CN101144824A - 总胆红素测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种总胆红素测定试剂盒，该试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1的各组分及浓度范围为：磷酸氢二钠13.5～81g/L，磷酸二氢钠0.6～3.6g/L，氯化钠9.0g/L，乙二胺四乙酸二钠0.2～1g/L，吐温－80 0.5～2ml/L，十二烷基硫酸钠1～10g/L；试剂2的各组份及其浓度范围为：磷酸二氢钠1g/L，氯化钠9g/L，过硫酸钠11.9～23.8g/L，硫酸0.1～2ml/L。该总胆红素测定试剂盒稳定、环保，线性范围适当，测定准确度、精密度和灵敏度高，抗干扰性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定血清、血浆或尿液中总胆红素的试剂盒，具体讲是一种过硫酸钠氧化法测定总胆红素的试剂盒。
背景技术
总胆红素是人体内由血红素代谢产生的结合和非结合型胆红素的总称，总胆红素异常偏高常见于肝胆疾病，近年来一些研究表明血液中胆红素低于正常值常与冠心病有关。因此，对人体的血清、血浆或尿液中总胆红素的测定，是医学检验最常规的项目之一。
本发明人曾经提出一种过硫酸钾化学氧化法测定总胆红素的试剂盒，专利申请号200610154480.2。该专利申请提供了一种既具有现有技术的过硫酸钾氧化法测定总胆红素试剂盒的优点，又线性上限大、抗干扰性强、反应曲线规范、能迅速到达终点且测定的准确度、精密度和灵敏度高的化学氧化法(过硫酸钾氧化法)测定总胆红素的试剂盒(以下简称现有的试剂盒)。
现有的试剂盒，虽然具有上述优点，但我们在实际应用中也发现了以下一些新的问题：
1.现有的试剂盒对溶血情况较严重的标本检测时有较大的误差。由于目前生化检测的实际操作中处理标本时血清与细胞通常不分离，所以标本常有溶血情况，生成游离的血红蛋白。而血红蛋白在450nm(主波长)、546nm(副波长)附近波长处均出现明显吸收峰，严重干扰了总胆红素的测定。
2.现有的试剂盒对脂浊情况较严重的标本检测时测值不准确。现时人们饮食中油脂含量较高，而抽血时不一定是隔夜空腹，所以血清标本中出现脂浊的几率也越来越多，导致样本空白偏高而影响了胆红素测定。现有的试剂盒中采用表面活性剂曲通100(Triton X-100)主要解决了样本中蛋白质的溶解性问题，对轻微脂浊也有一定抗干扰作用，但若样本脂浊较严重就会影响胆红素测定。加大曲通100的量虽然可以促脂浊消失，但加入试剂2后需较长时间平衡，即导致反应曲线波动，而不规范的反应曲线使得测值不准确。
3.现有的试剂盒中过硫酸钾缓慢降解生成酸性物质，导致一定时间后试剂pH值下降，测量时反应体系达不到要求的pH值环境则影响测量准确度。此外过硫酸钾含量过高，虽然检测线性上限大，但在自动生化仪中测量样本时易发生过硫酸钾污染后测项目而导致测量不准确。
4.现有的试剂盒中含有硫柳汞，其本身毒性虽小，但其排放到环境中后会被某些微生物转化生成剧毒的甲基汞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定、环保，线性范围适当，测定准确度、精密度和灵敏度高，抗干扰性强的总胆红素测定试剂盒。
本发明的技术方案是，提供一种总胆红素测定试剂盒，该试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1的各组分及浓度范围为：
磷酸氢二钠 13.5～81g/L
磷酸二氢钠 0.6～3.6g/L
氯化钠 9.0 g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.2～1g/L
吐温-80 0.5～2ml/L
十二烷基硫酸钠 1～10g/L
试剂2的各组份及其浓度范围为：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 11.9～23.8g/L
硫酸 0.1～2 ml/L。
作为优选，本发明所述的总胆红素测定试剂盒，试剂1的各组分及浓度范围为：
磷酸氢二钠 27～60g/L
磷酸二氢钠 1.2～2.4g/L
氯化钠 9.0g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.3～0.7g/L
吐温-80 0.7～1.5ml/L
十二烷基硫酸钠 3～7.5g/L
试剂2的各组份及其浓度范围为：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 15～22g/L
硫酸 0.5～1.5ml/L。
作为最优选，本发明所述的总胆红素测定试剂盒，试剂1的各组分及浓度范围为：
磷酸氢二钠 40.5g/L
磷酸二氢钠 1.8g/L
氯化钠 9.0g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.5g/L
吐温-80 1.0ml/L
十二烷基硫酸钠 5g/L
试剂2的各组份及其浓度范围为：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 18g/L
