CN1034999A - 溶液中胆红素的测定方法 - Google Patents
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Abstract
生物流体中胆红素的新分析方法。在胆红素氧
化酶(BOX)存在下，将胆红素催化氧化为胆绿素，后
者反过来又在适当的还原剂存在下反转化为初始的
胆红素。所述还原剂的相应氧化产生一种信号，监测
此信号即得到所需的分析数据。如果利用选定的有
机氟化合物，则所述信号由F-离子的释放提供，F-离
子的释放可用电位测量方法来测量。
Description
本发明涉及水溶液主要是生物流体中的胆红素的测定方法。
现有大量文献述及为临床和医疗目的测定（检测、浓度测定等）胆红素的方法。例如专利文献DE-C-2，240，471;DE-A-2，007，013;DE-A-2，364，844;DE-A-2，013，558报导了可以利用诸如卤化重氮苯等重氮盐。但这类试剂在通常的温度和湿度条件下稳定性差，因此贮存过程中可能会失效。
另一些胆红素测定技术涉及到胆红素经酶催化的空气氧化而转变成胆绿素。这种技术在下列文献中有报道：R.BRODERSEN et al.，European Journal of Biochemistry 10：468，1969;日本专利公开11.194（1983）;日本专利申请141.783（1983），1799（1984）;B.T.DOUMAS et al.，Clin.Chem.33：1349-1353，（1987）;C.J.P.MULLON et al.，出处同上，1822-1825。
胆红素是一种非极性的黄色色素，它作为血红素细胞外分解代谢的产物而存在于血浆中，经这一分解代谢后，血红蛋白的血红素基被酶促氧化成胆红素。胆红素由于与血浆中的清蛋白紧密结合及与肝脏中的二葡糖苷酸结合而获得了水溶性。血浆中胆红素水平异常是肝脏疾病的指征。其正常水平约为6-18微摩尔/升（3.5-10毫克/升），并几乎完全为未结合形式。该色素在无水条件下在暗中是较为稳定的，但在溶液中，尤其是在光照下，它逐渐氧化成胆绿素，因此其浓度不能通过测量它在黄色谱带中（例如460nm）光密度的绝对值来直接测量。此外，在处理血清样品时，直接测定就更为复杂化，因为样品中存在有其它化合物，而这些化合物在与胆红素相同的或相邻的光谱范围内吸光强度不定。因此用光学方法测定溶液中的胆红素必须依赖于光吸收的变化速率，即胆红素的黄色随时间的变化率，在已知的给定条件下，它取决于血清（或其它水溶液）样品中胆红素的初始浓度。
另外，已知胆红素（BR）被空气氧化成胆绿素（BV）的反应受得自某些真菌和植物的胆红素氧化酶（BOX）催化。胆红素氧化酶（酶学委员会编号EC1.3.3.5）是一种含铜的酶，最近曾被用来做血浆中胆红素的定量测定（GB-A-2，146，997）。该酶可从许多不同类型的植物中提取，并且该酶本身随提取方法的不同而显然有若干类型。胆红素催化氧化成胆绿素的过程中形成何种产物（H2O2还是H2O）取决于所用的BOX的类型。在此所报导的实验中，并未使用所有形式的BOX。优选的一种BOX得自漆斑菌属真菌。先有技术通过在该酶存在下BR溶液在460nm处的光吸收迅速下降证实了BOX的作用。这便构成了胆红素分析测试的基础（具体参见GB-A-2，146，997及其中引用的有关参考文献）。但这一测试法在灵敏度和应用上有局限性，如果所要分析的溶液在460nm附近有固有光吸收，或者这些溶液不透明，就更受到限制。因此，人们在不断寻找适应面更广、更灵敏的方法。
