CN105510261A - 一种灵敏度高的d3-羟丁酸（d3h）检测试剂及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种D3-羟丁酸(D3H)检测试剂以及检测方法。本发明试剂盒包括试剂R1和试剂R2。本发明在原有的酶法检测血清D3H的基础上优先选择了三乙醇胺作为缓冲液，试剂R1和R2中分别增加了707和吐温20两种表面活性剂，能够有效的乳化反应试剂，放大反应效率，使反应能够快速的达到平衡，从而增大反应的灵敏性。在试剂R1中还添加了消泡剂壬基酚聚氧乙烯醚(NP-4)，能够有效地去除反应过程中产生的气泡，从而提高检测结果的精密度。这些物质的添加和选择大大提高了生化试剂的分析灵敏度和精密度，对临床使用提供了很大的便利。
Description
技术领域
本发明涉及D3-羟丁酸（D3-H）检测技术领域，特别涉及一种分析灵敏度高的D3-羟丁酸（D3H）检测试剂。
背景技术
D3-羟丁酸(D3H)也叫β-羟丁酸。它是酮体的主要成分，约占酮体总量的78% ，是脂肪酸在肝脏进行正常分解代谢所生成的特殊中间产物。正常人血液中β-羟丁酸含量极少，这是人体利用脂肪氧化供能的正常现象。但在某些生理情况(饥饿、禁食)或病理情况 (如糖尿病) 下，糖的来源或氧化供能障碍，脂动员增强，脂肪酸就成了人体的主要供能物质。脂肪酸分解代谢产生酮体(β-羟丁酸含量最多，约占78％，乙酰乙酸约占20％，丙酮约占2％)的量超过肝外组织利用的能力，二者之间失去平衡，血中D3-羟丁酸浓度就会过高，导致酮血症(acetonemia)和酮尿症(acetonuria)。乙酰乙酸和β-羟丁酸都是酸性物质，因此酮体在体内大量堆积还会引起代谢性酸中毒。早期检测人体的酮体均是检查尿酮体的含量，但尿酮体以乙酰乙酸为主。而酮体的主要成分为β-羟丁酸，所以检测β-羟丁酸才是监测酮症酸中毒最敏感的指标。β-羟丁酸在酮体中最稳定，采用目前先进的酶联反应方法，结果准确可靠。β- 羟丁酸检测在糖尿病酮症酸中毒诊断、治疗中有重要意义，对糖尿病的早期诊断也有重要意义。它还做为糖尿病昏迷的诊断及鉴别诊断指标。
检测人体酮体的方法比较多，传统检测酮体的方法是在碱性条件下，尿中的乙酰乙酸、丙酮与亚硝基铁氰化钠反应，生成紫红色的复合物。这种测试方法对乙酰乙酸的敏感度为5～l0mg／dl，对丙酮的敏感度为40～70mg／dl，并且不与β-羟丁酸反应。而β-羟丁酸在酮体中所占比例最大，可以代表酮体的含量。1962年以前，检测β-羟丁酸的方法是将β-羟丁酸氧化成丙酮，再用滴定法、比重法、比色法测定所生成的丙酮，这是半定量的结果，而且丙酮生成量在很大程度上受实验条件的影响，用气相色谱(GC)法定量分析丙酮也仅能测定血清总酮浓度，无特异性，检测血液中D3H的方法还有酶法和免疫比浊法，其中免疫比浊法需要特定的抗体，对抗体的要求较高，成本也较高，目前临床中使用比较多的是酶法，酶法相对于其他的方法有较高的特异性，能够较准确度检测出血液中的D3H，并且能够在全自动生化分析仪器上使用，成本相对较低，操作简单，目前已经有公司能够提供相应的试剂盒。但是由于人体中D3H的含量较低，多数酶法的试剂盒无法准确度检测出较低值的D3H的含量，甚至出现0结果，由于灵敏度低导致检测的试剂盒的结果重复性较差，给临床中的使用带来了很大的不便，因此提高酶法检测血清D3H的灵敏度有极其重要的应用意义。
本发明根据这个问题发明了一种建立在酶法基础之上的分析灵敏度高的D3H检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测分析灵敏度高的D3-羟丁酸（D3H）检测试剂以及检测方法。
基本原理：
在β-羟丁酸脱氢酶的（β-HBD）的催化下，β-羟丁酸被氧化成乙酰乙酸（碱性化境下）同时NAD+被还原成NADH.通过监测340nm下，颜色的变化，得到D3羟丁酸的含量。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：
试剂R1：
缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
D3羟丁酸脱氢酶 1.8KU/L-3.2KU/L
草酸铵 20mmol/L- 20mmol/L
重金属离子螯合剂 1ml/L- 3ml/L
消泡剂 2ml/L- 5ml/L
酶激活剂 2g/L-5mg/L
表面活性剂 3ml/L- 20g/L
酶保护剂 5g/L- 5ml/L
防腐剂 1g/L- 1g/L
试剂R2：
缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
NAD 3.0mmol/L-5mmol/L
重金属螯合剂 5mmol/L-10mmol/L
表面活性剂 1ml/L-5ml/L
防腐剂 0.1g/L-1g/L
