JP2003088398A

JP2003088398A - 発光による試料の測定方法及び装置

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Publication number: JP2003088398A
Application number: JP2001285281A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Sakakibara; 達哉榊原; Seiji Murakami; 成治村上; Yasushi Haketa; 靖羽毛田
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2001-09-19
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2003-03-25

Abstract

(57)【要約】【課題】小型、軽量で安価な試料の測定装置を提供す
る。【解決手段】検査用器具の収納室９、該収納室９におか
れた検査用器具による発光を受光する低感度受光素子
５、及びゲルマニウムホトダイオード、ガリウム砒素ホ
トダイオード、ガリウム砒素リンホトダイオード、イリ
ジウムガリウム砒素ホトダイオード等の低感度受光素子
５からの信号を電気的に処理する演算装置４６で発光に
よる試料の測定装置１を構成し、試料の汚れをＰＰＤＫ
等のＡＴＰ再生酵素を含有する発光試薬により発光さ
せ、その発光量を低感度受光素子５により測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本願発明は、ＡＴＰ再生酵素
を含有する発光試薬または含有しない発光試薬と試料を
作用させて、アデノシンリン酸エステル類を測定する方
法及び装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】バクテリアまたは食品由来の汚れを検出
するにあたって、ルシフェラーゼとルシフェリン等を含
有する試薬を用いて、アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰ
と称する）を指標にして発光反応により、測定できるこ
とが知られている。しかし、この光の出力は極めて小さ
く、今までは、測定可能な出力を得るために、光検出装
置には光電子倍増管（ホトマルチプライヤー）が利用さ
れていた。しかしながら、光電子倍増管は、高電圧を必
要とするので、電圧変換装置や、安全のための対策を必
要とするため、装置が大型になり、値段も高いという欠
点を有していた。

【０００３】また、アバランシェホトダイオードを使用
する光検出装置（特表平4-502403）も知られている。ア
バランシェホトダイオードは、通常、０〜５℃の使用温
度を保持する必要があるため、この装置は、温度安定シ
ステムを必要とする。また、この装置は、アバランシェ
ホトダイオードに隣接して取り付けられたペルティエ効
果型のヒートポンプを有しており、温度制御回路からの
電流供給を受けてアバランシェホトダイオードを冷却す
るようになっている。したがって、装置も複雑になり、
値段も高いという欠点を有していた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本願発明者は、感度は
あまり高くはないが、高電圧、高電流の電源を必要とし
ない受光素子、例えばゲルマニウム(Ge)ホトダイオー
ド、ガリウム砒素(GaAs)ホトダイオード、ガリウム砒素
リン(GaAsP)ホトダイオード、イリジウムガリウム砒素
（InGaAs）ホトダイオード、ホトトランジスター、硫化
カドミウム（CdS）ホトコンダクティブセル（可視光導
電素子）、PINホトダイオード、ホトIC、Charge Couple
d Device（CCD素子）、MOS 素子等（以下総称して低感
度受光素子という）に着目した。一方、本願発明者は先
に「生物発光試薬及びその試薬を用いたアデノシンリン
酸エステルの定量法並びにその試薬を用いたＡＴＰ変換
反応系に関する物質の定量法」（特開平9-234099）を出
願した。この発明は、少なくともピルベートオルトホス
フェートジキナーゼ（以下ＰＰＤＫと称する、Pyruvate
orthophospate dikinase、EC 2.7.9.1)等のＡＴＰ再生
酵素を含有する試薬で生物発光試薬を構成し、微量なア
デノシンリン酸エステル類でも高い発光量が得られる方
法である。そこでさらに本願発明者は鋭意研究の結果、
ＰＰＤＫ等のＡＴＰ再生酵素を含有する発光試薬により
アデノシンリン酸エステル類を発光検出し、その発光量
を低感度受光素子で測定すれば、簡便な装置でアデノシ
ンリン酸エステル類、すなわち汚れを検出できることを
知見して本願発明を完成させた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち本願発明は、ア
デノシンリン酸エステル類を、ＡＴＰ再生酵素を含有す
る発光試薬により発光させ、その発光量を低感度受光素
子により測定することを特徴とする発光による試料の測
定方法、ならびに検査用器具の収納室、該収納室におか
れた検査用器具による発光を受光する低感度受光素子、
及び該低感度受光素子からの信号を電気的に処理する演
算装置より構成されることを特徴とする発光による試料
の測定装置である。

