CN109557238A - 一种一氧化氮检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种一氧化氮检测方法及其相关应用，属于生物化学领域，是通过检测一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量，间接反映生物体内一氧化氮的总含量。本发明准确度高，操作简便，反应时间短，易于保存，可实现自动化操作，适用于多种样本的检测，具有广阔的应用前景和较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种一氧化氮的检测方法、试剂盒及其相关应用。
背景技术
一氧化氮(NO)在生物体内是一种具有双重作用的信使分子，作为第二信使和神经递质而起着不同的作用。NO普遍存在于脊椎动物的各种细胞，如内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞中，是细胞间和细胞内信息传递的重要调节因子，同时还是宿主免疫反应中一种细胞毒性因子。内源性NO作为血管内皮细胞产生并释放的可舒张血管的内源性舒张因子，在神经传导、免疫应答、血管扩张和血小板功能等许多病理生理过程中有重要作用。
NO半衰期短，可迅速与水、氧和细胞中广泛存在的超氧自由基反应生成硝酸盐和亚硝酸盐，同时检测出硝酸盐与亚硝酸盐的总量即可推算出总的NO含量。目前NO的光谱检测方法主要有两种：一是采用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐，然后通过Griess试剂检测亚硝酸盐，从而得出总NO的含量；二是以镉柱对样本进行数小时的预处理，将硝酸盐转化为亚硝酸盐，再用Griess试剂检测亚硝酸盐，从而得出总NO的含量。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术中存在如下问题：一，操作繁琐，耗时较长，需要几个小时以上；二，检测试剂需现配现用，无法长期保存；三，无法实现自动化，不适于大量样本的检测。因此，建立一种准确、快速、方便的NO检测方法显得十分重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，发明人提供了一种简便快速、适用于大样本自动化检测的总NO检测方法。具体技术方案如下：
一种一氧化氮检测方法的步骤包括：
检测生物样品中一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量；
通过一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量，间接计算生物样品中一氧化氮的总含量。
具体如下：
先采用硫酸肼还原法将样品中的硝酸盐转化为亚硝酸盐，即在强碱性条件下，样品中的硝酸盐在含铜离子与锌离子的催化剂下与硫酸肼发生氧化还原反应，被还原为亚硝酸盐；
然后，亚硝酸盐与Griess试剂反应，生成紫红色溶液，测得其吸光值高低，吸光值高低与亚硝酸盐含量成正比；
测得的亚硝酸盐含量即为样品中硝酸盐与亚硝酸盐的总含量，也即一氧化氮的总含量。
所述的一氧化氮检测方法在细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液中的应用。
所述的一氧化氮检测方法在一氧化氮检测试剂盒中的应用。
一种一氧化氮检测试剂盒，包括R1和R2双试剂。其中，R1主要成分为硫酸肼、CuSO4-酒石酸、ZnSO4-酒石酸、Na2HPO4·12H2O、稳定剂，R1的作用是使硝酸盐转化为亚硝酸盐；R2主要成分为磺胺嘧啶钠盐、盐酸萘乙二胺，R2用于测定亚硝酸盐的含量。
所述的稳定剂包括Tris、三乙胺、丙三醇或三乙醇胺中的一种或一种以上。
进一步的，R1试剂的组分包括：1-9mg/mL硫酸肼，0.5-15μg/mL CuSO4-酒石酸,0.5-15μg/mL ZnSO4-酒石酸，0.21-2.15mg/mL Na2HPO4·12H2O，丙三醇0.06-0.6％，pH 9.0-13.0；R2试剂的组分包括：8-24mg/mL磺胺嘧啶钠盐，0.2-1.5mg/mL盐酸萘乙二胺，盐酸5-30％。
R1试剂的配制方法为：10-30mg/mL硫酸肼5-15mL,0.5-1.5mg/mL CuSO4-酒石酸50-500μL，0.5-1.5mg/mL ZnSO4-酒石酸50-500μL，0.1mol/LNa2HPO4·12H2O 0.3-3mL,丙三醇30-300μL，调节pH为9.0-13.0，加水定容到50mL；R2试剂的配制方法为：磺胺嘧啶钠盐0.08-0.24g，盐酸萘乙二胺2-15mg，盐酸0.5-3mL，加水至总体积为10mL溶解。
