CN109557238A - 一种一氧化氮检测方法及其应用 - Google Patents
一种一氧化氮检测方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109557238A CN109557238A CN201811580528.5A CN201811580528A CN109557238A CN 109557238 A CN109557238 A CN 109557238A CN 201811580528 A CN201811580528 A CN 201811580528A CN 109557238 A CN109557238 A CN 109557238A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nitric oxide
- sample
- tartaric acid
- detection method
- oxide detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 117
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric Acid Chemical compound [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 claims description 39
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-2-(4,4-dimethyl-2-oxoimidazolidin-1-yl)-n-[3-(trifluoromethyl)phenyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C1NC(C)(C)CN1C(N=C1N)=NC=C1C(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 FUSNOPLQVRUIIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 239000012493 hydrazine sulfate Substances 0.000 claims description 34
- 229910000377 hydrazine sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 32
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 23
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 23
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 18
- 229960004306 sulfadiazine Drugs 0.000 claims description 17
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- -1 sulphadiazine sodium salt Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 10
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- ZGCHATBSUIJLRL-UHFFFAOYSA-N hydrazine sulfate Chemical compound NN.OS(O)(=O)=O ZGCHATBSUIJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 claims 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Inorganic materials [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 16
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 14
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- SEEPANYCNGTZFQ-UHFFFAOYSA-N sulfadiazine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)NC1=NC=CC=N1 SEEPANYCNGTZFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 4
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 description 4
