CN101738379A

CN101738379A - 测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂

Info

Publication number: CN101738379A
Application number: CN200910155965A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 沃燕波; 胡治宝
Original assignee: MEIKANG BIOTECH CO Ltd NINGBO
Current assignee: Medical System Biotechnology Co ltd
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2029-12-31
Also published as: CN101738379B

Abstract

本发明公开一种测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，该试剂以5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷为底物，加上合适的缓冲液、表面活性剂、防腐剂和稳定剂等配制而成，本发明提供的液体试剂具有底物溶解度大，试剂稳定性强，检测灵敏度高，临床检测方便、检测成本低，且对N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的测定结果受外界干扰小的优点。

Description

测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂

技术领域

本发明涉及一种测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂。

背景技术

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(英文名：N-acteyl-β-D-glucosaminidase；英文缩写：NAG；EC 3.2.1.30)是细胞内溶酶体水解酶之一，分子量140,000，血中的NAG不能通过肾小球滤膜，NAG在肾单位中含量较高，尤其是在近曲小管上皮细胞中。

研究表明，NAG在糖尿病、高血压肾小管早期损伤、药物肾毒性以及感染、休克、肾移植排异反应等造成的急性肾小管损害时具有重要的检测价值，也是环境肾毒性物质对人群影响的简便筛查手段。尿酶有多种，其中NAG测定是目前应用率最高的尿液酶学诊断项目。它对肾小管损伤的反应很灵敏。此外，用尿作标本，又是一种无创伤性检查，符合当代医学检验方法的潮流，适合于日常检验和连续动态分析，也便于人群筛查的应用。

目前，NAG在临床应用中的测定方法主要包括：放免分析法、荧光分析法和可见分光光度法等。放免分析法和荧光分析法都需要昂贵的仪器，且对底物溶液配制的要求较高而不适于临床的自动化分析。分光光度法从一开始就以合成色原底物为方法学主流。国内目前应用最广的是以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(PNP-NAG)为底物做终点法测定或以氯硝基苯-乙酰氨基葡萄糖苷(CNP-NAG)为底物做速率法测定。前者底物溶解度和稳定性较差，并且以其为底物测定NAG活性时，底物的分解产物对硝基酚在碱性条件下的显色与尿液的颜色非常接近，检测时必须扣除尿液本身在405nm的吸光度，否则将导致较大测量误差，难以满足临床检验要求。后者检测灵敏度仅为前者的1/3，通常以干粉形式试剂盒提供临床使用，需要将底物和缓冲液的混合物在60℃保温6h以上才能溶解，且混合物4℃只能稳定7d，临床实际使用十分不便。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种底物溶解度大，试剂稳定性强，检测灵敏度高，临床检测方便、检测成本低，且对NAG的测定结果受外界干扰小的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，该液体试剂由A(或称为R1)、B(或称为R2)两个组份组成：

A组份(R1)：

缓冲液 50～500mmol/L

表面活性剂 0.1～100g/L

防腐剂 0.1～100g/L，

B组份(R2)：

5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷

0.1～10mmol/L

稳定剂 1～100mmol/L

表面活性剂 0.1～100g/L

防腐剂 0.1～100g/L。

上述的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液等；

上述的表面活性剂为吐温-20(Tween-20)、吐温-80(Tween-80)、聚氧乙烯十二烷醚(Brij 35)或聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)等非离子表面活性剂；

上述的稳定剂为多元醇(如甘油、乙二醇等)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、牛血清白蛋白(BSA)、β-环糊精或甘露醇等；

上述的防腐剂为叠氮钠(NaN₃)或PC防腐剂(如4-氯-3，5-二甲基苯酚)等。

利用上述测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂测定体液(尿液、血液)样本中的NAG：采用行业内常规的固定时间两点法(或称为两点终点法)测定，温度为37℃，R1∶样本∶R2(体积比)为300∶20∶100，测定波长为485～505nm。

本发明上述的5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷，该化合物的结构式如下：

该化合物的外观为淡黄色到黄色结晶型粉末，分子式为C₂₁H₂₇N₃O₁₀S₂·H₂O。熔点为：165～173℃(熔融时分解)，比旋度[α]_D＝+18°。元素分析：实验结果为C，44.65％；H，5.33％；N，7.28％。理论计算为C₂₁H₂₇N₃O₁₀S₂·H₂O：C，44.75％；H，5.19％；N，7.4％。

本发明上述5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷的合成方法，合成路线如下：

本发明突出的实质性特点及显著进步主要表现在：

1)采用本发明的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，利用固定时间两点测定法测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，测定波长为505nm，较目前临床所用405nm波长红移，因此，色原干扰小，能够满足临床检验要求。

2)本发明液体试剂以5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷作为底物溶解度好，在20℃水中的溶解度可达到10mmol，因此解决了目前临床应用中因底物溶解度差带来的使用不便。

3)以5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷为底物，结合本发明中使用的防腐剂、稳定剂、缓冲液和表面活性剂配制成的本发明的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，在2～8℃至少可稳定12个月，稳定性好，以本发明液体稳定剂测定NAG方法和试剂可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。