硫酸 1.0ml/L。
本发明的总胆红素测定试剂盒，所述试剂1和试剂2的容积比为4∶1。
本发明的总胆红素测定试剂盒试剂1和试剂2中的原料选择依据是：
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)，可络合微量元素等金属离子，减少胆红素的自氧化。氯化钠，为生理盐水的浓度，模拟人体内真实的生化环境，使样本中胆红素成分可保持原有空间构像，且有增强溶液的离子强度、加速反应的作用。过硫酸钠，是起氧化性作用的主要成分。过硫酸钠的浓度较低，虽然测量线性上限降低，但也保证能够满足临床测定绝大多数样本的需要，又不致引起交叉污染。加入少量硫酸，调节体系pH为酸性，可抑制过硫酸钠降解。因试剂2调节为酸性，为保证反应体系要求的pH值环境，增大了试剂1中磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的浓度，磷酸二氢钠和磷酸氢二钠形成稳定的缓冲液，利于试剂中各种成分的分散，可提高试剂的稳定性。
因为要经常检测溶血情况较严重的标本，设计在试剂1加入后而在加试剂2前反应前就将血红蛋白转变为只在546nm处仍有较强吸收，但又不能采用氧化剂对被测的胆红素造成影响。我们采用表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)与血红蛋白结合生成棕红色的SDS-Hb后，其最大吸收波峰在546nm附近波长处，而在450nm处吸收峰消失。但十二烷基硫酸钠会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。所在试剂中不能有钾盐。
聚山梨酯80(吐温-80，Tween-80)是一种表面活性剂，作为非结合型胆红素的增溶剂，同时是反应的促进剂，它提高检测的灵敏度，促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定的影响。
由于试剂1中有表面活性剂十二烷基硫酸钠，聚山梨酯80可促使细菌等微生物细胞膜溶解，因而有一定的防腐作用，而试剂2中加有硫酸，也可防止微生物生长繁殖。
本发明试剂1和试剂2的配置方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。
用本发明的试剂盒通过下列方法测定总胆红素：总胆红素在表面活性剂存在下，被化学氧化剂氧化，生成胆绿素，由此测定反应前后吸光度差异，以求得样品中的总胆红素的浓度。
应用本发明总胆红素测定试剂盒测定样本中总胆红素的测试条件如下：温度30～37℃ 比色杯光径为1.0cm。检测主波长450nm，副波长520-570nm(副波长可消除标本中其它基质的干扰，提高检测灵敏度，即仪器读取的吸光度A为A主波长-A副波长。)。
应用本发明总胆红素测定试剂盒测定样本中总胆红素的方法如下：样品(校准管以校准品作样品)加R1混匀，30-37℃孵育3～5min后读取吸光度A0；立即加入R2混匀，30-37℃孵育反应5min后，读取吸光度A1，ΔA＝A1-A0。其中，样品(校准品)用量5～10μl；试剂1用量240μl；试剂2用量60μl。
应用本发明总胆红素测定试剂盒测定样本中总胆红素的计算公式如下：
本发明总胆红素测定试剂盒与现有技术化学过硫酸钾氧化法测定总胆红素的试剂盒相比，试剂稳定、环保，保存时间长(双试剂剂型在室温下可以稳定一年，置于仪器的试剂仓中可以稳定一个月以上)；反应专一、线性范围适当，上限基本能涵盖临床上遇到绝大多数的胆红素病理变化；反应具有很快的到达终点时间的特性，其规范反应曲线能保证测值具有较高的准确度和精密度；抗溶血和脂浊干扰性强。
附图说明
图1是现有的试剂盒的测定总胆红素的实时反应曲线图。
图2是本发明总胆红素测定试剂盒的测定总胆红素的实时反应曲线图。
图1、图2中横坐标为全自动生化分析仪反应监测的时刻，按10分钟分为35个时段；纵坐标为吸光度A。
图3是现有的试剂盒测值线性范围示意图。
图4是本发明的总胆红素测定试剂盒测值线性范围示意图。
图3、图4中横坐标表示为理论测值，纵坐标表示为实测值。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例及对比例对本发明进行进一步的说明，但本发明远不仅限于以下实施例。
实施例1
试剂1(R1)各组份及其浓度范围：
磷酸氢二钠 13.5g/L
磷酸二氢钠 0.6g/L
氯化钠 9g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.2g/L
吐温-80 0.5ml/L
十二烷基硫酸钠 1g/L
试剂2的各组份及其浓度范围如下：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 12g/L
硫酸 2ml/L
试剂1和试剂2的配置方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。
实施例2
试剂1(R1)各组份及其浓度范围：
磷酸氢二钠 81g/L
磷酸二氢钠 3.6g/L
氯化钠 9g/L
乙二胺四乙酸二钠 1g/L
吐温-80 2ml/L
十二烷基硫酸钠 10g/L