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N nitrous oxide Inorganic materials [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- PAVKBQLPQCDVNI-UHFFFAOYSA-N n',n'-diethyl-n-(9-methoxy-5,11-dimethyl-6h-pyrido[4,3-b]carbazol-1-yl)propane-1,3-diamine Chemical class N1C2=CC=C(OC)C=C2C2=C1C(C)=C1C=CN=C(NCCCN(CC)CC)C1=C2C PAVKBQLPQCDVNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNOPIUAQISRISI-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxy-2-propan-2-ylsulfonylethanimidamide Chemical compound CC(C)S(=O)(=O)CC(N)=NO LNOPIUAQISRISI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002040 relaxant effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
- G01N31/10—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using catalysis
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
本发明提供了一种一氧化氮检测方法及其相关应用,属于生物化学领域,是通过检测一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量,间接反映生物体内一氧化氮的总含量。本发明准确度高,操作简便,反应时间短,易于保存,可实现自动化操作,适用于多种样本的检测,具有广阔的应用前景和较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域,具体涉及一种一氧化氮的检测方法、试剂盒及其相关应用。
背景技术
一氧化氮(NO)在生物体内是一种具有双重作用的信使分子,作为第二信使和神经递质而起着不同的作用。NO普遍存在于脊椎动物的各种细胞,如内皮细胞、巨噬细胞、神经细胞中,是细胞间和细胞内信息传递的重要调节因子,同时还是宿主免疫反应中一种细胞毒性因子。内源性NO作为血管内皮细胞产生并释放的可舒张血管的内源性舒张因子,在神经传导、免疫应答、血管扩张和血小板功能等许多病理生理过程中有重要作用。
NO半衰期短,可迅速与水、氧和细胞中广泛存在的超氧自由基反应生成硝酸盐和亚硝酸盐,同时检测出硝酸盐与亚硝酸盐的总量即可推算出总的NO含量。目前NO的光谱检测方法主要有两种:一是采用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐,然后通过Griess试剂检测亚硝酸盐,从而得出总NO的含量;二是以镉柱对样本进行数小时的预处理,将硝酸盐转化为亚硝酸盐,再用Griess试剂检测亚硝酸盐,从而得出总NO的含量。
在实现本发明的过程中,发明人发现现有技术中存在如下问题:一,操作繁琐,耗时较长,需要几个小时以上;二,检测试剂需现配现用,无法长期保存;三,无法实现自动化,不适于大量样本的检测。因此,建立一种准确、快速、方便的NO检测方法显得十分重要。
发明内容
为了解决上述技术问题,发明人提供了一种简便快速、适用于大样本自动化检测的总NO检测方法。具体技术方案如下:
一种一氧化氮检测方法的步骤包括:
检测生物样品中一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量;
通过一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量,间接计算生物样品中一氧化氮的总含量。
具体如下:
先采用硫酸肼还原法将样品中的硝酸盐转化为亚硝酸盐,即在强碱性条件下,样品中的硝酸盐在含铜离子与锌离子的催化剂下与硫酸肼发生氧化还原反应,被还原为亚硝酸盐;
然后,亚硝酸盐与Griess试剂反应,生成紫红色溶液,测得其吸光值高低,吸光值高低与亚硝酸盐含量成正比;
测得的亚硝酸盐含量即为样品中硝酸盐与亚硝酸盐的总含量,也即一氧化氮的总含量。
所述的一氧化氮检测方法在细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液中的应用。
所述的一氧化氮检测方法在一氧化氮检测试剂盒中的应用。
一种一氧化氮检测试剂盒,包括R1和R2双试剂。其中,R1主要成分为硫酸肼、CuSO4-酒石酸、ZnSO4-酒石酸、Na2HPO4·12H2O、稳定剂,R1的作用是使硝酸盐转化为亚硝酸盐;R2主要成分为磺胺嘧啶钠盐、盐酸萘乙二胺,R2用于测定亚硝酸盐的含量。
所述的稳定剂包括Tris、三乙胺、丙三醇或三乙醇胺中的一种或一种以上。
进一步的,R1试剂的组分包括:1-9mg/mL硫酸肼,0.5-15μg/mL CuSO4-酒石酸,0.5-15μg/mL ZnSO4-酒石酸,0.21-2.15mg/mL Na2HPO4·12H2O,丙三醇0.06-0.6%,pH 9.0-13.0;R2试剂的组分包括:8-24mg/mL磺胺嘧啶钠盐,0.2-1.5mg/mL盐酸萘乙二胺,盐酸5-30%。
R1试剂的配制方法为:10-30mg/mL硫酸肼5-15mL,0.5-1.5mg/mL CuSO4-酒石酸50-500μL,0.5-1.5mg/mL ZnSO4-酒石酸50-500μL,0.1mol/LNa2HPO4·12H2O 0.3-3mL,丙三醇30-300μL,调节pH为9.0-13.0,加水定容到50mL;R2试剂的配制方法为:磺胺嘧啶钠盐0.08-0.24g,盐酸萘乙二胺2-15mg,盐酸0.5-3mL,加水至总体积为10mL溶解。
进一步的,R1试剂的组分还可以包括5-25%的三乙胺。