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R1和R2中缓冲液为25℃，PH=8.5的 浓度为100mmol/L 三乙醇胺缓冲液。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，所述防腐剂为叠氮钠。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R1中所述消泡剂为壬基酚聚氧乙烯醚（NP-4）。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R1中所述酶激活剂为FAD。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R1中所述表面活性剂为Emulgen707 (上海钧尚)。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R1中所述酶保护剂为海藻糖。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R1中所述重金属离子螯合剂为羟基乙叉二膦酸 。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R2中所述重金属离子螯合剂为EDTA-Na2。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，试剂R2中所述表面活性剂为吐温-20。
所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂来检测一种分析灵敏度高的D3H的检测方法，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为340 nm。
所述的检测方法，R1试剂和R2试剂的比例为3:1。
本发明的创新处：
1）本发明在原有的酶法检测血清D3H的基础上优先选择了三乙醇胺作为缓冲液。
2）在试剂R1和R2中分别增加了707和吐温20两种表面活性剂，这两种表面活性剂能够有效的乳化反应试剂，能够放大反应的效率，是反映能够快速的达到平衡，从而增大反应的灵敏性。
3）在试剂的R1中分别加入了酶激活剂FAD和酶保护剂海藻糖，这两种物质的加入有效的激活和保护了酶的活性，使用非常少量的酶就能够达到较好的效果，并且会放慢酶的衰减的速度，从而降低了试剂的成本。
4）由于在整个反应中，重金属离子会对反应产生较大的抑制作用，尤其是铜离子、锌离子，因此在试剂R1和R2中分别优先选择了羟基乙叉二膦酸和EDTA-Na2作为重金属离子螯合剂，能够有效的去除金属离子对反应的影响。
5）在试剂R1中还添加了消泡剂壬基酚聚氧乙烯醚（NP-4），能够有效地去除反应过程中产生的气泡，从而提高检测结果的精密度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
一种传统的D3H检测试剂，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：
试剂R1：
Tris缓冲液 PH8.5 100mmol/L
D3羟丁酸脱氢酶 0.18KU/L
试剂R2：
Tris缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
NAD 3.0mmol/L
草酸铵 20mmol/L
实施例2
一种灵敏度高的酶法D3H检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：
试剂R1：
三乙醇胺缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
D3羟丁酸脱氢酶 1.8KU/L
草酸铵 5mmol/L
羟基乙叉二膦酸 1ml/L
壬基酚聚氧乙烯醚（NP-4） 2ml/L
FAD 2mg/L
海藻糖 5g/L
707 3ml/L
叠氮钠 1g/L
试剂R2：
三乙醇胺缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
NAD 3.0mmol/L
EDTA.NA2 5mmol/L
吐温-20 1ml/L
叠氮钠 1g/L
实施例3
本实施例描述的是一种重要组成部分含量增加的准确度高的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：
试剂R1：
三乙醇胺缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
D3羟丁酸脱氢酶 3.2KU/L
草酸铵 20mmol/L
羟基乙叉二膦酸 3ml/L
壬基酚聚氧乙烯醚（NP-4） 5ml/L
FAD 5mg/L
海藻糖 20g/L
707 5ml/L
叠氮钠 1g/L
试剂R2：
三乙醇胺缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
NAD 5mmol/L
EDTA-Na2 10mmol/L
吐温-20 5ml/L
叠氮钠 1g/L
3）检测使用方法：
本实施例描述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用速率法进行测定。分别将实施例1、实施例2和实施例3的R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：
表1 实施例1试剂检测方法
计算：一种分析灵敏度高的D3H含量（U/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准。
4）干扰性试验：
