CN106442503A - 一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒，乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂包括反应剂和显色剂；所述反应垫的制备方法，包括步骤：1)将对硝基苯‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于无水甲醇中，得到浸泡液A；2)将聚乙烯吡咯烷酮、Triton X‑10、EDTA和柠檬酸溶于纯水中，得到浸泡液B；3)将载体置于浸泡液A中浸泡后取出，干燥，得到浸泡液A载体；4)将浸泡液A载体置于浸泡液B中浸泡后取出，干燥，得到反应垫；通过该制备方法获得的反应垫结合检测试剂的成分应用于制备一种灵敏度高、精确度高的试剂盒。

Description

一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试 剂盒

技术领域

本发明涉及乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂领域，具体涉及一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒。

背景技术

阴道炎是阴道黏膜及黏膜下结缔组织的炎症，是妇科门诊常见的疾病。正常健康妇女，由于解剖学及生物化学特点，阴道对病原体的侵入有自然防御功能，当阴道的自然防御功能遭到破坏，则病原体易于侵入，导致阴道炎症。常见的阴道炎有细菌性阴道炎(BV/AV)、霉菌性阴道炎(VVC)及滴虫性阴道炎(TV)三大类。其中，霉菌性阴道炎又称念珠菌性阴道炎，是以念珠菌特别是白色念珠菌为病原体产生的一类阴道炎症。滴虫性阴道炎是以阴道毛滴虫为主要病原体产生的一类阴道疾病，是全球性、十分常见的公共卫生性传播疾病。

研究表明，滴虫、念珠菌具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶特异性酶，因此可以通过检测N-乙酰氨基葡萄糖苷酶检测滴虫和念珠菌。但目前用于检测乙酰氨基葡萄糖苷酶的检测试剂其精确度有所欠缺。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，该试剂可使用生理盐水作为样品稀释液，使用条件简单方便，精确性高。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，包括反应剂和显色剂；所述反应剂包括：无水甲醇、对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100、EDTA和柠檬酸。

作为优选，所述反应剂的成分按重量份计包括：

所述Triton X-10占乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂的体积百分比为0.01～0.5％。

再优选地，所述反应剂的成分按重量份计包括：

所述Triton X-10占乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂的体积百分比为0.2％。

作为优选，所述显色剂为氢氧化钠溶液；再优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.004～0.04g/mL。

作为优选，所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮-K90。

作为优选，使用所述乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

本发明的第二个目的是为了提供一种反应垫，该反应垫使用方便快捷，精确性高。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种反应垫，包括载体和如上所述的反应剂的成分；所述反应剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测乙酰氨基葡萄糖苷酶。

作为优选，使用所述反应垫进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

本发明的第三个目的是为了提供一种反应垫的制备方法，通过该制备方法结合检测试剂的成分获得一种灵敏度高、精确度高的反应垫。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的反应垫的制备方法，包括以下步骤：

1)制备浸泡液A：将对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于无水甲醇中，得到浸泡液A；

2)制备浸泡液B：将聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和柠檬酸溶于纯水中，得到浸泡液B；

3)浸泡液A处理：将载体置于浸泡液A中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到浸泡液A载体；

4)浸泡液B处理：将浸泡液A载体置于浸泡液B中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到反应垫。

作为优选，步骤3)中，所述载体置于浸泡液A中充分浸泡10～20s；步骤4)中，所述载体置于浸泡液B中充分浸泡10～20s。

作为优选，步骤3)中，所述干燥的温度为20～70℃，时间为30～40min；步骤4)中，所述干燥的温度为20～75℃，时间为30～40min。

作为优选，步骤3)中，所述载体为滤纸。

本发明的第四个目的是为了提供一种试剂盒，该试剂盒用于检测乙酰氨基葡萄糖苷酶，使用方便灵活。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种试剂盒，包括如上所述的反应垫，以及显色剂；所述试剂盒用于检测乙酰氨基葡萄糖苷酶。

作为优选，所述试剂盒通过以下步骤得到：

1)放置反应垫：将反应垫置于反应孔中，然后将反应孔密封；

2)制备显色剂：配制氢氧化钠溶液作为显色剂；所述显色剂配合反应垫，得到试剂盒。

本发明的设计原理如下：

滴虫、念珠菌具有特异性酶：N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，因此可以通过检测N-乙酰氨基葡萄糖苷酶检测滴虫和念珠菌。当阴道分泌物中存在N-乙酰氨基葡萄糖苷酶时，水解对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，在显色剂的作用下显黄色。其中，念珠菌白带pH≤4.6，而滴虫白带pH≥4.8，还可将本发明的检测试剂盒结合pH检测结果进一步判别滴虫性阴道炎还是念珠菌性阴道炎。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的反应垫可使用生理盐水作为检测样品稀释液，使用条件简单方便，并可结合使用条件相同的其他菌种预成酶的检测反应垫同时对样品进行检测，效率更高；

2、本发明的反应垫制备方法最大限度地将检测试剂的成分包被在反应垫中，获得的反应垫灵敏度高，精确性好。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，包括：反应剂和显色剂；反应剂按重量份计包括以下成分：

所述Triton X-10占乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂的体积百分比为0.01～0.5％。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-K90，在25℃下，体积百分数为5％的水溶液(aq)，其粘度为39.5～45.8mPas。

其中反应剂通过以下制备方法制得：

将无水甲醇、对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和柠檬酸依次溶于纯水中，得到反应剂；

显色剂为浓度0.004～0.04g/mL的氢氧化钠溶液；显色剂配合反应剂，得到乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂。

一种反应垫，包括载体和如上所述的反应剂的成分；所述反应剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测乙酰氨基葡萄糖苷酶；使用该反应垫进行样品检测时，样品的稀释液为生理盐水。