R1试剂的配制方法优选为:10-30mg/mL硫酸肼5-15mL,0.5-1.5mg/mLCuSO4-酒石酸50-500μL,0.5-1.5mg/mL ZnSO4-酒石酸50-500μL,0.1mol/LNa2HPO4·12H2O 0.3-3mL,加水定容到50mL,冻干后保存,使用时用pH为11.0-13.0的含5-25%三乙胺、0.06-0.6%丙三醇的水溶液复溶至50mL;R2试剂的配制方法优选为:磺胺嘧啶钠盐0.08-0.24g,盐酸萘乙二胺2-15mg,盐酸0.5-1.5mL,加水至总体积为10mL,冻干后保存,使用时用含15%-25%盐酸的水溶液复溶至10mL。
所述的R1和R2试剂使用时的体积比为3:1-5:1,检测波长为530-570nm,反应时间10-30min,反应温度30-40℃。
一氧化氮检测试剂盒在细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液、水体中的应用。
一氧化氮检测试剂盒在人心血管病检测中的应用,尤其是高血压病检测中的应用。
进一步的,所述的一氧化氮检测试剂盒在水体硝酸盐检测中的应用。
区别于现有技术,上述技术方案的有益效果在于:
(1)用价格低廉的催化剂及还原剂取代了硝酸盐还原酶法中价格高昂的还原酶,操作简便,反应时间短,5-10分钟即可将硝酸盐转化为亚硝酸盐。
(2)本试剂盒不需对样本进行预处理,可在分光光度计、酶标仪、生化分析仪上使用,可以实现自动化检测,适用于大量样本的检测。
(3)解决了硫酸肼还原法中还原剂及催化剂在反应体系中无法久存,会迅速沉淀分解的问题,本试剂盒中的试剂为冻干粉,可在2-8℃条件下长期保存。
(4)不仅可用于生物体内NO含量的检测,还可用于环境、食品工业、生理样本中硝酸盐含量的检测。
附图说明
图1为实施例1所述的标准曲线;
图2为实施例1所述的两种试剂盒对临床样本检测的比对结果。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果,以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1
一氧化氮检测试剂盒的原理,是通过检测NO与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量,间接反映生物体内NO的总含量。先采用硫酸肼还原法将硝酸盐还原为亚硝酸盐,即在强碱性条件下,硝酸盐在含铜离子与锌离子的催化剂下与硫酸肼发生氧化还原反应;再将原有的和还原的亚硝酸盐与Griess试剂反应,生成紫红色溶液,其吸光值高低与亚硝酸盐含量成正比。测得的亚硝酸盐的含量即可反映样本中NO的总含量。
1.试剂盒的配制方法
一氧化氮检测试剂盒包括R1与R2双试剂,其配制方法如下:
(1)R1的配制
25mg/mL硫酸肼9mL,0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL,0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL,0.1mol/L Na2HPO4·12H2O 1.2mL,丙三醇70μL,用10mol/LKOH调节pH至11.5,用水定容到50mL,2-8℃保存。
(2)R2的配制
磺胺嘧啶钠盐0.12g,盐酸萘乙二胺4mg,盐酸2mL,水8mL,溶解后,2-8℃保存。
2.试剂盒的检测方法
R1和R2试剂使用时的体积比为4:1,检测波长为548nm,反应时间10min,反应温度37℃。在东芝40全自动生化分析仪上检测,参数设置如下:
REACTION MODE:END
CALIBRATION MODE:SPLINE
ABSORBANCE CHANGE:UP
TEST WAVE LENGTH:548
BLANK WAVE LENGTH:--
TEST READ TIMING:[60]-[62]
BLANK READ TIMING:[31]-[32]
SAMPLE:25μL
REAGENT1:120μL
REAGENT2:30μL
3.标准曲线的测定结果
校准品为NaNO3溶液,用去离子水将100.0μmol/L校准品稀释为50.0、25.0、12.5μmol/L,三个浓度。以去离子水定值为0.0μmol/L,分别测定四个浓度校准品吸光度值,以校准品的吸光度值为y轴,校准品的浓度值为x轴,在全自动分析仪上,采用线性模式建立标准曲线。计算时根据样本的吸光度值在标准曲线上找到相应的浓度值。校准品测定结果见表1,根据测定结果绘制标准曲线见图1,标准曲线为:y=0.002x+0.0133。
表1校准品定标测定结果
4.试剂盒性能测定结果
(1)相对偏差
分别测定浓度为10.0、40.0、60.0μmol/L的硝酸钠质控品各5次,计算相对偏差,结果见表2。
表2试剂盒相对偏差测试结果
实验结果表明,本试剂盒相对偏差小于5%。
(2)精密度
分别测定浓度为10.0、40.0、60.0μmol/L的硝酸钠质控品各20次,计算变异系数,即为本试剂盒精密度,结果见表3。
表3精密度测试结果
质控品(μmol/L) | 测量均值(μmol/L) | 标准差SD | 变异系数CV(%) |
10.0 | 10.56 | 0.426 | 4.03 |
40.0 | 40.94 | 0.518 | 1.27 |
60.0 | 60.53 | 0.551 | 0.91 |
实验结果表明,三个浓度质控品检测值CV均小于5%,所以本试剂盒的精密度小于5%。
(3)分析灵敏度
用浓度为12.5μmol/L的血清样本测试试剂盒的分析灵敏度。实验结果表明,本试剂盒的分析灵敏度△A为0.04-0.06。
(4)线性范围
用去离子水将100.0μmol/L NaNO3校准品稀释为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5μmol/L几个浓度进行测定。以实际值为x,以均值为y,作图拟合曲线。结果见表4。