此外，如上所述，460nm测试有赖于测定吸光度的下降速率，而且该技术需要特别慎重地保护样品在进行测定和记录测定结果之前不被降解（即过早氧化）。这就较为复杂化了。如果能找到一些试验条件，使血红素样品至少在一个适当的预备期内保持对氧化和颜色变化不敏感，在此期间处理样品可以不必特别谨慎地避免褪色，那么将是非常可取的。
本发明人经研究有了下面公开的发现，这一发现构成了一种全新方法的基础，该方法克服了上述缺陷，还具有后面将提到的许多优点。
这种新分析方法是一种测定水溶液特别是生物流体中的胆红素的方法，该方法包括以下步骤：
a.在胆红素氧化酶和过量的一种还原性化合物存在下，将胆红素氧化成胆绿素，所述还原性化合物能够将胆绿素还原回初始的胆红素;
b.测定该还原性化合物的消耗速率，从而确定水溶液中存在的胆红素的量。
更具体地说，业已令人惊奇地发现，在BR经BOX催化氧化成BV的反应中，如果还存在有一种或数种经选用的还原剂（R），则可诱导产生一个快速的逆反应，使胆绿素反转化为胆红素。因此本方法依赖于一个闭合正逆反应的存在，而不仅仅依赖一个强烈向左移动的简单平衡。这可以表示如下：
该反应式中“产物”指氧的还原产物，RO指R的氧化产物。
这一反应式不仅得到了460nm处的吸光度基本不变这一现象的支持，而且得到了下列现象的支持，即
（a）该反应中确实消耗了氧;
（b）最终消耗了R，即当R耗尽时，胆红素转化成了胆绿素。
这样，如果给定起始大量过量的还原剂（R），则后者消耗的速率与胆红素的量成比例（因而也与胆绿素的量成比例）。因此，测定R的消耗速率便构成了一种普遍适用于测定水溶液及生物流体中胆红素的试验方法。
实现这一目的的方式之一是，选择其氧化态（RO）能给出可测信号的R。
例如，选用某些体系或化合物就有可能实现上述目的，这些体系或化合物的标准氧化还原电势大致在Fe2+/Fe3+电对和H+/H2电对的标准氧化还原电势之间，即在pH 7时大致在0.42和-0.60V之间（见H.R.Mahler and E.H.Cordes，Equilibria and Thermodynamics in Biochemical Transformations Biological Chemistry，Harper Internat.Ed.1969，New-York，London）。在这些可在氧化后给出颜色信号的体系中，可以举出的有：细胞色素a和c、泛醌、黄酶FMN、核黄素、NAD+/NADH、铁氧还蛋白。优选的化合物为4-氨基安替比林（4-AAP），该化合物氧化后可与苯酚偶联生成有色复合物。这种测定法实际上是常规性的，例如如果是利用生成过氧化氢的氧化酶（例如葡萄糖氧化酶）的体系，则后者是以苯酚的过氧化物酶催化氧化来测定的。重要的是要注意，许多类型的胆红素氧化酶都适用于本体系，包括在催化胆红素空气氧化成胆绿素过程中不生成H2O2的氧化酶。
根据另一方案，业已令人惊奇地发现，如果在4-AAP存在下使用卤代苯酚或卤代苯胺，则卤化物的释放量与该试验中胆红素的量成比例。适宜的卤代化合物（RHal）包括4-氟苯酚、4-氟苯胺、四氟苯酚和五氟苯酚（定义为RF化合物）。
因此，关键反应的反应式如下：
F-的释放由BOX催化，并且速度很快，所以F-的释放速率是由4-AAP的氧化速率控制的，而4-AAP的氧化速率本身又取决于胆红素的初始浓度。
F-可以用常规手段来测定，一种合适的方法是利用F-离子选择性电报。
在由酶催化的生化反应中应用F-选择性电报先前已有报导，参见例如美国专利申请4，353，983;4，607，010。