进一步的，R1试剂的组分还可以包括5-25％的三乙胺。
R1试剂的配制方法优选为：10-30mg/mL硫酸肼5-15mL,0.5-1.5mg/mLCuSO4-酒石酸50-500μL，0.5-1.5mg/mL ZnSO4-酒石酸50-500μL，0.1mol/LNa2HPO4·12H2O 0.3-3mL，加水定容到50mL，冻干后保存，使用时用pH为11.0-13.0的含5-25％三乙胺、0.06-0.6％丙三醇的水溶液复溶至50mL；R2试剂的配制方法优选为：磺胺嘧啶钠盐0.08-0.24g，盐酸萘乙二胺2-15mg，盐酸0.5-1.5mL，加水至总体积为10mL，冻干后保存，使用时用含15％-25％盐酸的水溶液复溶至10mL。
所述的R1和R2试剂使用时的体积比为3：1-5：1，检测波长为530-570nm，反应时间10-30min，反应温度30-40℃。
一氧化氮检测试剂盒在细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液、水体中的应用。
一氧化氮检测试剂盒在人心血管病检测中的应用，尤其是高血压病检测中的应用。
进一步的，所述的一氧化氮检测试剂盒在水体硝酸盐检测中的应用。
区别于现有技术，上述技术方案的有益效果在于：
(1)用价格低廉的催化剂及还原剂取代了硝酸盐还原酶法中价格高昂的还原酶，操作简便，反应时间短，5-10分钟即可将硝酸盐转化为亚硝酸盐。
(2)本试剂盒不需对样本进行预处理，可在分光光度计、酶标仪、生化分析仪上使用，可以实现自动化检测，适用于大量样本的检测。
(3)解决了硫酸肼还原法中还原剂及催化剂在反应体系中无法久存，会迅速沉淀分解的问题，本试剂盒中的试剂为冻干粉，可在2-8℃条件下长期保存。
(4)不仅可用于生物体内NO含量的检测，还可用于环境、食品工业、生理样本中硝酸盐含量的检测。
附图说明
图1为实施例1所述的标准曲线；
图2为实施例1所述的两种试剂盒对临床样本检测的比对结果。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1
一氧化氮检测试剂盒的原理，是通过检测NO与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量，间接反映生物体内NO的总含量。先采用硫酸肼还原法将硝酸盐还原为亚硝酸盐，即在强碱性条件下，硝酸盐在含铜离子与锌离子的催化剂下与硫酸肼发生氧化还原反应；再将原有的和还原的亚硝酸盐与Griess试剂反应，生成紫红色溶液，其吸光值高低与亚硝酸盐含量成正比。测得的亚硝酸盐的含量即可反映样本中NO的总含量。
1.试剂盒的配制方法
一氧化氮检测试剂盒包括R1与R2双试剂，其配制方法如下：
(1)R1的配制
25mg/mL硫酸肼9mL,0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL，0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL，0.1mol/L Na2HPO4·12H2O 1.2mL，丙三醇70μL，用10mol/LKOH调节pH至11.5，用水定容到50mL，2-8℃保存。
(2)R2的配制
磺胺嘧啶钠盐0.12g，盐酸萘乙二胺4mg，盐酸2mL，水8mL，溶解后，2-8℃保存。
2.试剂盒的检测方法
R1和R2试剂使用时的体积比为4：1，检测波长为548nm，反应时间10min，反应温度37℃。在东芝40全自动生化分析仪上检测，参数设置如下：
REACTION MODE:END
CALIBRATION MODE:SPLINE
ABSORBANCE CHANGE:UP
TEST WAVE LENGTH:548
BLANK WAVE LENGTH:--
TEST READ TIMING:[60]-[62]
BLANK READ TIMING:[31]-[32]
SAMPLE:25μL
REAGENT1:120μL
REAGENT2:30μL
3.标准曲线的测定结果
校准品为NaNO3溶液，用去离子水将100.0μmol/L校准品稀释为50.0、25.0、12.5μmol/L，三个浓度。以去离子水定值为0.0μmol/L，分别测定四个浓度校准品吸光度值，以校准品的吸光度值为y轴，校准品的浓度值为x轴，在全自动分析仪上，采用线性模式建立标准曲线。计算时根据样本的吸光度值在标准曲线上找到相应的浓度值。校准品测定结果见表1，根据测定结果绘制标准曲线见图1，标准曲线为：y＝0.002x+0.0133。