表4线性范围实验结果
实验结果表明,本试剂盒线性范围在0-100μmol/L内符合R2大于0.900,浓度为[0,2.5]μmol/L时绝对偏差在0.2μmol/L以内,浓度在(2.5,100]时,相对偏差小于6%。
5.血清样本的检测结果
将本试剂盒与碧云天公司的总一氧化氮试剂盒(硝酸盐还原酶法)对相同的样本进行检测,检测结果比对见表5。
表5血清样本的检测结果
硝酸盐还原酶法步骤繁琐,不能在生化分析仪上检测,而本试剂盒可以在生化分析仪上实现自动化检测。以本试剂盒检测样本值为x,碧云天试剂盒检测样本值为y,进行相关性分析,回归曲线如图2所示。由图2可知,两种试剂盒的回归曲线为y=1.2374x-0.1519,相关系数R2=0.9923,说明两种试剂盒具有很高的相关性。本试剂盒能将样本中大部分硝酸盐转化为亚硝酸盐,能很好的检测出样本中NO的总浓度。
实验结果表明,正常人组血清中NO值明显比高血压组的高,NO可以作为高血压等心血管病的临床辅助诊断指标,在临床上具有较高的应用价值。
在其他实施例中,血清样本也可以换成细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血浆、尿液等样本,检测方法与本实施例相同。检测仪器也可以换成酶标仪或者分光光度计,根据标准曲线及样本吸光度值计算出样本中的NO总浓度。用酶标仪或者分光光度计检测时,还可以适当延长反应时间为20或30分钟,以提高硝酸盐的还原率,使样本测定值更接近实际NO总浓度。
另外,在其他实施例中,利用本试剂盒的检测方法也可以检测水体中硝酸盐和亚硝酸盐的含量。
实施例2
1.R1试剂配方优化实验
以下实验R2试剂配方为磺胺嘧啶0.2g,盐酸萘乙二胺8mg,HCl 2mL,水8mL。
(1)螯合剂用量选择
取25mg/mL硫酸肼9mL、螯合剂酒石酸分别取0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25mg/mL各180μL,与0.75mg/mL ZnSO4180μL、0.75mg/mL CuSO4180μL、0.1mol/L NaH2PO4·12H2O0.9mL、丙三醇70μL、水45mL,混匀后,调节pH=11.0,加水定容至50mL,4℃保存3天后,测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表6。
表6螯合剂浓度优化实验结果
实验结果表明,当采用传统方法不添加螯合剂时,在配制反应溶液过程中,作为催化剂的Cu2+与Zn2+均出现絮状沉淀,4℃避光保存3天后已完全沉降,失去催化剂作用,所以在传统方法中硫酸肼、Cu2+、Zn2+得分开配制、分开保存。而添加螯合剂后,其沉淀现象完全消失,并且当添加浓度为0.75mg/mL、添加剂量为与Cu2+与Zn2+离子相同时具有最佳催化活性。
(2)pH优化
取25mg/mL硫酸肼9mL、0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸180μL、0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL、0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL、丙三醇70μL、水45mL,混匀后,调节pH分别为10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5,加水定容至50mL。4℃保存3天后,测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表7。
表7 R1 pH值优化实验结果
实验结果表明,当pH=11.5时,相对偏差最小,故应选用pH=11.5最佳。
(3)硫酸肼用量优化
取硫酸肼15、20、25、30、35mg/mL各9mL、0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL、0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸180μL、0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL、丙三醇70μL、水45mL,混匀后,调节pH=11.5,加水定容至50mL。测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表8。
表8硫酸肼用量优化实验结果
实验结果表明,硫酸肼浓度为25mg/mL时,相对偏差最小,故选用硫酸肼浓度为25mg/mL,用量为9mL。
(4)铜离子用量优化
铜离子在硫酸肼还原硝酸盐反应中作为催化剂使用。取25mg/mL硫酸肼9mL,0.75mg/mL CuSO4-酒石酸120、180、240、300、360μL,0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸180μL,0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL,丙三醇70μL,水45mL,混匀后,调节pH=11.5,加水定容至50mL。测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表9。
表9 CuSO4-酒石酸用量优化实验结果
实验结果表明,用量为180μL时,相对偏差最小,故CuSO4-酒石酸浓度为0.75mg/mL用量为180μL最优。
(5)锌离子用量优化