【０００６】

【発明の実施の形態】本願発明では、汚れを採取しそれ
を発光させる検査用器具を収納するための収納室とその
放出光を受光するための低感度受光素子、及び受光した
光を測定するための演算装置を含み、さらに操作パネル
あるいは表示パネル等を備えた試料の測定装置が提供さ
れる。低感度受光素子は光電子倍増管ほどではないが、
低レベルの光に反応して測定可能な電気信号を出力する
半導体素子である。また、低感度受光素子の回路部に
は、高電圧または高電流の電源は必要ではなく電源とし
てバッテリーを使用することができる。また、低感度受
光素子は、他の一般のダイオード例えばアバランシェホ
トダイオードに比べて、温度変化に対する性能の変化が
少なく、温度安定装置を必要としない。さらに、低感度
受光素子は、光電子倍増管に比べて、堅牢であり、強い
光にさらされても悪影響を受けることがない。従って、
本願発明による清浄度の測定装置は、従来のものに比べ
て、大幅に小型、軽量、低価格とすることができる。

【０００７】本願発明に用いる発光試薬は、ＰＰＤＫ等
のＡＴＰ再生酵素を含有するもので、ルシフェリン・ル
シフェラーゼ発光試薬に添加して用いることもできる。
ＡＴＰ再生酵素を含有する発光試薬は、ＡＴＰのみでな
くアデノシン二リン酸（以下ＡＤＰと称する）やアデノ
シン一リン酸（以下ＡＭＰと称する）、リボ核酸（以下
ＲＮＡと称する）にも反応して発光し、かつ安定した高
水準の発光を示す。従って、低感度受光素子の光電子倍
増管に比べて若干感度が低いという欠点を補うことがで
きる。もちろん、ＡＴＰ再生酵素を含有しない通常のル
シフェリンルシフェラーゼ発光試薬や化学発光に基づく
発光試薬や蛍光試薬も使用可能であることはいうまでも
無い。本願発明でいう汚れとは、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭ
Ｐ、ＲＮＡ等のアデノシンリン酸エステル類を含有する
ものであり、好適には、清浄度検査における汚れの検査
を挙げることができる。

【０００８】本願発明でいうＡＴＰ再生酵素とは、ＡＭ
ＰからＡＴＰを生成する反応を触媒する酵素なら何でも
よい。また、酵素を組み合わせて、ＡＭＰからＡＴＰを
生成する反応を行う場合も含む。例えば、ホスホエノー
ルピルベートシンセターゼ（Phosphoenolpyruvate Synt
hetase、EC 2.7.9.2）が挙げられる。また、アデニレー
トキナーゼ（Adenylate kinase、EC 2.7.4.3）、ピルベ
ートキナーゼ（Pyruvate kinase、EC 2.7.1.40）を組み
合わせて用いて、ＡＭＰからＡＴＰを生成しても良い。
また、特開2001-211900に記載されているように、ポリ
リン酸キナーゼ(Polyphosphate kinase)とアデニレート
キナーゼ（Adenylate kinase、EC 2.7.4.3）を組み合わ
せて用いて、ＡＭＰからＡＴＰを生成しても良い。ま
た、AMP-PolyP ホスホトランスフェラーゼ（AMP-Polyph
osphate phosphotransferase）とポリリン酸キナーゼ(P
olyphosphate kinase)を組み合わせて用いて、ＡＭＰか
らＡＴＰを生成しても良い。また、Applied and Enviro
nmental Microbiology,May 2000,P2045-P2051に記載さ
れているようにpolyphosphate:AMP phosphotransferase
とAdenyrate kinaseを組み合わせてＡＴＰを生成しても
良い。また、Journal of Biochemistry 128,P1079-P108
5 2000に記載されているADP-Dependent(AMP-Forming)Gl
ucokinaseを用いてＡＤＰからＡＭＰを生成して、さら
にピルベ−トオルトホスフェ−トジキナ−ゼを用いて、
ＡＭＰからＡＴＰを生成しても良い。好適には、ＰＰＤ
Ｋを用いることができる。