表1校准品定标测定结果
4.试剂盒性能测定结果
(1)相对偏差
分别测定浓度为10.0、40.0、60.0μmol/L的硝酸钠质控品各5次，计算相对偏差，结果见表2。
表2试剂盒相对偏差测试结果
实验结果表明，本试剂盒相对偏差小于5％。
(2)精密度
分别测定浓度为10.0、40.0、60.0μmol/L的硝酸钠质控品各20次，计算变异系数，即为本试剂盒精密度，结果见表3。
表3精密度测试结果
| 质控品(μmol/L) | 测量均值(μmol/L) | 标准差SD | 变异系数CV(％) |
| 10.0 | 10.56 | 0.426 | 4.03 |
| 40.0 | 40.94 | 0.518 | 1.27 |
| 60.0 | 60.53 | 0.551 | 0.91 |
实验结果表明，三个浓度质控品检测值CV均小于5％，所以本试剂盒的精密度小于5％。
(3)分析灵敏度
用浓度为12.5μmol/L的血清样本测试试剂盒的分析灵敏度。实验结果表明，本试剂盒的分析灵敏度△A为0.04-0.06。
(4)线性范围
用去离子水将100.0μmol/L NaNO3校准品稀释为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5μmol/L几个浓度进行测定。以实际值为x，以均值为y，作图拟合曲线。结果见表4。
表4线性范围实验结果
实验结果表明，本试剂盒线性范围在0-100μmol/L内符合R2大于0.900，浓度为[0,2.5]μmol/L时绝对偏差在0.2μmol/L以内，浓度在(2.5,100]时，相对偏差小于6％。
5.血清样本的检测结果
将本试剂盒与碧云天公司的总一氧化氮试剂盒(硝酸盐还原酶法)对相同的样本进行检测，检测结果比对见表5。
表5血清样本的检测结果
硝酸盐还原酶法步骤繁琐，不能在生化分析仪上检测，而本试剂盒可以在生化分析仪上实现自动化检测。以本试剂盒检测样本值为x，碧云天试剂盒检测样本值为y，进行相关性分析，回归曲线如图2所示。由图2可知，两种试剂盒的回归曲线为y＝1.2374x-0.1519，相关系数R2＝0.9923，说明两种试剂盒具有很高的相关性。本试剂盒能将样本中大部分硝酸盐转化为亚硝酸盐，能很好的检测出样本中NO的总浓度。
实验结果表明，正常人组血清中NO值明显比高血压组的高，NO可以作为高血压等心血管病的临床辅助诊断指标，在临床上具有较高的应用价值。
在其他实施例中，血清样本也可以换成细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血浆、尿液等样本，检测方法与本实施例相同。检测仪器也可以换成酶标仪或者分光光度计，根据标准曲线及样本吸光度值计算出样本中的NO总浓度。用酶标仪或者分光光度计检测时，还可以适当延长反应时间为20或30分钟，以提高硝酸盐的还原率，使样本测定值更接近实际NO总浓度。
另外，在其他实施例中，利用本试剂盒的检测方法也可以检测水体中硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
实施例2
1.R1试剂配方优化实验
以下实验R2试剂配方为磺胺嘧啶0.2g，盐酸萘乙二胺8mg，HCl 2mL，水8mL。
(1)螯合剂用量选择
取25mg/mL硫酸肼9mL、螯合剂酒石酸分别取0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mg/mL各180μL，与0.75mg/mL ZnSO4180μL、0.75mg/mL CuSO4180μL、0.1mol/L NaH2PO4·12H2O0.9mL、丙三醇70μL、水45mL，混匀后，调节pH＝11.0，加水定容至50mL，4℃保存3天后，测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表6。
表6螯合剂浓度优化实验结果
实验结果表明，当采用传统方法不添加螯合剂时，在配制反应溶液过程中，作为催化剂的Cu2+与Zn2+均出现絮状沉淀，4℃避光保存3天后已完全沉降，失去催化剂作用，所以在传统方法中硫酸肼、Cu2+、Zn2+得分开配制、分开保存。而添加螯合剂后，其沉淀现象完全消失，并且当添加浓度为0.75mg/mL、添加剂量为与Cu2+与Zn2+离子相同时具有最佳催化活性。
(2)pH优化