试剂2的各组份及其浓度范围如下：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 24g/L
硫酸 0.1ml/L
实施例2试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例3
试剂1(R1)各组份及其浓度范围：
磷酸氢二钠 60g/L
磷酸二氢钠 2.4g/L
氯化钠 9g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.7g/L
吐温-80 1.5ml/L
十二烷基硫酸钠 7.5g/L
其中试剂2的各组份及其浓度范围如下：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 22g/L
硫酸 0.5ml/L
实施例3试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例4
试剂1(R1)各组份及其浓度范围：
磷酸氢二钠 27g/L
磷酸二氢钠 1.2g/L
氯化钠 9g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.3g/L
吐温-80 0.7ml/L
十二烷基硫酸钠 3g/L
其中试剂2的各组份及其浓度范围如下：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 15g/L
硫酸 1.5ml/L
实施例4试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例5
试剂1(R1)各组份及其浓度范围：
磷酸氢二钠 40.5g/L
磷酸二氢钠 1.8g/L
氯化钠 9g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.5g/L
吐温-80 1ml/L
十二烷基硫酸钠 5g/L其中试剂2的各组份及其浓度范围如下：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 18g/L
硫酸 1ml/L
实施例5试剂盒的制备方法同实施例1。
应用本发明总胆红素测定试剂盒测定样本中总胆红素的测试条件如下：温度30～37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长450nm，副波长520-570nm(副波长可消除标本中其它基质的干扰，提高检测灵敏度，即仪器读取的吸光度A为A主波长-A副波长.)。
应用本发明总胆红素测定试剂盒测定样本中总胆红素的方法如下：样品(校准管以校准品作样品)加 R1混匀，30-37℃孵育3～5min后读取吸光度A0；立即加入R2混匀，30-37℃孵育反应5min后，读取吸光度A1，ΔA＝A1-A0。其中，样品(校准品)用量5～10μl；试剂1用量240μl 试剂2用量60μl。
最后，应用计算公式：
得到本发明总胆红素测定试剂盒测定样本中总胆红素的浓度。
下面结合附图和表格对现有的试剂盒与本发明试剂盒的性能进行比较。通过反应曲线、灵敏度、线性范围、测定精密度、准确性及各种干扰物等的影响比较这两种试剂盒。
1、两种试剂盒实时反应曲线的比较：
良好的反应曲线是保证结果准确的基础。现有的试剂盒的反应曲线规范(参见图1)。本发明的试剂盒的实时反应曲线(参见图2)与现有的试剂盒的曲线基本相同，样本经与试剂2氧化后产生的吸光度下降明显，且经监测时刻10min后吸光度基本稳定。
2、两种试剂盒的灵敏度的比较：
用现有的试剂盒和本发明的试剂盒测定罗氏校正液标示值为95.9μmol/L，吸光度读数如下：
| 吸光度 | A0 | A1 | A1-A0 |
| 本发明的试剂盒 | 3286 | 834 | -2452 |
| 现有的试剂盒 | 2921 | 815 | -2106 |
本发明的试剂盒较现有的试剂盒测定同一样本引起的吸光度变化更大，表明本发明的试剂盒灵敏度更高。
3、两种试剂盒的线性范围的比较(参见图3、图4)：
配制0, 100,200,300,400,500,600,700,800μmol/L总胆红素标准溶液，分别用本发明总胆红素测定试剂盒和现有的试剂盒来测定其浓度，结果见表1。
表1 本发明总胆红素测定试剂盒和对比例试剂盒测定线性范围对比
| 理论值(μmol/L) | 0 | 100 | 200 | 300 | 400 | 500 | 600 | 700 | 800 |
| 本发明试剂盒测值(μmol/L) | 0.1 | 101.4 | 198.6 | 303.1 | 397.1 | 506.5 | 605.6 | 687.1 | 751.2 |
| 现有的试剂盒测值(μmol/L) | 0.1 | 100.5 | 201.4 | 294.7 | 394.9 | 489.3 | 587.4 | 706.6 | 796.4 |
结合图3(现有的试剂盒)、图4(本发明的试剂盒)可以看出，本发明的试剂盒的线性范围比现有的试剂盒的线性范围小，但在0～700μmol/L(临床上常见胆红素样本值)范围内，标准曲线基本呈线性，说明本发明的试剂盒在此范围内仍能较真实反映测量上限浓度。