适用于本发明的胆红素氧化酶（BOX）有若干种类型，其中包括从各种种属的真菌，如裂褶菌属真菌、粗皮属真菌（Trachyderma）、漆斑菌属真菌中提取的BOX（参见例如KOSAKA et al.，Clin.Biochem.16，October 1983）。本发明优选来自疣状漆斑菌（Myrothercium Verucaria）的BOX。BR的氧化反应形成副产物过氧化氢还是水取决于BOX的来源，但本方法不论是否形成H2O2都是适用的。此外，与先前的工作（见美国专利申请4，353，983）不同的是，加入过氧化物酶对本方法没有可察觉的影响，而先前的工作却是用过氧化物酶催化有机氟化合物释放F-离子。
从实用的角度讲，实施本方法就是测定合适缓冲液中的血清样品中F-的释放。
简言之，为测定未知样品反应后F-离子的释放速率，最好求助于一条标准曲线。测定一组含已知浓度胆红素的样品即可作出标准曲线。在体系稳定后，速度曲线为直线时，记录每个样品的F-离子释放速率并测量动力学曲线的斜率（当然，每个样品都同时测量）。注意，只要氟化合物和4-AAP的浓度过量，速度曲线就是直线（零级反应）。然后以各曲线的斜率对胆红素浓度做图，就得到一条标准曲线。制作动力学曲线时所测量的电位参数，可以是所用的电位测量体系及氟化物电极的电压读数（mV），或者最好是〔F-〕的相应数值，这可用能斯特方程来计算。能斯特方程在这里具有下列形式：
E＝Eo-S·ln[F-]
其中E为所测的电压，Eo为实验确定的体系本身的常数，包括活度系数和液体接界电势。S为“能斯特斜率”，此常数在F-浓度变化范围为10单位时，在Tris缓冲液中约等于57mV（在pH为7.0的卡可酸盐缓冲液中其数值更高一些）。F-浓度则是以毫摩尔数/升表示的。如果将由上述方程式计算的〔F-〕的值以毫克/升表示并用来“绘图”，则所得曲线为近乎完美的直线，其斜率能够很容易地计算出来。
下列实例说明本发明，最好参照附图来理解。
图1为一条标准曲线，显示F-释放速率对标准水溶液中胆红素浓度的斜率。
实例1
胆红素分析标准曲线的制作
在Tris缓冲液（200毫摩尔/升），pH7，5微摩尔/升NaF中制备下列试剂溶液。
a）胆红素标准液：在10毫升100毫摩尔/升碳酸钠溶液中制备含2.5克/升胆红素的贮液。用蒸馏水稀释该贮液即制得下列浓度（以毫克/升表示）的标准液：10、20、40、50、100。
b）胆红素氧化酶（BOX）溶液：由冰冻干燥的市售缓冲制剂制备2.5毫升含10单位/毫升的溶液。采用两种来源的市售BOX：（ⅰ）疣状漆斑菌的BOX（Calbiochem＃201105）;（ⅱ）疣状漆斑菌的BOX（Sigma＃BO390）。优选Calbiochem公司的试剂。
c）五氟苯酚（PFP）溶液：100毫摩尔/升的水溶液。
d）4-氨基安替比林（4APP）溶液：50毫摩尔/升的缓冲溶液。
仪器：采用Orion氟化物复合电极（96-09）。该电极与一个微分放大器相连。该放大器的输出端与Keithley 197多量程电位计相连，并经IEEE 488总线与AppleⅡ电脑接口以得到数据。
实验：实验在Linbro组织培养平板（Flow Laboratories Ltd.，Scotland）中进行。每个培养平板中有24个平底小孔（17×16毫米），每个小孔的容量为3.5毫升。
在Linbro平板的一个小孔中加入下列试剂溶液：Tris缓冲液（500微升）、氨基安替比林溶液（10微升）氟苯酚溶液（50微升）、蒸馏水（370微升）。将氟化物电极降入溶液中，使其电极电势稳定（3-5分钟）。然后加入50微升BOX溶液，并重新使该电极稳定（3-5分钟）。最后加入胆红素工作标准溶液（20微升）启动反应。监测F-释放5分钟。然后用通常的方法计算出F-的释放速率（微摩尔/升·分），以所测得的数值对相应的BR浓度作图。