取25mg/mL硫酸肼9mL、0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸180μL、0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL、0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL、丙三醇70μL、水45mL，混匀后，调节pH分别为10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5，加水定容至50mL。4℃保存3天后，测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表7。
表7 R1 pH值优化实验结果
实验结果表明，当pH＝11.5时，相对偏差最小，故应选用pH＝11.5最佳。
(3)硫酸肼用量优化
取硫酸肼15、20、25、30、35mg/mL各9mL、0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL、0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸180μL、0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL、丙三醇70μL、水45mL，混匀后，调节pH＝11.5，加水定容至50mL。测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表8。
表8硫酸肼用量优化实验结果
实验结果表明，硫酸肼浓度为25mg/mL时，相对偏差最小，故选用硫酸肼浓度为25mg/mL，用量为9mL。
(4)铜离子用量优化
铜离子在硫酸肼还原硝酸盐反应中作为催化剂使用。取25mg/mL硫酸肼9mL，0.75mg/mL CuSO4-酒石酸120、180、240、300、360μL，0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸180μL，0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL，丙三醇70μL，水45mL，混匀后，调节pH＝11.5，加水定容至50mL。测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表9。
表9 CuSO4-酒石酸用量优化实验结果
实验结果表明，用量为180μL时，相对偏差最小，故CuSO4-酒石酸浓度为0.75mg/mL用量为180μL最优。
(5)锌离子用量优化
锌离子在硫酸肼还原硝酸盐反应中作为催化剂使用。取25mg/mL硫酸肼9mL，0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸120、180、240、300、360μL，0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL，0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL，丙三醇70μL，水45mL，混匀后，调节pH＝11.5，加水定容至50mL。测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表10。
表10 ZnSO4-酒石酸用量优化实验结果
实验结果表明，用量为360μL时，相对偏差最小，故ZnSO4-酒石酸浓度为0.75mg/mL用量为360μL最优。
(6)缓冲液种类、用量优化
硫酸肼还原硝酸盐反应中，硫酸肼具有还原性，在碱性环境中会缓慢分解，但分解速度过快则在冻干粉复溶后无法久置，故而在R1中加入不同缓冲物质以调节反应速率。考察的缓冲物质为NaH2PO4、Na2HPO4、酒石酸。
取25mg/mL硫酸肼9mL，0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL，0.75mg/mLCuSO4-酒石酸180μL，0.1mol/L NaH2PO4、Na2HPO4、酒石酸分别取0.3、0.6、1.2、1.8、2.4mL，丙三醇70μL，水45mL，混匀后，调节pH＝11.5，加水定容至50mL。4℃保存3天后，测定31.3μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表11。
表11缓冲物质种类、用量优化实验结果