该反应垫的制备方法包括以下步骤：

1)备料：按以上重量份准备无水甲醇、对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、EDTA和柠檬酸；

2)制备浸泡液A：将对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于无水甲醇中，得到浸泡液A；

3)制备浸泡液B：将聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和柠檬酸溶于纯水中，得到浸泡液B；

4)浸泡液A处理：将滤纸置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为20～70℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到浸泡液A滤纸；

5)浸泡液B处理：将浸泡液A滤纸置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度20～75℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到反应垫。

更具体地，所述滤纸可以是Whatman玻璃纤维滤纸、GF/A Whatman的纤维滤纸Grade3或普通定量滤纸。

应用反应垫制备试剂盒：试剂盒包括反应垫和显色剂；试剂盒通过以下步骤得到：

1)放置反应垫：将反应垫置于反应孔中，然后将反应孔密封；

2)制备显色剂：配制氢氧化钠溶液作为显色剂；显色剂为浓度0.004～0.04g/mL的氢氧化钠溶液；

所述显色剂配合反应垫，得到试剂盒；试剂盒置于2～8℃中保存。

实施例1～3

实施例1～3公开了一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，按表1分别准备三组原料成分，按表2准备浓度不同的氢氧化钠溶液作为显色剂；A组用于实施例1，B组用于实施例2，C组用于实施例3。

将无水甲醇、对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和柠檬酸依次溶于100mL的纯水中，得到反应剂；显色剂配合反应剂，得到凝固酶检测试剂。

表1反应剂的成分及含量

表2显色剂的配制参数

对实施例1～3中获得的检测试剂进行检测：分别制备酶活性浓度不同的乙酰氨基葡萄糖苷酶标准品溶液，乙酰氨基葡萄糖苷酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例1～3的灵敏度。

分别取实施例1～3的乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂各1mL，然后分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴17～20min，然后滴入显色剂，观察溶液中的颜色变化，溶液显色为黄色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表3所示：

表3实施例1～3的检测结果

+表示阳性，-表示阴性。

实施例1～3均可检测乙酰氨基葡萄糖苷酶，且当乙酰氨基葡萄糖苷酶活性较低时仍然能够检测到乙酰氨基葡萄糖苷酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例1仍可检测得到少量的乙酰氨基葡萄糖苷酶，实施例1的检测试剂灵敏度最高。

实施例4～6

实施例4～6公开了一种试剂盒：

1)按表1和表2进行备料；A组用于实施例4，B组用于实施例5，C组用于实施例6；

2)制备浸泡液A：将对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于无水甲醇中，得到浸泡液A；

3)制备浸泡液B：将聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和柠檬酸溶于纯水中，得到浸泡液B；

4)浸泡液A处理：将滤纸置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为40℃，时间为40min的条件下进行干燥，得到浸泡液A滤纸；

5)浸泡液B处理：将浸泡液A滤纸置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为45℃，时间为30min的条件下进行干燥，得到反应垫；

6)放置反应垫：将反应垫置于反应孔中，然后将反应孔密封；

7)制备显色剂：配制氢氧化钠溶液作为显色剂；所述显色剂配合反应垫，得到试剂盒。

对实施例4～6中获得的试剂盒进行检测：分别制备酶活性浓度不同的乙酰氨基葡萄糖苷酶标准品溶液，乙酰氨基葡萄糖苷酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例4～6的灵敏度；在实施例4～6的试剂盒反应孔中分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴17～20min，然后滴入显色剂，观察试剂盒中的颜色变化，显色为黄色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表4所示：

表4实施例4～6的检测结果

+表示阳性，-表示阴性。

实施例4～6的试剂盒均可检测乙酰氨基葡萄糖苷酶，且当乙酰氨基葡萄糖苷酶活性较低时仍然能够检测到乙酰氨基葡萄糖苷酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例4仍可检测得到少量的乙酰氨基葡萄糖苷酶，实施例4的检测试剂灵敏度最高。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于：包括反应剂和显色剂；所述反应剂包括：无水甲醇、对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、EDTA和柠檬酸。

2.如权利要求1所述的乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于：所述反应剂的成分按重量份计包括：

所述Triton X-10占乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂的体积百分比为0.01～0.5％。

3.如权利要求1所述的乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于：所述显色剂为氢氧化钠溶液。

4.如权利要求3所述的乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于：所述氢氧化钠溶液的浓度为0.004～0.04g/mL。

5.如权利要求1所述的乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于：所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮-K90。

6.如权利要求1所述的乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于：使用所述乙酰氨基葡萄糖苷酶检测试剂进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

7.一种反应垫，其特征在于：包括载体和如权利要求1-6任一所述的反应剂的成分；所述反应剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测乙酰氨基葡萄糖苷酶。

8.如权利要求7所述的反应垫，其特征在于：使用所述反应垫进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

9.一种如权利要求7所述的反应垫的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备浸泡液A：将对硝基苯-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶充分溶于无水甲醇中，得到浸泡液A；

2)制备浸泡液B：将聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-10、EDTA和柠檬酸溶于纯水中，得到浸泡液B；

3)浸泡液A处理：将载体置于浸泡液A中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到浸泡液A载体；

4)浸泡液B处理：将浸泡液A载体置于浸泡液B中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到反应垫。

10.如权利要求9所述的反应垫的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述载体置于浸泡液A中充分浸泡10～20s；步骤4)中，所述载体置于浸泡液B中充分浸泡10～20s。

11.如权利要求9所述的反应垫的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述干燥的温度为20～70℃，时间为30～40min；步骤4)中，所述干燥的温度为20～75℃，时间为30～40min。

12.一种试剂盒，其特征在于：包括如权利要求7所述的反应垫，以及显色剂；所述试剂盒用于检测乙酰氨基葡萄糖苷酶。