测定含10.20.50和100毫克/升胆红素的标准液及空白样品（胆红素浓度为0）的速率（微摩尔/升·分），其斜率图示于图1。
应当指出，在这些试验中，在约20分钟或更长的时间内速率不变。由于氟化合物和4AAP的摩尔浓度约比浓度为100毫克/升的胆红素标准液高1700倍，并且从测得的数据来看反应速度为约0.5-4微摩尔/分，因此有证据表明，只是在所供给的试剂几乎耗尽之后，胆红素才有效地转化为胆绿素。这一令人惊奇的观察结果进一步证实了，决速步骤是胆绿素在4-AAP存在下随着还原剂的消耗而反转化为胆红素的反应。分光光度分析也获得了证据，表明在一种疚乃幕乖链嬖谙陆械腂OX催化的氧化反应中，胆红素在460nm处的光吸收基本不变。例如，在BOX存在下使用50毫克/升的胆红素溶液，在头10分钟内观察到的光吸收变化约为15%。如果有更多的4AAP，则同样时间内的变为小于2%。
还应该指出，除五氟苯酚外，还可应用带有给电子取代基的其它含氟的芳香化合物。在这类化合物中，可以举出下列化合物：4-氟苯酚（FP）、4-氟苯胺（FA）和四氟苯酚（TFP）也可用于上述测试。
实例2
在类似条件下重复实例1的方法，得到下列结果并以每分钟释放的F-离子浓度（微摩尔/升/分）表示（两次试验结果的平均值）。
胆红素标准液 结果〔F-〕
（毫克/升） （微摩尔/升/分）
0 0，176（本底）
1，0 0，179
5，0 0，292
10，0 0，442
20，0 0，738
40，0 1，292
用上表作对比数据，测定作同样分析的正常血清（NS）和病理血清（PS）。结果为：NS14毫克/升，PS32毫克/升，这与由通常方法得到的数值确实相一致。
实例3
前一实例的结果表明，即使在完全没有胆红素时（空白），电位参数的读数也不为零。
虽然这种情况仅在血红素浓度很低时才会成为问题，我们仍然研究了减少这种误差的手段，包括改变反应介质和pH。
例如，除了pH 7的Tris缓冲液（Tris＝三（羟甲基）氨基甲烷）外，研究了pH 7和pH5.5的卡可酸盐（二甲基次胂酸钠）缓冲液及pH5.5的乙酸盐缓冲液。
这三种缓冲液都为0.1M，并用0.1N NaOH或0.1N酸（对Tris和卡可酸盐用HCl，对乙酸盐用乙酸）调至所要求的pH。如前面的实例所述，利用浓度为0（空白）和20毫克/升的胆红素进行试验。
空白（即胆红素浓度为0）的结果示于下表，为方便起见，结果以占对20毫克/升样品记录的相应数值的百分比表示。
下表给出两组结果，一组是用4-氟苯酚（4-FP）作还原剂时的结果，另一组是用4-氟苯胺（4-FA）作还原剂时的结果。
缓冲液（pH） 结果（%）
4-FP 4-FA
Tris（7） 93 33
卡可酸盐（7） 16 33
卡可酸盐（5.5） 9 20
乙酸盐（5.5） 25 50
上面的数据表明，在用pH5.5的卡可酸盐时出现最小本底，而且4-FP比4-FA结果更好。
实例4
还进行了一些实验来测试若干氟化合物在本方法中的优劣。测试的化合物为4-氟苯酚（4-FP）、4-氟苯胺（4-FA）和五氟苯酚（PFP）。如前面的实例所述，用浓度为0的胆红素相对于低浓度胆红素（在此为5毫克/升）进行测试。缓冲液为pH为5.5和7的卡可酸盐。下表给出的是0胆红素的测试结果哉?毫克/升胆红素测试结果的百分比表示。
氟化合物 结果（%）
pH5.5 pH7
4-FP 20 28
4-FA 6，25 20
PFP 15 6
应当注意，如果实例3和4所公开的实验在不加4-AAP（4-氨基安替比林）的情况下进行，则只记录本底，而不管胆红素的量是多少。