取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成6等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例2和实施例3所得试剂，同时对比测定血清中一种分析灵敏度高的D3H的含量,加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－无干扰物质的样本的测定均值)/无干扰物质的测定均值×100%。
由表2可以看出，实施例1试剂在血红蛋白≤110g/L、胆红素≤274umol/L、甘油三酯≤11.3mmol/L对测试结果没有明显干扰。
表2 实施例试剂抗干扰性能比较
5)灵敏度实验：
分别将实施例1、实施例2、实施例3对8个不同浓度的样本进行检测，样本浓度由低到高，分别记录对比检测结果，如表4中所显示的内容，通过表中的内容可以看出，实施例1中的对于低值的样本检测结果非常的不准确度，甚至出现0值，而实施例2与实施例3检测结果较好，说明实施例2和实施例3检测试剂有非常高的灵敏度和准确度。
表3 实施例1试剂、实施例2试剂、实施例3试剂同事检测不同浓度血清对比检测结果
| 理论浓度（mg/dl） | 实施例1试剂（mg/dl） | 实施例2试剂（mg/dl） | 实施例3试剂（mg/dl） |
| 0 | 0.02 | 0 | 0 |
| 0.1 | 0 | 0.09 | 0.1 |
| 0.2 | 0 | 0.21 | 0.19 |
| 0.4 | 0.27 | 0.39 | 0.42 |
| 0.8 | 0.92 | 0.79 | 0.83 |
| 1.6 | 1.42 | 1.55 | 1.58 |
| 3.2 | 3.91 | 3.17 | 3.31 |
| 6.4 | 6.9 | 6.52 | 6.43 |
6）重复性试验
分别将实施例1、实施例2、实施例3对高中低值三个浓度的样本进行检测，每个样本重复20次分别记录对测结果，并计算检测结果的重复性变异系数CV%.计算结果如表5中所显示的内容，通过表中的内容可以看出，实施例1中的检测结果重复性较差，而实施例2和实施例3检测重复性CV%值低，结果较好。
表4 实施例1、实施例2、实施例3对检测高中低值重复性结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 低值（0.5mg/dl） | 23% | 7.6% | 6.5% |
| 中值（1.2mg/dl） | 15% | 4.6% | 4.8% |
| 高值（4.2mg/dl） | 8.3% | 2.3% | 3.7% |
Claims (8)
1.一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：
试剂R1中含有：
缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
D3羟丁酸脱氢酶 1.8KU/L-3.2KU/L
草酸铵 20mmol/L- 20mmol/L
重金属离子螯合剂 1ml/L- 3ml/L
消泡剂 2ml/L- 5ml/L
酶激活剂 2g/L-5mg/L
表面活性剂 3ml/L- 20g/L
酶保护剂 5g/L- 5ml/L
防腐剂 1g/L- 1g/L
试剂R2中含有：
缓冲液 PH 8.5 100mmol/L
NAD 3.0mmol/L-5mmol/L
重金属螯合剂 5mmol/L-10mmol/L
表面活性剂 1ml/L-5ml/L
防腐剂 0.1g/L-1g/L。
2.根据权利要求1所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，其特征在于缓冲液为25℃，PH=8.5的 浓度为100mmol/L三乙醇胺缓冲液。
3.根据权利要求1和权利要求2所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，其特征在于所述消泡剂为壬基酚聚氧乙烯醚（NP-4）。
4.根据权利要求1所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，其特征在于在试剂R1中所述表面活性剂为Emulgen707 (上海钧尚)，试剂R2中表面活性剂为吐温-20。
5.根据权利要求1所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，其特征在于试剂R1中所述金属离子螯合剂为羟基乙叉二膦酸，试剂R2中金属螯合剂为EDTA-Na2。
6.根据权利要求1所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂，其特征在于试剂R1中所述酶激活剂为FAD，试剂R1中酶保护剂为海藻糖。
7.一种使用权利要求1-6中任一项所述的一种分析灵敏度高的D3H检测试剂来检测一种分析灵敏度高的D3H的检测方法，其特征在于使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为340nm。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于R1试剂和R2试剂的比例为3:1。
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