实验结果表明，缓冲物质为NaH2PO4时，整体偏差较小，故应选用0.1mol/LNaH2PO4作为R1体系的缓冲物质，用量0.3mL，可保证体系在碱性缓冲液中具有较高还原性。
(7)稳定剂种类、用量优化
硫酸肼还原硝酸盐反应中，硫酸肼在强碱性环境中缓慢分解，故而在R1中加入不同稳定剂以减缓硫酸肼在低温储存过程中的分解，稳定其在高温反应环境中的还原速率。除了丙三醇外，还考察了Tris、三乙醇胺、三乙胺这三种稳定剂。
取25mg/mL硫酸肼9mL，0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL，0.75mg/mLCuSO4-酒石酸180μL，0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL，0.1mol/L的Tris、三乙醇胺、三乙胺分别加入5、10、15、20、25mL，丙三醇70μL，混匀后，调节pH＝11.5，加水定容至50mL。4℃保存3天后，测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表12。
表12稳定剂种类、用量优化实验结果
实验结果表明，稳定剂为三乙胺时，整体偏差较小，故应选用0.1mol/L三乙胺作为R1体系的另一稳定剂，用量10mL，即占体系总体积20％可保证体系在碱性缓冲液中具有较好的稳定性。
2.R2试剂配方优化实验
以下实验R1的配制方法为：取25mg/mL硫酸肼9mL，0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL，0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL，0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.3mL，丙三醇70μL，混匀后，调节pH＝11.5，加水定容至50mL。
(1)R2组成成分优化
按如下配方分别配制R2试剂：
A.0.2g磺胺嘧啶，8mg盐酸萘乙二胺，2mL HCl，8mL水
B.0.2g对氨基苯环酸，8mg盐酸萘乙二胺，2mL HCl，8mL水
C.0.2g氨基磺酸，8mg盐酸萘乙二胺，2mL HCl，8mL水
D.0.2g磺胺，8mg盐酸萘乙二胺，2mL HCl，8mL水
E.0.2g对氨基苯环酸，8mg a-萘胺，2mL HCl，8mL水
测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表13。
表13 R2组成成分优化实验结果
实验结果表明，配方A相对偏差最小，故选用磺胺嘧啶和盐酸萘乙二胺的配方组合为宜。
(2)磺胺嘧啶用量优化
分别取0.12g、0.16g、0.20g、0.24g、0.28g磺胺嘧啶，与8mg盐酸萘乙二胺、1mLHCl、9mL水，混匀后冻干。用含20％盐酸的水溶液(2mL盐酸/10mL水)复溶，4℃保存3天后，测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表14。
表14磺胺嘧啶用量优化实验结果
实验结果表明，当磺胺嘧啶为0.12g时相对偏差最小，故选用磺胺嘧啶为0.12g/10mL最优。
(3)盐酸萘乙二胺用量优化
分别取4mg、6mg、8mg、10mg、12mg盐酸萘乙二胺，与0.12g磺胺嘧啶、1mL HCl、9mL水，混匀后冻干。用含20％盐酸的水溶液复溶，4℃保存3天后，测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表15。
表15盐酸萘乙二胺用量优化实验结果
实验结果表明，当盐酸萘乙二胺为4mg时相对偏差最小，故选用盐酸萘乙二胺质量为4mg/10mL最优。
实施例3
R1的配制方法为：10mg/mL硫酸肼22.5mL,1mg/mL CuSO4-酒石酸135μL，1mg/mLZnSO4-酒石酸270μL，0.1mol/L Na2HPO4·12H2O 1.2mL，加水定容到50mL，冻干后4℃保存，使用时用pH 13.0的含0.2％丙三醇、10％三乙胺的水溶液复溶至50mL。
R2的配制方法为：磺胺嘧啶钠盐0.2g，盐酸萘乙二胺5mg，盐酸0.5mL，加水至总体积为10mL，溶解后冻干保存，使用时用含25％盐酸的水溶液复溶至10mL。
(1)样本用量25μL，考察R1、R2不同配比，测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表16。
表16 R1、R2不同配比实验结果