以前曾认为，本发明的方法并不依赖于经过氧化氢氧化后F-的释放，而胆红素在某些种类的BOX存在下进行氧化时可能会生成过氧化氢。以前这样认为是用不生成H2O2的胆红素氧化酶来证实的。为了进一步进行检验，加（或不加）催化量的辣根过氧化物酶（POD）进行试验。已知POD催化H2O2对有机氟化合物的氟碳键的断裂反应（见本申请中及别处引用的先前的工作）。
如前面的实例所述，测试在加（5单位/毫升）或不加POD的情况下，用0和5毫克/升胆红素在pH7的卡可酸盐缓冲液中进行。
0试验的结果仍以占5毫克/升测试结果的百分比表示。结果表明，POD的存在与否无关紧要。例如，对4-FA结果为23%（加POD）和24%（不加POD）。对4-FP结果都为13%。
Claims (14)
1、一种水溶液中胆红素的测定方法，包括以下步骤：
a.在胆红素氧化酶和过量的一种还原性化合物存在下，将胆红素氧化成胆绿素，所述还原性化合物能够将胆绿素还原回初始的胆红素；
b.测定该还原性化合物的消耗速率，从而确定水溶液中存在的胆红素的量。
2、权利要求1的方法，其特征在于其中的水溶液为生物流体。
3、权利要求2的方法，其特征在于，其中的还原剂为一种化合物，其标准氧化还原电势处在Fe2+/F3+电对和H+/H2电对的标准氧化还原电势之间，并且该还原剂能够产生一个指示该还原剂消耗的信号。
4、权利要求3的方法，其特征在于，其中的还原剂为4-氨基安替比林;此外，胆绿素的还原反应在选定的卤代化合物存在下进行，这些选定的卤代化合物能够在氧化态4-氨基安替比林存在下产生游离的卤离子，卤离子的产生速率由氧化态4-安基安替比林的生成速率控制;对卤离子进行分析，以测定水溶液中存在的胆红素的量。
5、权利要求4的方法，其特征在于，用离子选择性电极测量水溶液中所述卤离子的生成速率。
6、权利要求4的方法，其特征在于，其中的卤代化合物选自对氟苯酚、对氟苯胺、四氟苯酚、五氟苯酚、及带有给电子取代基的含氟芳香化合物。
7、权利要求6的方法，其特征在于，其中的卤代化合物选自对氟苯酚、对氟苯胺、四氟苯酚和五氟苯酚。
8、一种水溶液样品中胆红素的测定方法，包括以下步骤：
a.在胆红素氧化酶存在下，将胆红素定量氧化为胆绿素;
b.利用还原剂定量还原胆绿素，其中所用还原剂的摩尔数相对于胆红素过量;
c.测定还原剂的消耗速率，以确定水溶液样品中存在的胆红素的量。
9、权利要求8的方法，其特征在于，其中的水溶液为生物流体。
10、权利要求9的方法，其特征在于，其中的还原剂为一种化合物，其标准氧化还原电势处在Fe2+/Fe3+电对和H+/H2电对的标准氧化还原电势之间，并且该还原剂能够产生一个指示该还原剂消耗的信号。
11、权利要求10的方法，其特征在于，其中的还原剂为4-氨基安替比林;此外，胆绿素的还原反应在选定的卤代化合物存在下进行，这些选定的卤代化合物能够在氧化态4-氨基安替比林存在下产生游离的卤离子，卤离子产生的速率由氧化态4-氨基安替比林的生成速率控制;对卤离子进行分析，以测定水溶液中存在的胆红素的量。
12、权利要求11的方法，其特征在于，用离子选择性电极测量水溶液中所述卤离子的生成速率。
13、权利要求11的方法，其特征在于，其中的卤代化合物选自对氟苯酚、对氟苯胺、四氟苯酚、五氟苯酚和带有给电子取代基的含氟芳香化合物。
14、权利要求13的方法，其特征在于，其中的卤代化合物选自对氟苯酚、对氟苯胺、四氟苯酚、五氟苯酚。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |