전기 신호를, 소정 기간에 복수개 샘플링하여 비교하고, 그 중 최소치를 출력하는 최소치 필터 또는 막대 그래프의 최빈치를 출력하는 최빈치 필터를 더 구비하는 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼화액 유지 수단은 상기 혼화액을 교반하는 교반 수단을 가지는 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치.
- 제14항에 있어서, 상기 교반 수단에 의한 상기 혼화액의 교반 속도는 300 rpm 이상 3000 rpm 이하인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물 유래의 생리활성 물질은 엔도톡신 또는 β-D-글루칸인 것을 특징으로 하는, 생물 유래의 생리활성 물질의 측정 장치.
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