锌离子在硫酸肼还原硝酸盐反应中作为催化剂使用。取25mg/mL硫酸肼9mL,0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸120、180、240、300、360μL,0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL,0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL,丙三醇70μL,水45mL,混匀后,调节pH=11.5,加水定容至50mL。测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表10。
表10 ZnSO4-酒石酸用量优化实验结果
实验结果表明,用量为360μL时,相对偏差最小,故ZnSO4-酒石酸浓度为0.75mg/mL用量为360μL最优。
(6)缓冲液种类、用量优化
硫酸肼还原硝酸盐反应中,硫酸肼具有还原性,在碱性环境中会缓慢分解,但分解速度过快则在冻干粉复溶后无法久置,故而在R1中加入不同缓冲物质以调节反应速率。考察的缓冲物质为NaH2PO4、Na2HPO4、酒石酸。
取25mg/mL硫酸肼9mL,0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL,0.75mg/mLCuSO4-酒石酸180μL,0.1mol/L NaH2PO4、Na2HPO4、酒石酸分别取0.3、0.6、1.2、1.8、2.4mL,丙三醇70μL,水45mL,混匀后,调节pH=11.5,加水定容至50mL。4℃保存3天后,测定31.3μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表11。
表11缓冲物质种类、用量优化实验结果
实验结果表明,缓冲物质为NaH2PO4时,整体偏差较小,故应选用0.1mol/LNaH2PO4作为R1体系的缓冲物质,用量0.3mL,可保证体系在碱性缓冲液中具有较高还原性。
(7)稳定剂种类、用量优化
硫酸肼还原硝酸盐反应中,硫酸肼在强碱性环境中缓慢分解,故而在R1中加入不同稳定剂以减缓硫酸肼在低温储存过程中的分解,稳定其在高温反应环境中的还原速率。除了丙三醇外,还考察了Tris、三乙醇胺、三乙胺这三种稳定剂。
取25mg/mL硫酸肼9mL,0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL,0.75mg/mLCuSO4-酒石酸180μL,0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.9mL,0.1mol/L的Tris、三乙醇胺、三乙胺分别加入5、10、15、20、25mL,丙三醇70μL,混匀后,调节pH=11.5,加水定容至50mL。4℃保存3天后,测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表12。
表12稳定剂种类、用量优化实验结果
实验结果表明,稳定剂为三乙胺时,整体偏差较小,故应选用0.1mol/L三乙胺作为R1体系的另一稳定剂,用量10mL,即占体系总体积20%可保证体系在碱性缓冲液中具有较好的稳定性。
2.R2试剂配方优化实验
以下实验R1的配制方法为:取25mg/mL硫酸肼9mL,0.75mg/mL ZnSO4-酒石酸360μL,0.75mg/mL CuSO4-酒石酸180μL,0.1mol/L NaH2PO4·12H2O 0.3mL,丙三醇70μL,混匀后,调节pH=11.5,加水定容至50mL。
(1)R2组成成分优化
按如下配方分别配制R2试剂:
A.0.2g磺胺嘧啶,8mg盐酸萘乙二胺,2mL HCl,8mL水
B.0.2g对氨基苯环酸,8mg盐酸萘乙二胺,2mL HCl,8mL水
C.0.2g氨基磺酸,8mg盐酸萘乙二胺,2mL HCl,8mL水
D.0.2g磺胺,8mg盐酸萘乙二胺,2mL HCl,8mL水
E.0.2g对氨基苯环酸,8mg a-萘胺,2mL HCl,8mL水
测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表13。
表13 R2组成成分优化实验结果
实验结果表明,配方A相对偏差最小,故选用磺胺嘧啶和盐酸萘乙二胺的配方组合为宜。
(2)磺胺嘧啶用量优化
分别取0.12g、0.16g、0.20g、0.24g、0.28g磺胺嘧啶,与8mg盐酸萘乙二胺、1mLHCl、9mL水,混匀后冻干。用含20%盐酸的水溶液(2mL盐酸/10mL水)复溶,4℃保存3天后,测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表14。
表14磺胺嘧啶用量优化实验结果
实验结果表明,当磺胺嘧啶为0.12g时相对偏差最小,故选用磺胺嘧啶为0.12g/10mL最优。
(3)盐酸萘乙二胺用量优化
分别取4mg、6mg、8mg、10mg、12mg盐酸萘乙二胺,与0.12g磺胺嘧啶、1mL HCl、9mL水,混匀后冻干。用含20%盐酸的水溶液复溶,4℃保存3天后,测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表15。
表15盐酸萘乙二胺用量优化实验结果
实验结果表明,当盐酸萘乙二胺为4mg时相对偏差最小,故选用盐酸萘乙二胺质量为4mg/10mL最优。
实施例3
R1的配制方法为:10mg/mL硫酸肼22.5mL,1mg/mL CuSO4-酒石酸135μL,1mg/mLZnSO4-酒石酸270μL,0.1mol/L Na2HPO4·12H2O 1.2mL,加水定容到50mL,冻干后4℃保存,使用时用pH 13.0的含0.2%丙三醇、10%三乙胺的水溶液复溶至50mL。