实验结果表明，当R1：R2＝4.4:1时，相对偏差最小。
(2)样本用量25μL，R1用量110μL，考察R2最适用量，测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度，计算相对偏差。实验结果见表17。
表17 R2用量优化实验结果
实验结果表明，当R2用量为35μL时，相对偏差最小。
综上，最优试剂使用量为R1 110μL，R2 35μL，即R1：R2＝3.14:1，样本量25μL。
实施例4
(1)一氧化氮检测试剂盒的制备方法
R1的配制方法为：30mg/mL硫酸肼7.5mL,1.5mg/mL CuSO4-酒石酸90μL，1.5mg/mLZnSO4-酒石酸180μL，0.1mol/L Na2HPO4·12H2O 1mL,加水定容到50mL，冻干后保存。使用时用pH 12.0的含10％三乙胺、0.6％丙三醇的水溶液复溶至50mL。
R2的配制方法为：磺胺嘧啶钠盐0.1g，盐酸萘乙二胺15mg，盐酸1.5mL，加水至总体积为10mL，溶解后冻干保存，使用时用含3％浓盐酸的水溶液(1.5mLHCl/10mL水)复溶至10mL。
(2)检测仪器：全自动生化分析仪
(3)检测方法：R1 110μL，R2 35μL，样本量25μL。检测波长550nm，反应时间10min，反应温度37℃
(4)本试剂盒性能指标为：相对偏差小于5％，精密度小于5％，分析灵敏度△A550nm为0.04-0.06，线性范围为0-100μmol/L。
(5)本试剂盒中R1和R2均为冻干粉，2-8℃条件下可保存12个月，复溶后至少可保存3天。
综上所述，利用本一氧化氮检测方法制备的试剂盒具有较高的准确性，成本低，操作简单，可以实现自动化检测，可用于检测人体NO自由基的总浓度，在临床上用于高血压等心血管病的辅助诊断。本发明的试剂盒也可以在食品或环境等领域用于水溶液中硝酸盐的检测。因此，本发明具有广阔的应用前景。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (9)
1.一种一氧化氮检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括步骤：
检测生物样品中一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量；
通过一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量，间接计算生物样品中一氧化氮的总含量。
2.根据权利要求1所述的一氧化氮检测方法，其特征在于：所述的检测方法具体步骤如下：
将待测样品置于强碱性溶液中，在含铜离子与锌离子的催化剂催化下，样品中的硝酸盐先与硫酸肼反应生成亚硝酸盐；
然后，将上述反应后的样品与Griess试剂反应，待生成紫红色溶液后，测定其吸光值高低；
根据测得的吸光值计算出样品中硝酸盐与亚硝酸盐的总含量，也即一氧化氮的总含量。
3.如权利要求1所述的一氧化氮检测方法在细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液中的应用。
4.如权利要求1所述的一氧化氮检测方法在一氧化氮检测试剂盒中的应用。
5.一种一氧化氮检测试剂盒，其特征在于：所述的一氧化氮检测试剂盒包括R1和R2双试剂，其中，R1的成分包括：硫酸肼、CuSO4-酒石酸、ZnSO4-酒石酸、Na2HPO4·12H2O、稳定剂，R2的成分包括：磺胺嘧啶钠盐、盐酸萘乙二胺。
6.根据权利要求5所述的一氧化氮检测试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂包括三乙胺、丙三醇或三乙醇胺中的一种或二种以上。
7.根据权利要求5所述的一氧化氮检测试剂盒，其特征在于：所述的R1试剂的组分包括：1-9mg/mL硫酸肼，0.5-15μg/mL CuSO4-酒石酸,0.5-15μg/mL ZnSO4-酒石酸，0.21-2.15mg/mL Na2HPO4·12H2O，丙三醇0.06-0.6％，pH9.0-13.0；所述的R2试剂的组分包括：8-24mg/mL磺胺嘧啶钠盐，0.2-1.5mg/mL盐酸萘乙二胺，盐酸5-30％。
8.根据权利要求7所述的一氧化氮检测试剂盒，其特征在于：所述的R1试剂的组分还包括5-25％的三乙胺。
9.如权利要求5至8中任一所述的一氧化氮检测试剂盒在心血管病检测中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20190402 |