4、两种试剂盒的抗干扰性能的比较：
在罗氏质控品(标示值95.9μmol/L)中加入四种干扰物形成混合血清，其中加入脂肪乳为模拟样本脂浊、血红蛋白为模拟样本溶血的情况，测定结果如下：
表2 本发明总胆红素测定试剂盒和现有的试剂盒测定抗干扰性能对比
| 肝素(1300U/L) | 脂肪乳(10mmol/L) | 血红蛋白(20g/L) | VitC(1.5g/L) | |
| 本发明的试剂盒测值(μmol/L) | 94.6 | 59.0 | 94.5 | 97.2 |
| 测值与标示值偏差 | 1.36％ | 0.94％ | 1.46％ | 1.36％ |
| 现有的试剂盒测值(μmol/L) | 94.9 | 98.7 | 91.3 | 97.7 |
| 测值与标示值偏差 | 1.04％ | 2.92％ | 4.8％ | 1.88％ |
从上表可以看出本发明的试剂盒比现有的试剂盒在抗较严重的脂浊和溶血干扰时性能表现得更好。
5、两种试剂盒的精密度和准确度比较：
以罗氏校正品定标，测定罗氏高值(异常值)和低值(正常值)质控品。连续用二法进行准确度比较，结果如下：
表3 本发明总胆红素测定试剂盒和现有的试剂盒测定精确度对比
| 罗氏高值(标示95.9μmol/L) | 罗氏低值(标示23.4μmol/L) | |
| 本发明的试剂盒实测均值 | 94.5μmol/L | 22.8μmol/L |
| 均值与标示值偏差 | 1.46％ | 2.56％ |
| 本发明的试剂盒精密度(n＝20) | 1.4％ | 2.49％ |
| 现有的试剂盒实测均值 | 97.6μmol/L | 24.1μmol/L |
| 均值与标示值偏差 | 1.77％ | 2.99％ |
| 现有的试剂盒精密度(n＝20) | 1.6％ | 2.38％ |
二法对罗氏质控品的测值准确度和精密度均接近，表明在测定临床大多数样本时，两者精密度和准确度无明显差别。
综上所述， 相比现有的试剂盒本发明试剂盒具有的以下显著优点和有益效果：
1、灵敏度提高，对测量胆红素含量较低的样本的准确度有一定程度的提高，从而能更广泛地应用于冠心病的及早诊断预防。
2、抗干扰性能更强。临床检测中样本溶血和脂浊已成为最常见的干扰，而本发明的试剂盒采取了多种措施，能消除更严重的溶血(血红蛋白20g/L)和脂浊(脂肪乳10mmol/L)对样本测定胆红素含量的干扰影响。从而保证了测量过程的准确性。
3、本发明的试剂盒比现有技术的试剂盒更稳定。
4、本发明的试剂盒比现有技术的试剂盒还具有更好的环保安全性能。本试剂盒的原料是低分子无机物，少量表面活性剂也属于无毒范畴。它不污染环境，对操作者健康无任何损害。因为不含有汞化合物，没有环境安全隐患。
上述实施例用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种总胆红素测定试剂盒，其特征在于该试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1的各组分及浓度范围为：
磷酸氢二钠 13.5～81g/L
磷酸二氢钠 0.6～3.6g/L
氯化钠 9.0g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.2～1g/L
吐温-80 0.5～2ml/L
十二烷基硫酸钠 1～10g/L
试剂2的各组份及其浓度范围为：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 11.9～23.8g/L
硫酸 0.1～2ml/L。
2.根据权利要求1所述的总胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述试剂1的各组分及浓度范围为：
磷酸氢二钠 27～60g/L
磷酸二氢钠 1.2～2.4g/L
氯化钠 9.0g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.3～0.7g/L
吐温-80 0.7～1.5ml/L
十二烷基硫酸钠 3～7.5g/L
所述试剂2的各组份及其浓度范围为：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 15～22g/L
硫酸 0.5～1.5ml/L。
3.根据权利要求2所述的总胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述试剂1的各组分及浓度范围为：
磷酸氢二钠 40.5g/L
磷酸二氢钠 1.8g/L
氯化钠 9.0g/L
乙二胺四乙酸二钠 0.5g/L
吐温-80 1.0ml/L
十二烷基硫酸钠 5g/L
所述试剂2的各组份及其浓度范围为：
磷酸二氢钠 1g/L
氯化钠 9g/L
过硫酸钠 18g/L
硫酸 1.0ml/L。
4.根据权利要求1、2或3所述的总胆红素测定试剂盒，其特征在于：所述试剂1和试剂2的容积比为4∶1。
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2007
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