R2的配制方法为:磺胺嘧啶钠盐0.2g,盐酸萘乙二胺5mg,盐酸0.5mL,加水至总体积为10mL,溶解后冻干保存,使用时用含25%盐酸的水溶液复溶至10mL。
(1)样本用量25μL,考察R1、R2不同配比,测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表16。
表16 R1、R2不同配比实验结果
实验结果表明,当R1:R2=4.4:1时,相对偏差最小。
(2)样本用量25μL,R1用量110μL,考察R2最适用量,测定40.0μmol/L硝酸钠质控品的浓度,计算相对偏差。实验结果见表17。
表17 R2用量优化实验结果
实验结果表明,当R2用量为35μL时,相对偏差最小。
综上,最优试剂使用量为R1 110μL,R2 35μL,即R1:R2=3.14:1,样本量25μL。
实施例4
(1)一氧化氮检测试剂盒的制备方法
R1的配制方法为:30mg/mL硫酸肼7.5mL,1.5mg/mL CuSO4-酒石酸90μL,1.5mg/mLZnSO4-酒石酸180μL,0.1mol/L Na2HPO4·12H2O 1mL,加水定容到50mL,冻干后保存。使用时用pH 12.0的含10%三乙胺、0.6%丙三醇的水溶液复溶至50mL。
R2的配制方法为:磺胺嘧啶钠盐0.1g,盐酸萘乙二胺15mg,盐酸1.5mL,加水至总体积为10mL,溶解后冻干保存,使用时用含3%浓盐酸的水溶液(1.5mLHCl/10mL水)复溶至10mL。
(2)检测仪器:全自动生化分析仪
(3)检测方法:R1 110μL,R2 35μL,样本量25μL。检测波长550nm,反应时间10min,反应温度37℃
(4)本试剂盒性能指标为:相对偏差小于5%,精密度小于5%,分析灵敏度△A550nm为0.04-0.06,线性范围为0-100μmol/L。
(5)本试剂盒中R1和R2均为冻干粉,2-8℃条件下可保存12个月,复溶后至少可保存3天。
综上所述,利用本一氧化氮检测方法制备的试剂盒具有较高的准确性,成本低,操作简单,可以实现自动化检测,可用于检测人体NO自由基的总浓度,在临床上用于高血压等心血管病的辅助诊断。本发明的试剂盒也可以在食品或环境等领域用于水溶液中硝酸盐的检测。因此,本发明具有广阔的应用前景。
需要说明的是,尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述,但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此,基于本发明的创新理念,对本文所述实施例进行的变更和修改,或利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换,直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域,均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (9)
1.一种一氧化氮检测方法,其特征在于:所述的检测方法包括步骤:
检测生物样品中一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量;
通过一氧化氮与超氧自由基反应生成的硝酸盐和亚硝酸盐的含量,间接计算生物样品中一氧化氮的总含量。
2.根据权利要求1所述的一氧化氮检测方法,其特征在于:所述的检测方法具体步骤如下:
将待测样品置于强碱性溶液中,在含铜离子与锌离子的催化剂催化下,样品中的硝酸盐先与硫酸肼反应生成亚硝酸盐;
然后,将上述反应后的样品与Griess试剂反应,待生成紫红色溶液后,测定其吸光值高低;
根据测得的吸光值计算出样品中硝酸盐与亚硝酸盐的总含量,也即一氧化氮的总含量。
3.如权利要求1所述的一氧化氮检测方法在细胞裂解液、组织裂解液、组织或细胞培养液、血清、血浆、尿液中的应用。
4.如权利要求1所述的一氧化氮检测方法在一氧化氮检测试剂盒中的应用。
5.一种一氧化氮检测试剂盒,其特征在于:所述的一氧化氮检测试剂盒包括R1和R2双试剂,其中,R1的成分包括:硫酸肼、CuSO4-酒石酸、ZnSO4-酒石酸、Na2HPO4·12H2O、稳定剂,R2的成分包括:磺胺嘧啶钠盐、盐酸萘乙二胺。
6.根据权利要求5所述的一氧化氮检测试剂盒,其特征在于:所述的稳定剂包括三乙胺、丙三醇或三乙醇胺中的一种或二种以上。
7.根据权利要求5所述的一氧化氮检测试剂盒,其特征在于:所述的R1试剂的组分包括:1-9mg/mL硫酸肼,0.5-15μg/mL CuSO4-酒石酸,0.5-15μg/mL ZnSO4-酒石酸,0.21-2.15mg/mL Na2HPO4·12H2O,丙三醇0.06-0.6%,pH9.0-13.0;所述的R2试剂的组分包括:8-24mg/mL磺胺嘧啶钠盐,0.2-1.5mg/mL盐酸萘乙二胺,盐酸5-30%。
8.根据权利要求7所述的一氧化氮检测试剂盒,其特征在于:所述的R1试剂的组分还包括5-25%的三乙胺。
9.如权利要求5至8中任一所述的一氧化氮检测试剂盒在心血管病检测中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811580528.5A CN109557238A (zh) | 2018-12-24 | 2018-12-24 | 一种一氧化氮检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811580528.5A CN109557238A (zh) | 2018-12-24 | 2018-12-24 | 一种一氧化氮检测方法及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109557238A true CN109557238A (zh) | 2019-04-02 |
