JPS6344167A - 試験手段の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、指示薬物質として一成分系指示薬が用いられ
、更にそれ自体同志では互いにカップリングすることが
できない被酸化性芳香族アミノもしくはヒドラジノ化合
物を脱色剤として上記試験手段に添加する、分析対象物
を酸化還元反応により測定するだめの試験手段（ｔｅｓ
ｔ　ａｉｄｓ）の製造方法に関する。

脱色剤の添加により、試験手段のブランク色値（ｂｌａ
ｎｋ　ｃｏｌｏｒ　ｖａｌｕｅ）の発現が防止される。

比咬的多１３’ｌの脱色剤を加えることにより試験−ｆ
段の感度を正確に調整することができる。

近年、いわゆる「色試験」は、医学的診断学において益
々重要な地位を獲得してきている。この「色試験」は、
過酸化水素又はクメンヒドロペルオキシドのような過酸
化物が関与する、分析対象物（分析すべき物質）をΔ１
１１定するための方法である。１Ｉｉｉ＋酸化水素は酸
素の存在下、適当なオキシダーゼ（酸化酵素）を触媒と
する分析対象物の酸化反応中に生成される。これらの色
試験においては、試験手段として液体試薬又はいわゆる
試験片が用いられる。考えられる分析対象物としては、
グルコース、グリセリン、リン酸グリセリン、サルコシ
ン、ガラクトース及びコレステロールが挙げられる。適
切なオキシダーゼとしてはグルコース・オキシダーゼ、
グリセリン・オキシダーゼ、リン酸グリセリン−：ｔ＋
シダーゼ、サルコシン嗜オキシグーゼ、ガラクトース・
オキシダーゼ及びコレステロール・オキシダーゼが挙げ
られる。この他に、更なる酸素と基質の対も知られてい
る。

上記のクメンヒドロペルオキシドは、ヘモグロビンのよ
うに過酸化的に活性な物質の測定に用いられる。大便試
料中の欝血の３１１１定はこの原理にノ、（〈ものであ
る。

これらの３１１１定方法のいずれにおいても、ベルオキ
シターゼ又は過酸化的に活性な物質を触媒とするレドッ
クス同等物がペルオキシドから指示薬に移される。かか
る指示薬は２つの群に大別される。

１、一成分系指示薬類 これらの指示薬においては、レドックス同等物は指示薬
に移され、得られた酸化生成物は着色される。代表例と
してはベンジジン、アルキルベンジジン、例えばテトラ
メチルテトラエチルベンジジン又はトルイジン等が挙げ
られる。

２　二成分系指〉■り薬類 これらの指示薬においては、１つの成分がレドックス同
等物す物の移行によって酸化される。この無色の酸化生
成物は適切なカンブリング成分と反応して色素を形成す
ることができる。最も良く知られたこの種の反応は恐ら
く、いわゆる「トリンター（Ｔｒｉｎｄｅｒ）反応」［
トリングー、　Ｐ、　Ａ、　Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、、６　：　２４−２７（１９６９）］で
あり、ここでは］４−アミノアンチピリは１　カップリ
ング成分としてのフェノールと反応して赤色のキノンイ
ミン色素を形成する被酸化性成分である。同様の系にお
いて、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
が被酸化性成分として用いられる。

ペルオキシドを経て進行するＪｌｌｌｌｌｌ定判法は、
極く少量の分析対象物のＪｌｌｌ定を可能にする高い感
度である。しかしながら、感度が高いということは妨害
を受けやすいということにもなる。したがって、分析す
べき試料を加える前に、上記指示薬は、たとえ痕跡量の
過酸化的に活性な不純物、又は試験片の製造工程中又は
液体分析を行う際の大気中酸素に対しても明確な発色を
示す。そのため、定着分析を行う前にブランクをΔｌｌ
Ｉ定し、それを分析後の測定値から差し引かねばならな
い。特に低濃度の分析対象物については不正確な測定値
しか得られない、かかるブランク値を回避するには、大
気市酸素を除去しながら、高度に精製された試薬のみを
用いて操作することで原理的には可能であるが、これは
費用がかかるため技術的に実施不ｉｉｆ能である。

ドイツ国特許公開公報（Ｄ　Ｅ　−ＯＳ）第２７　１６
　０６０号には、酸化指示薬（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ　１
ｎｄｉｃａｔｏｒ）が用いられ、これには、ブラン′り
色値の発現を防止するだめの７リールセミカルパジドが
加えられている、安定化された迅速な１診断方法が記載
されている。しかしながら、かかるアリールセミカルバ
ジド に加えねばならず（ドイツ国特許公開公報第３０　　１
２　　３６８号及び第３４　　０６　　３２８号にその
例が記載されている）、その上発癌性物質の疑いがある
ため、それらを試験手段に用いることは勧められない。