【０００９】本願発明に用いるＰＰＤＫはマグネシウム
等の金属イオンの存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノールピ
ルビン酸及びピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、ピルビン
酸及びリン酸を生じる反応を触媒する酵素である。その
理化学的性質及び製法についてはすでに知られており容
易に入手可能である（特開平9-234099参照）。ＡＴＰ再
生酵素を含有する発光試薬としては、例えば、ルシフェ
リン、ルシフェラーゼ及び金属塩を含む発光試薬にＰＰ
ＤＫを添加して用いるが、ホスホエノールピルビン酸、
ピロリン酸を同時に添加するとよりよい効果が得られ
る。これを使用することにより、汚れの指標成分である
ＡＴＰに加え、ＡＭＰも同時に測定することができ、少
ない汚れを感度よく検出できる。また、上記ＡＴＰ再生
酵素含有発光試薬にさらに、ＡＤＰからＡＴＰを生成す
る反応を触媒する酵素および/またはＲＮＡ分解酵素を
併用すると、ＡＴＰおよびＡＭＰに加え、さらにＡＤＰ
及びＲＮＡも同時に測定して、さらに少ない汚れを検出
できる。

【００１０】本願発明の実施に際しては、試験される表
面の汚れを綿棒で拭き、この綿棒を、バクテリア類等の
汚れから、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＲＮＡ等のアデノ
シンリン酸エステル類を抽出するための界面活性剤など
を含有する抽出試薬に浸す。こうして得られたサンプル
液をＰＰＤＫ等のＡＴＰ再生酵素を含有する発光試薬と
混合し、放出された発光量を試料の測定装置で測定する
ことにより、検体の汚れを検出することができる。好ま
しくは、綿棒、抽出試薬、発光試薬が一体になった清浄
度検査用器具、すなわち、拭取検査用器具を用いると、
より簡便に検査ができる。このＰＰＤＫ等のＡＴＰ再生
酵素を含有する発光試薬を備えた拭取検査用器具で装置
を構成すれば、小型、軽量、低価格で、かつ高感度な清
浄度検査方法を提供することができる。すなわち、試験
する表面を拭取検査用器具の綿棒で拭き、これを該器具
に備えられた抽出試薬に浸し、得られた試料液を同様に
該器具に備えられたＰＰＤＫ等のＡＴＰ再生酵素を含有
する発光試薬と反応させ、拭取検査用器具ごと清浄度検
査装置にセットし、得られた発光量から汚れの量を測定
するのである。これらの装置は、全て携帯用ケースに入
れて持ち運び可能に構成することができる。従って本願
発明によれば、発光量測定装置、綿棒、抽出試薬、発光
試薬が一体になった拭取検査用器具からなる清浄度検査
用キットが提供できる。上記に説明した発光量測定装置
は他の多様な試料の試験、例えば、食品工業における原
料と最終製品の試験、試薬、水質、臨床用試料等の試験
にも用いることができる。

【００１１】以下図面に従って本願発明を具体的に説明
する。まず図１において、１は試料の測定装置で、その
本体２には検体すなわち汚れを拭取し生物発光反応を行
う拭取検査用器具３、該拭取検査用器具３の発光を集め
る集光レンズ４、該レンズ４からの光を電気信号に変換
する低感度受光素子５、該受光素子５からの電気信号を
処理する演算装置４６が収納されている。