4)采用本发明的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，能够直接用于体液样品中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的测定，无需复溶，因此，检测方法简便、易操作，可快速得到检测结果，不需要特殊或额外的仪器，便于行业内推广应用，检测成本低。

具体实施方式

实施例

实施例1为5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷的合成。

实施例1

(1)将3.11g N-乙酰氨基葡萄糖(购自广州伟伯化工有限公司)溶于10ml乙酸酐中，加入高氯酸0.1ml，30℃搅拌2h，冷却至8℃以下，加入红磷0.5g，缓缓滴入2.25g溴，10℃反应3h，再加入冰水5ml，然后过滤去除红磷，所得滤液用5ml二氯甲烷萃取2次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次，再用水洗一次得到含化合物C的二氯甲烷溶液：

(2)向步骤(1)所得的含化合物C的二氯甲烷溶液中加入四丁基溴化铵0.45g，将1.07g香草醛和2g碳酸钠合10ml水混合成溶液，搅拌条件下将上述含香草醛D的溶液加入到含化合物C和四丁基溴化铵的上述反应体系中，加热至40℃，反应6h，反应完成后，静置、分层，分出有机相(有机层)，所得水相(水层)用二氯甲烷萃取2次，合并萃取液(即含有二氯甲烷的萃取层)，减压浓缩除去萃取液中的二氯甲烷，所得浓缩物即化合物E；

(3)将步骤(2)所得化合物E加入到15ml甲醇中，加热到40℃溶解，然后再加入7ml醋酸，1g锌粉，然后在40℃下反应4h，趁热过滤去除锌粉，所得滤液冷却、析晶，然后过滤、干燥，所得晶体即4-醛基-2-苯甲氧基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖糖苷(II)；

(4)将步骤(3)所得的4-醛基-2-苯甲氧基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖糖苷溶在200ml 75％的乙醇中，然后再依次加入氯化铵2.25g，绕丹宁-3-乙酸(I)(购自日本TCI)2.69g，然后在50℃下不断搅拌反应2h，过滤，所得滤渣用热的甲醇清洗，然后干燥，得5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷(III)，产率68％。

上述合成步骤中提到的化合物A、化合物C、化合物E、I和II、III等均见发明内容中的合成路线中所对应的化合物。

实施例2-4为利用上述合成的5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷为底物配制本发明的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，及利用本发明的液体试剂测定NAG的方法：

实施例2 表面活性剂选用Tween-20，稳定剂选用BSA。

A组份(R1)：pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液 200mmol/L

Tween-20 2g/L

NaN₃ 1g/L，

B组份(R2)：

5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷液

3mmol/L

BSA 10mmol/L

Tween-20 2g/L

NaN₃ 1g/L。

测定样本时，采用固定时间两点法，温度为37℃，R1∶样本∶R2＝300∶20∶100(体积比)，测定波长为505nm，R1加入标准品或样本(定标时加标准品或校准品，检测样本时加样本)后，孵育300s后读取第一点吸光度，然后再加入R2继续孵育150～300s后读取第二点吸光度。

实施例3表面活性剂选用Brij 35，稳定剂选用β-环糊精。

A组份(R1)：pH 5.0甘氨酸缓冲液 50mmol/L

Brij 35 0.5g/L

NaN₃ 1g/L，

B组份(R2)：5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷液

4mmol/L

β-环糊精 100mmol/L

Brij 35 0.5g/L

NaN₃ 1g/L。

实施例3的测定方法与实施例2相同。

实施例4：表面活性剂选用Tween-80，稳定剂选用甘油。

A组份(R1)：pH 5.0Tris 100mmol/L

Tween-80 1g/L

NaN₃ 1g/L，

B组份(R2)：5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-绕丹宁]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖

苷液 10mmol/L

甘油 100mmol/L

Tween-80 1g/L

NaN₃ 1g/L。

实施例4的测定方法与实施例2相同。

以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权力保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，其特征在于：该液体试剂由A、B两个组份组成：

A组份：

缓冲液 50～500mmol/L

表面活性剂 0.1～100g/L

防腐剂 0.1～100g/L，

B组份：

0.1～10mmol/L

稳定剂 1～100mmol/L

表面活性剂 0.1～100g/L

防腐剂 0.1～100g/L。

2.根据权利要求1所述的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，其特征在于：上述A组份中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液。

3.根据权利要求1所述的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，其特征在于：上述A组份或B组份中的表面活性剂为吐温-20、吐温-80、聚氧乙烯十二烷醚或聚乙二醇辛基苯基醚。

4.根据权利要求1所述的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，其特征在于：上述B组份中的稳定剂为多元醇、乙二胺四乙酸二钠、牛血清白蛋白、β-环糊精或甘露醇。

5.根据权利要求4所述的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，其特征在于：所述的多元醇为甘油或乙二醇。

6.根据权利要求1所述的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，其特征在于：上述A组份或B组份中的防腐剂为叠氮钠或PC防腐剂。

7.根据权利要求6所述的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体试剂，其特征在于：所述的PC防腐剂为4-氯-3，5-二甲基苯酚。