アスコルビン酸を加えることにより試験手段のブランク
色値を回避する試みは、上記目的のために十分・Ｖのア
スコルビン酸を加えると、試験手段の感度の点で再現性
がないという結果に終った。

−成分系酸化指示薬を含む試験手段を製造するだめの試
薬液又は含浸液を脱色し得ること１又はそれ自体同志で
は互にカンプリングすることができない被酸化性芳香族
アミノもしくはヒドラジノ化合物を脱色剤として少量加
えることによりブランク色値の形成を防止し得ることが
判明した。

更に、脱色剤を比較的多量に加えることにより、移変の
低減及び分析対象物の高濃度方向への較正関係（検量線
）（分析対象物の濃度の関数としての着色強度）の移動
が可能であることが判明した。

本発明は、指示薬物質として一成分系酸化指示薬を含み
、分析対象物を酸化還元反応により＋１１疋するだめの
試験手段の製造方法であって、それ自体同志では互いに
カップリングすることができない被酸化性芳香族アミノ
もしくはヒドラジノ化合物を脱色剤として添加する方法
に関する。

脱色剤は、試験手段の脱色のために、−成分系酸化指示
薬に対して０．０５〜５屯量％、好ましくは０．１〜１
　ニーＴ＜　ｉＬｉ：％の濃度で用いられる。磁切な量
は、不純物の滴定により容易に求められる。上記濃度を
多少上まわっても！較正関係には、Ｎ＋１１疋され得る
ような悪影響を及すことはない。

試験手段の感度の低減又は較正曲線の横座標とのす１片
の高濃度方向への移動を行うには、脱色剤は酸化指示薬
の５〜２００重呈％、電動しくは５〜１００重呈％の電
動用いられる。

本発明は更に、試験片の製造に役立ち、−成分系酸化指
示薬を含む無色の含浸溶液又は試薬混合物を製造するた
めの方法（ここで、該溶液又は混合物は更に脱色剤を含
む）に関する。

本発明は更に、−成分系酸化指示薬及び更に脱色剤を含
む試験手段に関する。試験手段とは試薬ｌコ合物、凍結
乾燥生成物、試薬の組合せ、液体試薬等を意味するもの
とする。

更に１本発明は分析対象物の測定に用いるための試験手
段に関する。適切な分析対象物としてはグルコース、コ
レステロール、トリグリセリド、ガラクトース等又は酵
素１例えばベルオキシターゼ又は過酸化的活性を有する
蛋白質、例えばヘモグロビン又はメトヘモグロビンが挙
げられる。

考えられる試料材料としては例えば血液、血漿、液、尿
のような体液及び大便試料が挙げられる。

本発明により用いられる脱色剤は通常、二成分指示薬系
の被酸化性成分として用いられるが、本発明の範囲内で
カップリング成分なしで用いられる。

適切な脱色剤は、例えば３位で置換された一般式： ［式中、Ｒ１は場合により、−〇Ｈ１−ＯＲ１−ＯＣＯ
Ｒ１−０ＣＯＯＲ（こ、：でＲは炭素原子数１〜４のア
ルキル店（を表す）、炭素原子数１〜４のフルコキシ２
．（、アリールノ、（又はアラルキル基＾を表し； Ｒ２は水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキルノ、（
を表し； Ｒ３はアリール基、アラルキル基、場合により、上記Ｒ
１の場合と同様に：ご換された炭素原子数１〜４のアル
キル基又は水素原子を表す］で示される４−アミノピラ
ゾリノン；又は一般式： （式中、Ｒ１は水素原子又は炭素原子数１〜４のフルキ
ルノ、（を表し；Ｒ２は水素原子又は５ｏ３Ｈを表す）
で示される２−ペンジチアソリノンヒドラランである。

４−アミノアンチピリン［式（Ｉ）においてＲ１＝Ｒ２
＝メチル基；Ｒ３＝フェニル基］又は３−メチル−２−
ヘンゾチアゾリノンヒトラゾン［式（＋！　）において
Ｒ，＝メチル店（、Ｒ２＝水素原子］か好ましい。

―上ヱ」 グルコース試験フィルムを製造するために下記成分から
成る混合物を：Ａ製したニ ゲルコース串オキシダーゼ ９ｍｇ　（２５０Ｕ／ｍｇ） ベルオキンダーゼ　　　５０ｍｇ　（８０Ｕ／ｍｇ）４
−アミノアンチピリン１ｍｇのクエン酸塩緩衝液１．７
４溶液（１ｍ、ｐＨ５，５） この溶液をＦデシルヘンゼンスルホン酸ナトリウム０３
４ｇを含むクロロホルム３．４−に微細な液滴の形に、
振盪しながら分散させた。得られた分散液を、クロロホ
ルムを油相とする水／油比１：１の水／油分散液１６−
とポリアクリルアミド（ドイツ国特許公開公報第３４　
３４　８２２号、実施例８に製造方法が記・成されてい
る）１３．１重量％、アセト酪酸セルコース［ｎ　　　
（アセトン：エタノール−ｒｅ文 １９：ｌＩ＋１１９％）＝２００コのクロロホルム中７
．５％溶液３４−及び３．３’、５．５’−テトラメチ
ルベンジジン０．６ｇ（７）’ＩＷ合物に加えた。上記
混合物を激しく振盪した。この工程中に、混合物は、ま
ず強い緑色の発色を示したが、３０〜９０秒後に再び色
が消失した。