【００１２】そして図２において、６は、電源回路部４
１、アンプ部４２、Ａ／Ｄ変換部４３、ＣＰＵ４４とメ
モリ４５より成る演算装置４６、表示部４７、操作部４
８、及び外部インターフェース４９より構成されている
測定回路部である。まず電源回路部４１は、直流電源あ
るいは交流電源の両者を受け入れ可能にするためのもの
である。アンプ部４２は、拭取検査用器具３の発光の強
弱すなわち低感度受光素子５からの電気信号の強弱に応
じて、その出力を電圧に変換し増幅するためのものであ
り、該アンプ部４２からの電圧信号は、Ａ／Ｄ変換部４
３でディジタル化されて演算装置４６へと送信される。
演算装置４６は、低感度受光素子５からの信号を受け、
それを数値化し表示部４７に示させたり、必要に応じ予
めメモリ４５に記憶させておいた汚れ度のデータと比較
し、例えば洗浄の必要性等の対応策を表示させたりする
ものである。５０は、アンプ部４２と低感度受光素子５
を覆う、例えばアルミニウムや鉄等の金属で形成された
シールド部材で、これにより外部からのノイズを遮断で
きる。

【００１３】操作部４８は、ＣＰＵ４４へ指示するもの
で、測定データの保存あるいはそれらデータを外部イン
ターフェース４９を介してプリンターへの送信、又は遠
隔地への送信、さらにはメモリ４５へのデータの入力等
を行うためのものである。そしてさらに、図３に示すよ
うに本体２の正面には、操作部４８及び表示部４７が設
けられており、それらは、前述した図２に示すように演
算装置４６に電気的に接続されていて、測定条件の設定
あるいは開始を指示したり、また結果が表示される。図
２においては、集光レンズを省略した。本体２には、さ
らに拭取検査用器具３の収納室９が設けられており、該
器具３は、テーブル部材１０に載せられ常に同じ位置に
定位するよう構成されている。１１は拭取検査用器具３
の背面に配置した反射鏡で、より多くの発光量を集光レ
ンズ４を介して低感度受光素子５に送ることができる。

【００１４】そして次ぎに拭取検査用器具３についてで
あるが、この器具３は、発光試薬としてＰＰＤＫ等のＡ
ＴＰ再生酵素を利用できればどのような構成のものでも
よく、一例として図４に示すものを挙げることができ
る。まず図４において、拭取検査用器具３は、主に検体
採取具１２と試験管状をした発光試薬容器１３から構成
されている。そして検体採取具１２は、検体拭取具１
４、抽出液容器１５、及び管状をした検体採取具１２の
本体１６より構成されている。発光試薬容器１３の開口
部１７は、例えばアルミ箔で形成されたシール材１８に
より閉鎖されており、発光試薬容器１３は密閉される。
検体拭取具１４は、棒状の綿軸１９とその下端部の卵状
に形成されて設置されている綿部２０より成る綿棒２１
と、該綿棒２１を保持する保持部材２２より構成されて
いる。

【００１５】保持部材２２は、下段の小径部２３と上段
の大径部２４より成り、小径部２３と大径部２４の境界
の段部２５は、本体１６の上端部２６に当接し、検体拭
取具１４が本体１６において下動する時に常に一定の位
置で停止する機能を有する。検体拭取具１４は、本体１
６に着脱自在に装着されており、本体１６より取り外し
検体の表面を綿棒２１で拭き、汚れを採取する機能を有
する。抽出液容器１５には、検体を拭くことにより綿棒
２１の綿部２０に付着した汚れを抽出するための抽出液
３２が封入されている。抽出液容器１５は、上下端部は
開口されていて、まず下部をシール材２７でシールした
後、前記抽出液３２を注入し、次いで上部をシール材２
８でシールして、抽出液３２を封入する。このシール材
２７，２８は、綿棒２１の押圧により容易に破れる程度
のもので例えばアルミ箔で形成される。