Family
ID=65870997
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811580528.5A Pending CN109557238A (zh) | 2018-12-24 | 2018-12-24 | 一种一氧化氮检测方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109557238A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111289501A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-16 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种基于间接比色法检测no的试剂盒及其制备使用方法 |
CN116622802A (zh) * | 2022-09-26 | 2023-08-22 | 北京安百胜诊断科技有限公司 | 一种一氧化氮检测试剂和检测方法及其应用 |
-
2018
- 2018-12-24 CN CN201811580528.5A patent/CN109557238A/zh active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111289501A (zh) * | 2020-02-21 | 2020-06-16 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种基于间接比色法检测no的试剂盒及其制备使用方法 |
CN116622802A (zh) * | 2022-09-26 | 2023-08-22 | 北京安百胜诊断科技有限公司 | 一种一氧化氮检测试剂和检测方法及其应用 |
CN116622802B (zh) * | 2022-09-26 | 2024-08-09 | 北京安百胜诊断科技有限公司 | 一种一氧化氮检测试剂和检测方法及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1959415B (zh) | 化学氧化法测定总胆红素的试剂盒 | |
CN102735664B (zh) | 钾离子浓度检测方法 | |
CN105241854A (zh) | 一种利用荧光碳量子点检测三价铁离子的方法 | |
CN101603925A (zh) | 多通道选向流动注射六价铬水质快速分析系统 | |
CN110066655B (zh) | 银掺杂碳量子点及其制备方法和应用 | |
CN109557238A (zh) | 一种一氧化氮检测方法及其应用 | |
Györy et al. | Simultaneous titrimetric determination of bicarbonate and titratable acid of urine | |
CN105021601A (zh) | 食品中二氧化硫含量的测定方法 | |
CN106950306B (zh) | 一种测定复方氨基酸注射液中半胱氨酸含量的方法 | |
CN101144824A (zh) | 总胆红素测定试剂盒 | |
CN114544734A (zh) | 一种贝克曼au系列分析仪电解质模块配套用试剂 | |
US4393142A (en) | Assay method and reagent for the determination of chloride | |
CN104049090B (zh) | 一种检测丙氨酰氨基肽酶的试剂盒 | |
CN113655006A (zh) | 泌尿系结石成石危险因素检测试系统 | |
CN110514625A (zh) | 一种人体血清叶酸的测定方法 | |
CN1995975A (zh) | N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性的测定方法及诊断试剂盒 | |
CN112595710B (zh) | 一种用于血清样本中碘离子的快速检测试剂盒及检测方法 | |
Mokrasch | Spectrophotometric determination of phosphate in the presence of highly labile phosphorus compounds | |
CN110672518A (zh) | 一种稳定的二甲苯胺蓝法血清镁检测试剂盒及其制备方法 | |
CN109971463B (zh) | 一种检测细胞内溶酶体no的比率型荧光探针及其应用 | |
Wills et al. | Micro-method for the estimation of calcium by AutoAnalyser | |
CN100494994C (zh) | 一种检测土壤亚硝酸还原酶活性的分析方法 | |
CN112557316A (zh) | 一种水中镍离子含量的测定方法 | |
Ahmed et al. | Spectrophotometric determination of sulphadiazine Using 2, 4–dinitrophenylhydrazine as Coupling Reagent | |
CN107014789B (zh) | 一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190402 |