上記混合物をドクターブレードによりポリエステルフィ
ルム上に塗布しく湿温塗布％　１８０μＩ＋１）　、暗
条件下に２４°Ｃの温風を吹き付けて乾燥させた。白色
の試験フィルムが得られ、これを０．５ｃｍ巾の長片に
切断した。

試験の実施にあたり、全面３０舊文を０．５ｃ工Ｘ１ｃ
ｍの試験領域に施し、１５秒後に拭き取った。

血液試料のグルコース含有値に対応して発色した色を反
射光度計で６４０ｎｍにて測定し、Ｋ／Ｓ値［Ｋ／Ｓ＝
　（１−Ｒ）　２／２Ｒ：ここでＲ２反射率、に＝吸着
係数：及びＳ−散乱光係数］を計算した。上記試験片に
よるグルコース濃度に対するに／Ｓのグラフ（較正曲線
）を第１図に示す。上記曲線は濃度ゼロにおいてに／Ｓ
値ゼロを示すことがわかる。、２０ｍｇ／　ｄ　（ｌの
グルコースを含む血１今試料によって得られる発色は試
験を行っていない試験片の色と目視的に識別することが
でさた。

ル笠主ユ ４−アミノアンチピリンを加えずに実施例１と同様に操
作した場合、緑色に着色された混合物及び明緑色の試験
片がイ１ｔられた。これらの試験片によって描かれた較
正曲線は、グルコース濃度ゼロにおいてゼロとは異るに
／Ｓ値を示した。２０ｇｇ／ｄｌのグルコースを含む血
液試料によって得られた発色は試験片のブランク色値と
目視的に識別することは不可能であった。

ｋ１町」 酵素以外に４−アミ／アンチピリン合計１００ｚｚｆ含
むクエン酸塩緩衝剤２．６−を用いた他は実施例１に従
って混合物を調製した。この混合物を用いて実施例１と
同様にして製造した試験片を、実施例１と同様に種々の
グルコース濃度の血液試料を用いて試験した。この操作
により得られた較正曲線を第２図に示す。第１図と比較
して、横座標の切片が約３０Ｂ／ｄ文のグルコース濃度
へ移動しており、また３０〜２００ｍｇ／ｄＱのグルコ
ース濃度における較正曲線か実質的に低い勾配、すなわ
ち低い感度を示していることがわかる。

実」ｌ帆Ａ ４−アミ／アンチピリンの代りに３−メチル−２−ヘン
ゾチアツリノンヒトラゾン塩Ｍ　１ｋＸ　２　ｍｇを用
いた以外は実施例１に従って混合物を：Ａ製した。実施
例１と同様に、混合物のｈ所の緑色の発色が観察された
。このσこ合物により製造した試験片は実施例１で得ら
れたと同様の較正曲線（第１図）を与えた。

上記のように、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに本
発明の修正及び変形が種々になされ得ることは明らかで
あり、したかって、］しく課すべき制限のみを特許請求
の範囲に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明手段により得られｔコゲルコ
ース濃度に対するに／Ｓの較正曲線を示すグラフである
。 Ｋ／Ｓ Ｋ／Ｓ 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、指示薬物質として一成分系指示薬からなる組成物を
   含み、分析対象物を酸化還元反応により測定するための
   試験手段の製造方法であって、それ自体同志では互いに
   カップリングすることができない被酸化性芳香族アミノ
   もしくはヒドラジノ化合物を該組成物に添加する方法。 ２、被酸化性芳香族アミノもしくはヒドラジノ化合物が
   ３位で置換された、４−アミノピラゾリノン又はベンゾ
   チアゾリノンヒドラゾンである特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、被酸化性芳香族アミノ化合物として４−アミノアン
   チピリン及びヒドラジノ化合物として３−メチル−２−
   ベンゾチアゾリノンヒドラゾン又はそれらの塩を用いる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、被酸化性芳香族アミノもしくはヒドラジノ化合物を
   上記一成分系指示薬に対して０．０５〜５重量％の濃度
   で用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、被酸化性芳香族アミノもしくはヒドラジノ化合物を
   上記一成分系指示薬に対して５〜２００重量％の濃度で
   用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。