【００１６】検体採取具１２の本体１６は、上下端部が
開放された管状の部材で構成されており、下方の内壁面
に円環状をした突起部材２９が設けられており、さらに
該突起部材２９に下方に連結して飛散防止部材３０が延
設されている。そして、発光試薬容器１３を突き上げる
ことにより、飛散防止部材３０の鋭角部３１によりシー
ル材１８が破られ、綿部２０より抽出された汚れが抽出
液と共に発光試薬容器１３に落下送出され、発光等の反
応をし、汚れを検出する構成となっている。

【００１７】

【作用】最初に、検体拭取具１４を本体１６より引き抜
き、綿部２０により検体表面を拭き、汚れを採取する。
次に汚れを採取した検体拭取具１４を本体１６に挿入し
た後、発光試薬容器１３を押し上げ該容器１３のシール
材１８を飛散防止部材３０の鋭角部３１に押し当ててシ
ール材１８を破る。次いで、検体拭取具１４を押し下げ
ると、まず綿棒２１によりシール材２８を破り、綿部２
０は抽出液容器１５の内部に入る。そして次に、検体拭
取具１４を保持部材２２の段部２５と本体１６の上端部
２６が当接するまで押し下げ、シール材２７を綿棒２１
により破る。

【００１８】そして次に、拭取検査用器具３全体を上下
方向に軽く振ることにより、バクテリアや汚れを含んだ
抽出液３２が発光試薬容器１３に落下し、発光試薬３３
と接触して、例えば発光反応によりこの部分が光ること
になる。そして、拭取検査用器具３を汚れ測定装置１の
収納室９に装着し、発光量すなわち汚れの量を測定する
のである。以上説明した拭取検査用器具３における発光
試薬３３としてＰＰＤＫ等のＡＴＰ再生酵素を含有した
ものを用いるのである。以上検体として拭取の場合を説
明したが、その他としてＰＰＤＫ等のＡＴＰ再生酵素を
含有する発光試薬が収納された試験管に検査対象となる
液体、固形物、粉粒体等を投入しその汚れの量を測定し
てもよい。また本願発明にかかる装置は、試料として生
物発光だけではなく、化学発光あるいは蛍光によるもの
も測定できることは言うまでもない。

【００１９】

【実施例】次ぎに、実施例を示し、本願発明の効果を数
値的に示す。酵素の単位は、国際単位である。

【００２０】

【実施例１】ＰＰＤＫを含有する発光試薬の組成ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセテート） 1.0mM ジチオスレイトール 1.0mM 硫酸アンモニウム 3.75mM ピロリン酸 0.3mM ホスホエノールピルビン酸 2.1mM ルシフェリン 0.75mM 硫酸マグネシウム 7.5mM ＢＳＡ（牛血清アルブミン） 0.5% シュークロース 5.0% ルシフェラーゼ 2.5mg/ml ＰＰＤＫ 1.5U/ml アデノシンリン酸デアミナーゼ 0.05U/ml ＨＥＰＥＳ(50mM) pH7.8 抽出試薬の組成塩化ベンザルコニウム 0.02％ＨＥＰＥＳ (10mM) pH7.8

【００２１】上記の組成のＰＰＤＫを含有する発光試薬
を凍結乾燥したものを、図４に示す拭取検査用器具３の
発光試薬容器１３に、抽出試薬を抽出液容器１５にそれ
ぞれ封入した（ＰＰＤＫあり）。一方、上記の組成か
ら、ＰＰＤＫのみを除いた発光試薬を凍結乾燥したもの
を、同様に発光試薬容器に封入した。ただし抽出試薬は
同じものを抽出液容器１５にセットした（ＰＰＤＫな
し）。食品由来の汚れのモデルとして、市販の酵母エキ
ス、牛肉エキス、麦芽エキス、ビール、牛乳を超純水で
各濃度に希釈したものに拭取検査用器具３の綿棒２１を
浸した後、綿棒ホルダーを押し込み綿棒頭部を抽出試薬
に浸し、さらに綿棒ホルダーを押し込み、汚れが溶け込
んだ抽出試薬を発光試薬の凍結乾燥物の入った発光試薬
容器１３に送り込み、発光させた。また、手指の場合
は、綿棒２１をあらかじめ水で浸して、手のひらと指を
その綿棒でふき取り、綿棒ホルダーを押し込み綿棒頭部
を抽出試薬に浸し、さらに綿棒ホルダーを押し込み、汚
れが溶け込んだ抽出試薬を発光試薬の凍結乾燥物の入っ
た発光試薬容器１３に送り込み、発光させた。

【００２２】次いで拭取検査用器具３ごと低感度受光素
子（GaAsP ホトダイオード）を使用した試料の測定装置
１にセットして、発光量を測定した。測定値は、相対発
光量ＲＬＵ（Relative light Unit）で示し、結果を表
１に示す。この表１より、ＰＰＤＫを含有しない発光試
薬を用いた場合（ＰＰＤＫなし）は、ＡＴＰ由来の発光
量しか得られず、また、発光量が急激に減衰し不安定で
あるために、測定値はほとんどの場合０であった。一
方、ＰＰＤＫを含有した発光試薬の場合（ＰＰＤＫあ
り）は、ＡＴＰ以外に、食品中に大量に含まれるＡＭＰ
由来の発光が得られ、また、発光量も安定しているため
に、汚れを高感度に測定することができた。また、手指
の場合は食品の場合よりも、ＡＭＰに対するＡＴＰの比
率が高いために、ＰＰＤＫを含有しない発光試薬でも比
較的高感度に測定することができた。

【００２３】

【表１】

【００２４】

【実施例２】実施例１においてＰＰＤＫを含有する発光
試薬の場合をＰＰＤＫあり、また、同試薬からＰＰＤＫ
のみを除いた発光試薬の場合をＰＰＤＫなしとした。Ｐ
ＰＤＫありとＰＰＤＫなし各２００μｌを試験管に採取
し、市販のオレンジジュースを超純水にて１%に希釈し
たものを各１００μｌ添加した。これを、GaAsホトダイ
オードをセットした試料の測定装置１にセットして、発
光量を測定した。測定値は、相対発光量ＲＬＵ（Relati
ve light Unit）で示した。ＰＰＤＫなしの場合の測定
値は124ＲＬＵであったが、ＰＰＤＫありの場合の測定
値は1356ＲＬＵであった。

【００２５】

【発明の効果】発光試薬としてＰＰＤＫ等のＡＴＰ再生
酵素を含有する発光試薬を用いているので、発光が強く
安定しており、低感度受光素子でもその発光を検出で
き、さらに装置を小型、軽量化できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】試料の測定装置の正面断面図

【図２】回路図

【図３】試料の測定装置の正面図

【図４】拭取検査用器具

【符号の説明】

１試料の測定装置２本体３拭取検査用器具４集光レンズ５低感度受光素子６測定回路部９収納室１０テーブル部材１１反射鏡１２検体採取具１３発光試薬容器１４検体拭取具１５抽出液容器４６演算装置４７表示部４８操作部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G054 AA10 AB03 BB01 BB02 BB10 CA20 EA01 EA02 EA03 FA17 FA33 JA00 JA09 4B029 AA07 BB16 FA03 FA09 FA12 4B063 QA01 QA20 QQ17 QQ20 QQ62 QQ63 QR07 QR66 QS28 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノシンリン酸エステル類を、ＡＴＰ再
生酵素を含有する発光試薬により発光させ、その発光量
を低感度受光素子により測定することを特徴とする発光
による試料の測定方法
【請求項２】検査用器具の収納室、該収納室におかれた
検査用器具による発光を受光する低感度受光素子、及び
該低感度受光素子からの信号を電気的に処理する演算装
置より構成されることを特徴とする発光による試料の測
定装置。
【請求項３】検査用器具が、拭取検査用器具である請求
項２記載の発光による試料の測定装置。
【請求項４】拭取検査用器具がＡＴＰ再生酵素を含有す
る発光試薬を利用する請求項２あるいは３記載の発光に
よる試料の測定装置。
【請求項５】検査用器具が試験管である請求項２記載の
発光による試料の測定装置。